CN110982917B - 一种大肠杆菌o8、o9血清型的双重pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种大肠杆菌o8、o9血清型的双重pcr检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒引物组为基于O8、O9血清型大肠杆菌的O抗原合成相关基因所设计的2对特异性引物。本发明所述含该引物组的检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌O8、O9血清分型检测方法上的不足，可以满足当前大肠杆菌O8、O9血清型分型的检测需求，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。

Description

一种大肠杆菌O8、O9血清型的双重PCR检测试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌O8、O9血清型鉴定的PCR引物组、检测方法及包括该引物组的双重PCR检测试剂盒。
背景技术
大肠杆菌是大肠埃希氏菌（Escherichia coli, E. coli）的俗称，属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌属（Escherichia）。自然界中大肠杆菌种类很多，其中绝大多数是非致病性大肠杆菌，但某些特殊血清型具有致病性，可以引起人或动物的腹泻、泌尿道感染、肺炎、败血症、心内膜炎、幼儿脑炎，家禽的卵黄性腹膜炎、肉芽肿等病症。大肠杆菌抗原复杂，主要有菌体抗原（O）、荚膜抗原（K）、鞭毛抗原（H）和菌毛抗原（F）等，是血清型鉴定的物质基础，其中O抗原又作为大肠杆菌最为常用的分型抗原。目前已知大肠杆菌O抗原有180多种，可用单因子抗O血清做玻板或试管凝集试验鉴定。然而，血清凝集试验存在诸多不足，如交叉反应比较严重、假阳性多、自凝现象严重、敏感性低等。因此，实现大肠杆菌血清型的快速有效检测，对于大肠杆菌鉴定具有重要的作用。
大肠杆菌O抗原合成相关基因簇主要编码O抗原合成、翻转及运输相关蛋白，包括糖基转移酶、乙酰基转移酶、多糖聚合酶及翻转酶。由于不同血清型大肠杆菌编码的O抗原不同，其O抗原合成相关基因簇的基因有所差别。因此，大肠杆菌O抗原合成相关基因可以作为血清型的诊断靶标。现在用于检测的分子生物学方法主要包括聚合酶链反应（PCR）方法、基因芯片技术等。基因芯片技术对于样品的要求比较高，且需要根据不同需求定制，花费较高，不太适用于兽医临床使用。PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单、检测快速等优点而被广泛应用于基因扩增、鉴别诊断等方面。目前，已有报道针对O抗原合成相关基因簇的基因设计引物进行大肠杆菌O1、O2、O6、O15、O18、O78、O45、O55、O114、O174、O177等血清型鉴定。O8、O9血清型大肠杆菌是危害养殖业的常见血清型，但是不同地区的优势血清型存在差异，给流行病学调查及疫病防控带来了困难。目前，仅有传统的血清凝集检测方法，其存在诸多缺点，尚没有针对O8、O9血清型的快速检测及鉴别诊断PCR方法。因此，迫切需要一种高效、快速的检测方法用于区分鉴定O8、O9血清型，对大肠杆菌的流行病学调查、大肠杆菌病的精准诊断及疫病防控具有重要意义。
发明内容
针对现有大肠杆菌血清型分型方面存在的问题，本发明采用了如下技术方案：
本发明的一个目的是提供了一种能够准确、快速、稳定、特异性和灵敏性高的检测大肠杆菌O8、O9血清型的引物组，其特征在于，包括以下引物，其核苷酸序列分别为：
O8-F：5’-CAGGCACGCTATCAAACTAG-3’ (SEQ ID NO.1)
O8-R：5’-CGCTCTGACCTTTATCCAGCA-3’ (SEQ ID NO.2)
09-F：5’-GTACGTTACTGAAGCTGCTG-3’ (SEQ ID NO.3)
O9-R：5’-GAGCGCTTCATCGACGATCA-3’ (SEQ ID NO.4)
本发明提供的引物组，还具有这样的特征：引物对O8-F和O8-R扩增的目的片段的大小为208bp；引物对O8-F和O8-R扩增的目的片段的大小为326bp。
本发明的另一目的在于提供一种检测大肠杆菌O8、O9血清型的双重PCR检测试剂盒。其特征在于，包括：用于建立PCR反应体系的2×PCR预混液和引物组，其中，PCR反应体系用于引物组中的各个引物对进行特异性扩增，引物组为上述的引物组。
本发明提供的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：2×PCR PreMix的体积为10.0μL，引物O8-F、O9-F和O8-R、O9-R的体积各为1.0μL。
本发明的再一个目的在于提供一种非诊断目的的用于检测大肠杆菌O8、O9血清型的双重PCR检测方法，其特征在于，先将待测大肠杆菌制备PCR模板，用权利要求1或2所述的引物组进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若电泳结果出现208bp条带为大肠杆菌O8血清型，出现326bp条带为大肠杆菌O9血清型。具体地说，本发明所述试剂盒在用于检测大肠杆菌O8、O9血清型的方法，包括下列步骤：
1）大肠杆菌模板的制备
将待检大肠杆菌菌株接种至LB液体培养基，在温度为37℃的条件下培养过夜得到细菌培养液，即得到可以用做PCR模板的菌液。
2）特异性引物的制备
所述的O抗原特异性引物O8-F、O9-F和O8-R、O9-R的使用浓度为10pM；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；
3）PCR反应体系的建立和扩增
取PCR管，分别加2×PCR PreMix的体积为10.0μL，引物O8-F、O9-F和O8-R、O9-R的体积各为1.0μL、模板1.0μL、超纯水5.0μL，混匀；PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃ 45s，50℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；
4）PCR检测结果判定与表述
取10μL PCR产物，点样于2.0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果出现208bp条带为大肠杆菌O8血清型，出现326bp条带为大肠杆菌O9血清型。
有益效果
本发明以O8、O9血清型大肠杆菌的O抗原合成相关基因为靶标，设计合成血清型特异性引物，采用聚合酶链反应（PCR）判定待检大肠杆菌的血清型。本发明提供的检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌血清型检测方法上的不足。本发明的试剂盒能用于快速的鉴定O8和O9血清型大肠杆菌，可作为大肠杆菌传统血清学分型的辅助方法，并为养殖场、动物产品及饲料等样品中大肠杆菌的监测与实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。附图说明
图1为本发明的引物组对O8、O9血清型大肠杆菌的PCR扩增结果；其中，泳道1为O8血清型大肠杆菌、O9血清型大肠杆菌的双重PCR产物（208bp和326bp）；泳道2为O8血清型大肠杆菌（208bp）；泳道3为O9血清型大肠杆菌（326bp）；泳道M为DNA Marker；泳道7为阴性对照。
图2为本发明大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的特异性实验结果；其中，泳道M：DNA Marker；泳道1-22分别为：O8血清型大肠杆菌(CE189)和O9血清型大肠杆菌(CE223)、O8血清型大肠杆菌(CE189)、O9血清型大肠杆菌(CE223)、O1血清型大肠杆菌(APECO1)、O2血清型大肠杆菌(DE14)、O6血清型大肠杆菌(CFT073)、O16血清型大肠杆菌(MG1655)、O18血清型大肠杆菌(CE66)、O20血清型大肠杆菌(CVCC194)、O38血清型大肠杆菌(CVCC1543)、O73血清型大肠杆菌(CVCC1547)、O78血清型大肠杆菌(APCE94)、O101血清型大肠杆菌(CVCC1513)、O139血清型大肠杆菌(CVCC1496)、O141血清型大肠杆菌(CVCC1497)、O149血清型大肠杆菌(CVCC1500)、O157血清型大肠杆菌(ATCC43889)、鼠伤寒沙门氏菌(CVCC3384)、肠炎沙门氏菌(CVCC1805)、鸭疫里默氏杆菌(CH3)、金黄色葡萄球菌(CVCC543)、铜绿假单胞菌(PA14)；泳道23为阴性对照。
图3为本发明大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的细菌菌液敏感性实验结果；其中，泳道M：DNA Marker；泳道1-7分别表示倍比稀释后对应的细菌数106CFU/μL、105CFU/μL、104CFU/μL、103CFU/μL、102CFU/μL、10CFU/μL、1CFU/μL；泳道8为阴性对照。
图4为本发明大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的细菌基因组DNA敏感性实验结果；其中，泳道M：DNA Marker；泳道1-7分别表示稀释浓度为100ng/μL、50ng/μL、1ng/μL、500pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL；泳道8为阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
实施例1大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测方法
本实施例采用用于双重PCR检测O8、O9血清型大肠杆菌的引物组对O8、O9血清型大肠杆菌进行检测，具体包括以下步骤：
步骤1，基于待检测细菌制备得到PCR模板
将待检大肠杆菌菌株接种至LB液体培养基，在温度为37℃的条件下培养过夜得到细菌培养液，即得到可以用做PCR模板的菌液。
步骤2，制备特异性引物组
制备用于O8、O9血清型大肠杆菌双重PCR检测的引物组：以其中的各个引物组的浓度为10pM，对该浓度的引物的稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融，
上述引物组包括以下引物对：
O8-F：5’-CAGGCACGCTATCAAACTAG-3’ (SEQ ID NO.1)
O8-R：5’-CGCTCTGACCTTTATCCAGCA-3’ (SEQ ID NO.2)
09-F：5’-GTACGTTACTGAAGCTGCTG-3’ (SEQ ID NO.3)
O9-R：5’-GAGCGCTTCATCGACGATCA-3’ (SEQ ID NO.4)
其中，引物对O8-F和O8-R扩增的目的片段的大小为208bp；引物对O8-F和O8-R扩增的目的片段的大小为326bp。
步骤3，进行PCR扩增反应
基于步骤1中得到的PCR模板，采用步骤2中的特异性引物组建立得到包括的引物组的PCR反应体系：取PCR管，分别加2×PCR PreMix 10.0μL、引物O8-F、O8-R、O9-F、O9-R各1.0μL、模板1.0μL、超纯水5.0μL，混匀，得到20μL的PCR反应体系。
然后采用上述PCR反应体系在预定PCR反应参数条件下进行PCR扩增反应得到PCR扩增产物：预定PCR反应参数条件为95℃预变性5min；95℃ 45s，50℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min。
步骤4，进行电泳检测，
对步骤3中得到的扩增产物进行电泳检测得到电泳结果，根据电泳结果判定是否为O8血清型大肠杆菌或O9血清型大肠杆菌：
取10μL PCR产物，点样于2.0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果出现208bp条带为大肠杆菌O8血清型，出现326bp条带为大肠杆菌O9血清型。
实施例2大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒进行检测
本实施例，与实施例1的步骤一致，不同的是本实施例直接采用包括实施例1中提到的引物组的双重PCR检测试剂盒来建立上述PCR反应体系。
本发明所述的大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的组成包括：2×PCRPreMix的体积为10.0μL，引物O8-F、O8-R、和O9-F、O9-R的体积各为1.0μL。
本实施例中对实施例2中制备的大肠杆菌O8、O9血清型检测试剂盒特异性、敏感性和重复性等主要特征分别进行了测评。
评价例1 特异性评价
本实施例以实施例2的大肠杆菌O8、O9血清型检测试剂盒为例对实施例1和实施例2中的引物组进行了特异性检测：
选取O8血清型大肠杆菌(CE189)、O9血清型大肠杆菌(CE223)、O1血清型大肠杆菌(APECO1)、O2血清型大肠杆菌(DE14)、O6血清型大肠杆菌(CFT073)、O16血清型大肠杆菌(MG1655)、O18血清型大肠杆菌(CE66)、O20血清型大肠杆菌(CVCC194)、O38血清型大肠杆菌(CVCC1543)、O73血清型大肠杆菌(CVCC1547)、O78血清型大肠杆菌(APCE94)、O101血清型大肠杆菌(CVCC1513)、O139血清型大肠杆菌(CVCC1496)、O141血清型大肠杆菌(CVCC1497)、O149血清型大肠杆菌(CVCC1500)、O157血清型大肠杆菌(ATCC43889)、鼠伤寒沙门氏菌(CVCC3384)、肠炎沙门氏菌(CVCC1805)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC519)、鸭沙门氏菌(CAU0118)、血清1型鸭疫里默氏杆菌(CH3)、血清2型鸭疫里默氏杆菌(NJ3)、血清10型鸭疫里默氏杆菌(HXb2)、金黄色葡萄球菌(CVCC543)、铜绿假单胞菌(PA14)、禽巴氏杆菌(CVCC493)等细菌按照五重PCR检测试剂盒使用说明操作进行PCR，产物于2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果如图2所示，结果显示以O8血清型大肠杆菌、O9血清型大肠杆菌为模板，可扩增到特异性条带；而对其他血清型大肠杆菌、沙门菌等对照样品扩增，PCR结果均为阴性。说明实施例1和实施例2中的引物组的特异性较强，采用其建立的双重PCR检测方法或检测试剂盒可以准确、快速、特异性地鉴别出大肠杆菌的O8、O9血清型。
评价例2 敏感性评价
本实施例以实施例2的双重PCR检测试剂盒为例对实施例1和实施例2中的引物组的敏感性进行了测评：
本实施例分别以倍比稀释的细菌培养物和细菌DNA为模板进行PCR扩增。
（1）以细菌培养物为模板的敏感性试验
分别接种O8、O9血清型大肠杆菌至LB液体培养基中，37℃摇菌至OD600=1.0左右，得到菌液，调整至合适的浓度，然后倍比稀释后对应的细菌数分别为106CFU/μL、105CFU/μL、104CFU/μL、103CFU/μL、102CFU/μL、10CFU/μL、1CFU/μL。各取1μL加入PCR反应体系，按照试剂盒操作说明进行PCR，根据试验结果测定试剂盒的灵敏度。结果表明（如表1），本发明建立的大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的最低可以检测出104CFU的O9血清型大肠杆菌及103CFU的O8血清型大肠杆菌（电泳图如图3）。
表1 大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的菌液敏感性评价结果
血清型 O8 O9
泳道1（106CFU） ＋ ＋
泳道2（105CFU） ＋ ＋
泳道3（104CFU） ＋ ＋
泳道4（103CFU） ＋ －
泳道5（102CFU） － －
泳道6（10CFU） － －
泳道7（1CFU） － －
泳道8（阴性对照） － －
（＋：出现特异性条带；－：未出现特异性条带）
（2）以细菌基因组DNA为模板的试剂盒灵敏度试验
分别接种O8、O9血清型大肠杆菌至LB液体培养基中，37℃摇菌至OD600=1.0左右，各取1mL菌液12000r/min离心1min，去上清，然后按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒中的说明书提取基因组DNA。分别稀释浓度为100ng/μL、50ng/μL、1ng/μL、500pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL。各吸取1μL加入PCR反应体系，按照试剂盒操作说明进行PCR，根据试验结果测定试剂盒的灵敏度。结果表明（如表2），本发明建立的大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒最低可以检测出10pg的O8血清型大肠杆菌DNA，而仅能检测出500pg的O9血清型大肠杆菌DNA（电泳图如图4）。
表2 大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的细菌DNA敏感性评价结果
血清型 O8 O9
泳道1（100ng） ＋ ＋
泳道2（50ng） ＋ ＋
泳道3（1ng） ＋ ＋
泳道4（500pg） ＋ ＋
泳道5（10pg） ＋ －
泳道6（1pg） － －
泳道7（0.1pg） － －
泳道8（阴性对照） － －
（＋：出现特异性条带；－：未出现特异性条带）
实施例3大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的重复性评价
为了评价本实施例2中制备的大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的稳定性，本实施例以实施例2的大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒为例，分别在不同时间、不同操作条件(包括PCR仪、操作人员)下对阳性模板进行检测，对试剂盒的重复性进行了测评：
如表3所示，根据PCR检测结果，说明实施例1和实施例2中的引物组的重复性较强，采用其建立的大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测方法或检测试剂盒可以重复性较好地鉴定大肠杆菌的O8血清型和O9血清型。
表3 大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的重复性检测结果
血清型 不同时间 不同PCR仪 更换操作人员 更换实验室
O8 ＋ ＋ ＋ ＋
O9 ＋ ＋ ＋ ＋
（＋：出现特异性条带；－：未出现特异性条带）
实施例4大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的应用
采用实施例2中的大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒，检测50株大肠杆菌分离株，可快速准确地检测出O8、O9血清型大肠杆菌。具体步骤如下：
步骤1，大肠杆菌PCR模板的制备
按照常规方法，从冰箱复苏保存的不同血清型大肠杆菌分离株50株。然后，按照实施例1中的方法制备大肠杆菌分离株的PCR模板。
步骤2，大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测
按照实施例2中大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒的方法进行检测，观察是否出现特异性条带，判定结果。共鉴定O8血清型大肠杆菌8株、O9血清型大肠杆菌3株。
步骤3，大肠杆菌的传统血清型鉴定
本试验检测的50株大肠杆菌的血清型鉴定参考现有技术及传统血清凝集方法进行。结果显示，8株大肠杆菌为O8血清型、3株大肠杆菌为O9血清型，其他39株为其他血清型大肠杆菌。结果表明，本发明建立的双重PCR方法鉴定结果与传统血清型鉴定结果完全一致。
在本实施例中，采用传统血清凝集的方法鉴定大肠杆菌血清型，至少需要2天的时间，耗时耗力。而本发明实施例2的双重PCR检测试剂盒，仅需2-3个小时，即可准确快速鉴定大肠杆菌O8、O9血清型，且双重PCR鉴定结果与血清型鉴定结果完全吻合，正确率为100%。
实施例的作用与效果
传统大肠杆菌血清型鉴定方法通常制备细菌的菌体抗原，然后进行血清凝集试验。而大肠杆菌有180多种O抗原血清型，因此需要准备上百种单因子血清，费时费力，且结果判定存在人为误差。然而，本研究针对大肠杆菌O8、O9血清型的靶基因，分别设计特性引物，通过优化PCR反应体系，建立了大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测方法，并组装了检测试剂盒。本发明方法及试剂盒操作简单，特异性强，敏感性高。同时，该试剂盒具有良好的重复性。因此，本发明研制的大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒具有灵敏、特异、快速的优点，为大肠杆菌O8、O9血清型检测及流行病学调查提供了新的技术手段。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120>一种大肠杆菌O8、O9血清型的双重PCR检测试剂盒及其检测方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> O8-F
<400> CAGGCACGCTATCAAACTAG
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> O8-R
<400> CGCTCTGACCTTTATCCAGCA
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 09-F
<400> GTACGTTACTGAAGCTGCTG
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 09-R
<400> GAGCGCTTCATCGACGATCA

Claims (2)

1. 一种大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：2×PCR PreMix的体积为10.0μL，引物O8-F、O9-F和O8-R、O9-R的体积各为1.0μL；
所述引物核苷酸序列分别为：
O8-F：5’-CAGGCACGCTATCAAACTAG-3’，SEQ ID NO.1，
O8-R：5’-CGCTCTGACCTTTATCCAGCA-3’，SEQ ID NO.2，
09-F：5’-GTACGTTACTGAAGCTGCTG-3’，SEQ ID NO.3，
O9-R：5’-GAGCGCTTCATCGACGATCA-3’，SEQ ID NO.4；
大肠杆菌O8、O9血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为208bp和326bp。
2.一种非诊断目的的检测大肠杆菌O8、O9血清型的双重PCR检测方法，其特征在于，先将待测大肠杆菌制备PCR模板，用检测大肠杆菌O8、O9血清型的引物组中的正向引物O8-F、O9-F和反向引物O8-R、O9-R作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若电泳结果出现208bp条带为大肠杆菌O8血清型，出现326bp条带为大肠杆菌O9血清型，
所述引物的核苷酸序列分别为：
O8-F：5’-CAGGCACGCTATCAAACTAG-3’，SEQ ID NO.1，
O8-R：5’-CGCTCTGACCTTTATCCAGCA-3’，SEQ ID NO.2，
09-F：5’-GTACGTTACTGAAGCTGCTG-3’，SEQ ID NO.3，
O9-R：5’-GAGCGCTTCATCGACGATCA-3’，SEQ ID NO.4；
大肠杆菌O8、O9血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为208bp和326bp；所述方法包括下列步骤：
1）大肠杆菌模板的制备
将待检大肠杆菌菌株接种至LB液体培养基，在温度为37℃的条件下培养过夜得到细菌培养液，即得到可以用做PCR模板的菌液；
2）特异性引物的制备
引物O8-F、O9-F和O8-R、O9-R的使用浓度为10pM；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；
3）PCR反应体系的建立和扩增
取PCR管，分别加2×PCR PreMix的体积为10.0μL，引物O8-F、O8-R和O9-F、O9-R的体积各为1.0μL、模板1.0μL、超纯水5.0μL，混匀；PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃ 45s，50℃30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；
4）PCR检测结果判定与表述
取10μL PCR产物，点样于2.0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果出现208bp条带为大肠杆菌O8血清型,出现326bp条带为大肠杆菌O9血清型。
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