CN104711365B - 沙门菌和大肠杆菌o78多重pcr快速检测的试剂盒 - Google Patents

沙门菌和大肠杆菌o78多重pcr快速检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于沙门菌和大肠杆菌O78的多重PCR快速检测的试剂盒。包括：PCR反应mix(含buffer，dNTP，引物等)，酶混合物以及阳性质控。本发明试剂盒能够检测畜禽肛拭子、粪便以及食品中的沙门菌和大肠杆菌O78，具有操作简单、特异性好、灵敏度高(可达102cfu/mL‑103cfu/mL)及快速检测(从样品处理到出结果8h内完成)的特点，将在畜禽疾病的早期检测和食品安全等方面有广阔的应用前景。

Description

沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测的试剂盒与应用。
背景技术
快速检测与鉴定致病性病原菌是及时有效的预防和控制病原菌传播的前提，对于畜禽业的健康正常发展以及食品的检验检疫安全和人类健康具有重要意义。
目前食品卫生微生物学检验(GB/T 4789.1—2003)病原菌仍主要依靠传统的细菌培养、血清学、生化鉴定等方法，检测周期长(需4～7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低，不能适应快速检测的需要。1996年由美国Applied Biosystems公司推出的荧光PCR方法因其污染小，灵敏度高等优势很快发展成为分子生物学检测的重要手段，但由于荧光PCR的反应体系更为复杂，引物和探针之间的干扰难以预测，且荧光探针价格昂贵，故多重荧光PCR方法的建立较为困难，其实用性也大受影响。普通多重PCR技术的优势在于可以同时对成组病原物进行检测，且操作和普通PCR一样简单，所以可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，具有显著地经济效益和社会效益，特别适合成组病原体的检测，不论在致病微生物引起的传染病诊断方面，还是在食品、化妆品以及环境中微生物的检验方面都具有极高的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供用于沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测的引物。
本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测的试剂盒。
对于用于沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测的引物，本发明采用的技术方案是，包括：
(1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或
(2)与(1)的核苷酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核苷酸序列。
对于沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测的试剂盒，本发明采用的技术方案是,包括：
有一条与细菌16s RNA特异结合的内参引物SEQ ID NO:1，两条可与沙门菌基因序列特异结合的检测引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，两条可与大肠杆菌O78基因序列特异结合的检测引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
上述试剂盒在沙门菌或大肠杆菌O78检测中的应用。
本发明主要基于靶标基因的PCR技术和多重PCR扩增技术对大肠杆菌O78和沙门菌进行快速检测，同时对环境中广泛存在的细菌进行扩增，避免假阴性结果的产生，达到一次性快速检测沙门菌和大肠杆菌O78的目的。
本发明所选用的各病原菌的基因均具有较强的特异性和灵敏性。通用阳性质控引物的设计选用细菌16s rRNA一段高度保守序列，存在于所有细菌中且片段大小相近，约566bp。沙门菌的invA基因和O78O-抗原特异基因为沙门菌和大肠杆菌O78特有的毒力因子基因，且序列高度保守。
本发明的有益效果是：
畜禽养殖方面，目前都是规模化养殖，密度大，病原菌感染后传播快，而传统的病原菌检测方法操作繁琐，耗时耗力，不能起到有效地监测和预防作用，也很难指导发病后的合理用药。而国标中对于食品和化妆品等领域微生物的检测仍主要依靠传统的细菌培养、血清学、生化鉴定等方法，检测周期长(需4～7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低，不能适应快速检测的需要。本发明提供的多重PCR检测方法可以弥补以上不足，提供一种沙门菌和大肠杆菌O78快速高效的分子检测方法。多重PCR扩增结果表明：沙门菌和大肠杆菌O78的特异引物具有较高的检测灵敏度和特异性，细菌通用引物可以高灵敏度的广谱扩增细菌16s rRNA的部分序列，很好的起到了阳性质控条带的作用，有效地避免了样品中假阴性结果的产生。本发明提供的畜禽粪便增菌培养后制备DNA的方法，可以有效缩短检测的时间，提高检测效率。同时，增菌培养后可使扩增体系中死菌的模板DNA所占比例大大降低，从而确保了对病原菌的传播和防治情况进行实时检测的可靠性。总之，本发明提供的一种沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR检测方法操作简单、高效、灵敏，为病原菌的实时监测和快速诊断提供了有效手段，可以推广应用于畜禽养殖、食品卫生、环境安全等领域病原菌的快速检测。
本发明解决了病原菌传统技术检测周期长(需4～7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低的问题。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例的单对引物特异性验证。
图2是本发明实施例的多重PCR特异性扩增产物电泳分析。
图3是本发明实施例的多重PCR检测灵敏度实验结果。
图4是本发明实施例的模拟鸡粪样品多重PCR检测灵敏度实验结果。
图5是本发明实施例的模拟奶粉样品多重PCR检测灵敏度实验结果。
图6是本发明实施例的模拟化妆水样品多重PCR检测灵敏度实验结果。
具体实施方式
实施例1
一种沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测方法，采用多重PCR技术一次性扩增沙门菌和大肠杆菌O78的特异基因以及细菌16s rRNA的部分序列，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
本实施例所用病原菌分别购自中国工业微生物所、中国兽医菌种保藏中心和广州微生物所菌种保藏中心：鸡肠炎沙门菌(Salmonella enterica)：CICC21510，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)：CMCC50115，猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)：ATCC13312；大肠杆菌O78(Escherichia coli O78)：CVCC1490、ATCC35401。
本实施例所用主要试剂：
Taq DNA聚合酶，dNTPs，2000bp DNA Marker[宝生物工程(大连)有限公司]，引物(北京华大基因科技有限公司)，LB(青岛海博生物科技有限公司)。
本实施例所用主要仪器：
Life Touch TC-XP基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)；
DYCP-31DN水平电泳仪(北京六一仪器厂)；
Tanon-2500R全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。
上述沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤：
(1)合成引物
根据沙门菌invA基因和大肠杆菌O78O-抗原特异基因设计特异引物，根据细菌16srRNA高度保守区设计细菌的通用扩增引物，和16s通用引物1492R配对进行通用阳性质控条带的扩增。上述引物的核苷酸序列为：
926F：5’-GCACAAGCGGTGGAGCAT-3’；
O78-F1：5’-ATAACAGTGGCACTATTGATC-3’
O78-R1：5’-TTCGCTTCATTGTTACCTTTG-3’
invA-F308：5’-CGCTCTTTCGTCTGGCATTA-3’
invA-R1128：5’-CAGTCCTAACGACGACCCTTC-3’
引物的特异性检测：首先将设计合成的引物在BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网上比对，发现引物对O78-F1/O78-R1和大肠杆菌O78有100％的相似度(CP004009，FJ940775)，另外和一株未注明血清型的大肠杆菌(FN649414)有100％的同源性，与其它菌株的相似度较低；引物对invA-F308/invA-R1128只和沙门氏菌相似度100％，和其它菌株相似度都不足50％。然后用3株沙门氏菌，2株大肠杆菌O78和13株含其他大肠杆菌血清型菌株和常见肠道致病菌组成的非目标菌基因组DNA分别进行单引物对PCR反应，验证引物的特异性。
PCR反应体系为：上下游引物各0.25μM，0.2mM dNTPs，含2mM MgCl2的1×PCR缓冲液，1U Taq DNA聚合酶，1μL上述18种菌微量DNA模板，ddH2O补足25μl体系。
PCR条件为：预变性94℃3min；94℃变性30s，60℃退火30s和72℃延伸30s，共30循环；终延伸72℃5min。
将5μL PCR产物用1％琼脂糖电泳分离，电泳结果如附图1所示，其中A为invA-F308/invA-R1128单引物特异性验证结果；B为O78-F1/O78-R1单引物特异性验证结果；C为926F/1492R1-3单引物特异性验证结果。1-3为沙门菌属，分别为鸡肠炎沙门菌(S.enterica，CICC21510)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium，CMCC50115)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis，ATCC13312)；4-5为2株大肠杆菌O78(E.coli O78，CVCC1490和ATCC35401)；6为大肠杆菌O2(E.coli O2，CVCC1562)；7-8为大肠杆菌(E.coli，CMCC44102和CICC10413)；9为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CMCC26003)；10为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853)；11-12为2株志贺氏菌：痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae，CMCC51252)和福氏志贺氏菌(S.flexneri，CMCC51572)；13为阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii，CMCC45401)；14为大肠杆菌O157(E.coli O157，CVCC248)；15为粪肠球菌(Enterococcus faecalis，ATCC29212)；16-17为2株芽孢杆菌：蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，CMCC63301)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis，CMCC63501)；18为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，GIM1.347)；19为白色念珠菌(Candida albican，ATCC10231)；Nc为清水对照。结果表明引物对O78-F1/O78-R1扩增大肠杆菌O78产生约1000bp左右的条带，扩增沙门菌、其他非目标菌菌株均无条带产生；引物对invA-F308/invA-R1128扩增沙门菌不同菌种均可得到约750bp大小的条带，扩增其他菌均无条带产生。通用引物对926F/1492R所有细菌菌株均可获得一条约500bp大小的条带，扩增白色念珠菌无扩增条带产生。此结果说明所设计沙门菌和大肠杆菌O78引物具有高度特异性，16s通用引物对细菌扩增有较好的通用性，不能扩增真菌。对沙门菌和大肠杆菌O78的特异扩增条带进行回收测序，大肠杆菌O78扩增特异条带实际大小为1113bp，沙门菌特异扩增条带大小为821bp，与引物设计预期一致，说明所设计引物特异性好。
(2)多重PCR扩增反应体系的建立
将步骤(1)中的3对引物926F/1492R、invA-F308/invA-R1128和O78-F1/O78-R1进行多重PCR扩增以检测沙门菌和大肠杆菌O78。根据单重PCR结果选取对多重PCR有较大影响的因素：退火温度、引物浓度、模板量进行单因素优化实验，以摸索确定最佳的多重PCR反应体系。反应组分和反应条件优化如下：退火温度从55℃到65℃，扩增延伸时间分别为30s，60s和90s，引物浓度从0.02mM到0.4mM，dNTP浓度从0.02mM到0.5mM。优化后按下列体系配置PCR反应体系：
2×PCR buffer 2.5μL，0.2mM dNTPs，invA-F308和invA-R1128各0.04μM，O78-F1和O78-R1各0.36μM，926F和1492R各0.08μM，exTaq 1.25U，DNA模板1.0μL，ddH2O补足25μL。
PCR扩增条件为：94℃，4min；94℃30s，60℃30s，72℃45s，共28循环；最后72℃后延伸5min。PCR反应可在杭州博日Life Touch PCR仪上完成。然后用1.2％琼脂糖凝胶加样5μLPCR产物电泳，紫外灯下观察，用凝胶成像分析系统照像。
电泳结果如附图2所示，其中M1为沙门菌和O78等量DNA混合样品；1-3为沙门菌属，分别为鸡肠炎沙门菌(S.enterica，CICC21510)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium，CMCC50115)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis，ATCC13312)；4-5为2株大肠杆菌O78(E.coli O78，CVCC1490和ATCC35401)；6为大肠杆菌O2(E.coli O2，CVCC1562)；7-8为大肠杆菌(E.coli，CMCC44102和CICC10413)；9为金黄色葡萄球菌(S.aureus，CMCC26003)；10为铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，ATCC27853)；11-12为2株志贺氏菌：痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae，CMCC51252)和福氏志贺氏菌(S.flexneri，CMCC51572)；13为阪崎肠杆菌(E.Sakazakii，CMCC45401)；14为大肠杆菌O157(E.coli O157，CVCC248)；15为粪肠球菌(E.faecalis，ATCC29212)；16-17为2株芽孢杆菌：蜡样芽胞杆菌(B.cereus，CMCC63301)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis，CMCC63501)；18为单增李斯特菌(L.monocytogenes，GIM1.347)；19为白色念珠菌(C.albican，ATCC10231)；Nc为清水对照。结果表明3种沙门菌扩增产生约750bp和约500bp的条带，2株大肠杆菌O78的基因组DNA扩增产生约1000bp和约500bp大小的条带，其它对照细菌菌株只有约500bp大小的通用条带扩增产生，而真菌菌株白色念珠菌和阴性对照无扩增条带。在混合DNA样品中，各目标条带清晰，分子量与预期吻合，扩增结果与预期一致。此结果说明该多重PCR检测体系在优化的反应条件和反应体系下有很好的扩增特异性。
(3)多重PCR灵敏度检测实验
将步骤(2)中的多重PCR反应体系在优化的反应条件下进行灵敏度检测实验。取过夜增菌液，10倍倍比稀释后LB平板计数，同时高温裂解法制备核酸，并以此为模板进行多重PCR扩增，每个处理3个重复。电泳结果见附图3。附图中，M1为沙门菌和O78等量DNA混合样品阳性质控；E0-E6分别为大肠杆菌O78菌液浓度为106-100cfu/mL制备的DNA样品；S0-S7分别为沙门菌液浓度为107-100cfu/mL制备的DNA样品；Nc为ddH2O阴性对照。结果表明：多重PCR体系扩增106-103cfu/mL大肠杆菌O78不同浓度菌液DNA均可产生约1000bp和约500bp大小的两条带，102cfu/mL菌液DNA扩增条带较弱，但肉眼仍可见约1000bp和约500bp大小的两条带，说明大肠杆菌O78检测灵敏度约102cfu/mL；多重PCR体系扩增107-104cfu/mL的沙门菌DNA，均可产生约750bp和约500bp大小的两条扩增条带，菌液浓度为103cfu/mL时扩增条带很弱几乎不可见，说明沙门菌的检测灵敏度约为104cfu/mL。此检测灵敏度与前人所做多重PCR对致病菌的检测灵敏度基本一致。若按照100ng DNA相当于107cfu/mL菌量算，大肠杆菌和沙门菌的检测灵敏度分别可以达到每个反应10-2pg和10-1pg，与文献报道病原菌检测灵敏度相当，甚至略高。说明所建立的多重扩增体系呈现较好的检测灵敏度。
实施例2
一种鸡粪样品中沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测方法，在无菌鸡粪中添加沙门菌或大肠杆菌O78后增菌培养，提取鸡粪样品中总DNA，利用实施例1中所述体系进行多重PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1.
上述鸡粪样品中沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤：
取高温高压灭菌的新鲜鸡粪1g加入10倍梯度倍比稀释的沙门菌和大肠杆菌O78菌液1mL，LB液体培养基补足5mL，37℃，200rpm，增菌5h；低速离心5min；取1mL上清，12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH2O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min。12000rpm离心3min，上清即为DNA模板。
利用实施例1中所建立的多重PCR扩增体系对上述DNA模板进行扩增，反应体系和反应条件同前“多重PCR扩增反应体系的建立”。电泳结果见附图4。附图4中，M为DL2000DNAMarker；Pc为沙门菌和O78等量DNA混合样品阳性质控；M6-M0分别为1g灭菌鸡粪中加入浓度为106-100cfu/mL大肠杆菌O78和沙门菌混合菌液制备的DNA样品；Nc为ddH2O阴性对照。扩增结果表明：加入同等浓度106-103cfu/mL沙门菌和大肠杆菌O78的混合鸡粪样品，采用化学裂解和高温裂解制备的DNA样品多重PCR扩增均可产生约1000bp、750bp和500bp三条扩增条带；加入103cfu/mL沙门菌和大肠杆菌O78的混合鸡粪样品制备的DNA只能看到约1000bp和约500bp两条扩增条带，沙门菌约750bp的特异条带肉眼不可见；无假阳性或假阴性结果出现。此结果说明增菌培养5h后，鸡粪中大肠杆菌O78的检测灵敏度约102cfu/mL，沙门菌的检测灵敏度约为103cfu/mL，呈现较好的检测灵敏度。
实验结果表明鸡粪样品DNA提取方法简单高效。实验也同时采用酚氯仿法抽提DNA，扩增结果和高温煮沸法制备的DNA扩增结果没有明显差别，只是条带稍微亮了一点，但是浪费试剂和时间，有悖于分子诊断快速简便的基本要求，所以本发明建议采用上述高温裂解法进行带菌鸡粪样品中总DNA的制备。
实施例3
一种奶粉样品中沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测方法，在无菌奶粉中添加沙门菌或大肠杆菌O78后增菌培养，提取奶粉样品中总DNA，利用实施例1中所述体系进行多重PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1.
上述奶粉样品中沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤：
取奶粉5g加入100mL LB液体培养基中，高压灭菌后取1mL添加10倍梯度倍比稀释的沙门菌和大肠杆菌O78菌液各100uL，37℃250rpm增菌5h；12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH2O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min。12000rpm离心3min，上清即为DNA模板。
利用实施例1中所建立的多重PCR扩增体系对上述DNA模板进行扩增，反应体系和反应条件同前“多重PCR扩增反应体系的建立”。电泳结果见附图5。附图5中，M为DL2000DNAMarker；Pc为沙门菌和O78等量DNA混合样品阳性质控；M6-M0分别为50mg奶粉中加入浓度为106-100cfu/mL大肠杆菌O78和沙门菌混合菌液制备的DNA样品；Nc为ddH2O阴性对照。扩增结果表明：加入同等浓度106-103cfu/mL沙门菌和大肠杆菌O78的混合奶粉样品，采用高温裂解制备的DNA样品多重PCR扩增均可产生约1000bp、750bp和500bp三条扩增条带；加入102和101cfu/mL沙门菌和大肠杆菌O78的混合奶粉样品制备的DNA只能看到约1000bp和约500bp两条扩增条带，沙门菌约750bp的特异条带肉眼不可见；无假阳性或假阴性结果出现。此结果说明增菌培养5h后，奶粉中大肠杆菌O78的检测灵敏度约101cfu/mL，沙门菌的检测灵敏度约为103cfu/mL，呈现较好的检测灵敏度。
食源性致病微生物的检验通常采用24h静置增菌培养，这种方法可以尽可能降低非菌体DNA对于PCR扩增的抑制作用从而提高检测灵敏度，但是延长了检测时间，同时降低检测效率。本实施例采用恒温震荡增菌培养结合差速离心法制备混合样品的DNA，仅用5h可使待检菌浓度达到可检测水平，加上PCR反应时间，可在8h内获得检测结果，大大提高了检测效率。
实施例4
一种化妆水样品中沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测方法，在无菌化妆水中添加沙门菌或大肠杆菌O78后增菌培养，提取化妆水样品中总DNA，利用实施例1中所述体系进行多重PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1.
上述化妆水样品中沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤：
取107cfu/mL的沙门菌和大肠杆菌O78用灭菌化妆水10倍比梯度稀释，分别取不同浓度的化妆水稀释菌液100uL加入900uL LB液体培养基中，37℃250rpm增菌5h；SDS法裂解制备DNA模板。
利用实施例1中所建立的多重PCR扩增体系对上述DNA模板进行扩增，反应体系和反应条件同前“多重PCR扩增反应体系的建立”。电泳结果见附图6。附图6中，M1为沙门菌和O78等量DNA混合样品阳性质控；M6-M0分别为化妆水稀释浓度为106-100cfu/mL大肠杆菌O78和沙门菌混合菌液制备的DNA样品；Nc为ddH2O阴性对照。扩增结果表明：化妆水稀释浓度为106-102cfu/mL沙门菌和大肠杆菌O78的样品，多重PCR扩增均可产生约1000bp、750bp和500bp三条扩增条带；化妆水稀释浓度为101和100cfu/mL沙门菌和大肠杆菌O78的样品制备的DNA只能看到约1000bp O78的特异扩增条带，沙门菌约750bp的特异条带和约500bp的通用条带肉眼不可见；无假阳性或假阴性结果出现。此结果说明增菌培养5h后，化妆水中大肠杆菌O78的检测灵敏度约101cfu/mL，沙门菌的检测灵敏度约为103cfu/mL，呈现较好的检测灵敏度。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何使用本发明引物序列或部分序列(连续碱基相似度不高于50％)用于分子检测，包括各种等温或变温PCR以及基因芯片等分子杂交技术的应用均在本发明的权力要求保护范围之内。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (2)

1.用于沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测的引物组，其特征在于，所述引物组具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的引物组在制备检测沙门菌和大肠杆菌O78试剂盒的应用，其特征在于：包括有一条与细菌16s RNA特异结合的内参引物SEQ ID NO:1，两条与沙门菌基因序列特异结合的检测引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，两条与大肠杆菌O78基因序列特异结合的检测引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
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