KR101529042B1 - 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법 - Google Patents
살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 (1)서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트, (2)서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Typhimurium 검출용 프라이머 세트, (3)서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트, (4)서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트, 상기 (1)의 프라이머 세트 내지 (4)의 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 (1)서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트, (2)서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Typhimurium 검출용 프라이머 세트, (3)서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트, (4)서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Enteritidis 검출용 프라이머 세트, 상기 (1)의 프라이머 세트 내지 (4)의 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법에 관한 것이다.
살모넬라(Salmonella)는 그람 음성의 운동성이 있는 통성 혐기성 간균으로 7∼45℃에서 증식이 가능하다. 현재까지 살모넬라는 2,500개 이상의 혈청형이 알려져 있는데 이중에서 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella Enteritidis, S. Enteritidis), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis, S. Choleraesuis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium, S. Typhimurium)은 사람과 가축에서 질병을 일으키는 주요 병원체로 알려져 있다.
살모넬라는 국내 뿐만 아니라 전 세계적으로 가장 빈발하는 식중독 원인균 중 하나이다. 살모넬라균을 원인으로 하는 살모넬라 식중독은 오염된 식품을 섭취하거나 살모넬라균에 감염 동물과 직접 접촉함으로써 발생할 수 있다. 2006년 미국의 CDC 자료에 따르면 돼지에서 살모넬라 혈청형 중에서 S. Typhimurium이 36%로 가장 많이 분리되었고 S. Choleraesuis는 9%를 차지하였다. 한편 닭에서는 S. Enteritidis가 34.4%, S. Typhimurium이 10.3%로 분리되었다.
국내의 경우 2006년부터 2010년까지 돼지에서 분리한 살모넬라의 혈청형을 동정한 결과, S. Typhimurium이 가장 많이 확인되었다. 한편, 1998년부터 10년 동안 국내 식중독 환자에서 분리된 살모넬라 혈청형은 S. Enteritidis와 S. Typhimurium이 대부분을 차지하였다.
국내에서 돼지의 살모넬라병을 유발시키는 혈청형은 주로 S. Typhimurium으로서 이는 숙주 특이성이 없어 축종에 상관없이 감염된다. 또한 식육을 통해 사람의 식중독을 유발시키는 인수공통전염병의 원인균으로서 공중보건학적으로도 매우 중요하게 여겨지고 있다. S. Choleraesuis는 돼지의 분변으로 배출되며 토양에서 수년간 생존한다. 사람에서는 잘 감염되지 않지만 감염되면 심한 패혈증을 일으키므로 매우 치명적인 병원균이다. 국내 돼지 살모넬라의 경우 S. Typhimurium이 대부분을 차지하고 있는 반면, 전신 패혈증을 일으키는 S. Choleraesuis는 전 세계적으로 다수 분리되고 있음에도 불구하고 국내에서는 아직 보고가 드물다. 그러나 외국으로부터 식용, 종돈 등의 도입이 많은 실정을 고려할 때 이들 살모넬라 혈청형 등의 원인체에 대한 철저한 대책이 필요할 것으로 생각된다.
살모넬라 혈청형 중에서 S. Enteritidis는 1998년부터 2007년까지 국내에서 가장 빈번하게 분리된 살모넬라 식중독의 혈청형이다. 또한 2000년부터 2002년까지 전 세계적으로 가장 많이 확인된 non-typhoid Salmonella로 보고되었다. 또한 S. Enteritidis는 숙주 범위가 매우 넓어 사람뿐 만 아니라 가금류 및 포유동물에도 감염되어 질병을 유발한다. 사람의 S. Enteritidis 감염원은 닭으로부터 얻을 수 있는 닭고기와 계란으로 조사된 바 있다.
살모넬라의 혈청형을 파악하기 위한 살모넬라 혈청형 동정은 균체항원과 편모항원에 대한 항혈청을 사용하여 평판응집반응과 시험관응집반응으로 동정한다. 그러나 이 방법은 고가의 항혈청을 보유한 실험실에서만 가능하고 실험에 능숙한 전문가가 필요하며 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 또한 분리주의 약 5∼8%는 표면항원의 소실로 인해 정확하게 동정이 되지 않는다는 보고가 있어, 살모넬라 혈청형을 동정하는데 표현형보다는 더욱 안정적인 유전자 진단법이 많이 활용되고 있다. 현재 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 신속, 간편하여 항혈청을 이용한 살모넬라 혈청형 동정법을 대체할 수 있는 유용한 방법으로 보고되고 있다.
이에 본 발명자들은 살모넬라 공통 유전자(invA) 및 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Typhimurium을 감별할 수 있는 특이 프라이머를 새롭게 제작하였고, 상기 프라이머 및 이를 포함하는 키트를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 살모넬라 공통 유전자(invA) 및 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Typhimurium을 신속, 정확하게 진단할 수 있도록 하여 살모넬라의 감염 여부를 진단할 수 있다. 또한 상기 프라이머를 포함하는 키트를 이용하여 살모넬라 감염 여부를 진단시 특이도 및 민감도 등은 농림수산검역검사본부 동물질병 표준검사법 및 표준기술활용자료와 비교하였으며, 반응에 필요한 시약 등을 건조형태로 공급, 사용함으로써 진단능력은 동등하게 유지하면서 보관기간을 향상시켜 본 발명을 완성하였다.
한편 본 발명과 관련된 선행기술로써 한국공개특허 제2007-0054794호에 hin 유전자 특이적 PCR을 이용하여 단상 편모 살모넬라 혈청형을 동정하는 방법 및 이를 위한 프라이머 세트를 나타내고 있다.
또한, 한국공개특허 제2009-0122554호에 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 티피무리움 검출용 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 대상 시료에서 살모넬라 티피무리움을 검출하는 방법, 살모넬라 티피무리움 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 및 상기 프로브가 고정화된 마이크로어레이를 나타내고 있다.
그리고, 한국공개특허 제2010-0011563호에 살모넬라 타이피를 보다 신속하게 검출할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 살모넬라 타이피 검출키트 및 이를 이용하여 살모넬라 타이피의 감염여부를 신속하게 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 나타내고 있다.
그러나 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법을 나타내는 본 발명과 대비시 상기 선행기술은 발명의 기술적 특징이 서로 상이하여 발명의 구성이 서로 다른 발명이다.
본 발명의 목적은 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Typhimurium을 신속, 정확하게 진단하고자 다중 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용되는 진단용 프라이머를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Typhimurium을 동시에 검출하는 키트로써 PCR 반응에 필요한 모든 시약이 1회 테스트 용량으로 혼합, 분주 및 건조되어 있어 숙련되지 않은 검사자라도 손쉽게 3종의 살모넬라 혈청형을 진단할 수 있는 PCR 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Typhimurium을 검출용 프라이머를 포함하는 키트를 이용하여 가축으로부터 살모넬라의 감염 여부를 신속, 정확하게 알 수 있는 진단방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 제1발명은 (1)서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트, (2)서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Typhimurium 검출용 프라이머 세트, (3)서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트, (4)서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Enteritidis 검출용 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
본 발명의 제2발명은 상기 (1)의 프라이머 세트 내지 (4)의 프라이머 세트를 포함하도록 하여 살모넬라의 감염 여부를 확인할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 제3발명은 상기 (1)의 프라이머 세트 내지 (4)의 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출과 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis, 및 S. Enteritidis를 진단하여 살모넬라의 감염 여부를 신속, 정확하게 알 수 있는 진단방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Enteritidis를 검출할 수 있는 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 키트를 이용하여 가축으로부터 살모넬라 감염 유무를 쉽게 파악할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis에 대해서도 항혈청을 이용한 응집반응을 시행하지 않고 감별이 가능하였다.
또한 본 발명에 의해 2시간 이내에 가축에 대한 살모넬라 감염 유무를 신속, 간편하게 결과를 확인할 수 있으며 민감도가 높아 가축 내에 존재하는 소수의 살모넬라도 검출할 수 있다.
도 1은 액상형 혼합액과 본 발명의 건조형 키트의 반응 양상을 비교하기 위해 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis의 DNA를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 결과이다(Lane M:100bp DNA ladder, 1:액상형 혼합액, 2:본 발명품인 건조형 키트, N:negative control).
도 2는 본 발명의 다중 중합효소 연쇄반응을 통해 민감도를 측정한 결과이다(Lane M:100bp DNA ladder, 1∼7:3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis를 1×108∼1×102 CFU/㎖까지 각 lane별로 10진 단계희석, N:negative control).
도 3은 농림수산검역검사본부에서 현재 사용하고 있는 표준기술활용자료에 따른 다중 중합효소 연쇄반응의 민감도 측정 결과로서 사람에서 가장 중요한 식중독 원인균이며 가축에서도 주요한 병원체인 S. Typhimurium과 S. Enteritidis를 감별하지 못하는 단점이 있다(Lane M, 100bp DNA ladder; 1∼7:3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis를 1×108∼1×102 CFU/㎖까지 각 lane별로 10진 단계희석, N:negative control).
도 2는 본 발명의 다중 중합효소 연쇄반응을 통해 민감도를 측정한 결과이다(Lane M:100bp DNA ladder, 1∼7:3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis를 1×108∼1×102 CFU/㎖까지 각 lane별로 10진 단계희석, N:negative control).
도 3은 농림수산검역검사본부에서 현재 사용하고 있는 표준기술활용자료에 따른 다중 중합효소 연쇄반응의 민감도 측정 결과로서 사람에서 가장 중요한 식중독 원인균이며 가축에서도 주요한 병원체인 S. Typhimurium과 S. Enteritidis를 감별하지 못하는 단점이 있다(Lane M, 100bp DNA ladder; 1∼7:3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis를 1×108∼1×102 CFU/㎖까지 각 lane별로 10진 단계희석, N:negative control).
본 발명의 제1발명은 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명의 제1발명은 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출과 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis를 선택적으로 감별하거나 또는 동시에 감별하기 위한 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Typhimurium 검출용 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Enteritidis 검출용 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트와; 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Typhimurium 검출용 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트, 서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Enteritidis 검출용 프라이머 세트를 포함하도록 하여 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis를 선택적으로 검출하거나 또는 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 나타낸다.
상기의 제1발명에서 살모넬라 공통 유전자(InvA; GenBank accession No. EU348369.1), S. Enteritidis gene(GenBank accession No. AF370716.1), S. Choleraesuis gene(GenBank accession No. AE017220.1), S. Typhimurium gene(GenBank accession No. AE006468.1)의 염기서열 사이에서 길이는 22bp, Tm 값은 60∼65℃가 되도록 임의로 염기서열을 선택하여 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 하였다. Tm 값은 MP primer 프로그램을 사용하여 체크하였다(표 1 참조).
| 항목 | 염기서열 | 비고 |
| 살모넬라 공통유전자(inVA) | F : TCTCCCCCTCTTCATGCGTTAC | 서열번호 1 |
| R : CCTTTGACGGTGCGATGAAGTT | 서열번호 2 | |
| S.T | F : CCGCTGACCCAAAAGCTGGGTT | 서열번호 3 |
| R : ACCTCAATGGCGGAACCATGCC | 서열번호 4 | |
| S.C | F : AGCTGCGTCAGGAAGATCGTAT | 서열번호 5 |
| R : ATCTAAGCTAGCCTCTGGCGTC | 서열번호 6 | |
| S.E | F : GCGTGCCGGGGATGAGCATAAA | 서열번호 7 |
| R : TTGCAGAGCTCCGCCAGCTTTC | 서열번호 8 |
*상기 표 1에서 염기서열의 F는 정방향 프라이머(Forward primer)를 나타내며, R은 역방향 프라이머(Reverse primer)를 나타낸다.
**상기 표 1에서 S.T는 S. Typhimurium, S.C는 S. Choleraesuis, S.E는 S. Enteritidis를 의미한다.
본 발명의 제2발명은 상기 제1발명의 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 나타낸다.
본 발명의 제2발명은 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 나타낸다.
본 발명의 제2발명은 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트와; 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Typhimurium 검출용 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트, 서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Enteritidis 검출용 프라이머 세트를 포함하도록 하여 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis를 선택적으로 검출하거나 또는 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 나타낸다.
상기 제2발명의 다중 중합효소 연쇄반응 키트는 가축을 시료로하여 이러한 시료의 살모넬라 감염 여부를 확인할 수 있으며, 이때 가축은 돼지, 소, 닭, 오리, 염소 또는 양일 수 있다.
본 발명의 제3발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법을 나타낸다.
본 발명의 제3발명은 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트와; 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Typhimurium 검출용 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트, 서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Enteritidis 검출용 프라이머 세트를 포함하도록 하여 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis를 선택적으로 검출하거나 또는 동시에 검출할 수 있는 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법을 나타낸다.
상기의 제3발명은 가축을 시료로 하여 이러한 시료로부터 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis를 선택적으로 검출하거나 또는 동시에 검출할 수 있어 시료의 살모넬라 감염 여부를 확인할 수 있으며, 이때 가축은 돼지, 소, 닭, 오리, 염소 또는 양일 수 있다.
본 발명의 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법을 제공하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 주형 DNA 제조
다중 중합효소 연쇄반응을 실시하기 위해 먼저 주형 DNA를 추출하였다. 사용한 균주는 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 제공받은 ATCC 13076(S. Enteritidis), ATCC 7001(S. Choleraesuis), ATCC 14028(S. Typhimurium) 균주를 사용하였으며 혈액배지(Sheep blood agar plate, 아산제약(주), 대한민국)에 상기 균주 현탁액 100㎕를 접종한 후 37℃에서 16시간 동안 호기배양 하였다.
그후, 콜로니를 채취하여 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen사제, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. DNA는 UV 분광도계로 농도와 순도를 측정한 다음 순도가 1.8∼2.0인 것을 확인한 후 다중 중합효소 연쇄반응에서 주형 DNA로 사용하였다.
주형 DNA는 다중 중합효소 반응시 사용하기 쉽도록 1×TE buffer(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)를 이용하여 10ng/㎕로 희석하여 다음 사용시까지 -70℃에 보관하였다.
<실시예 2> 프라이머 디자인
살모넬라 공통 유전자(InvA; GenBank accession No. EU348369.1) 및 혈청형 3종 S. Enteritidis gene(GenBank accession No. AF370716.1), S. Choleraesuis gene(GenBank accession No. AE017220.1), S. Typhimurium gene(GenBank accession No. AE006468.1)의 염기서열 사이에서 길이는 22bp, Tm 값은 60∼65℃가 되도록 염기서열을 선택하여 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 하였다. Tm 값은 MP primer 프로그램을 사용하여 체크하였다(표 2 참조).
| 항목 | 염기서열 | 비고 |
| 살모넬라 공통유전자(inVA) | F : TCTCCCCCTCTTCATGCGTTAC | 서열번호 1 |
| R : CCTTTGACGGTGCGATGAAGTT | 서열번호 2 | |
| S.T | F : CCGCTGACCCAAAAGCTGGGTT | 서열번호 3 |
| R : ACCTCAATGGCGGAACCATGCC | 서열번호 4 | |
| S.C | F : AGCTGCGTCAGGAAGATCGTAT | 서열번호 5 |
| R : ATCTAAGCTAGCCTCTGGCGTC | 서열번호 6 | |
| S.E | F : GCGTGCCGGGGATGAGCATAAA | 서열번호 7 |
| R : TTGCAGAGCTCCGCCAGCTTTC | 서열번호 8 |
*상기 표 2에서 염기서열의 F는 정방향 프라이머(Forward primer)를 나타내며, R은 역방향 프라이머(Reverse primer)를 나타낸다.
**상기 표 2에서 S.T는 S. Typhimurium, S.C는 S. Choleraesuis, S.E는 S. Enteritidis를 의미한다.
<실시예 3> 표준 주형 중합효소 연쇄반응
상기 실시예 2의 표 2에 언급한 살모넬라 공통 유전자 및 3종의 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Enteritidis에 대한 각각의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 조합한 후 이들 각각의 프라이머 세트를 이용하여 Gene Ampㄾ PCR system 9700 (Applied Biosystem사제, USA)을 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 진행하였다.
상기 실시예 1에서 추출한 살모넬라의 DNA를 주형으로 하고, 실시예 2의 표 2에 언급한 살모넬라 공통 유전자 및 3종의 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Enteritidis에 대한 각각의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 조합한 후 실시예 1에서 추출한 살모넬라의 DNA를 주형을 첨가하여 Gene Ampㄾ PCR system 9700(Applied Biosystem 제품, USA)을 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. 이때 다중 중합효소 연쇄반응 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 후 95℃에서 30초와 65℃에서 1분 30초씩 30 사이클, 72℃에서 5분간 반응시켰다.
<실시예 4> 동결건조형 PCR 조성물을 이용한 다중 중합효소 연쇄반응
상기 실시예 2 및 실시예 3과 같은 조성의 PCR 혼합액을 제조, 동결건조한 후 다중 중합효소 연쇄반응을 실행하였다. 이는 시약의 동결건조 조건에 의해 PCR 성능이 영향을 받지 않음을 확인하고 사용의 편리성 및 재현성이 향상된 살모넬라 공통 유전자 및 3종의 혈청형 진단용 키트를 제공하기 위함이다.
PCR에 필요한 시약은 AccuPowerㄾ Gold Multiplex PCR Premix (바이오니아제, 한국) 와 실시예 3에서 선택된 살모넬라 공통 유전자 검출용 프라이머 세트 및 3종 혈청형의 프라이머 세트를 혼합한 후 96 well 플레이트에 분주하고, SuperCentra2(바이오니아사 제품, 한국)를 이용하여 50분간 동결건조(진공도 : -76cmHg)하여 PCR 조성물을 얻었다. 동결건조된 PCR 조성물에 상기 실시예 1에서 추출한 살모넬라 DNA를 주형으로 첨가하고, 멸균증류수로 총 용량이 20㎕가 되도록 분주하여 동결건조물이 완전히 용해되도록 혼합하였다. Gene Ampㄾ PCR system 9700(Applied Biosystem 제품, USA)을 이용하여 상기 실시예 3에 언급한 동일한 반응조건으로 다중 중합효소 연쇄반응을 실시하였다.
도 1에서 보듯이 실시예 3의 액상형 PCR 혼합액과 실시예 4의 건조형 PCR 조성물에 대해 키트를 사용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 비교한 결과 모두 동등한 결과가 나타났다(Lane M:100bp DNA ladder, 1:액상형 혼합액, 2:본 발명품인 동결건조형 키트, N:negative control).
<실시예 5> 본 발명 살모넬라 진단의 민감도
American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 제공받은 ATCC 13076(S. Enteritidis), ATCC 7001(S. Choleraesuis), ATCC 14028(S. Typhimurium) 균주를 사용하여 실시예 3 및 실시예 4의 방법으로 농림수산검역검사본부 표준기술활용자료 (2010년)의 살모넬라 콜레라수이스의 분리 및 동정기법과 민감도를 비교하고 이를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
상기 표 2의 프라이머 세트를 포함하는 키트를 이용한 본 발명의 살모넬라 진단 방법(도 2 참조)과 표준기술활용자료의 살모넬라검사법(도 3 참조) 모두 살모넬라 주형 DNA를 1×104 CFU/㎖까지 검출이 가능하였다(도 2, 도 3 참조, lane M:100bp DNA ladder, 1∼7:살모넬라 주형 DNA 1×108∼1×102 CFU/㎖, N:negative control). 따라서 본 발명에 의한 살모넬라 진단 방법과 기존 표준기술활용자료를 이용한 검사법은 살모넬라 측정에 대한 민감도가 동등함을 확인 하였다.
그러나 상기 표 2의 프라이머 세트를 포함하는 키트를 이용한 본 발명의 살모넬라 진단 방법(도 2)은 살모넬라 감염의 주요한 혈청형인 S. Enteritidis와 S. Typhimurium 감별이 가능한 반면, 농림수산검역검사본부의 표준기술활용자료(도 3)를 이용한 측정법으로는 이들 2종류의 S. Enteritidis와 S. Typhimurium을 감별하지 못하여 오염원 추적이 어려운 단점이 있다.
<실시예 6> 본 발명의 살모넬라 진단의 특이도
농림수산검역검사본부에 보관 중인 살모넬라 표준 균주 40주(표 3 참조) 및 살모넬라 이외의 세균 16주(표 4 참조)를 이용하여 상기 표 2의 프라이머 세트를 포함하는 키트를 이용한 본 발명의 살모넬라 진단 방법에 대한 특이도를 조사하였다.
하기 표 3에 나타난 바와 같이 검사 대상의 모든 살모넬라 표준 균주들은 살모넬라 공통 유전자인 invA 유전자를 가지고 있으며 본 발명의 주요 혈청형인 S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Typhimurium은 살모넬라 공통 유전자인 invA와 각각의 특이 증폭산물을 형성하였다.
또한 표 4에서 보듯이 살모넬라 이외의 세균에서는 16주 모두 음성반응을 나타내었다.
따라서 표 2의 프라이머 세트를 포함하는 키트를 이용한 본 발명의 살모넬라 진단 방법은 살모넬라 유무 확인과 동시에 주요 혈청형에 대해서 감별이 가능함을 알 수 있었다.
| 대상 유전자 또는 혈청형 |
양성 반응 혈청형 |
| invA (살모넬라 공통 유전자) |
Aberdeen, Anatum, Bareilly, Berta, Bradeney, Chester, Choleraesuis, Choleraesuis serovar kunzendorf, Daressalaam, Derby, Dublin, Enteritidis, Essen, Gallinarum, Glostrup, Grumpensis, Hvittingfoss, Illinois, Javiana, Lille, London, Moscow, Oranienburg, Panama, Paratyphi A, Paratyphi B, Pullorum, Reading, Rostock, Rubislaw, Sandiego, Senftenberg, Tallahassee, Tennessee, Thompson, Typhimurium, Typhimurium var. copenhagen, Uganda, Virchow, Virginia |
| Typhimurium | Typhimurium, Typhimurium var. copenhagen |
| Choleraesuis | Choleraesuis, Choleraesuis serovar kunzendorf |
| Enteritidis | Enteritidis |
| 검사 균종 | 본 발명에서 반응 결과 |
| Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter junii, Acinetobacter lwoffii, Burkholderia cepacia, Citrobacter freundii, Clostridium perfrigens, Comamonas testosteroni, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Ochrobactrum anthropi, Proteus mirabilis, Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia | 모두 음성 |
<실시예 7> 분리균주를 이용한 본 발명의 살모넬라 진단과 기존 검사법과의 진단효율 비교
농림수산검역검사본부 질병진단과에서 분리한 살모넬라 분리균주 111주(S. Typhimurium 36주, S. Choleraesuis 6주, S. Enteritidis 29주, 기타 혈청형 40주)를 대상으로 표 2의 프라이머 세트를 포함하는 키트를 이용한 본 발명의 살모넬라 진단 방법과 기존 검사법과의 살모넬라 감염 여부에 대한 진단효율을 비교하였다.
표 5에 나타난 바와 같이, 살모넬라 검출에 있어서 기존 검사법은 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출과 S. Choleraesuis 감별만 가능하였으나 본 발명품은 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Typhimurium을 모두 감별할 수 있어 살모넬라 감염 여부에 대한 진단효율이 기존 검사법에 비하여 상당히 개선되었음을 확인할 수 있었다.
| 살모넬라 혈청형 (검출 대상) |
본 발명 | 기존 검사법 | ||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | |
| S. Typhimurium (invA +Typhimurium) |
36 | 75 | Enteritidis와 감별불가 | |
| S. Choleraesuis (invA +Choleraesuis) |
6 | 105 | 6 | 105 |
| S. Enteritidis (invA +Enteritidis) |
29 | 82 | Typhimurium과 감별불가 | |
| 기타 혈청형 (invA) |
40 | 0 | 40 | 0 |
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Enteritidis를 검출할 수 있는 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 키트를 이용하여 가축으로부터 살모넬라 감염 유무를 쉽게 파악할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis 및 S. Enteritidis에 대해서도 항혈청을 이용한 응집반응을 시행하지 않고 감별이 가능하다.
또한 본 발명에 의해 2시간 이내에 시료로서 가축에 대한 살모넬라 감염 유무를 신속, 간편하게 결과를 확인할 수 있으며 민감도가 높아 시료 내에 존재하는 소수의 살모넬라도 검출할 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA) )
BIONEER CORPORATION
<120> Multiplex PCR kits and primers of the differentiation and
simultaneous detection for 3 serovars of Choleraesuis,
Enteritidis, Typhimurium in Salmonella
<130> 8810
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Salmonella InvA Forward primer
<400> 1
tctccccctc ttcatgcgtt ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Salmonella InvA Reverse primer
<400> 2
cctttgacgg tgcgatgaag tt 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Salmonella Typhimurium Forward primer
<400> 3
ccgctgaccc aaaagctggg tt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Salmonella Typhimurium Reverse primer
<400> 4
acctcaatgg cggaaccatg cc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Salmonella Choleraesuis Forward primer
<400> 5
agctgcgtca ggaagatcgt at 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Salmonella Choleraesuis Reverse primer
<400> 6
atctaagcta gcctctggcg tc 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Salmonella Enteritidis Forward primer
<400> 7
gcgtgccggg gatgagcata aa 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Salmonella Enteritidis Reverse primer
<400> 8
ttgcagagct ccgccagctt tc 22
Claims (10)
- 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트.
- 제1항의 프라이머 세트에,
서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Typhimurium 검출용 프라이머 세트;
서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트; 및
서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Enteritidis 검출용 프라이머 세트 중에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 더 포함하는 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 프라이머를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 살모넬라 공통 유전자(invA) 검출용 프라이머 세트와;
서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Typhimurium 검출용 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Choleraesuis 검출용 프라이머 세트, 서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 S. Enteritidis를 검출용 프라이머 세트를 포함하도록 하여 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Enteritidis를 선택적으로 검출하거나 또는 동시에 검출할 수 있는 키트. - 제6항에 있어서,
키트는 가축을 대상으로 하여 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Enteritidis를 선택적으로 검출하거나 또는 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 키트. - 제7항에 있어서,
가축은 돼지, 소, 닭, 오리, 염소 또는 양인 것을 특징으로 하는 키트. - 청구항 제6항의 키트를 이용하여 가축으로부터 살모넬라 공통 유전자(invA)와 3종의 살모넬라 혈청형인 S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Enteritidis를 선택적으로 진단하거나 또는 동시에 진단하는 방법.
- 제9항에 있어서,
가축은 돼지, 소, 닭, 오리, 염소 또는 양인 것을 특징으로 하는 방법.
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