CN101173315A

CN101173315A - 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、大肠杆菌多重pcr快速检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN101173315A
Application number: CNA2007101755193A
Authority: CN
Inventors: 罗云波; 许文涛; 黄昆仑; 白卫滨; 元延芳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2007-09-30
Filing date: 2007-09-30
Publication date: 2008-05-07

Abstract

本发明公开了一种简单快速同时检测沙门氏菌(Salmonella)、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)和大肠杆菌的方法并由此发明了一种检测试剂盒。首先采用热裂解法(沙门菌，大肠杆菌)和酶解法(李斯特菌)提取三种微生物的DNA模板，并分别针对沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)和大肠杆菌设计了特异性的引物，实际扩增片段分别为沙门氏菌320bp、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)440bp、大肠杆菌706bp。本发明和经典方法的细菌分离、鉴定和血清学分型试验方法相比更快速、准确。且较一般的多重PCR方法特异性强，灵敏度高，能够同时对以上三种病原菌进行检测和鉴定。

Description

沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、大肠杆菌多重PCR快速检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，发明公开了一种同时检测沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌三种致病菌的多重PCR的方法的和检测试剂盒。

背景技术

沙门菌、产单核细胞李斯特菌是重要的人兽共患病原菌，是世界卫生组织WHO所列最主要的两种食源性致病菌。由沙门菌不仅能导致动物疾病还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒，由此引起的食物中毒病例在食物中毒中居于首位或第二位。产单核细胞李斯特菌是一种能引起动物和人类流产、败血症和脑膜炎等疾病的食源性病原体，新生儿、老年人、孕妇及免疫缺陷病人是产单核细胞李斯特菌感染的高危人群。在发达国家临床产单核细胞李斯特菌病的发病率大约为2～15/10万，死亡率为13％～34％，在美国每年约有2500例产单核细胞李斯特菌病病例，其中500例死亡。因此，尽管产单核细胞李斯特菌的病例不如其他食源性疾病常见，但它仍然是仅次于沙门菌感染的第二号致命的食源性感染性。世界各国，包括美国等发达国家，沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌引起的食源性污染日益增多，我国也不例外。这给国家的经济造成了巨大的损失，同时严重的威胁着人民的身体健康和生命安全。

沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌作为致病菌检测的一项重要的指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是必须检测的项目，有重要的社会和经济意义。传统的沙门菌、产单核细胞李斯特菌的国标和行标多采用传统的平板培养或酶联免疫反应的方法，至少需要7～10d的时间可以获得检验结果，操作分别采用不同的检验程序、方法，分别报告，检验方法繁琐、费时费力、特异性较低，这给食品的进出口带来了极大的不便。随着我国加入世界贸易组织进程的推进，国际贸易量与日俱增。因此，急需建立一种快速、准确、简便的细菌检验法方法。而同时检测多种治病菌微生物的技术更是具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快速、特异性强、灵敏度高的能够同时检测沙门氏菌(Salmonella)、产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和大肠杆菌三种病原菌的方法。本发明提供了一种同时检测沙门氏菌(Salmonella)、产单核细胞李斯特菌和大肠杆菌三种病原菌的试剂盒其特征正在于含有以下引物：

1检测沙门氏菌的引物：

Sal320-F：CCTTCCTTCCTTCCCCCCGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA

Sal320-R：

CCTTCCTTCCTTCCCCCCTCATCGCACCGTCAAAGGAACC

2检测单核细胞李斯特菌的引物：

LM440-F：CCTTCCTTCCTTCCCCCCATCATCGACGGCAACCTCGGAGAC

LM440-R：

CCTTCCTTCCTTCCCCCCCACCATTCCCAAGCTAAACCAGTGC

3检测大肠杆菌的引物：

Ecoli706-F：CCTTCCTTCCTTCCCCCCACCTGCGTTGCGTAAATA

Ecoli706-R：CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGGCGGGAGAAGTTGATG

4多重PCR扩增时的通用引物：

Universal primer：CCTTCCTTCCTTCCCCCC

本发明所述试剂盒中各项组分的终浓度分别为：检测沙门氏菌的引物终浓度为0.15μmol/L；检测李斯特菌的引物终浓度为0.15μmol/L；检测大肠杆菌的引物终浓度为0.15μmol/L；同用引物终浓度3μmol/L；Mg2+浓度为1.0mmol/L；dNTP0.175mmol/L；10×PCR反应缓冲液3μL；，Taq DNA聚合酶2U；用无菌水补足体积至30μL。

本发明还提供了一种检测方法，它包括如下步骤：

1)将模板DNA加入权利要求1所述的试剂盒中；

2)多重PCR在ABI7000PCR仪上进行，具体参数设置如下：95℃预变性5min；

95℃30s，60℃30s，72℃30s，35循环；

72度延伸7min，4℃30min结束PCR扩增。

3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳检测。电泳后扩增的特异性条带分别为：沙门氏菌2320bp、产单核细胞李斯特菌(440bp、大肠杆菌706bp。

本发明所述试剂盒的优点：

1)多重PCR方法操作简单，与各种病原菌的单重PCR方法一样具有良好的特异性，它对不同菌株的同一类细菌具有广泛的适应性。

2)多重PCR检测与各种病原菌的单重PCR方法一样具有具有较高的灵敏度，可以检测出痕量级的DNA模板。

3)该方法可以用于开发同时检测其他多种致病菌的试剂盒。

附图说明

图1：本发明试剂盒检测结果图

M：DL200 DNA Marker；1：空白对照；2，3，4：多重PCR单一检测出大肠杆菌、李斯特菌以及沙门菌；5：多重PCR同时检测出大肠杆菌和李斯特菌；6：多重PCR同时检测出沙门菌和李斯特菌；7：多重PCR同时检测出大肠杆菌和沙门菌；8：多重PCR同时检测出大肠杆菌、李斯特菌和沙门菌。

具体实施方案

1、采集待检样品、培养病原菌

采集待检样品，采集前后注意避免交叉污染，适当处理后分别接种于肉汤培养基37℃培养18h(培养沙门菌)，BHI(购自美国Difo公司，培养李斯特菌)培养基培养过夜，LB培养基(培养大肠杆菌)37℃培养过夜。

并分别对培养出来的菌液进行如下处理：

大肠杆菌和沙门菌：取0.5mL细菌培养液，置于Eppendorf管中，2000rpm离心20min，用灭菌蒸馏水洗涤两次，最后用1mL蒸馏水悬浮，水浴煮沸，8000rpm离心15min，取上清，即获得大肠杆菌和沙门氏菌的模板溶液。

李斯特菌：250ul过夜培养物加入Eppendorf管中，13000rpm离心10min，弃上清液，用95ul1×缓冲液混匀，加4ul溶菌酶(50mg/mL)，颠倒混匀，试问赋予15min；加1ul蛋白酶K(20mg/mL)，震荡数秒钟；58℃孵育直至菌液变得澄清；95℃加热8min，使酶失活；离心取上清液，即成产单核细胞李斯特菌DNA模板溶液。

2、病原菌模板DNA的制备

取1mL菌液8000rpm(4℃)离心3min，弃上清，并将残余液滴吸净。加入500TE(pH8.0)100℃煮沸10min；立即放入冰水混合物中，冷却后10000rpm(4℃)离心3min；取上清作为PCR反应模板，-20℃保存备用。

3、多重PCR反应

以提取的待检样品的基因组为模板按以下比例进行多重PCR反应：检测沙门氏菌的引物终浓度为0.15μmol/L；检测李斯特菌的引物终浓度为0.15μmol/L；检测大肠杆菌的引物终浓度为0.15μmol/L；同用引物终浓度3μmol/L；Mg2+浓度为1.0mmol/L；dNTP0.175mmol/L；10×PCR反应缓冲液3μL；，Taq DNA聚合酶2U；待检样品模板基因组2ul，用无菌水补足体积至30μL样品。

多重PCR反应在ABI7000中进行，具体的参数条件如下：95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，35循环；72度延伸7min，4℃30min结束PCR扩增。

4、PCR扩增产物的鉴定

用l×TAE缓冲液配置成2％的琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解后加入golden view(5mg/mL)至终浓度为0.5μg/mL，倒胶然后取适量待电泳的PCR产物与1/6体积的电泳上样液(0.25％溴酚蓝；0.25％二甲苯青FF；40％蔗糖)混匀，将PCR产物加到上样槽中，在5V/cm电压下进行恒压电泳。当样品电泳至适当的位置后，在紫外凝胶成像系统(Bio-Rad，Gel Doc2000)观察结果并拍照记录。电泳后扩增的目的片段为沙门氏菌404bp、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)284bp、大肠杆菌670bp。有以上片段则认为检验出阳性结果，无此片段则认为检测结果为阴性。

5、PCR扩增产物的序列鉴定

利用DNA回收试剂盒(大连宝生物公司)从琼脂糖凝胶中回收PCR产物进行克隆和(PGEM-Tvector)和DNA序列测定。DNA序列测定由上海联合基因公司完成。

Claims

1.沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、大肠杆菌多重PCR快速检测试剂盒及其应用，其特征在于经过一次简单的多重PCR可以达到同时检测沙门氏菌、大肠杆菌和产单核细胞李斯特菌的目的。

2.根据权利要求1所述沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、大肠杆菌多重PCR快速检测试剂盒及其应用其特征在于，在进行多重PCR时对产单核细胞李斯特菌进行扩增时所需要的引物：

LM440-F：CCTTCCTTCCTTCCCCCCATCATCGACGGCAACCTCGGAGAC

LM440-R：CCTTCCTTCCTTCCCCCCCACCATTCCCAAGCTAAACCAGTGC

对沙门氏菌进行扩增时所需要的引物：

Sal320-F：CCTTCCTTCCTTCCCCCCGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA

Sal320-R：

CCTTCCTTCCTTCCCCCCTCATCGCACCGTCAAAGGAACC

对大肠杆菌进行扩增时所需要的引物：

Ecoli706-F：CCTTCCTTCCTTCCCCCCACCTGCGTTGCGTAAATA

Ecoli706-R：CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGGCGGGAGAAGTTGATG

进行多重PCR扩增时所需要的通用引物：

Universal primer：CCTTCCTTCCTTCCCCCC

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：各组分的终浓度分别为：检测沙门氏菌的引物终浓度为0.15μmol/L；检测李斯特菌的引物终浓度为0.15μmol/L；检测大肠杆菌的引物终浓度为0.15μmol/L；同用引物终浓度3μmol/L；Mg2+浓度为1.0mmol/L；dNTP0.175 mmol/L；10×PCR反应缓冲液3μL；，Taq DNA聚合酶2U；用无菌水补足体积至30μL。

4.一种检测方法：

1)将模板DNA加入权利要求的1或2所述的试剂盒中；

2)在pcr仪上进行目的基因的扩增，PCR条件如下：

95℃预变性5min；

95℃30s，60℃30s，72℃30s，35循环；

72℃延伸7min，4℃30min结束PCR扩增。

3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳检测。

5.根据权利要求4的检测方法，其中电泳后扩增的特异性条带分别为：

沙门氏菌320bp、产单核细胞李斯特菌440bp、大肠杆菌706bp。

6.权利要求1或2所述试剂盒在检测沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、大肠杆菌中的应用。