KR101533594B1 - 대장균 섬모유전자 감별을 위한 프라이머 세트, 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대장균 섬모유전자 감별을 위한 프라이머 세트, 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트 보다 상세하게는 (1)서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 대장균 섬모유전자 F4 검출용 프라이머 세트, (2)서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F5 검출용 프라이머 세트, (3)서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F6 검출용 프라이머 세트, (4)서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F18 검출용 프라이머 세트, (5)서열번호 9의 포워드 프라이머와 서열번호 10의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F41 검출용 프라이머 세트 및 상기 (1) 내지 (5) 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 동시에 감별할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 대장균 섬모유전자 감별을 위한 프라이머 세트, 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트 보다 상세하게는 (1)서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 대장균 섬모유전자 F4 검출용 프라이머 세트, (2)서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F5 검출용 프라이머 세트, (3)서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F6 검출용 프라이머 세트, (4)서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F18 검출용 프라이머 세트, (5)서열번호 9의 포워드 프라이머와 서열번호 10의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F41 검출용 프라이머 세트 및 상기 (1) 내지 (5) 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 5종 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 동시에 감별할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트에 관한 것이다.
대장균(Escherichia coli)은 사람을 포함해서 포유류의 장관을 기생장소로 하고 있는 장내세균으로, 통성혐기성 그람음성의 간균이며 글루코오스를 분해하여 산을 생산한다. 사람이나 동물의 분변에 오염된 외계에 널리 존재하기 때문에 음료수, 수영장이나 식품의 변질에 의한 오염을 검사하는 지표가 된다.
대장균은 여러 종류가 있으며 이중 병원성 대장균들은 수송, 온도변화 등과 같은 스트레스 인자가 있을 때 폭발적으로 증식하여 설사를 유발한다. 대장균의 대표적인 병원성 인자로는 장상피세포 부착에 관여하는 부착인자(adhesin)와 설사를 유발하는 독소(toxin)로 구분된다.
돼지(pig)에서 주로 질병을 유발하는 병원성 대장균의 섬모유전자로는 F4(K88), F5(K99), F6(987P), F18, F41 등이 관여하는 것으로 알려져 있다.
F4 섬모는 잘 휘어지는 성질이 있으며, 단백질의 특성에 따라 F4ab, F4ac, F4ad와 같이 3가지로 구분되어 있다. 이러한 F4 섬모단백질은 장독소형 대장균에서 빈번하게 발현된다. F4 단백질은 플라스미드(plasmid)에 있는 유전자(Fae)에 의해 생산이 조절되며, 이중 FaeG gene이 major gene으로 이 유전자의 변이에 따라 F4 단백질의 특성이 변하는 것으로 알려져 있다(Van den Boreck W, Cox E, Oudega B, Goddeeris BM. 2000. The F4 fimbrial antigen of Escherichia coli and its receptor. Veterinary Microbiology, 71, 223-244).
F5 섬모는 plasmid에 있는 Fan 유전자에 의해 발현되며, 주된 인자는 FanC이다. F5 섬모는 주로 포유기 설사병과의 연관성이 높은 것으로 알려져 있다.
F6 섬모도 plasmid 유래이며 주로 포유기 및 이유기 설사병 대장균에서 많이 분리되고 있다.
F18 섬모도 plasmid에 존재하는 Fad에서 발현된다. 이 섬모단백질은 Fad의 유전적 변이에 따라 F18ab 및 F18ac로 구분되고 있다. F18 섬모는 돼지의 이유 후 설사병 및 부종병을 유발하는 대장균에서 빈번히 분리되는 것으로 알려져 있다.
F41 유전자는 chromosome에 존재하며, 설사병 대장균에서 분리되나 다른 유전자에 비하여 검출빈도는 낮은 것으로 알려져 있다.
상기에서 언급한 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41들은 단독으로 질병을 일으키기 보다는 독소와 병행하여 질병을 일으킨다. 즉 독소를 산생하는 대장균일지라도 장내에 부착하지 못하면 병원성을 발현하기 이전에 분변으로 배출되기 때문에 독소유전자 뿐만 아니라 부착에 관여하는 섬모유전자도 병원성 대장균을 진단하는데 매우 중요한 유전자이다.
현재 전세계적으로 대장균증을 진단하는 방법은 설사발생 개체의 분변이나 소장에서 대장균을 분리하고 독소유전자와 함께 섬모유전자 등의 병원성 유전자가 증명되면 병원성 대장균에 의한 설사로 진단하고 있다. 그러나 독소유전자 및 섬모유전자의 종류가 다양하기 때문에 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 및 응집반응에 의한 검사는 시간과 비용이 많이 소모되어 일반실험실에서 사용하기 곤란하며, 따라서 최근에는 이러한 병원성 유전자를 검출하는 PCR법이 널리 사용되고 있다.
이에, 본 발명자들은 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 진단할 수 있는 특이적인 프라이머를 새롭게 제작하고, 상기 프라이머를 포함하는 키트(kit)를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시함으로써 가축의 대장균증을 신속, 정확하게 진단할 수 있도록 하였다. 특이도 및 민감도 등은 농림수산검역검사본부 동물질병표준진단법과 비교하였으며, 반응에 필요한 시약 등을 건조형태로 공급, 사용함으로써 진단능력은 동등하게 유지하면서 보관기간을 향상시켜 본 발명을 완성하였다.
한편 본 발명과 관련된 선행기술로써 한국공개특허 제1999-0081058호에 가축에서 설사를 일으키는 병원성 대장균의 신속 검출을 위한 멀티플렉스 PCR 기법(multiplex polymerase chain reaction-based method)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 4종의 섬모항원 각각에 대한 PCR 프라이머(primer)의 개발, 및 이들 프라이머들을 동시에 이용하는 대장균 섬모항원의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 PCR 기법을 나타내고 있다.
한국공개특허 제2002-0090257호에 인체에 치명적인 독성 유전자를 갖는 대장균 O-157:H7, O-20과 같은 장관출혈성 대장균(EHEC) 및 O-28과 같은 장독소원성 대장균(ETEC)에 의해서 유발되는 장염유발 대장균, 비병원성 대장균 및 수계오염지표가 되는 대장균군의 동시검출하기 위한 멀티플렉스 PCR용 프라이머들, 및 이를 포함하는 키트를 나타내고 있다.
한국공개특허 제2010-0028082호에 장독소형 대장균증 (Enterotoxigenic E.coli, ETEC)을 유발하는 병원성 인자들인 F1(Type1 pili), F4(K88), F5(K99), F6(987P), F18, F41, STa (Heat-stable toxin a), STb(Heat-stable toxin b), LT(Heat-labile toxin)에 대해 특이적인 프라이머를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 돼지 대장균 진단용 프라이머 세트를 나타내고 있다.
그러나 본 발명의 대장균 섬모유전자 감별을 위한 프라이머 세트, 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트와 상기 선행기술은 발명의 기술적 특징이 서로 상이하여 발명의 구성이 서로 다른 발명이다.
본 발명의 목적은 병원성 대장균의 5종 섬모유전자인 F4, F5, F6, F18, F41를 신속, 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 병원성 대장균의 5종 섬모유전자인 F4, F5, F6, F18, F41를 동시에 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트(PCR kit)를 제공하는 것으로서 보다 상세하게는 PCR 반응에 필요한 모든 시약이 1회 테스트 용량으로 혼합, 분주 및 건조되어 있어 숙련되지 않은 검사자라도 손쉽게 대장균 5종 섬모유전자인 F4, F5, F6, F18, F41을 진단할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트(PCR kit)를 제공하는 것이다.
본 발명은 (1)서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 대장균 섬모유전자 F4 검출용 프라이머 세트, (2)서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F5 검출용 프라이머 세트, (3)서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F6 검출용 프라이머 세트, (4)서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F18 검출용 프라이머 세트, (5)서열번호 9의 포워드 프라이머와 서열번호 10의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F41 검출용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 (1) 내지 (5) 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 동시에 감별할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 동시에 감별할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응으로 대장균의 섬모유전자 5종을 2시간 이내에 신속, 간편하게 검출할 수 있으며, 민감도가 높아 시료 내에 존재하는 미량의 섬모유전자를 검출할 수 있어 이를 가축에 적용시 빠른 시간에 가축의 설사병 원인을 진단할 수 있어 가축 사육 농가의 생산성 향상에 기여할 수 있다.
도 1은 액상형 PCR 혼합액과 본 발명품인 건조형 PCR 키트의 반응 양상을 비교하기 위하여 대장균 섬모유전자 DNA를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 결과이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1:액상형 PCR 혼합액, 2:본 발명품, N:negative control).
도 2는 본 발명품의 민감도를 측정한 결과이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:대장균 1×108∼1×102CFU/ml(각 lane별로 10진단계 희석), N:negative control).
도 3은 농림수산검역검사본부에서 사용하고 있는 동물질병표준검사법에 따른 다중 중합효소 연쇄반응의 민감도 측정 결과이다Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:대장균 1×108∼1×102CFU/ml(각 lane별로 10진단계 희석), N:negative control).
도 2는 본 발명품의 민감도를 측정한 결과이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:대장균 1×108∼1×102CFU/ml(각 lane별로 10진단계 희석), N:negative control).
도 3은 농림수산검역검사본부에서 사용하고 있는 동물질병표준검사법에 따른 다중 중합효소 연쇄반응의 민감도 측정 결과이다Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:대장균 1×108∼1×102CFU/ml(각 lane별로 10진단계 희석), N:negative control).
본 발명은 대장균 섬모유전자 감별을 위한 프라이머 세트, 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 나타낸다.
본 발명은 (1)서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 대장균 섬모유전자 F4 검출용 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 (2)서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F5 검출용 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 (3)서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F6 검출용 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 (4)서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F18 검출용 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 (5)서열번호 9의 포워드 프라이머와 서열번호 10의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F41 검출용 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 상기 (1)프라이머 세트 내지 (5)프라이머 세트를 이용하여 가축에 대한 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 감별할 수 있다.
본 발명은 상기 (1)프라이머 세트 내지 (5)프라이머 세트를 이용하여 돼지, 소, 닭, 오리 및/또는 염소 등의 가축에 대한 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 감별할 수 있다.
본 발명은 병원성 대장균의 섬모유전자 5종에 대해 F4 gene(GenBank accession No. M25302.1), F5 gene(GenBank accession No. M35282), F6 gene(GenBank accession No. M35257), F18 gene(GenBank accession No. AY970782), F41 gene(GenBank accession No. M21788)의 염기서열 사이에서 길이는 22∼23bp, Tm값은 60∼65℃가 되도록 염기서열을 선택하여 정방향 프라이머(Forward primer) 및 역방향 프라이머(Reverse primer)로 이루어진 프라이머 세트로 구성하였다(표 1 참조). Tm값은 MP primer 프로그램을 사용하여 체크하였다.
| 섬모유전자 | 염기서열 | 비고 |
| F4 | F : AGATAGCGCTGCAGGTGGAGGA | 서열번호 1 |
| R : AGCTCCCCGTCCGCAGAAGTAA | 서열번호 2 | |
| F5 | F : TGCGACTACCAATGCTTCTGCGA | 서열번호 3 |
| R : AGACGGAGCGCGGTCATCTTTT | 서열번호 4 | |
| F6 | F : CAGCGCCCGCTGAAAACAACAC | 서열번호 5 |
| R : GCCTGGGCGTTGTTGTCCTGAA | 서열번호 6 | |
| F18 | F : ATGCGCTCGAGTGTCGTGTGAG | 서열번호 7 |
| R : CTCGAAAACAATGGGCACCGACAA | 서열번호 8 | |
| F41 | F : ATCCGCAGGGGATGGTTTTGCG | 서열번호 9 |
| R : TCACCTGGTTGACCTTCCGTCCA | 서열번호 10 |
*상기 표 1에서 염기서열의 F는 정방향 프라이머(Forward primer)를 나타내며, R은 역방향 프라이머(Reverse primer)를 나타낸다.
상기 프라이머들은 각 target 별 정방향과 역방향으로 구성된 5세트의 프라이머들이 혼합된 multiplex PCR 형태로 사용 가능하다. 본 발명의 5종 프라이머들은 한 튜브에 혼합되어 있으며, 이들 프라이머들은 현재까지 보고된 병원성 대장균 유전자와는 교차반응이 없음을 확인하였다. 또한, 본 발명은 5종의 프라이머를 사용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하며 5종의 병원성 대장균 섬모유전자를 선택적으로 또는 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 (1)프라이머 세트 내지 (5)프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 선택적으로 감별할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 나타낸다.
본 발명은 상기 (1)프라이머 세트 내지 (5)프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 동시에 감별할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 나타낸다.
상기 5종 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 동시에 감별할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트는 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 검출할 수 있는 프라이머 외에 증폭용 완충용액, dNTP, 양성대조군, 검출 시약을 포함하며, 건조 상태로 제공되고, 반응에 영향이 없는 경우 목적에 따라 추가적인 성분 등을 포함할 수 있다. 건조 상태로 제공되는 상기 키트는 안정성이 향상되어 제품의 유효기간이 최소 1년 이상 가능하며, 2시간 이내에 정확한 결과를 얻을 수 있었다.
본 발명은 상기 (1)프라이머 세트 내지 (5)프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트에 의해 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 선택적으로 감별할 수 있는 방법을 나타낸다.
본 발명은 상기 (1)프라이머 세트 내지 (5)프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트에 의해 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 동시에 감별할 수 있는 방법을 나타낸다.
본 발명은 상기 (1)프라이머 세트 내지 (5)프라이머 세트를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트에 의해 가축에 대한 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 감별할 수 있다.
본 발명은 상기 (1)프라이머 세트 내지 (5)프라이머 세트를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트에 의해 돼지, 소, 닭, 오리 및/또는 염소 등의 가축에 대한 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 감별할 수 있다.
본 발명의 대장균 섬모유전자 감별을 위한 프라이머 세트, 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 대장균 섬모유전자 감별을 위한 프라이머 세트, 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 제공하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 주형 DNA 제조
다중 중합효소 연쇄반응을 실시하기 위해 먼저 주형 DNA를 추출하였다.
사용한 균주는 캐나다 몬트리올 대학의 OIE 대장균 표준연구실에서 제공받은 대장균 A, D, 1033 균주를 사용하였으며 혈액배지(Sheep blood agar plate, 아산제약(주), 한국)에 상기 균주를 접종한 후 37℃, 16시간 배양하였다. 그 후 콜로니를 채취하여 DNesay Blood & Tissue kit(Qiagen사제, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
DNA는 UV 분광도계로 농도와 순도를 측정한 다음 순도가 1.8∼2.0 것을 확인한 후 다중 중합효소 연쇄반응에서 주형 DNA로 사용하였다.
주형 DNA는 다중 중합효소 반응 시 사용하기 쉽도록 1X TE buffer(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)를 이용하여 10ng/㎕로 희석하여 다음 사용 시까지 -70℃에 보관하였다.
<실시예 2> 프라이머 디자인
병원성 대장균의 섬모유전자 5종에 대해 F4 gene(GenBank accession No. M25302.1), F5 gene(GenBank accession No. M35282), F6 gene(GenBank accession No. M35257), F18 gene(GenBank accession No. AY970782), F41 gene(GenBank accession No. M21788)의 염기서열 사이에서 길이는 22∼23bp, Tm값은 60∼65℃가 되도록 염기서열을 선택하여 정방향 프라이머(Forward primer) 및 역방향 프라이머(Reverse primer)로 이루어진 프라이머 세트로 구성하였다(표 2 참조). Tm값은 MP primer 프로그램을 사용하여 체크하였다.
| 섬모유전자 | 염기서열 | 비고 |
| F4 | F : AGATAGCGCTGCAGGTGGAGGA | 서열번호 1 |
| R : AGCTCCCCGTCCGCAGAAGTAA | 서열번호 2 | |
| F5 | F : TGCGACTACCAATGCTTCTGCGA | 서열번호 3 |
| R : AGACGGAGCGCGGTCATCTTTT | 서열번호 4 | |
| F6 | F : CAGCGCCCGCTGAAAACAACAC | 서열번호 5 |
| R : GCCTGGGCGTTGTTGTCCTGAA | 서열번호 6 | |
| F18 | F : ATGCGCTCGAGTGTCGTGTGAG | 서열번호 7 |
| R : CTCGAAAACAATGGGCACCGACAA | 서열번호 8 | |
| F41 | F : ATCCGCAGGGGATGGTTTTGCG | 서열번호 9 |
| R : TCACCTGGTTGACCTTCCGTCCA | 서열번호 10 |
*상기 표 2에서 염기서열의 F는 정방향 프라이머(Forward primer)를 나타내며, R은 역방향 프라이머(Reverse primer)를 나타낸다.
<실시예 3> 표준 주형 중합효소 연쇄반응
상기 실시예 2의 표 2에 기재된 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41에 대한 프라이머 세트를 각각 조합한 후 Gene Ampㄾ PCR system 9700(Applied Biosystem, USA)을 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 진행하였다.
상기 실시예 1에서 추출한 병원성 대장균의 DNA를 주형으로 하고, 실시예 2의 표 2에 기재된 5종의 대장균 섬모유전자 검출을 위해 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41에 대한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 한 세트로 각각 조합 후 병원성 대장균 주형을 첨가하여 다중 중합효소 연쇄반응을 실행하였다. 반응시간은 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 30초와 65℃에서 1분 30초씩 30 사이클, 72℃에서 5분간 반응시켰다.
<실시예 4> 건조형 PCR 조성물을 이용한 다중 중합효소 연쇄반응
상기 실시예 2 및 실시예 3과 같은 조성의 PCR 혼합액을 제조, 건조한 후 다중 중합효소 연쇄반응을 실행하였다. 이는 시약의 건조 조건에 의해 PCR 성능이 영향을 받지 않음을 확인하고 사용의 편리성 및 재현성이 향상된 대장균 섬모유전자 5종 진단용 키트를 제공하기 위함이다.
PCR 반응액은 기존 바이오니아 AccuPower Gold Multiplex PCR Premix(Cat K-2115)를 기본으로 target primer를 추가시켜 혼합한 후 96 well 플레이트에 분주하고, SuperCentra2(바이오니아, 한국)를 이용하여 60분간 건조하여 1차 건조물을 얻었다. 이후 상기 실시예 3에서 선택된 각 대장균의 섬모유전자 5종 프라이머를 총 용량 2㎕가 되도록 혼합 후 1차 건조물에 추가 분주하여 동결 건조(진공도 : -76cmHg)하였다. 건조된 PCR 조성물에 상기 실시예 1에서 추출한 병원성 대장균의 섬모유전자 DNA를 주형으로 첨가하고, 멸균증류수로 총 용량이 20㎕가 되도록 분주하여 건조물이 완전히 용해되도록 혼합하였다. Gene Ampㄾ PCR system 9700을 이용하여 상기 실시예 3과 동일한 조건으로 다중 중합효소 연쇄반응을 실시하였다(도 1 참조).
도 1에서 보듯이 액상형 PCR 혼합액과 건조형 PCR 키트를 사용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 비교한 결과 동등한 반응결과가 나타나 건조 조건에서도 영향을 받지 않음을 확인하였다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1:액상형 PCR 혼합액, 2:본 발명품, N:negative control).
<실시예 5> 본 발명품과 기존 검사법과의 민감도 비교
캐나다 대장균 표준연구실에서 분양받은 대장균 A, D, 1033 균주로 사용하여 실시예 3 및 실시예 4를 이용한 방법 및 동물질병표준검사법 중 대장균검사법(농림수산검역검사본부[(구)국립수의과학검역원], 2009년)과 민감도를 비교하였다.
본 발명품은 대장균 주형 DNA를 1X104 CFU/ml까지 검출이 가능하였으나(도 2 참조, Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:대장균 1×108∼1×102 CFU/ml(각 lane별로 10진단계 희석), N:negative control), 동물질병표준검사법(대장균의 섬모유전자와 독소인자를 모두 검출) 중 대장균 검사법은 1×105 CFU/ml까지 검출이 가능하였다(도 3 참조, Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:대장균 1×108∼1×102 CFU/ml(각 lane별로 10진단계 희석), N:negative control).
따라서 본 발명품이 기존 검사법보다 민감도가 10배 이상 우수하였다.
<실시예 6> 분리균주를 이용하여 발명품과 기존 검사법과의 진단효율 비교
농림수산검역검사본부 질병진단과에서 분리하여 보관중인 병원성 대장균 171주를 대상으로 본 발명품과 기존에 사용 중인 동물질병표준검사법과의 대장균 섬모 유전자 F4, F5, F6, F18 및 F41에 대한 진단효율을 상호 비교하였다.
하기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명품은 기존 검사법에 비하여 검출율이 동등 수준인 대장균 F41 섬모유전자의 진단효율을 제외하고, 나머지 4종 섬모유전자에 대해 진단효율이 향상되었음을 알 수 있었다.
| 섬모유전자 | 발명품 | 기존 검사법 | ||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | |
| F4 | 43 | 128 | 42 | 129 |
| F5 | 10 | 161 | 9 | 162 |
| F6 | 4 | 167 | 2 | 169 |
| F18 | 47 | 124 | 45 | 126 |
| F41 | 9 | 162 | 9 | 162 |
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은 5종의 대장균 섬모유전자 F4, F5, F6, F18, F41를 동시에 감별할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응으로 대장균의 섬모유전자 5종을 2시간 이내에 신속, 간편하게 검출할 수 있으며, 민감도가 높아 시료 내에 존재하는 미량의 섬모유전자를 검출할 수 있어 이를 가축에 적용시 빠른 시간에 가축의 설사병 원인을 진단할 수 있어 가축 사육 농가의 생산성 향상에 기여할 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA) )
BIONEER CORPORATION
<120> Primers for the simultaneous detection of F4, F5, F6, F18, F41 in
E. coli and ultiplex PCR kits using former primers
<130> 8809
<160> 10
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F4 gene Forward primer
<400> 1
agatagcgct gcaggtggag ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F4 gene Reverse primer
<400> 2
agctccccgt ccgcagaagt aa 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F5 gene Forward primer
<400> 3
tgcgactacc aatgcttctg cga 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F5 gene Reverse primer
<400> 4
agacggagcg cggtcatctt tt 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F6 gene Forward primer
<400> 5
cagcgcccgc tgaaaacaac ac 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F6 gene Reverse primer
<400> 6
gcctgggcgt tgttgtcctg aa 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F18 gene Forward primer
<400> 7
atgcgctcga gtgtcgtgtg ag 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F18 gene Reverse primer
<400> 8
ctcgaaaaca atgggcaccg acaa 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F41 gene Forward primer
<400> 9
atccgcaggg gatggttttg cg 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F41 gene Reverse primer
<400> 10
tcacctggtt gaccttccgt cca 23
Claims (10)
- 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 대장균 섬모유전자 F4 검출용 프라이머 세트를 포함하는 대장균 섬모유전자 검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F5 검출용 프라이머 세트;
서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F6 검출용 프라이머 세트;
서열번호 7의 포워드 프라이머와 서열번호 8의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F18 검출용 프라이머 세트; 및
서열번호 9의 포워드 프라이머와 서열번호 10의 리버스 프라이머로 이루어진 대장균 섬모유전자 F41 검출용 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균 섬모유전자 검출용 프라이머 세트. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하여 대장균 섬모유전자 F4를 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트.
- 제2항의 프라이머 세트를 포함하여 대장균 섬모유전자 F5, F6, F18, F41 중에서 선택된 어느 하나 이상 및 대장균 섬모유전자 F4를 검출할 수 있는 다중 중합효소 연쇄반응 키트.
- 제6항의 키트를 이용하여 가축으로부터 대장균 섬모유전자 F4를 검출하는 것을 특징으로 하는 대장균 섬모유전자의 검출방법.
- 제7항의 키트를 이용하여 가축으로부터 대장균 섬모유전자 F5, F6, F18, F41 중에서 선택된 어느 하나 이상 및 대장균 섬모유전자 F4를 검출하는 것을 특징으로 하는 가축으로부터 대장균 섬모유전자의 검출방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 가축은 돼지, 소, 닭, 오리 또는 염소인 것을 특징으로 하는 대장균 섬모유전자의 검출방법.
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| KR1020120061306A KR101533594B1 (ko) | 2012-06-08 | 2012-06-08 | 대장균 섬모유전자 감별을 위한 프라이머 세트, 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트 |
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| International Microbiology, Vol. 9, pages 53-60 (2006)* |
| Journal of Medical Microbiology, Vol. 61, pages 148-156 (ePub 2011.08) * |
| Journal of Medical Microbiology, Vol. 61, pages 148-156 (ePub 2011.08)* |
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