KR102369308B1 - 살모넬라 타이피무리움, 살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 톰프슨의 동시 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트 - Google Patents

살모넬라 타이피무리움, 살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 톰프슨의 동시 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것으로, 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis), 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)을 현저히 낮은 위양성 발생 빈도로 신속하게 검출할 수 있다.

Description

살모넬라 타이피무리움, 살모넬라 엔테리티디스 및 살모넬라 톰프슨의 동시 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트 {Primer sets for detecting Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Thompson and polymerase chain reaction kit thereof}
본 발명은 살모넬라 검출용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 살모넬라 여러 혈청중 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것이다.
살모넬라는 장내세균과 살모넬라속(Salmonella)에 속하는 프로테오박테리아의 일종이다. 막대 모양의 세균으로, 직경이 약 0.7~1.5 μm, 길이가 약 2~5 μm 정도의 크기로, 주로 사람이나 동물의 소화관에 서식한다. 살모넬라는 식중독 원인균으로 오염된 계란, 쇠고기, 가금육, 우유가 주요 원인이며, 복통·설사·구토·발열 등의 위장장애를 일으킨다.
살모넬라(Salmonella) 속 미생물은 지질다당류인 O 항원과 편모 H 항원 두개로 판정되는 2,500개 이상의 항원형이 존재한다. 이러한 살모넬라균이 집단 식중독을 일으키면, 무엇보다 신속하고 정확하게 원인균의 혈청형(serotype)을 가려내는 게 중요하다.
한편, 현재까지 식중독 세균 (food poisoning bacteria)의 탐지법 중에 가장 많이 사용되어 온 방법은 배양법 (culture-based method)으로, 정확도는 높지만, 많은 샘플을 동시에 처리하기가 어려우며, 최소 24시간 이상의 농화배양(enrichment culture)을 필요로 하고, 농화배양 후에도 선택 배양, 항혈청응집반응까지를 필요로 한다. 이러한 전통적인 배양법은 노동 집약적이며 많은 시간이 소요된다는 단점이 있다.
최근에 상기와 같은 배양을 이용한 방법 (culture-based method)을 대체하는 방법으로, 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 및 항체를 이용한 면역학적 탐지법이 개발되었다. 면역학적 방법은 실험과정이 간편한 반면, 민감도가 낮은 단점이 있다. 중합효소연쇄반응, 특히 다중중합효소연쇄반응 (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)은 다수의 타겟을 동시에 탐지할 수 있는 장점을 갖고 있지만 다중중합효소연쇄반응을 포함한 전통적인 중합효소연쇄반응방법 역시 증폭 산물 (product)의 분석을 위한 전기영동 (gel electrophoresis) 과정을 필요로 하여, 시간이 많이 소모되고 노동 집약적이다.
그런데, 실시간중합효소연쇄반응 (real-time polymerase chain reaction, Real-Time PCR)은 증폭 산물 (product)로부터 발생하는 형광의 강도(세기)를 탐지하는 방법으로써, 전통적인 중합효소연쇄반응방법에 비해 더 신속하고 민감하게 결과를 확인할 수 있으며 분석이 매우 간단한 장점이 있다. 또한, 증폭 산물을 분석하기 위한 전기영동 (gel electrophresis), DNA간 혼성 (DNA-DNA hybridization), 시퀀싱 (sequencing)과 같은 추가적인 실험이 필요하지 않는 장점도 있다.
대한민국 공개특허 제10-2013-0137781호 (공개일자 2013.12.18)에는, 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형을 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 살모넬라 공통 유전자 검출과 3종의 살모넬라 혈청형 진단방법이 기재되어 있다. 대한민국 공개특허 제10-2013-0055040호 (공개일바 2013.05.28)에는, 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella Pullorum)의 4종의 살모넬라를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법이 기재되어 있다.
본 발명은 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis), 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)을 Salmonella spp.로부터 구분 검출할 수 있는 Real-time PCR kit를 개발하여 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 실험 방법이 까다롭고, 위양성 발생 빈도가 잦은 살모넬라 (Salmonella) 항혈청 응집반응 검사를 보완한 신속검출법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium)의 검출을 위한 프라이머 세트 (a); 서열번호 4에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 5에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis)의 검출을 위한 프라이머 세트 (b); 서열번호 7에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 8에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)의 검출을 위한 프라이머 세트 (c); 및 서열번호 10에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 11에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 (Salmonella spp.)의 검출을 위한 프라이머 세트 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트를 제공한다.
한편, 상기 본 발명의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)일 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 (a)는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 (b)는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋으며, 상기 프라이머 세트 (c)는, 바람직하게 서열번호 9에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 (d)는, 서열번호 12에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋다.
한편, 상기 본 발명의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트에 있어서, 상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료 (fluorescence dye)로 FAM이 태깅 (tagging)되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 BHQ1이 태깅되어 있는 것이 좋으며, 상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료로 NED가 태깅되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 MGB가 태깅되어 있는 것이 좋으며, 상기 서열번호 9에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료로 Cy5가 태깅되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 BHQ2가 태깅되어 있는 것이 좋으며, 상기 서열번호 12에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료로 VIC가 태깅되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 MGB가 태깅되어 있는 것이 좋다.
본 발명에 의할 경우, 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis), 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)을 현저히 낮은 위양성 발생 빈도로 신속하게 검출할 수 있다.
도 1은 Salmonella Serotype Real-time PCR kit의 최소 검출한계 검증 실험 결과 그래프이다.
도 2는 식품샘플을 이용한 Salmonella Serotype Real-time PCR kit 결과 (위: 식용란, 아래: 난황)이다.
본 발명에서는, 식중독균으로 알려진 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)을 동시에 용이하게 분리 검출할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 노력하였으며, 그 결과 이들 3개의 균을 각각 다른 살모넬라균과 간섭없이 (위양성 없이) 검출할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였다.
본 발명은 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium)의 검출을 위한 프라이머 세트 (a); 서열번호 4에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 5에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis)의 검출을 위한 프라이머 세트 (b); 서열번호 7에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 8에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)의 검출을 위한 프라이머 세트 (c); 및 서열번호 10에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 11에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 (Salmonella spp.)의 검출을 위한 프라이머 세트 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 타이피무리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 톰프슨 (Salmonella Thompson)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.
상기 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 간섭없이 이들 3개의 균주가 검출됨이 확인되었다.
한편, 본 발명은 상기 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응용 키트를 제공한다. 상기 본 발명에서 개발한 프라이머 세트는 PCR에 사용되는데, 검체를 대상으로 하여 PCR을 수행할 경우, 상기 3개의 균주를 검출할 수 있게 된다. PCR용 키트에는 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트 외에 버퍼, dNTP 등이 첨가될 수 있는데, 이는 공지의 것을 특별한 것에 한정하지 않고 사용할 수 있으므로, 이에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응용 키트에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응(Real-time PCR, RT-PCR)인 것이 좋다. RT-PCR을 수행하면, 연쇄중합반응 결과 산물을 실시간에 정량적으로 확인할 수 있어, 현장에서 병원성 미생물의 감염을 즉시 확인할 수 있는 장점이 있다.
한편, 상기 본 발명의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 (a)는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 (b)는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋으며, 상기 프라이머 세트 (c)는, 바람직하게 서열번호 9에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 (d)는, 서열번호 12에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋다. 이때, 상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료 (fluorescence dye)로 FAM이 태깅 (tagging)되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 BHQ1이 태깅되어 있는 것이 좋으며, 상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료로 NED가 태깅되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 MGB가 태깅되어 있는 것이 좋으며, 상기 서열번호 9에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료로 Cy5가 태깅되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 BHQ2가 태깅되어 있는 것이 좋으며, 상기 서열번호 12에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료로 VIC가 태깅되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 MGB가 태깅되어 있는 것이 좋다. 일반적인 Real time PCR 기기의 경우, 4-5개의 형광값을 읽을 수 있는 channel이 존재한다. 동일한 Channel에서 읽을 수 있는 형광물질로 태깅할 경우, 형광물질 간 간섭현상으로 인해 결과값의 이상을 초래할 수 있는데, 각 4개의 형광 channel을 대표할 수 있는 형광물질로 상기와 같이 선정하여 간섭현상을 최소화하였다.
상기와 같은 형광염료의 태깅에 의해, 타겟 살모넬라의 감염 여부를 형광 분석기를 통해 확인할 수 있는데, 본 발명에서 타겟 살모넬라들에 대해 사용한 상기 형광염료 조합에 의해, 검출 감도를 높일 수 있다.
한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응용 키트에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2에 기재된 프라이머 및 서열번호 3에 기재된 탐침은, 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위한 워킹볼륨 20 μl에 대해, 각각 2, 2, 1 pM의 농도로 첨가되어 사용되는 것이 좋고, 상기 서열번호 4, 서열번호 5에 기재된 프라이머 및 서열번호 6에 기재된 탐침은, 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위한 워킹볼륨 20 μl에 대해, 각각 2, 2, 1.5 pM의 농도로 첨가되어 사용되는 것이 좋으며, 상기 서열번호 7, 서열번호 8에 기재된 프라이머 및 서열번호 9에 기재된 탐침은, 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위한 워킹볼륨 20 μl에 대해, 각각 2, 2, 1 pM의 농도로 첨가되어 사용되는 것이 좋고, 상기 서열번호 10, 서열번호 11에 기재된 프라이머 및 서열번호 12에 기재된 탐침은, 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위한 워킹볼륨 20 μl에 대해, 각각 2, 2, 1 pM의 농도로 첨가되어 사용되는 것이 좋다. 이와 같은 처리 농도 및 첨가량을 사용할 경우, 타겟 미생물들의 검출 감도를 더욱 유사하게 맞출 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
본 발명에서는 Whole genome sequences를 이용한 Comparative genomics 분석을 통해 타깃하는 균주 만을 증폭할 수 있는 유전자 마커(gene marker)를 발굴하였다. 또한, 본 발명에서는 41가지 혈청형, 52주의 살모넬라(Salmonella)에 대해 특이도 검증시험 수행 및 타사 제품과 비교를 수행하였다. 아울러, 최소 검출 한계 테스트를 수행하였고, 식품 적용 실험도 수행하였다.
[실시예 1: Salmonella Serotype Real-time PCR kit 개발]
본 실시예에서는 Salmonella Typhimurium NCCP 16207, Salmonella Enteritidis NCCP 12243, Salmonella Thompson NCCP 13578에 대해 각각 특이적인 프라이머세트를 제작하였고, 이들 3종에 대한 프라이머세트를 모두 포함하는, Salmonella Serotype Real-time PCR kit를 개발하였다 (표 1). Salmonella spp. 검출 프라이머 세트는 일종의 대조군으로서, 위 세 가지 살모넬라 혈청형 이외에도 모든 혈청형에 해당하는 살모넬라 균까지 검출하기 위함이다.
Salmonella Serotype Real-time PCR kit의 primer 및 probe 정보
Target Sequence (5'-3') 서열번호
Salmonella
Typhimurium		 Forward primer GGA AGG CAA GGA TTG GAT A 1
Reverse primer GCT GCT TTA AAT GAG TAA GAG TA 2
Probe FAM TCC AGC CAT CAT CAG CGT AAG AAC C BHQ1 3
Salmonella
Enteritidis		 Forward primer TCC AGA ACT CTT GTT GCA 4
Reverse primer CTC CAT CAG TTT CAA CAA TGA 5
Probe NED CGC ATA TGA CAG GTC AAT AAC AGC CG MGB 6
Salmonella
Thompson		 Forward primer AGG CTC AAC ATA GTG CTA TA 7
Reverse primer CAC ACC ACA CAT ATC TTC ATA 8
Probe CY5 TAA TGA TGC GAC ACC TTG CCT ACC A BHQ2 9
Salmonella
spp.		 Forward primer GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC 10
Reverse primer CGA ATT GCC CGA ACG TGG CGA 11
Probe VIC CTC TTT CGT CTG GCA TTA TCG ATC AGT ACC AG MGB 12
[실험예 1: 상기 실시예 1에서 제작한 Salmonella Serotype Real-time PCR kit의 위양성 검증 실험]
상기 실시예 1에서 제작한 Salmonella spp. 및 Salmonella Typhimurium, Salmonella Thompson, Salmonella Enteritidis의 유전자 마커가 Real-time PCR 진행 시, 대상 균주만 특이적으로 증폭하는지 여부를 확인하기 위한 검증 실험을 진행하였다.
Real-time PCR은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 후 95℃ 11초, 60℃ 1분을 40 cycles 수행하였다.
그 결과는 하기 표 2 및 표 3과 같았다. 증폭 정도는 표적 유전자의 역치 주기수(Ct value)를 확인하여 예측할 수 있는데, Ct value가 10~35 사이일 때 검출이 되었다고 판단할 수 있다.
본 발명 Salmonella Serotype Real-time PCR kit 위양성 검증실험 결과
No. Strain Strain number Ct value
S. Typhimurium gene marker S. Enteritidis gene marker S. Thompson gene marker S. spp. gene marker
1 Salmonella Typhimurium NCCP 16207 12 N/A N/A 16
2 Salmonella Typhimurium LT2 11 N/A N/A 16
3 Salmonella Typhimurium DT-104 11 N/A N/A 17
4 Salmonella Typhimurium ATCC 19585 12 N/A N/A 18
5 Salmonella Typhimurium ATCC 43971 12 N/A N/A 18
6 Salmonella Enteritidis NCCP 12236 N/A 18 N/A 17
7 Salmonella Enteritidis NCCP 12243 N/A 18 N/A 17
8 Salmonella Enteritidis NCCP 14544 N/A 20 N/A 18
9 Salmonella Enteritidis NCCP 14545 N/A 19 N/A 17
10 Salmonella Enteritidis NCCP 14547 N/A 19 N/A 16
11 Salmonella Enteritidis NCCP 14771 N/A 18 N/A 17
12 Salmonella Enteritidis NCCP 16206 N/A 18 N/A 17
13 Salmonella Thompson NCCP 13578 N/A N/A 16 17
14 Salmonella Dublin NCCP 12232 N/A N/A N/A 17
15 Salmonella Newport NCCP 12235 N/A N/A N/A 17
16 Salmonella Typhi NCCP 13699 N/A N/A N/A 18
17 Salmonella Typhi NCCP 14641 N/A N/A N/A 18
18 Salmonella Paratyphi A NCCP 14759 N/A N/A N/A 17
19 Salmonella Paratyphi B NCCP 12204 N/A N/A N/A 16
20 Salmonella Poona NCCP 10143 N/A N/A N/A 16
21 Salmonella Stanley NCCP 16330 N/A N/A N/A 17
22 Salmonella Montevideo NCCP 10140 N/A N/A N/A 17
23 Salmonella Rissen NCCP 13709 N/A N/A N/A 16
24 Salmonella Elisabethville NCCP 14030 N/A N/A N/A 17
25 Salmonella Isangi NCCP 14031 N/A N/A N/A 16
26 Salmonella Othmarschen NCCP 13706 N/A N/A N/A 14
27 Salmonella Aberdeen NCCP 10142 N/A N/A N/A 18
본 발명 Salmonella Serotype Real-time PCR kit 위양성 검증실험 결과
No. Strain Strain number Ct value
S. Typhimurium gene marker S. Enteritidis gene marker S. Thompson gene marker S. spp. gene marker
28 Salmonella Give NCCP 13696 N/A N/A N/A 17
29 Salmonella Havana NCCP 12216 N/A N/A N/A 18
30 Salmonella Singapore NCCP 12218 N/A N/A N/A 17
31 Salmonella Braenderup NCCP 13570 N/A N/A N/A 18
32 Salmonella Hadar NCCP 13571 N/A N/A N/A 18
33 Salmonella Bardo NCCP 13572 N/A N/A N/A 18
34 Salmonella Brandenburg NCCP 12835 N/A N/A N/A 17
35 Salmonella Essen NCCP 13569 N/A N/A N/A 16
36 Salmonella Kentucky NCCP 11686 N/A N/A N/A 17
37 Salmonella Lindenberg NCCP 11687 N/A N/A N/A 17
38 Salmonella Livingstone NCCP 11688 N/A N/A N/A 17
39 Salmonella Muenchen NCCP 11692 N/A N/A N/A 17
40 Salmonella Nchanga NCCP 11693 N/A N/A N/A 17
41 Salmonella Nigeria NCCP 11695 N/A N/A N/A 16
42 Salmonella Newington NCCP 10894 N/A N/A N/A 18
43 Salmonella Weltevreden NCCP 12239 N/A N/A N/A 17
44 Salmonella Istanbul NCCP 11684 N/A N/A N/A 17
45 Salmonella London NCCP 10357 N/A N/A N/A 17
46 Salmonella Bradford NCCP 11676 N/A N/A N/A 17
47 Salmonella Manhattan NCCP 12242 N/A N/A N/A 18
48 Salmonella Panama NCCP 12214 N/A N/A N/A 17
49 Salmonella Cerro NCCP 12215 N/A N/A N/A 18
50 Salmonella Derby NCCP 12238 N/A N/A N/A 16
51 Salmonella Agona NCCP 12231 N/A N/A N/A 16
52 Salmonella Infantis NCCP 12233 N/A N/A N/A 17
검증실험 결과, 타깃하는 균주만 특이적으로 증폭하는 것을 확인할 수 있었다. 타깃 균주를 제외한 균주에서는 40 cycle 이내 위양성 결과가 검출되지 않았다.
[실험예 2: 타사 Salmonella serotype multiplex Real-time PCR kit ( Salmonella spp., S. Typhimurium, S. Enteritidis)의 위양성 검증 실험]
타사 Salmonella serotype multiplex Real-time PCR kit (Salmonella spp., S. Typhimurium, S. Enteritidis)의 특이도 확인하기 위해 제품 protocol에 맞게 Real-time PCR을 수행하였다.
Real-time PCR은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 후 95℃ 11초, 60℃ 1분을 40 cycles 수행하였다.
그 결과는 하기 표 4 및 5와 같았다.
타사의 Salmonella Serotype Real-time PCR kit 위양성 검증실험 결과
No. Strain Strain number Ct value
S. Typhimurium gene marker S. Enteritidis gene marker
1 Salmonella Typhimurium NCCP 16207 16 N/A
2 Salmonella Enteritidis NCCP 12243 N/A 17
3 Salmonella Thompson NCCP 13578 N/A N/A
4 Salmonella Dublin NCCP 12232 N/A N/A
5 Salmonella Newport NCCP 12235 N/A N/A
6 Salmonella Typhi NCCP 13699 29 N/A
7 Salmonella Paratyphi A NCCP 14759 N/A N/A
8 Salmonella Paratyphi B NCCP 12204 N/A N/A
9 Salmonella Poona NCCP 10143 34 N/A
10 Salmonella Stanley NCCP 16330 N/A N/A
11 Salmonella Montevideo NCCP 10140 N/A N/A
12 Salmonella Rissen NCCP 13709 N/A N/A
13 Salmonella Elisabethville NCCP 14030 35 N/A
14 Salmonella Isangi NCCP 14031 N/A N/A
15 Salmonella Othmarschen NCCP 13706 N/A N/A
16 Salmonella Aberdeen NCCP 10142 N/A N/A
17 Salmonella Give NCCP 13696 34 N/A
18 Salmonella Havana NCCP 12216 N/A N/A
19 Salmonella Singapore NCCP 12218 N/A N/A
20 Salmonella Braenderup NCCP 13570 N/A N/A
타사의 Salmonella Serotype Real-time PCR kit 위양성 검증실험 결과
No. Strain Strain number Ct value
S. Typhimurium gene marker S. Enteritidis gene marker
21 Salmonella Hadar NCCP 13571 N/A N/A
22 Salmonella Bardo NCCP 13572 N/A N/A
23 Salmonella Brandenburg NCCP 12835 35 N/A
24 Salmonella Essen NCCP 13569 N/A 17
25 Salmonella Kentucky NCCP 11686 N/A N/A
26 Salmonella Lindenberg NCCP 11687 N/A N/A
27 Salmonella Livingstone NCCP 11688 N/A N/A
28 Salmonella Muenchen NCCP 11692 N/A N/A
29 Salmonella Nchanga NCCP 11693 N/A N/A
30 Salmonella Nigeria NCCP 11695 N/A N/A
31 Salmonella Newington NCCP 10894 N/A N/A
32 Salmonella Weltevreden NCCP 12239 N/A N/A
33 Salmonella Istanbul NCCP 11684 N/A N/A
34 Salmonella London NCCP 10357 35 N/A
35 Salmonella Bradford NCCP 11676 N/A N/A
36 Salmonella Manhattan NCCP 12242 N/A N/A
37 Salmonella Panama NCCP 12214 35 N/A
38 Salmonella Cerro NCCP 12215 N/A N/A
39 Salmonella Derby NCCP 12238 35 N/A
40 Salmonella Agona NCCP 12231 N/A N/A
41 Salmonella Infantis NCCP 12233 N/A N/A
41주의 Salmonella 혈청형 균주에 대한 특이도 검증시험 결과, S. Typhimurium gene marker에서는 Salmonella Typhi 등 8개의 혈청형에서 위양성이, S. Enteritidis gene marker에서는 Salmonella Essen 1개의 혈청형에서 위양성이 검출되었다.
[실험예 3: 본 발명 Salmonella Serotype Real-time PCR kit의 최소 검출한계 검증 실험]
상기 실시예 1의 gene marker primer 및 probe로 Real-time PCR 수행 시, 최소 검출 가능한 균수를 측정하는 검증 실험을 진행하였다.
Applied Biosystems사의 ABI 7500 FAST 장비를 사용하였다. S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Thompson 각각 배양 및 DNA 분리 후, 혼합, 십진희석하여 Real-time PCR 수행하였다.
Real-time PCR은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 후 95℃ 11초, 60℃ 1분을 40 cycles 수행하였다.
검증 실험 결과 (도 1), 모든 gene marker가 101~2 CFU/ml 수준의 검출한계를 나타내었다. 초기 균 농도는, 3반복 실험 평균값으로, S. Typhimurium 3.2×109 CFU/ml, S. Enteritidis 4.5×109 CFU/ml, S. Thompson 2.1×109 CFU/ml로 확인되었다.
도 1은 Salmonella Serotype Real-time PCR kit의 최소 검출한계 검증 실험 결과 그래프이다. 102 CFU/ml의 균농도에 해당하는 DNA 혼합액에서 S. Typhimurium , S. Enteritidis, S. Thompson, Salmonella spp. marker는 각각 Ct value 32.8, 34.2, 33.9, 32.3으로 검출되었다 (20 반복 후 Ct value임). 10 CFU/ml의 균농도에 해당하는 DNA 혼합액에서 Salmonella spp. marker는 Ct value 33.9 (20 반복 후 Ct value임)로 검출되었다. 두 실험 모두 20 반복 진행하여 모두 검출되어야 검출가능한 것으로 실험하였다. 따라서 모든 gene marker가 101~2 CFU/ml 수준의 검출한계를 나타내는 것으로 확인할 수 있었다.
[실험예 4: 본 발명 Salmonella Serotype Real-time PCR kit의 최소 검출한계 검증 실험]
상기 실시예 1에서 제작한 키트가 식품환경을 대상으로 적합한지 여부를 확인하기 위한 식품 적용 실험을 진행하였다.
실험을 위해, 식용란, 난황 샘플 20개 준비하였다. 각각 멸균 용기에 넣고 2 L의 멸균 TSB와 혼합 및 균질화를 수행하였다. 이후, S. Typhimurium NCCP 16207, S. Enteritidis NCCP 12243, S. Thompson NCCP 13578 배양액을 각각 접종하였다. 35℃에서 24시간 증균배양을 수행하였고, Genelix™ Rapid DNA Extraction Kit를 이용하여 DNA 분리하였다. 그 후, 상기 실시예 1에서 개발한 Salmonella Serotype Real-time PCR kit를 이용하여 Real-time PCR 수행하였다 (Applied Biosystems사의 ABI 7500 FAST 장비 이용).
Real-time PCR은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 후 95℃ 11초, 60℃ 1분을 40 cycles 수행하였다.
실험 결과는 도 2와 같았다. 식용란 및 난황 샘플에서 S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Thompson이 Real-time PCR을 통해 용이하게 검출됨을 확인하였다. 초기 균 농도는 3반복 실험 평균 S. Typhimurium 2.8×109 CFU/ml, S. Enteritidis 3.1×109 CFU/ml, S. Thompson 2.2×109 CFU/ml로 확인되었다. 균 수는 XLD 선택배지를 이용하여 측정하였다.
도 2는 식품샘플을 이용한 Salmonella Serotype Real-time PCR kit 결과 (위: 식용란, 아래: 난황)이다. 식용란 샘플에서 S. Typhimurium , S. Enteritidis, S. Thompson, Salmonella spp. marker는 각각 Ct value 18.6, 20.1, 19.0, 17.2로 검출되었고, 난황샘플에서 S. Typhimurium , S. Enteritidis, S. Thompson, Salmonella spp. marker는 각각 Ct value 20.0, 21.9, 20.0, 18.8로 검출되었다.
<110> Sanigen Co.,Ltd. <120> Primer sets for detecting Salmonella and polymerase chain reaction kit thereof <130> YP-20-099 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detection of Salmonella Typhimurium <400> 1 ggaaggcaag gattggata 19 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detection of Salmonella Typhimurium <400> 2 gctgctttaa atgagtaaga gta 23 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of Salmonella Typhimurium <400> 3 tccagccatc atcagcgtaa gaacc 25 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detection of Salmonella Enteritidis <400> 4 tccagaactc ttgttgca 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detection of Salmonella Enteritidis <400> 5 ctccatcagt ttcaacaatg a 21 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of Salmonella Enteritidis <400> 6 cgcatatgac aggtcaataa cagccg 26 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detection of Salmonella Thompson <400> 7 aggctcaaca tagtgctata 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detection of Salmonella Thompson <400> 8 cacaccacac atatcttcat a 21 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of Salmonella Thompson <400> 9 taatgatgcg acaccttgcc tacca 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detection of Salmonella spp. <400> 10 gaatcctcag tttttcaacg tttc 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detection of Salmonella spp. <400> 11 cgaattgccc gaacgtggcg a 21 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of Salmonella spp. <400> 12 ctctttcgtc tggcattatc gatcagtacc ag 32

Claims (5)

  1. 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머, 서열번호 3에 기재된 핵산 서열로 이루어진 탐침 (probe)를 포함하는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella Typhimurium)의 검출을 위한 프라이머 세트 (a);
    서열번호 4에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 5에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머, 서열번호 6에 기재된 핵산 서열로 이루어진 탐침 (probe)를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)의 검출을 위한 프라이머 세트 (b);
    서열번호 7에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 8에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머, 서열번호 9에 기재된 핵산 서열로 이루어진 탐침 (probe)를 포함하는 살모넬라 톰프슨(Salmonella Thompson)의 검출을 위한 프라이머 세트 (c); 및
    서열번호 10에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 11에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머, 서열번호 12에 기재된 핵산 서열로 이루어진 탐침 (probe)를 포함하는 살모넬라 (Salmonella spp.)의 검출을 위한 프라이머 세트 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 톰프슨(Salmonella Thompson)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트.
  2. 제1항의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은,
    실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)인 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서,
    상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침 (probe)은,
    5' 말단에 형광염료 (fluorescence dye)로 FAM이 태깅 (tagging)되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 BHQ1이 태깅되어 있고,
    상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침은,
    5' 말단에 형광염료로 NED가 태깅되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 MGB가 태깅되어 있고,
    상기 서열번호 9에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침은,
    5' 말단에 형광염료로 Cy5가 태깅되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 BHQ2가 태깅되어 있고,
    상기 서열번호 12에 기재된 핵산서열을 갖는 탐침은,
    5' 말단에 형광염료로 VIC가 태깅되어 있고, 3' 말단에 형광염료로 MGB가 태깅되어 있는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)용 키트.
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