CN108148892B - 沙门氏菌的pcr检测引物、核酸杂交膜条、试剂盒及方法 - Google Patents

沙门氏菌的pcr检测引物、核酸杂交膜条、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌的PCR检测引物、核酸杂交膜条、试剂盒及方法，所述沙门氏菌包括斯坦利沙门氏菌，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物。本发明可以检测斯坦利沙门氏菌。

Description

沙门氏菌的PCR检测引物、核酸杂交膜条、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及沙门氏菌检测技术领域，特别是涉及一种沙门氏菌的PCR检测引物、核酸杂交膜条、试剂盒及检测方法。
背景技术
沙门氏菌感染是一种常见的食源性传播疾病，是全球范围的重大公共卫生问题，影响成千上万的人口，并导致显著的死亡率。沙门氏菌可生活在暖血及冷血动物的肠道中。沙门氏菌属感染在临床上可分为胃肠炎型或食物中毒型、败血症(伤寒型)和局部感染型，肠炎是沙门氏菌感染的主要临床表现，以儿童多见。2004年，WHO估计全球的伤寒疾病负担是每年发生2100万病例，约有21.6～60万人死亡，其中绝大多数为学龄儿童或学龄前儿童，即受伤寒影响最严重的是儿童。在部分亚洲城市贫民区中开展的基于人群的前瞻性监测表明，在5～15岁年龄组中，经血培养证实的伤寒年发病率高达180～494/10万。在部分城市贫民区中，5岁以下学龄前儿童的伤寒发病率与学龄儿童(后者通常被视为伤寒的主要罹患者)相似或甚至更高。NTS(non-typhoidal salmonella serotypes)主要广泛分布于动物界，据估计可致全球每年九千万人的发病和近15.5万人的死亡。美国CDC报道每年约发生4万例的NTS感染；但是很多散发病例都没有报道，致使严重低估了该疾病的数据。低龄儿童容易感染沙门氏菌，小婴儿或者有潜在疾病的儿童(如血液病，HIV感染，恶性肿瘤或者其他免疫缺陷疾病)更加容易发生严重感染且多死于并发症。2013年CDC报道了一起由41个州涉及到473 例沙门氏菌感染的爆发，持续时间从2011年5月23日一直到2013年9月9日，大部分发生的病例集中在加利福尼亚(106例)，纽约(55例)和德克萨斯州(45例)，感染患儿的平均年龄是4岁，70％是10岁以下儿童，一岁以内的小婴儿占31％。我国还没有准确的有关沙门氏菌感染的发病例数以及每年所需的医疗费用等方面的数据，但卫生部全国细菌耐药监测网发布的数据表明，2011年全国149家医院引起血流感染的病原菌中，沙门氏菌属在革兰阴性杆菌中排名第六，占1.2％，何冬梅等对2010年广东省沙门氏菌监测结果显示，鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌是引起感染性腹泻的主要病原菌。
沙门氏菌肠道感染在儿童群体有如此高的发病率要求临床上提高相关疾病的诊断技术水平。细菌培养是诊断沙门氏菌感染的金标准，传代培养，生化检测和特异性的血清凝集试验用来鉴定沙门氏菌的血清型。但培养的敏感性受很多因素影响，如培养基的种类和质量，感染个体的年龄，抗生素的使用及疾病发展的病程。培养技术并不能常规使用，需要专业的培训，无菌的设备和专业操作。2004年Foodborne Diseases ActiveSurveillance Network(FoodNet)公布的数据显示，经CDC、FDA和美国农业部联合研究调查显示，每有一个培养确诊的病例就会漏检39个未明确记录的沙门氏菌感染。对于该病的爆发调查与感染控制而言，准确和快速的鉴定与分型是很重要的。近年来，越来越多的研究关注通过评估沙门氏菌分子水平特点为疾病控制负担提供数据，将是之后疫苗研制控制细菌感染最有前途的治疗手段。因此，为有效控制沙门氏菌感染，有必要深入研究沙门氏菌的分子水平上抗原表达特点，开发能广泛应用的、可快速准确对临床标本(主要是粪便)进行沙门氏菌检测和血清学分型，有效的指导临床诊断与治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种沙门氏菌的PCR检测引物、核酸杂交膜条、试剂盒及检测方法。
本发明采用以下的技术方案：
一种沙门氏菌的PCR检测引物，所述沙门氏菌包括斯坦利沙门氏菌，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
优选地，所述引物还包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的沙门氏菌亚种Ⅰ的PCR检测引物；核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的沙门氏菌的PCR检测引物。
优选地，所述沙门氏菌还包括肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌中的至少一种，所述引物还包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的肠炎沙门氏菌的PCR 检测引物；核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的鼠伤寒沙门氏菌的PCR 检测引物。
一种检测沙门氏菌的核酸杂交膜条，包括基底，以及在所述基底不同位置上固定的特异性的检测探针，所述检测探针包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的斯坦利沙门氏菌的检测探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的沙门氏菌亚种Ⅰ的检测探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的沙门氏菌的检测探针。
优选地，所述检测探针还包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的肠炎沙门氏菌的检测探针；核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的鼠伤寒沙门氏菌的检测探针。
优选地，所述检测探针的3’或5’端带有氨基标记。
一种检测沙门氏菌的试剂盒，其组分包括所述的PCR检测引物。
优选地，还包括所述的核酸杂交膜条。
一种非诊断和治疗目的的沙门氏菌PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取样品DNA，并用所述的PCR检测引物进行扩增；
(2)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在紫外灯下观察电泳结果，判断样品中的沙门氏菌血清型：
若PCR扩增产物电泳后在423bp，137bp和171bp出现条带，则判定样品中含有肠炎沙门氏菌；
若PCR扩增产物电泳后在423bp，137bp和310bp出现条带，则判定样品中含有鼠伤寒沙门氏菌；
若PCR扩增产物电泳后在423bp，137bp和223bp出现条带，则判定样品中含有斯坦利沙门氏菌；
若PCR扩增产物电泳后仅在423bp和137bp出现条带或者无条带，则判定样品中不含有斯坦利沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌中的任一者。
优选地，还包括对样品中的沙门氏菌血清型进行进一步确认的如下步骤：
(3)将步骤(1)得到的扩增产物与权利要求4-5任意一项所述的核酸杂交膜条进行杂交，杂交后通过洗膜、孵育和显色，进一步确定样品中的沙门氏菌血清型：
当沙门氏菌的检测探针所在位置、沙门氏菌亚种Ⅰ的检测探针所在位置、斯坦利沙门氏菌的检测探针所在位置同时显色，且肠炎沙门氏菌的检测探针所在位置和鼠伤寒沙门氏菌的检测探针所在位置不显色时，确认样品中含有斯坦利沙门氏菌；
当沙门氏菌的检测探针所在位置、沙门氏菌亚种Ⅰ的检测探针所在位置、肠炎沙门氏菌的检测探针所在位置同时显色，且斯坦利沙门氏菌的检测探针所在位置和鼠伤寒沙门氏菌的检测探针所在位置不显色时，确认样品中含有肠炎沙门氏菌；
当沙门氏菌的检测探针所在位置、沙门氏菌亚种Ⅰ的检测探针所在位置、鼠伤寒沙门氏菌的检测探针所在位置同时显色，且斯坦利沙门氏菌的检测探针所在位置和肠炎沙门氏菌的检测探针所在位置不显色时，确认样品中含有鼠伤寒沙门氏菌。
本发明的有益效果包括：
本发明通过研究得到斯坦利沙门氏菌的特异性基因序列，并由此得到特异性PCR检测引物，通过PCR扩增反应，可以检测斯坦利沙门氏菌。
进一步的，可以通过多重PCR检测同时检测沙门氏菌的多种血清型，也即在同一个PCR反应体系中不仅可以快速鉴定出菌种是否属于沙门氏菌种属及沙门氏菌亚种Ⅰ分类种，在沙门菌亚种Ⅰ的前提下，可以确定是否是肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌和斯坦利沙门氏菌中的一种或者三者皆不是；本发明可以在一次反应中特异检测肠炎、鼠伤寒、斯坦利沙门氏菌血清型，具有良好的特异性，相对于临床检测中使用的传统的对细菌进行分离纯化培养后进行血清玻板凝集检测方法，本发明的检测较为简便，整个检测用时也较短，结果也一样准确。
附图说明
图1是本发明实施例中多重PCR反应的凝胶电泳图；
图2是本发明实施例中的肠炎、鼠伤寒和斯坦利沙门氏菌的多重PCR反应膜条杂交结果显色图。
具体实施方式
下面对照附图和结合优选具体实施方式对本发明进行详细的阐述。
本发明提供一种沙门氏菌的PCR检测引物，在具体实施方式中，所述沙门氏菌包括斯坦利沙门氏菌，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
在一个优选的实施方式中，所述引物还包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的沙门氏菌亚种Ⅰ的PCR检测引物；核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的沙门氏菌的PCR检测引物。
通过研究得到斯坦利沙门氏菌的特异性基因序列，并由此得到特异性PCR检测引物，通过PCR扩增反应，可以检测斯坦利沙门氏菌。
在一个优选的实施方式中，所述沙门氏菌还包括肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌中的至少一种，所述引物还包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的肠炎沙门氏菌的PCR检测引物；核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的鼠伤寒沙门氏菌的PCR检测引物。
根据PCR检测引物，建立多重PCR反应，可以在一个反应体系中检测出不同的沙门氏菌血清型。
本发明还提供一种检测沙门氏菌的核酸杂交膜条，包括基底，以及在所述基底不同位置上固定的特异性的检测探针，所述检测探针包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的斯坦利沙门氏菌的检测探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的沙门氏菌亚种Ⅰ的检测探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的沙门氏菌的检测探针。
在一个优选的实施方式中，所述检测探针还包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的肠炎沙门氏菌的检测探针；核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的鼠伤寒沙门氏菌的检测探针。
在根据PCR反应后的电泳图对结果进行判定后，可以再利用核酸杂交膜条进行杂交显色对检测结果进行进一步确认，以进一步提高结果的准确性。
本发明还提供一种检测沙门氏菌的试剂盒，其组分包括所述的PCR检测引物。
在一个优选的实施方式中，还包括所述的核酸杂交膜条。
以下通过更具体的示例，对本发明作进一步阐述。
1、引物的设计
(1)从NCBI下载不同株的斯坦利沙门氏菌的基因组CDS序列，所选株系有BCW2782(4852genes)，BCW2784(4929genes)，ATCC7038(4864genes)，CFSAN039535 (4724genes)。
(2)从NCBI下载获得肠炎(GCF_000612325.1)、鼠伤寒(GCF_000636135.1)、甲型副伤寒(CMCC 50973)、布伦登卢普、得尔卑、纽波特、阿拉丁沙、阿哥纳、乙型副伤寒、圣保罗、汤卜逊、猪霍乱等血清型的沙门氏菌的全基因组序列，以及大肠埃希菌、弗氏枸橼酸杆菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌肺炎亚种、阴沟肠杆菌等与沙门氏菌亲缘较近的非沙门氏菌全基因组序列。将所有这些沙门氏菌和非沙门氏菌的全基因组序列建立数据库，以不同株系的斯坦利沙门氏菌基因组CDS序列，分别与上述数据库进行多次的序列比对，对比对结果进行分析：在斯坦利序列数据中删除与其它菌种基因组同源性较高的序列，保留同源性较低的序列，并根据比对结果，对斯坦利沙门氏菌菌株之间的特异序列进行横向比较分析，从中找出序列一致的基因视为斯坦利沙门氏菌的特异基因序列(如SEQ ID NO.16所示)。以获得的特异基因序列为模板设计得到斯坦利沙门氏菌的特异引物(PCR检测引物)，并通过PCR验证引物的特异性。
此外，参考现有的肠炎沙门氏菌(Park SH,Ricke SC:Development of multiplexPCR assay for simultaneous detection of Salmonella genus,Salmonellasubspecies I,Salm. Enteritidis,Salm.Heidelberg and Salm.Typhimurium.J ApplMicrobiol 2015, 118(1):152-160.)、鼠伤寒沙门氏菌(Park SH,Ricke SC:Developmentof multiplex PCR assay for simultaneous detection of Salmonella genus,Salmonella subspecies I,Salm. Enteritidis,Salm.Heidelberg andSalm.Typhimurium.J Appl Microbiol 2015, 118(1):152-160.)、沙门氏菌亚种Ⅰ(KimHJ,Park SH,Lee TH,Nahm BH,Chung YH,Seo KH,Kim HY:Identification of Salmonellaenterica serovar Typhimurium using specific PCR primers obtained bycomparative genomics in Salmonella serovars.J Food Prot 2006, 69(7):1653-1661.)和沙门氏菌(Kim HJ,Park SH,Lee TH,Nahm BH,Chung YH,Seo KH, Kim HY:Identification of Salmonella enterica serovar Typhimurium using specific PCRprimers obtained by comparative genomics in Salmonella serovars.J Food Prot2006, 69(7):1653-1661.)的特异性基因序列，合成得到相应的PCR检测引物。所涉及引物如下表1
Figure BDA0001557878820000061
2、探针的设计
根据前面获得的斯坦利沙门氏菌(SA)、沙门氏菌(SG)，沙门氏菌亚种Ⅰ(SS)，肠炎沙门氏菌(SE)和鼠疫沙门氏菌(ST)的特异基因序列，设计并合成得到相应的检测探针序列，其中，检测探针的3’或5’端带氨基标记，合成的方法为现有的常规的 DNA合成法。具体探针序列见表2。
Figure BDA0001557878820000062
3、细菌DNA的提取
(1)对于细菌DNA的获得可以选择现有方法，挑选经过血清型确认的菌株的单菌落于LB液体培养基中，将培养基放置于摇床中，保持温度28℃摇菌过夜。取400μL 菌液与1.5mL离心管，12000转离心5min，弃上清，留沉淀。用1mL无菌水对沉淀重悬，再次12000转离心5min，弃上清，留沉淀(此步骤重复一次)。对最后的沉淀用 100μL无菌水重悬，在沸浴锅中煮沸10分钟，冰浴10分钟，然后12000转离心5分钟，取上清液即为细菌DNA模板。
(2)提取细菌DNA。
可以使用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，具体操作参照相关说明书进行即可。
4、多重PCR扩增目的基因片段
采用25μL反应体系：其中含有10×Buffer 2.5μL，Mg2+1.5μL，dNTP 0.2μL，引物SG-F和SG-R、SS-F和SS-R、SE-F和SE-R、ST-F和ST-R、SA-F和SA-R 各0.5μL(浓度均为10μmol/μL)，TaqDNA聚合酶(1U/μL)0.5μL，DNA模板2μL，用无菌的超纯水补齐到25μL。反应程序：95℃预变性4min，95℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min。
5、多重PCR产物的鉴定
多重PCR跑完程序后，配置3wt％的琼脂糖凝胶，对产物进行电泳。样品加入适当的电泳缓冲液，以4μL加样进行电泳。1000bp ladder marker为参照物，用100V电压跑40分钟，电泳后进行紫外灯下观察拍照。其中扩增出423bp，137bp和171bp条带的是肠炎沙门氏菌，扩增出423bp，137bp和310bp条带的是鼠伤寒沙门氏菌，扩增出423bp，137bp和223bp条带的是斯坦利沙门氏菌。
为保证PCR扩增序列正确，对目的条带进行目的条带的割胶纯化测序，以测序回来的序列与理论序列进行对比，确认目的序列正确，经过序列比对表明，本例中PCR 扩增序列是正确的。
6、多重PCR特异性验证
选取肠炎、鼠伤寒、斯坦利、阿哥纳、布伦登卢普、汤卜逊、纽波特、阿拉丁沙、得尔卑沙门氏菌种血清型进行特异性验证，对所有菌种根据说明书中DNA提取的方法进行DNA溶液的提取，并利用五重PCR体系以各菌种DNA为模板进行反应。并经电泳凝胶成像对产物进行分析。以不同沙门氏菌为模板的多重PCR反应的凝胶电泳结果如图1所示，其中，DNAMaker：DL2000(TAKARA)；电泳图最上所示为沙门氏菌的菌种标识：斯坦利代表斯坦利血清型，肠炎代表肠炎血清型，鼠伤寒代表鼠伤寒血清型，126代表纽波特(Newport)血清型，97代表阿哥纳(Agona)血清型，107代表布伦登卢普(Braenderup)血清型，108代表汤卜逊血清型，154代表得尔卑(Derby) 血清型，138代表阿拉丁沙血清型，对照空白为不加模板。如图1所示，扩增出423bp (沙门氏菌)，137bp(沙门氏菌亚种Ⅰ)和171bp(肠炎沙门氏菌)条带的是肠炎沙门氏菌，扩增出423bp(沙门氏菌)，137bp和310bp(鼠伤寒沙门氏菌)条带的是鼠伤寒沙门氏菌，扩增出423bp(沙门氏菌)，137bp(沙门氏菌亚种Ⅰ)和223bp(斯坦利沙门氏菌)条带的是斯坦利沙门氏菌，而其它菌种(以上所列种都为沙门氏菌种第Ⅰ亚种)只能扩增出423bp和137bp的两条条带。
7、核酸杂交膜条进行杂交显色对上述五重PCR结果进行进一步验证
(1)、核酸杂交膜条的制备；
a.用打印机在基底(本实施例中为尼龙膜)上打印阵列(如表3)，并在不同位置标明相应沙门氏菌的名称(即SA表示斯坦利沙门氏菌，SG表示沙门氏菌，SS表示沙门氏菌亚种Ⅰ，SE表示肠炎沙门氏菌，ST表示鼠疫沙门氏菌)。
b.用5％的EDAC溶液泡膜30分钟，以活化尼龙膜表面的羧基；
c.分别用探针稀释液(10mmol/LTris，pH8.0)将5条探针稀释至5μmol/L；
d.按尼龙膜条上打印的阵列，将5条探针对应分别点加在尼龙膜相应位置上，探针上的氨基与尼龙膜表面的羧基发生交联反应；
e.待尼龙膜条干燥后，用0.1mol/L的NaOH泡膜5分钟，以封闭尼龙膜表面未反应的羧基；
f.纯水洗涤尼龙膜，干燥后备用。
表3：尼龙膜条上的探针阵列如下：
编号 SG SS SE ST SA
(2)、杂交及显色
2.1杂交
将PCR扩增后的产物与尼龙膜条加入到12mL的杂交液(2×SSC、0.1％SDS，pH7.4)中，在杂交箱中44℃杂交2～4小时。
2.2洗膜
将尼龙膜条转移到预热至44℃的洗液(0.5×SSC、0.1％SDS，pH7.4)中，于44℃洗涤12分钟。
2.3孵育
将膜条放入新鲜配制的0.25U/mL的链霉亲合素-POD(streptin-POD)溶液中，37℃孵育15分钟，使链霉亲合素与PCR产物中的生物素结合，POD连接到PCR产物上，洗去多余的streptin-POD。
2.4显色
现配显色液(0.1mol/L柠檬酸钠、0.1mg/mL TMB、0.0015％H2O2)，将尼龙膜条放入显色液中避光显色15分钟，有杂交产物的膜条相应探针位置处会显蓝色斑点。
(3)、结果判断
如图2所示，为肠炎、鼠伤寒、和斯坦利沙门氏菌的多重PCR反应膜条杂交结果。可以采用人工观察的方式进行判读：通过探针相应位置上蓝色斑点的有无作为是否发生杂交的定性判断依据。当SG和SS位置显色代表所测试样本为沙门氏菌且为沙门氏菌Ⅰ亚种，当SG，SS和SE位置显色代表所测试样本为肠炎沙门氏菌(如图2中的编号1)，当SG，SS和ST位置显色代表所测试样本为鼠伤寒沙门氏菌(如图2中的编号 2)，当SG，SS和SA位置显色代表所测试样本为斯坦利沙门氏菌(如图2中的编号3)，对于同一样品，所有显色结果与电泳结果所示的血清型一致，无非特异显色，无缺失显色。
每个样本需做重复测试，若个别位置有弱信号时，可以与重复测试中的其他膜条的对应的位置的信号作对照，明显弱于对照信号时，可以判为非特异信号，若对应的对照位置不显色或与对照位置信号相当时，可以判为阳性信号。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市儿童医院
<120> 沙门氏菌的PCR检测引物、核酸杂交膜条、试剂盒及方法
<130> 17A100506JYC
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tcacggtagg gctgacaaat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atcagttccg gggtcaattc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ggtggcctcg atgattcccg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cccacttgta gcgagcgccg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tttggcggcg caggcgattc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gcctccgcct catcaatccg 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gccgagcttg atgacaaacc tg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gcgcttcgct tttccaactg cc 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
aacaacggct ccggtaatga gattg 25
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
atgacaaact cttgattctg aagatcg 27
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
agcggtactg ctgtcatag 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gcgccgcaac gtatatgcac 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gttgcctatc cttgagcgcc 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
tggcaacgtt gggtgagg 18
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gctgacagac gcggtc 16
<210> 16
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
atgactaaac aaagctccga atatttccag ttgcattact gctattacct tgagcttatg 60
acagcgacac ttcacggtag ggctgacaaa ttgatgactg ctattcagat tattagcggt 120
actgctgtca tagccgatac cgggctggaa tgggtattcg ctttgcccgt tgttgtaatc 180
gcaacaattc aacttgtgtg gcaacccgca attatttccg agcgtgctag cgtacaaagc 240
cgtcagtacg gtgaattgct ttatgctggg gatgaattga ccccggaact gattgcacaa 300
aaattgaaaa cactgcatca ctctgattcc gcacctttcg gttctttgtt aaatccagcc 360
tacaaaagag cagctattgc atgtggtcgg tctgacgaca ctaagctcag cttccaggaa 420
aagcttttcg cctggtttgc aggatgcctg ccacgttaa 459

Claims (5)

1.一种沙门氏菌的PCR检测引物组，其特征在于，所述沙门氏菌为斯坦利沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌，所述引物组由以下组成：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的斯坦利沙门氏菌的PCR检测引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的沙门氏菌亚种Ⅰ的PCR检测引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的沙门氏菌的PCR检测引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的肠炎沙门氏菌的PCR检测引物；以及
核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的鼠伤寒沙门氏菌的PCR检测引物。
2.一种检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，其组分包括权利要求1所述的PCR检测引物组。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸杂交膜条，所述核酸杂交膜条包括基底，以及在所述基底不同位置上固定的特异性的检测探针，所述检测探针的3’或5’端带有氨基标记，所述检测探针由以下组成：
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的斯坦利沙门氏菌的检测探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的沙门氏菌亚种Ⅰ的检测探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的沙门氏菌的检测探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的肠炎沙门氏菌的检测探针；
核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的鼠伤寒沙门氏菌的检测探针。
4.一种非诊断目的的沙门氏菌PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取样品DNA，并用权利要求1所述的PCR检测引物组进行扩增；
（2）琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在紫外灯下观察电泳结果，判断样品中的沙门氏菌血清型：
若PCR扩增产物电泳后在423bp，137bp和171bp出现条带，则判定样品中含有肠炎沙门氏菌；
若PCR扩增产物电泳后在423bp，137bp和310bp出现条带，则判定样品中含有鼠伤寒沙门氏菌；
若PCR扩增产物电泳后在423bp，137bp和223bp出现条带，则判定样品中含有斯坦利沙门氏菌；
若PCR扩增产物电泳后仅在423bp和137bp出现条带，则判定样品中含有沙门氏菌，但不含有斯坦利沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌中的任一者。
5.如权利要求4所述的非诊断目的的沙门氏菌PCR检测方法，其特征在于，还包括对样品中的沙门氏菌血清型进行进一步确认的如下步骤：
（3）将步骤（1）得到的扩增产物与权利要求3所述的核酸杂交膜条进行杂交，杂交后通过洗膜、孵育和显色，进一步确定样品中的沙门氏菌血清型：
当沙门氏菌的检测探针所在位置、沙门氏菌亚种Ⅰ的检测探针所在位置、斯坦利沙门氏菌的检测探针所在位置同时显色，且肠炎沙门氏菌的检测探针所在位置和鼠伤寒沙门氏菌的检测探针所在位置不显色时，确认样品中含有斯坦利沙门氏菌；
当沙门氏菌的检测探针所在位置、沙门氏菌亚种Ⅰ的检测探针所在位置、肠炎沙门氏菌的检测探针所在位置同时显色，且斯坦利沙门氏菌的检测探针所在位置和鼠伤寒沙门氏菌的检测探针所在位置不显色时，确认样品中含有肠炎沙门氏菌；
当沙门氏菌的检测探针所在位置、沙门氏菌亚种Ⅰ的检测探针所在位置、鼠伤寒沙门氏菌的检测探针所在位置同时显色，且斯坦利沙门氏菌的检测探针所在位置和肠炎沙门氏菌的检测探针所在位置不显色时，确认样品中含有鼠伤寒沙门氏菌。
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