CN103305627B - 一种大肠杆菌o1、o2、o18、o78血清型检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒引物组的正向引物为高度保守的大肠杆菌O抗原合成相关基因序列，反向引物为基于O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因所设计的4条血清型特异性引物。本发明所述含该引物组的检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清分型检测方法上的不足，可以满足当前大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型分型的检测需求，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
大肠杆菌是大肠埃希氏菌（Escherichia coli,E.coli）的俗称，属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌属（Escherichia）的成员，由德国细菌学家Theodor Escherich于1885年首次从婴儿粪便中分离，由此得名大肠埃希氏菌。自然界中大肠杆菌种类很多，其中绝大多数非致病性大肠杆菌是人类和动物肠道内的正常菌群的主要成员，对肠道正常生理功能的维持具有积极意义。但某些特殊血清型具有致病性，可以引起人或动物的腹泻、泌尿道感染、肺炎、败血症、心内膜炎、幼儿脑炎，家禽的卵黄性腹膜炎、肉芽肿等病症(Kaper J B,Nataro J P,Mobley H L.Pathogenic Escherichia coli.Nat Rev Microbiol,2004,2(2):123-140)。
大肠杆菌抗原复杂，主要有菌体抗原（O）、荚膜抗原（K）、鞭毛抗原（H）和菌毛抗原（F）等，是血清型鉴定的物质基础。目前已知大肠杆菌O抗原有176种，是光滑型（S型）细菌溶解后释放出的内毒素，化学成分为多糖-磷脂复合物，S型细菌丢失O抗原即变成R型菌，此菌株无法做分型鉴定。K抗原是热不稳定抗原，多存在于荚膜或类似结构中，个别位于菌毛中，目前确定有103种K抗原。具有K抗原的菌株不会被其相应的抗O血清凝集，称为O不凝集性。K抗原有抗吞噬和补体杀菌作用，与细菌的毒力有关。根据耐热性等不同，K抗原分为L、A、B三种，其中L、B不耐热。H抗原是一类不耐热的鞭毛蛋白抗原，有83种，与细菌致病力关系不大。F抗原至少有5种，如F1、F4（K88）、F5（K99）、F18、F41等，F抗原与大肠杆菌的黏附作用有关（陆承平主编,兽医微生物学,第四版,中国农业出版社,2007,100-102）。
目前，根据对大肠杆菌抗原的鉴定，可用O:K:H排列表示其血清型，其中O抗原又作为大肠杆菌最为常用的分型抗原。每个大肠杆菌菌株仅含有一种O抗原，可用单因子抗O血清做玻板或试管凝集试验鉴定（陆承平主编,兽医微生物学,第四版,中国农业出版社,2007,100-102）。然而，血清凝集试验存在诸多不足，如交叉反应多，敏感性低。因此，实现大肠杆菌血清型的快速有效检测，对于大肠杆菌鉴定具有重要的作用。
基于聚合酶链反应（PCR）扩增的基因诊断技术备受青睐，聚合酶链反应对象是针对特定模板DNA基因片段设计的一小段互补寡核苷酸，PCR技术模拟DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，该原理主要包括3个基本反应过程:变性-退火-延伸。变性主要是指双链DNA的变性，即双链DNA经加热后，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物结合。退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性（称为退火）。在此过程中，引物与单链DNA模板仍然按照碱基互补的方式配对。延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，进行体外的半保留复制，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。经重复循环变性-退火-延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。通过倍数级的扩增后，该反应体系中表达出大量的规定长度目的基因片段。PCR产物通过凝胶电泳试验来验证是否含有要求长度的基因。通过PCR反应，能够在短时间内确定待检模板是否为目的产物。
大肠杆菌O抗原合成相关基因簇编码O抗原合成、翻转及运输相关蛋白，包括糖基转移酶、乙酰基转移酶、多糖聚合酶及翻转酶。由于不同血清型大肠杆菌编码的O抗原不同，其O抗原合成相关基因簇的基因有所差别（Gabrielle Samuel,Peter Reeves.Biosynthesis of O-antigens:genes and pathways involved in nucleotide sugar precursor synthesis and O-antigen assembly.Carbohydrate Research.2003(338):2503-2519）。目前，已有报道针对O抗原合成相关基因簇的基因设计引物进行大肠杆菌O1、O2、O6、O15、O18、O45、O55、O114、O174、O177等血清型鉴定（DebRoy C,Fratamico PM,Roberts E,Davis MA,Liu Y. Development of PCR assays targeting genes in O-antigen gene clusters for detection and identification of Escherichia coli O45and O55serogroups.Appl.Environ.Microbiol.2005(71):4919-4924.;Beutin L,Tao J,Feng L,Krause G,Zimmermann S,Gleier K,Xia Q,Wang L.Sequence analysis of the Escherichia coli O15antigen gene cluster and development of a PCR assay for rapid detection of intestinal and extraintestinal pathogenic E.coli O15strains.J.Clin.Microbiol.2005(43):703-710.;Beutin L,Kong Q,Feng L,Wang Q,Krause G,Leomil L,Jin Q,Wang L.Development of PCR assays targeting the genes involved in synthesis and assembly of the new Escherichia coli O174and O177O antigens.J.Clin.Microbiol.2005(43):5143-5149.;Feng L,Wang W,Tao J,Guo H,Krause G,Beutin L,Wang L.Identification of Escherichia coli O114O-antigen gene cluster and development of an O114serogroup-specific PCR assay.J.Clin.Microbiol.2004(42):3799-3804.;Li D,Liu B,Chen M,Guo D,Guo X,Liu F,Feng L,Wang L.A multiplex PCR method to detect14Escherichia coli serogroups associated with urinary tract infections.J.Microbiol.Methods.2010(82):71-77.）。但是，以前的报道都采用单重PCR方法，该方法每次仅能检测一种血清型，比较耗时且浪费试剂。虽然也有针对多个血清特异性基因进行检测的多重PCR方法，其反应体系引物多，引物间易干扰、发生错配，从而导致检测准确度和敏感性不高。
因此，本发明研究人员研究，是否可以根据高度保守的大肠杆菌O抗原合成相关基因序列设计通用正向引物，依据其不同的O抗原合成相关基因设计设计的血清型特异性反向引物，利用PCR扩增不同血清型大肠杆菌的O抗原合成相关基因，以判定待检菌株的血清型。
发明内容
本发明旨在针对现有大肠杆菌血清凝集技术某些方面的不足，寻找一种能够准确、快速、稳定、特异性和灵敏性高的检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的引物组。
本发明的另一目的在于提供一种检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的试剂盒。
本发明的还一目的在于提供一种用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的引物组，包括以下引物，其核苷酸序列分别为：
ECO-F：5’-CGATGTTGAGCGCAAGGTTG-3’(SEQ ID NO.1)
O1-R：5’-CATTAGGTGTCTCTGGCACG-3’(SEQ ID NO.2)
O2-R：5’-GATAAGGAATGCACATCGCC-3’(SEQ ID NO.3)
O18-R：5’-AGAAGCATTGAGCTGTGGAC-3’(SEQ ID NO.4)
O78-R：5’-TAGGTATTCCTGTTGCGGAG-3’(SEQ ID NO.5)；
正向引物ECO-F为高度保守的大肠杆菌O抗原合成相关基因序列，反向引物O1-R、O2-R、O18-R、O78-R分别为O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因的血清型特异性序列。其特异性扩增的目的片段大小分别为：263bp、355bp、459bp和623bp。
所述引物组在制备检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型试剂盒中的应用。
本发明的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒，其正向引物ECO-F为高度保守的大肠杆菌O抗原合成相关基因序列，反向引物O1-R、O2-R、O18-R、O78-R分别为O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因的血清型特异性序列，其引物序列分别为：
ECO-F：5’-CGATGTTGAGCGCAAGGTTG-3’(SEQ ID NO.1)
O1-R：5’-CATTAGGTGTCTCTGGCACG-3’(SEQ ID NO.2)
O2-R：5’-GATAAGGAATGCACATCGCC-3’(SEQ ID NO.3)
O18-R：5’-AGAAGCATTGAGCTGTGGAC-3’(SEQ ID NO.4)
O78-R：5’-TAGGTATTCCTGTTGCGGAG-3’(SEQ ID NO.5)。
在一些实施例中，所述大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒还含有10×Taq Buffer、Taq DNA polymerase、MgCl2、dNTP等试剂。
另一方面，本发明还提供所述试剂盒在用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的方法，先将待测大肠杆菌菌液或其DNA提取物作为模板，用所述的O抗原特异性引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R作为扩增 引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，电泳结果出现263bp条带为大肠杆菌O1血清型；出现355bp条带为大肠杆菌O2血清型；出现459bp条带为大肠杆菌O18血清型；出现623bp条带为大肠杆菌O78血清型。
所述PCR反应体系为25μL：10×Taq Buffer2.5μL、Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）1.0μL、MgCl2（25mM）2.0μL、dNTPs混合溶液（每种为2.5mM）4.0μL、引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R各0.5μL、模板1.0μL、超纯水12.0μL。
所述PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃40s，55℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
具体地说，本发明所述试剂盒在用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的方法，包括下列步骤：
1）大肠杆菌模板的制备
将待测大肠杆菌菌株菌液接种至LB液体培养基，37℃摇菌，至OD600=1.0，取1mL菌液12000r/min离心1min，去上清，灭菌超纯水洗3次，1mL灭菌超纯水重悬，制成模板备用；
2）特异性引物的制备
所述的O抗原特异性引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R的使用浓度为10pM；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；
3）PCR反应体系的建立和扩增
取PCR管，分别加10×Taq Buffer2.5μL、Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）1.0μL、MgCl2（25mM）2.0μL、dNTPs混合溶液（每种为2.5mM）4.0μL、引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R各0.5μL、模板1.0μL、超纯水12.0μL，混匀；PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃40s，55℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min；
4）PCR检测结果判定与表述
取10μL PCR产物，点样于2.0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果出现263bp条带为大肠杆菌O1血清型；出现355bp条带为大肠杆菌O2血清型；出现459bp条带为大肠杆菌O18血 清型；出现623bp条带为大肠杆菌O78血清型。
现有技术采用血清凝集试验，其交叉反应多，敏感性低。本发明以高度保守的大肠杆菌O抗原合成相关基因序列为共用正向引物，以O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因设计合成血清型特异性反向引物，采用聚合酶链反应（PCR）判定该菌大肠杆菌的血清型。所述检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌血清型检测方法上的不足，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
附图说明
图1为本发明设计的O1、O2、O18、O78血清特异性引物组设计示意图；
图2为本发明设计的引物组O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌PCR扩增结果；
图3为本发明PCR特异性实验结果；
图4为以细菌菌液为模板的PCR敏感性实验结果；
图5为以细菌基因组DNA为模板的PCR敏感性实验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
1．大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测引物组的设计
（1）比对分析O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因簇
大肠杆菌O抗原合成相关基因簇编码O抗原合成、翻转及运输相关蛋白，包括糖基转移酶、乙酰基转移酶、多糖聚合酶及翻转酶。由于不同血清型大肠杆菌编码的O抗原不同，其O抗原合成相关基因簇的基因有所差别（Gabrielle Samuel,Peter Reeves.Biosynthesis of O-antigens:genes and pathways involved in nucleotide sugar precursor synthesis and O-antigen assembly.Carbohydrate Research.2003(338):2503-2519）。因此，采用生物信息学方法比较Genbank公布的O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因簇，其中包括血清型O1(APEC O1[登陆号：CP000468.1]和G1632[登陆号：GU299791.1]),血清型O2(G1674[登陆号：GU299792.1]和E.coli O2[登陆号：EU549863.1]),血清型O18(IHE3034[登陆号：CP001969.1]和G1630[登陆号：GU299793.1]),和血清型O78(APEC O78[登陆号：CP004009.1]和E.coli O78[登陆号：FJ940775.1])。通过在线细菌脂多糖基因命名系统(www.microbio.usyd.edu.au/BPGD/default.htm)对预测的阅读框进行命名。如图1所示，通过比较分析发现，O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因簇的大小及基因存在差别，但其上下游的基因gnd和galF相同。进一步分析可知，临近基因gnd的O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因分别为糖基转移酶编码基因wekO,wekS,wekW和翻转酶编码基因wzx。
（2）大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测引物组的设计
根据O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因簇比对分析结果，正向引物为高度保守的大肠杆菌O抗原合成相关基因gnd序列，反向引物为基于O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因wekO,wekS,wekW和wzx所设计的4条血清型特异性引物。根据设计的引物组分别扩增263bp、355bp、459bp和623bp的O1、O2、O18、O78血清型特异性片段。
2．大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒的制备
（1）大肠杆菌模板的制备
将大肠杆菌菌株接种至LB液体培养基，37℃摇菌。至OD600=1.0左右，各取1mL菌液12000r/min离心1min，去上清，灭菌超纯水洗3次，1mL灭菌超纯水重悬，制成模板备用。
（2）特异性引物的制备
本试剂盒检测的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为：263bp（O1）、355bp（O2）、459bp（O18）和623bp（O78）。各条引物使用浓度为10pM，引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；可根据如下引物序列人工合成。
ECO-F：5’-CGATGTTGAGCGCAAGGTTG-3’(SEQ ID NO.1)
O1-R：5’-CATTAGGTGTCTCTGGCACG-3’(SEQ ID NO.2)
O2-R：5’-GATAAGGAATGCACATCGCC-3’(SEQ ID NO.3)
O18-R：5’-AGAAGCATTGAGCTGTGGAC-3’(SEQ ID NO.4)
O78-R：5’-TAGGTATTCCTGTTGCGGAG-3’(SEQ ID NO.5)
（3）PCR反应体系的建立和扩增
取PCR管，分别加10×Taq Buffer2.5μL、Taq DNA聚合酶（polymerase）（2.5U/μL）1.0μL、MgCl2（25mM）2.0μL、dNTPs混合溶液（每种为2.5mM）4.0μL、引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R各0.5μL、模板1.0μL、超纯水12.0μL，混匀。放入PCR仪进行扩增，反应参数：95℃预变性5min；95℃40s，55℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
（4）PCR检测结果判定与表述
取10μL PCR产物，点样于2.0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现。
具体判定方法：电泳结果出现263bp条带为大肠杆菌O1血清型；出现355bp条带为大肠杆菌O2血清型；出现459bp条带为大肠杆菌O18血清型；出现623bp条带为大肠杆菌O78血清型。如图2所示，泳道1、2为O1血清型大肠杆菌（263bp）；泳道3、4为O2血清型大肠杆菌（355bp）；泳道5、6为O18血清型大肠杆菌（459bp）；泳道7、8为O78血清型大肠杆菌（623bp）；泳道9为阴性对照。
3.大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒的特异性、敏感性和重复性评价
本实施例中对实施例1中制备的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒特异性、敏感性和重复性等主要特征分别进行了测评。
（1）试剂盒特异性试验
选取禽致病性大肠杆菌O1（APEC O1）(Johnson TJ,Kariyawasam S,Wannemuehler Y,Mangiamele P,Johnson SJ,Doetkott C,Skyberg JA,Lynne AM,Johnson JR,Nolan LK.The genome sequence of avian pathogenic Escherichia coli strain O1:K1:H7shares strong similarities with human extraintestinal pathogenic E.coli genomes.J.Bacteriol.2007(189):3228-3236.)、禽致病性大肠杆菌O2(DE14）(陈文静，韩先干，何亮，胡青海，于圣青.鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析。中国动物传染病学报.2010,18(2):34-40)、禽致病性大肠杆菌O18(CE66）(陈文静，韩先干，何亮，胡青海，于圣青.鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析。中国动物传染病学报.2010,18(2):34-40)、禽致病性大肠杆菌O78(DE48）(陈文静，韩先干，何亮，胡青海，于圣青.鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析。中国动物传染病学报.2010,18(2):34-40)、尿道致病性大肠杆菌O6（CFT073）(ATCC700928)、大肠杆菌O16(MG1655)(ATCC47076)、大肠杆菌O38(CVCC1543)、大肠杆菌O73(CVCC1547)、大肠杆菌O131(马新蕾，王少辉，刘永杰，戴建君。禽致病性大肠杆菌IMT5155株毒力相关基因片段E9的表达及生物学特性分析.畜牧与兽医,2010,42(2):20-24.)、肠出血性大肠杆菌O157(ATCC43889)、大肠杆菌O138(马新蕾，王少辉，刘永杰，戴建君。禽致病性大肠杆菌IMT5155株毒力相关基因片段E9的表达及生物学特性分析.畜牧与兽医,2010,42(2):20-24.)、鼠伤寒沙门氏菌(CVCC3384)、肠炎沙门氏菌(CVCC1805)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC519)、鸭沙门氏菌(CAU0118)、血清1型鸭疫里默氏杆菌（CH3）(Hu Q,Tu J,Han X,Zhu Y,Ding C,Yu S.Development of multiplex PCR assay for rapid detection of Riemerella anatipestifer,Escherichia coli,and Salmonella enterica simultaneously from ducks.J.Microbiol.Methods.2011(87):64-69.)、血清2型鸭疫里默氏杆菌（NJ3）(Hu Q,Tu J,Han X,Zhu Y,Ding C,Yu S.Development of multiplex PCR assay for rapid detection of Riemerella anatipestifer,Escherichia coli,and Salmonella enterica simultaneously from ducks.J.Microbiol.Methods.2011(87):64-69.)、血清10型鸭疫里默氏杆菌（HXb2）(Hu Q,Tu J,Han X,Zhu Y,Ding C,Yu S.Development of multiplex PCR assay for rapid detection of Riemerella anatipestifer,Escherichia coli,and Salmonella enterica simultaneously from ducks.J.Microbiol.Methods.2011(87):64-69.)、禽巴氏杆菌（CVCC493）、鸡毒支原体(CVCC1651)、禽支原体（CVCC274）、金 黄色葡萄球菌（CVCC543）、禽波氏菌（ATCC菌株IPDH591-77）按照试剂盒使用说明操作进行PCR，产物于2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。以禽致病性大肠杆菌O1、禽致病性大肠杆菌O2、禽致病性大肠杆菌O18、禽致病性大肠杆菌O78为模板，可扩增到特异性条带；而对其他血清型大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、禽巴氏杆菌、支原体等对照样品扩增，PCR结果均为阴性。如图3，泳道1-23分别为：禽致病性大肠杆菌O1、禽致病性大肠杆菌O2、禽致病性大肠杆菌O18、禽致病性大肠杆菌O78、尿道致病性大肠杆菌O6、大肠杆菌O16(MG1655)、大肠杆菌O38(CVCC1543)、大肠杆菌O73(CVCC1547)、大肠杆菌O131、肠出血性大肠杆菌O157(ATCC43889)、大肠杆菌O138、鼠伤寒沙门氏菌(CVCC3384)、肠炎沙门氏菌(CVCC1805)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC519)、鸭沙门氏菌(CAU0118)、血清1型鸭疫里默氏杆菌（CH3）、血清2型鸭疫里默氏杆菌（NJ3）、血清10型鸭疫里默氏杆菌（HXb2）、禽巴氏杆菌（CVCC493）、鸡毒支原体(CVCC1651)、禽支原体（CVCC274）、金黄色葡萄球菌（CVCC543）、禽波氏菌（IPDH591-77），泳道24为阴性对照。
（2）以细菌培养物为模板的试剂盒灵敏度试验
分别接种大肠杆菌O1、O2、O18、O78至LB液体培养基中，37℃摇菌至OD600=1.0左右，各取1mL菌液12000r/min离心1min，去上清，灭菌超纯水洗3次，1mL灭菌超纯水重悬，分别制备菌液，浓度为107CFU/μL、106CFU/μL、105CFU/μL、104CFU/μL、103CFU/μL、102CFU/μL、10CFU/μL、1CFU/μL。各吸取1μL加入PCR反应体系，按照试剂盒操作说明进行PCR，根据试验结果测定试剂盒的灵敏度。结果表明，本发明建立的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测方法最低可以检测出100CFU的O2和O18血清型大肠杆菌，而仅能检测出1000CFU的O1和O78血清型大肠杆菌（如图4）。
（＋：出现特异性条带；－:未出现特异性条带）
（3）以细菌基因组DNA为模板的试剂盒灵敏度试验
分别接种大肠杆菌O1、O2、O18、O78至LB液体培养基中，37℃摇菌至OD600=1.0左右，各取1mL菌液12000r/min离心1min，去上清，灭菌超纯水洗3次，1mL灭菌超纯水重悬，沸水中煮10min，菌液12000r/min离心5min，收集上清为细菌基因组DNA，分别稀释浓度为100ng/μL、50ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、500pg/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL。各吸取1μL加入PCR反应体系，按照试剂盒操作说明进行PCR，根据试验结果测定试剂盒的灵敏度。结果表明，本发明建立的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测方法最低可以检测出10pg的O2和O18血清型大肠杆菌，而仅能检测出500pg的O1和O78血清型大肠杆菌（如图5）。
（＋：出现特异性条带；－:未出现特异性条带）
（4）重复性试验
分别在不同时间、不同操作条件(包括PCR仪、操作人员)下对阳性模板进行检测。根据PCR检测结果，本发明试剂盒重复性良好。
（＋：出现特异性条带；－:未出现特异性条带）
通过优化PCR反应体系，组装了大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒。对实验室已保存的阳性菌株进行扩增，均可扩增到特异性条带， 而其他细菌标准菌株、等对照样品均为扩增到条件，说明该试剂盒特异性强。用试剂盒检测不同稀释度的阳性样品，其最低检测灵敏度可达到1000CFU细菌菌液及500pg细菌基因组DNA，说明该试剂盒灵敏性高。同时，该试剂盒具有良好的重复性。检测结果表明，本发明研制的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒具有灵敏、特异、快速的优点，为大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测及流行病学调查提供了新的技术手段。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所
<120> 一种大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒及其检测方法
<130> FP-081-011
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgatgttgag cgcaaggttg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cattaggtgt ctctggcacg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gataaggaat gcacatcgcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agaagcattg agctgtggac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taggtattcc tgttgcggag 20
Claims (10)
1.一种用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的引物组，其特征在于，包括以下引物，其核苷酸序列分别为：
ECO-F：5’-CGATGTTGAGCGCAAGGTTG-3’(SEQ ID NO.1)
O1-R：5’-CATTAGGTGTCTCTGGCACG-3’(SEQ ID NO.2)
O2-R：5’-GATAAGGAATGCACATCGCC-3’(SEQ ID NO.3)
O18-R：5’-AGAAGCATTGAGCTGTGGAC-3’(SEQ ID NO.4)
O78-R：5’-TAGGTATTCCTGTTGCGGAG-3’(SEQ ID NO.5)；
正向引物ECO-F为高度保守的大肠杆菌O抗原合成相关基因序列，反向引物O1-R、O2-R、O18-R、O78-R分别为O1、O2、O18、O78血清型大肠杆菌O抗原合成相关基因的血清型特异性序列。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为：263bp、355bp、459bp和623bp。
3.权利要求1或2所述引物组在制备检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型试剂盒中的应用。
4.一种含权利要求1或2所述引物组的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒。
5.根据权利要求4所述的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒，其特征在于，其还含有10×Taq Buffer、Taq DNA聚合酶、MgCl2及dNTP。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：10×Taq Buffer2.5μL、2.5U/μL的TaqDNA聚合酶1.0μL、25mM的MgCl22.0μL、每种为2.5mM的dNTPs混合溶液4.0μL、引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R各0.5μL。
7.权利要求4-6任意一项所述试剂盒在制备用于检测大肠杆菌O1、O2、O18、O78血清型的产品中的应用，其特征在于，所述应用中，采用先将待测大肠杆菌菌液或待测大肠杆菌的DNA提取物作为模板，用所述的正向引物ECO-F和反向引物O1-R、O2-R、O18-R、O78-R作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若电泳结果出现263bp条带为大肠杆菌O1血清型；出现355bp条带为大肠杆菌O2血清型；出现459bp条带为大肠杆菌O18血清型；出现623bp条带为大肠杆菌O78血清型。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，PCR反应体系为25μL时含有：10×Taq Buffer2.5μL、2.5U/μL Taq DNA聚合酶1.0μL、25mMMgCl22.0μL、每种为2.5mM的dNTPs混合溶液4.0μL、引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R各0.5μL、模板1.0μL、超纯水12.0μL。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃40s，55℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用中，采用下列步骤：
1)大肠杆菌模板的制备
将大肠杆菌菌株接种至LB液体培养基，37℃摇菌，至OD600＝1.0，取1mL菌液12000r/min离心1min，去上清，灭菌超纯水洗3次，1mL灭菌超纯水重悬，制成模板备用；
2)特异性引物的制备
权利要求1所述的引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R的使用浓度为10pM；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；
3)PCR反应体系的建立和扩增
取PCR管，分别加10×Taq Buffer2.5μL、2.5U/μL Taq DNA聚合酶1.0μL、25mM MgCl22.0μL、每种为2.5mM的dNTPs混合溶液4.0μL、引物ECO-F和O1-R、O2-R、O18-R、O78-R各0.5μL、模板1.0μL、超纯水12.0μL，混匀；PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃40s，55℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min；
4)PCR检测结果判定与表述
取10μL PCR产物，点样于2.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果出现263bp条带为大肠杆菌O1血清型；出现355bp条带为大肠杆菌O2血清型；出现459bp条带为大肠杆菌O18血清型；出现623bp条带为大肠杆菌O78血清型。
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