KR100979794B1 - 돼지 대장균 진단용 프라이머 세트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지 대장균 진단용 프라이머 세트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 장독소형 대장균증 (Enterotoxigenic E.coli, ETEC)을 유발하는 병원성 인자들인 F1(Type1 pili), F4(K88), F5(K99), F6(987P), F18, F41, STa (Heat-stable toxin a), STb(Heat-stable toxin b), LT(Heat-labile toxin)에 대해 특이적인 프라이머를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 돼지 대장균 진단용 프라이머 세트에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 장독소형 대장균의 9가지 병원성 인자에 대해 특이적인 프라이머 서열을 제공하는 것이다.

Description

돼지 대장균 진단용 프라이머 세트 {Diagnostic primer set for colibacillosis in pigs}
본 발명은 돼지 대장균 진단용 프라이머 세트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 장독소형 대장균증 (Enterotoxigenic E.coli, ETEC)을 유발하는 병원성 인자들인 F1(Type1 pili), F4(K88), F5(K99), F6(987P), F18, F41, STa (Heat-stable toxin a), STb(Heat-stable toxin b), LT(Heat-labile toxin)에 대해 특이적인 프라이머를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 돼지 대장균 진단용 프라이머 세트에 관한 것이다
대장균은 장내세균과(Enterobacteriaceae), 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 그람 음성의 단간균으로 포유동물을 비롯한 다양한 동물의 장관 내에 존재하는 정상 세균총 중의 하나이다. 대부분 비병원성으로 기회감염을 유발할 수 있으나, 일부 고병원성 균주는 사람을 비롯한 포유 동물에서 다양한 장 질환과 패혈증 등을 유발하는 것으로 밝혀져 있다. 이들 중 위장관계 질환을 일으키는 균주들을 병원성에 따라 크게 여섯 종류로 분류할 수 있다. 이들은 장독소형 대장균(Enterotoxigenic E.coli, ETEC), 장병원성 대장균(Enteropathogenic E.coli, EPEC), 장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC), 장응집성 대장균(Enteroaggregative E.coli, EAEC), 장침입성 대장균(Enteroinvacive E.coli, EIEC), 괴사소성 대장균(Necrotoxigenic E.coli, NTEC)이다. 이들 중 ETEC는 설사를 주증으로 하는 돼지 대장균증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 세균이나 바이러스에 의한 질병은 그 원인체를 밝히면 진단이 가능하지만, 대장균의 경우는 건강한 동물의 장내에 상재하기 때문에 대장균증을 진단하기 위해서는 대장균에 대한 검색보다는 대장균의 병원성 인자에 대한 검색이 이루어져야 한다.
장독소형 대장균증의 병원성 인자는 장점막에 부착소로서의 역할을 하는 섬모와 외독소인 장독소로 알려져 있다. 병원성 기전은 대장균이 섬모를 통하여 장점막 상피 세포에 부착하여 집락을 형성한 후, 한 종류 이상의 장독소를 생산하여 장내 삼투압과 전해질에 불균형을 초래하여 설사를 일으키는 것이다. ETEC가 갖고 있는 섬모는 F1, F4, F5, F6, F18, F41 등이 알려져 있으며, 장독소는 STa, STb, LT 등이 알려져 있다.
이들 병원성 인자들의 생성을 조사하기 위하여 여러가지 검출 기법들이 개발되어 사용되어 왔으나, 기존의 방법은 장독소와 섬모를 각기 다른 방법으로 검출하는 것으로, 여러 검출 기법들이 사용되며 시험 조건에 따라 결과에 차이를 나타낼 수 있어 객관적인 결과를 확인하기 어렵다. 예를 들어, 장독소의 경우 ST는 인퍼트 마우스 어세이(infant mouse assay) 법을, LT의 경우는 GM1-강글리오시드 ELISA(GM1-ganglioside ELISA)법을, 섬모는 그 종류에 따라서 각각 기니픽, 닭, 말, 사람 등의 적혈구를 이용하여 수동혈구 응집반응시험을 이용하여 실시하여 왔다. 최근에는 중합효소 연쇄 반응 기법을 이용한 유전적 진단 방법이 개발되어 이들 병원성 인자의 유전자를 진단하는 방법이 개발되고 있다. 그러나 이 역시 하나의 시료마다 여러 종류의 중합효소 연쇄 반응 기법을 사용하여 번거로우며, ETEC 병원성 인자 전반에 걸쳐 개발된 프라이머도 미미한 실정이다.
이에 본 발명자들은 보다 효과적으로 돼지 대장균증을 진단할 수 있는 방법을 연구하던 중, 장독소형 대장균의 대표적인 병원인자 9가지에 대해 특이적인 프라이머를 제작하고 이를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 신속하고 민감하게 돼지 대장균증을 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 장독소형 대장균의 9가지 병원성 인자에 대해 특이적인 프라이머를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 돼지 대장균 진단용 프라이머 세트에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 장독소형 대장균의 9가지 병원성 인자에 대해 특이적인 프라이머 서열을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장독소형 대장균의 9가지 병원성 인자에 대해 특이적인 프라이머를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 돼지 대장균증의 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 장독소형 대장균의 9가지 병원성 인자에 대해 특이적인 프라이머 서열을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 장독소형 대장균의 대표적 병원성 인자 9가지에 대해 특이적인 프라이머를 제작하고, 이를 이용하여 4종의 다중 중합효소 연쇄반응(섬모 진단 장치 1: fimA 및 fimH에 특이적인 프라이머 세트 이용, 섬모 진단 장치 2: F4 및 F18에 특이적인 프라이머 세트 이용, 섬모 진단 장치 3: F5, F6 및 F41에 특이적인 프라이머 세트이용 및 장독소 진단 장치: STa, STb 및 LT에 특이적인 프라이머 세트 이용)를 수행함으로써 신속하고 민감하게 돼지 대장균증을 진단하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 돼지 대장균증의 진단 방법에 대한 특이성을 확인하기 위해, 각 표적 유전자를 가지고 있는 표준균주를 대상으로 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하였다(실시예 1 참조). 그 결과, 표적 유전자를 가지고 있는 표준 균주에서만 특이적인 증폭산물을 확인할 수 있었으며, 유전자를 갖지 않은 대장균주에서는 전혀 증폭산물이 나타나지 않았다(도 1 내지 도 4 참조).
나아가, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 진단방법에 따라 돼지의 분변 또는 소장 내용물로부터 분리된 야외 분리주를 대상으로 하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과, 각 표적 유전자에 특이적인 증폭산물들을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
따라서, 본 발명의 진단방법은 돼지 대장균증을 보다 신속하고 민감하게 진단할 수 있도록 하므로 돼지 대장균증의 조속한 치료와 질병 확산의 방지에 큰 기여를 할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 돼지 대장균증 진단방법은 (a) 분석하고자 하는 핵산 시료를 fimA 및 fimH에 특이적인 프라이머 세트, F4 및 F18에 특이적인 프라이머 세트, F5, F6 및 F41에 특이적인 프라이머 세트, STa, STb 및 LT에 특이적인 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 선택된 프라이머 세트를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 유전자 산물의 크기를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 분석하고자 하는 핵산 시료는 자돈의 분변 또는 소장 내용물로부터 회수한 대장균으로부터 분리된 게놈 DNA 시료 일 수 있다.
핵산 시료를 분리하는 방법은 특별히 한정되지는 않으며, 당업계 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 단백질분해효소 첨가 및 열처리 방법 등을 사용할 수 있다. 또한, 시판되고 있는 DNA 추출용 키트를 사용할 수도 있다.
상기 프라이머는 장독소형 대장균의 9개의 병원성 인자의 핵산서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(oligonucletide)를 의미한다. 본 발명에서는 상기 9개의 병원성 인자의 핵산서열을 증폭할 수 있는 것이라면 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머가 본 발명의 프라이머 범위에 포함된다. 바람직하게는, 상기 프라이머로는 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
한편, 본 발명자들은 분석하고자 하는 핵산 시료 내에서 본 발명의 표적 유전자의 존재 여부를 용이하게 판정함으로써 고감도로 돼지 대장균증이 검출되도록 하기 위해 다중 중합효소 연쇄반응에서 발생하는 밴드 강도의 불균형으로 인해 유발되는 오류를 최소화할 수 있도록 PCR 증폭시의 반응시간, 반응온도 및 프라이머의 농도와 같은 PCR 반응조건을 최적화하였다.
따라서, 상기 (a) 단계에서 fimA 및 fimH에 특이적인 프라이머 세트의 경우 각각 0.2μM, F4 및 F18에 특이적인 프라이머 세트의 경우 각각 0.1 및 0.2μM, F5, F6 및 F41에 특이적인 프라이머 세트의 경우 각각 0.4, 0.36, 0.26μM, STa, STb 및 LT에 특이적인 프라이머 세트의 경우 각각 0.4, 0.36, 0.3μM 농도로 첨가하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (a) 단계에서 다중 중합효소 연쇄반응은 최초 변성을 95℃, 5분간 실시한 후, 변성 95℃, 30초, 어닐링 55℃, 30초, 신장 72℃, 1분으로 하여 35회 반복 수행한 다음, 마지막 신장을 72℃, 7분간 수행하는 것이 바람직하다.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계의 증폭 산물의 크기를 분석함으로써 각각의 표적 유전자의 존재 여부를 판정하는 단계이다. 증폭 산물의 크기 분석은 예컨대 아가로즈 젤 또는 아크릴아미드 젤을 이용한 전기영동에 의해 수행될 수 있다.
상기 (a) 단계의 증폭산물을 전기영동하고 생성된 밴드를 분자량 마커와 비교함으로써 상기 유전자들의 존재 여부를 판정할 수 있다.
증폭산물 내에 섬모 유전자 또는 장독소 유전자가 검출되는 경우 돼지 대장균증으로 판정할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따라 다중 중합효소 연쇄반응을 수행한 후 9 가지 병원성 인자 중 하나 이상 검출된 경우 돼지 대장균증으로 진단 할 수 있다. 단 F1 유전자의 경우는 fimA와 fimH 유전자가 모두 검출된 경우 돼지 대장균증으로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 F1, F4, F18, F5, F6, F41, STa, STb 및 LT에 특이적인 프라이머 서열을 제공한다.
바람직하게는 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 fimA에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 fimH에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 F4에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 F18에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 F5에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 F6에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 F41에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 염기서열로 이루어진 STa에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 STb에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 표시되는 염기서열로 이루어진 LT에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
이상, 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 진단방법은 신속하고 민감하게 돼지 대장균증을 진단할 수 있으므로 돼지 대장균증의 조속한 치료와 질병 확산의 방지에 큰 기여를 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 섬모 진단 장치 1에 의해 표준 균주를 진단한 결과이다.
M: 100bp 크기의 사이즈 마커
레인 1 및 레인 2: F1 양성 표준 균주(fimH+, fimA+)
레인 3: F1 음성 균주(fimH+, fimA-)
레인 4: 음성 대조군
도 2는 본 발명에 따른 섬모 진단 장치 2에 의해 표준 균주를 진단한 결과이다.
M: 100bp 크기의 사이즈 마커
레인 1: F4 양성 표준 균주
레인 2: F18 양성 표준 균주
레인 3: F4와 F18 양성균주의 혼합액
레인 4: 음성 대조군
도 3은 본 발명에 따른 섬모 진단 장치 3에 의해 표준 균주를 진단한 결과이다.
M: 100bp 크기의 사이즈 마커
레인 1: F5 양성 표준 균주
레인 2: F6 양성 표준 균주
레인 3: F41 양성 표준 균주
레인 4: F5와 F6 양성균주의 혼합액
레인 5: F5와 F41 양성균주의 혼합액
레인 6: F6과 F41 양성균주의 혼합액
레인 7: 음성 대조군
도 4는 본 발명에 따른 장독소 진단 장치에 의해 표준 균주를 진단한 결과이다.
M: 100bp 크기의 사이즈 마커
레인 1: STa 양성 표준 균주
레인 2: STb와 LT의 양성 표준 균주
레인 3: STa, STb와 LT의 양성 표준 균주
레인 4: 음성 대조군이다.
도 5는 본 발명에 따른 대장균증 진단 방법을 이용하여 야외 분리주를 진단한 결과이다.
M: 섬모 진단 장치 1의 결과(F1+),
레인 1~3: 섬모 진단 장치 2의 결과 (1F4+, 2F18+, 3F4+, F18+),
레인 4~7: 섬모 진단 장치 3의 결과 (4F5+, 5F6+, 6F41+, 7F5+, F6+, f41+)
레인 8~10 장독소 진단 장치의 결과 (8STa+, 9STb+, LT+, 10STa+, STb+, LT)
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
본 발명에 따른 돼지 대장균증 진단방법의 특이성 확인
<1-1> 사용균주
본 발명에 사용한 균주는 국립 수의 과학 검역원으로부터 분양 받은 F1, F4, F5, F6, F18, F41, STa, STb, LT 각각의 표준 균주를 사용하였다.
<1-2> 게놈 DNA의 분리
상기 <1-1>의 균주로부터 다음의 방법으로 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 표준균주를 TSB(Tryptic Soy Broth)에서 37℃, 18시간 동안 배양한 다음 집균하여 멸균 PBS로 2회 세척한 후 0.5ml의 3차 멸균 증류수에 재부유시켜 100℃에서 20분간 끓인 후, 14,000ⅹg로 5분간 원심분리한 다음 상등액을 취하여 두배 용량의 차가운 에탄올을 가하여 -20℃에서 24시간 방치하였다. 그 다음 12,000ⅹg (4℃)로 원심분리하여 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척 후 공기중에 건조(air dry)시킨 다음 멸균 증류수 50㎕에 부유시켜 이를 주형 DNA로 이용하였다.
<1-3> 프라이머 제작
본 발명의 방법에 따라 중합효소 연쇄 반응 기법을 이용하여 ETEC의 병원성 인자의 유전자 분포를 확인하기 위해 9가지 유전자(F1, F4, F18, F5, F6, F41, STa STb, LT)에 특이적인 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 유전자은행(Genbank)에서 얻은 정보를 바탕으로 작성하여 DNA 합성장치(synthesizer)를 이용하여 합성하였다(표 1).
프라이머 서열
중합효소
연쇄반응		 표적 유전자 올리고뉴클레오타이드 서열 유전자 산물의
증폭크기(bp)		 서열번호
섬모 진단 장치 1 fimA F; ACTGTGCAGTGGCAG 710 1
R; GTTATTTTTATCGCAGG 2
fimH F; ATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTG 903 3
R; TTATTGATAAACAAAAGTCACGCC 4
섬모 진단 장치 2 F4 F; GCCTGGATGACTGGTGATTT 715 5
R; TCTGACCGTTTGCAATACCC 6
F18 F; CTTTCACATTGCGTGTGGAG 441 7
R; ATTCGACGCCTTAACCTCCT 8
섬모 진단 장치 3 F5 F; TTGGGCAGGCTGCTATTAGT 222 9
R; TAGCACCACCAGACCCATTT 10
F6 F; GCGTGCATCGAAATGAGTT 589 11
R; GGTGGTTCCGATGTATGCTT 12
F41 F; GGAGCGGGTCATATTGGTAA 941 13
R; CTGCAGAAACACCAGATCCA 14
장독소 진단 장치 STa F; GAAACAACATGACGGGAGGT 229 15
R; GCACAGGCAGGATTACAACA 16
STb F; CCTACAACGGGTGATTGACA 480 17
R; CCGTCTTGCGTTAGGACATT 18
LT F; GGTTTCTGCGTTAGGTGGAA 605 19
R; GGGACTTCGACCTGAAATGT 20
<1-4> 다중 중합효소 연쇄 반응
상기 실시예 <1-2>의 표준 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 실시예 <1-3>의 프라이머를 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. ETEC의 병원성 인자인 9가지 유전자를 진단하기 위하여 총 4종류의 다중 중합효소 연쇄 반응 기법을 개발하였으며, 각각을 섬모 진단 장치 1, 섬모 진단 장치 2, 섬모 진단 장치 3, 장독소 진단 장치라 명명하였다. 섬모 진단 장치 1은 F1을 진단하는 것으로, fimH, fimA 유전자를, 섬모 진단 장치 2는 F4와 F18을, 섬모 진단 장치 3은 F5, F6과 F41을 표적으로 한다. 장독소 진단 장치는 STa, STb와 LT를 표적으로 한다.
중합효소 연쇄 반응 기법의 반응액은 10ⅹPCR 버퍼, 1mM dNTP, 1.5mM MgCl2, 2.5U Taq 중합효소, 프라이머, 1㎕ 주형 DNA를 넣어 최종 반응량이 50㎕가 되게 하였다. 프라이머의 농도는 각 장치마다 다르며, 이는 표 2에 나타낸 바와 같다. 중합효소 연쇄 반응 조건은 최초 변성을 95℃, 5분간 실시한 후, 변성 95℃, 30초, 어닐링 55℃, 30초, 신장 72℃, 1분으로 하여 35회 반복 실시한 다음, 마지막 신장을 72℃, 7분간 실시하였다. 이는 각 장치마다 동일하다.
프라이머 농도
중합효소 연쇄반응 표적 유전자 프라이머 농도(μM)
섬모 진단 장치 1 fim A 0.2
fim H 0.2
섬모 진단 장치 2 F4 0.1
F18 0.2
섬모 진단 장치 3 F5 0.4
F6 0.36
F41 0.26
장독소 진단 장치 STa 0.4
STb 0.36
LT 0.3
증폭된 산물을 10ㅧ로딩 버퍼와 혼합하여 1.5% 아가로스 겔, 0.5×TAE 버퍼하에서 90V, 1시간 동안 전기 영동 실시 후 EtBr 용액(1㎕/ml in D.W.)에서 염색한 후 자외선 투사 조명기(UV transilluminator)를 이용하여 관찰 후 폴라로이드 카메라로 사진촬영을 실시하였다.
실험 결과, 각 표적 유전자를 가지고 있는 표준균주에서만 특이적인 증폭산물을 확인할 수 있었으며, 각 유전자를 갖지 않은 대장균주에서는 전혀 증폭산물이 나타나지 않았다. 따라서 본 발명의 방법에 따라 제작된 프라이머가 특이성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 섬모 진단 장치 1에 의해 F1 양성 표준 균주(fimH+, fimA+) 및 F1 음성 균주(fimH+, fimA-)를 진단한 결과 F1 양성 표준 균주에서만 fimH와 fimA가 모두 증폭되었음을 확인할 수 있었다(도 1).
또한, 섬모 진단 장치 2에 의해 F4 양성 표준 균주, F18 양성 표준 균주 및 F4와 F18 양성균주의 혼합액을 진단한 결과, F4 양성 표준 균주에서는 F4 유전자만이 특이적으로 증폭되고, F18 양성 표준 균주에서는 F18 유전자만이 특이적으로 증폭되었으며 F4와 F18 양성균주 혼합액에서는 F4 및 F18 유전자가 모두 증폭되었다(도 2).
또한, 섬모 진단 장치 3에 의해 F5 양성 표준 균주, F6 양성 표준 균주, F41 양성 표준 균주, F5 및 F6 양성 균주 혼합액, F5 및 F41 양성균주 혼합액, F6 및 F41 양성 균주 혼합액을 진단한 결과 각각의 유전자를 가지고 있는 균주에서만 특이적으로 증폭된 유전자 산물이 검출되었다(도 3).
마지막으로 장독소 진단 장치에 의해 STa 양성 표준 균주, STb와 LT의 양성균주 혼합액, STa, STb 및 LT의 양성균주 혼합액을 진단한 결과, STa 양성 표준 균주에서는 STa 유전자 만이 증폭되었고 STb와 LT의 양성균주 혼합액에서는 STb와 LT가 증폭되었으며 STa, STb 및 LT의 양성균주 혼합액에서는 STa, STb 및 LT가 모두 증폭되었다(도 4).
<실시예 2>
본 발명에 따른 돼지 대장균증 진단방법의 야외 분리주에 대한 적용
<2-1> 사용균주
본 발명자들에 의해 2002~2006년, 전국 각 지방의 돼지 중 설사를 일으킨 개체로부터 분리한 266주의 야외균주를 사용하였다. 설사돈에서의 대장균의 분리 및 동정은 멸균면봉을 사용하여 설사 자돈의 직장내에서 분변을 채취하거나, 소장 내용물을 채취하여 탈섬유한 5%의 면양 혈액을 포함한 혈액배지에 접종한 후 37℃에서 18시간 배양 후 대장균의 전형적인 형태를 나타내고 대장균이 순수 분리 또는 우세 집락으로 나타나는 경우에 이들 집락을 선발하여 맥콩키 아가(MacConkey agar)와 EMB 아가에서 배양성상을 확인한 다음, IMViC 시험을 하여 인돌(Indole) 양성, 메틸레드(Methyl red) 양성, 보게스-프로스카우에(Voges-Proskauer) 음성, 사이트레이트 음성을 나타낸 균주를 선발하였다. 이후 미생물 자동 동정 장치인 VITEK 시스템 (bioMerieux Vitek Inc. Hazelwood, MO, USA)을 이용하여 최종 동정한 후 공시하였다.
<2-2> 다중 중합효소 연쇄반응
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <2-1>의 야외 분리주로 부터 게놈 DNA를 분리하고 실시예 <1-4>와 동일한 방법으로 4종류(섬모 진단 장치 1, 섬모 진단 장치 2, 섬모 진단 장치 3 및 장독소 진단 장치)의 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
실험 결과, F1은 147주, F4는 15주, F5는 21주, F6은 16주, F18은 4주, F41은 5주, STa는 18주, STb는 12주, LT는 12주에서 특이 증폭산물을 확인할 수 있었으며 전체 분리주 중 약 66%의 분리주가 ETEC로 진단되었다(도 5).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (1)

  1. 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 염기서열로 이루어진 STa에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 STb에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 19 및 서열번호 20으로 표시되는 염기서열로 이루어진 LT에 특이적인 프라이머 세트로 구성된 것을 특징으로 하는 다중 중합 효소 연쇄 반응을 통한 돼지 대장균 진단용 프라이머 세트.
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