CN101575637B

CN101575637B - 土壤中病原细菌的多重pcr检测方法

Info

Publication number: CN101575637B
Application number: CN200910026868A
Authority: CN
Inventors: 钟文辉; 尹睿; 刘燕; 李建林
Original assignee: Institute of Soil Science of CAS
Current assignee: Institute of Soil Science of CAS
Priority date: 2009-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2029-05-27
Also published as: CN101575637A

Abstract

一种土壤中病原菌多重PCR快速检测方法，其特征在于，采用多重PCR一次性同时扩增致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和福氏志贺菌的特异性基因：phoA、ttrBCA、vicK、ecfX、ipaH和virA，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。本发明克服了常规病原菌检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，充分发挥多重PCR技术在土壤病原菌检测中的应用，尽量增加病原菌的种类和引物的对数，提高检测的特异性和灵敏度。

Description

土壤中病原细菌的多重PCR检测方法

一、技术领域

本发明涉及一种用于土壤中病原细菌检测的多重PCR扩增方法，具体涉及多重PCR检测方法在被大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺氏菌(Shigella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)污染的土壤样品分析中的应用。

二、背景技术

快速检测与鉴定土壤环境中的病原菌是及时有效地控制与预防病原菌传播的前提，对人类健康具有重要意义。目前对病原细菌的检测方法，主要依靠常规的细菌学培养方法，一般需4～7d，操作繁琐，费时耗力；有关病原细菌检测的乳胶凝集法、免疫磁珠分离法、酶免疫测定方法、核酸杂交技术和PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单、检测快速等优点而被广泛应用，但这些方法每次实验通常只能检测一种病原细菌。本发明主要基于通用靶标gyrB基因的PCR扩增技术和多重PCR扩增技术快速检测土壤中的5种典型病原菌：致病性大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌，达到一次性、同时、快速检测出多种土壤病原菌的目的。

本发明所筛选的各病原菌基因均具有较强的特异性和灵敏性。大肠杆菌phoA基因是其持家基因，存在于所有大肠杆菌中；沙门氏菌的ttrBCA基因编码的是连四硫酸盐还原酶结构蛋白，沙门氏菌基因组中较为保守的序列；金黄色葡萄球菌vicK基因只存在于金黄色葡萄球菌中，在其它葡萄球菌和病原菌中均检测不出；志贺氏菌的ipaH基因存在于所有志贺菌属的质粒和染色体上，具有高度特异性，比其他毒力因子ipaB、C、D基因有更高的灵敏度，是侵袭力的特异标志；志贺氏菌的virA基因存在于所有志贺氏菌和侵染性大肠杆菌(EIEC)中，具有较高的特异性和灵敏度，目的条带为215bp；铜绿假单胞菌的ecfX基因是有关血红素或毒性的基因。本发明筛选合成这6对特异性引物通过不同的组合进行多重PCR扩增检测，以达到快速检测土壤样品中病原菌的目的。

三、发明内容

技术问题：本发明目的在于克服常规病原菌检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，充分发挥多重PCR技术在土壤病原菌检测中的应用，尽量增加病原菌的种类和引物的对数，提高检测的特异性和灵敏度。

技术方案：一种土壤中病原菌多重PCR快速检测方法，采用多重PCR一次性同时扩增致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和福氏志贺菌的特异性基因：phoA、ttrBCA、vicK、ecfX、ipaH和virA，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

一种多重PCR快速检测方法，所述多重PCR扩增土壤中病原菌特异性基因，包括如下步骤：

(1)土壤样品的采集及预处理：取距离土层表面1～5cm的土壤，装入灭菌封口塑料袋中，去除样品中带有的植物残体、沙石等大颗粒，研磨过20目筛，-80℃保存备用；

(2)DNA模板提取：

①取步骤1预处理过的土壤样品，采用土壤DNA提取试剂盒和核酸提取仪提取和纯化土壤中的细菌总DNA；

②取未被病原菌污染的土壤样品，采用土壤DNA提取试剂盒和核酸提取仪提取和纯化土壤中的细菌总DNA；

(3)多重PCR扩增检测土壤中病原菌的毒素基因、高度保守性基因及特异性基因phoA、ttrBCA、vicK、virA或ipaH、ecfX，具体步骤如下：

反应体系：总体系30μL

H₂O 9.5μL；

缓冲液(10×PCR) 3.0μL；

MgCl₂(25mM) 1.5μL；

dNTP(2.5mM) 2.5μL；

phoA正向(10μmol/L) 0.5μL，

phoA反向(10μmol/L) 0.5μL；

ttrC-13(10μmol/L) 2μL，

ttrB-1(10μmol/L) 2μL；

vicK1(10μmol/L) 1.5μL，

vicK2(10μmol/L) 1.5μL；

virA-F(10μmol/L) 1μL，

virA-R(10μmol/L) 1μL；或

【ipaH-U1(10μmol/L) 1μL，

ipaH-L1(10μmol/L) 1μL；】

ECF1(10μmol/L) 1μL，

ECF2(10μmol/L) 1μL；

模板DNA 1μL，

Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL。

引物：

致病性大肠杆菌引物为：

phoA正向：5′-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3′，

phoA反向：5′-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3′；

沙门氏菌引物为：

ttrC-13：5′-ACTGCCGATAAATGCACGTT-3′，

ttrB-1：5′-CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA-3′；

金黄色葡萄球菌引物为：

vicK1：5′-CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA-3′，

vicK2：5′-TCCTGCACAATCGTACTAAA-3′；

福氏志贺菌引物为：

【virA-F：5′-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA-3′，

virA-R：5′-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3′；】或

【ipaH-U1：5′-CCTTTTCCGCGTTCCTTGA-3′，

ipaH-L1：5′-CGGAATCCGGAGGTATTGC-3′；】

铜绿假单胞菌引物为：

ECF1：5′-ATGGATGAGCGCTTCCGTG-3′，

ECF2：5′-TCATCCTTCGCCTCCCTG-3′。

(4)PCR反应循环参数如下：

95℃5min；(95℃1min，55℃1min，72℃1min)30个循环；72℃10min；10℃保存

(5)电泳检测鉴定：

对多重PCR反应产物进行电泳检测，电泳图中含有622bp、528bp、418bp、289bp、112bp或215bp相应目的条带的一种或多种，分别对应于样本中的致病性大肠杆菌phoA基因、铜绿假单胞菌ecfX基因、沙门氏菌ttrBCA基因、金黄色葡萄球菌vicK基因、福氏致贺菌ipaH基因或virA基因的一种或多种。

多重PCR检测方法，步骤(5)中的电泳检测鉴定的具体操作方法如下：以0.5×TBE缓冲液配制2％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至50～60℃，倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入倒有TBE缓冲液的电泳槽中；再将8μL PCR扩增产物与2μL6×上样缓冲液的混合液依次加入加样孔内；200V恒压电泳25～35min；断电源，取出琼脂糖凝胶，置于1μg/mL的溴化乙锭中浸泡10～15min，取出置于紫外凝胶成像系统中观察分析结果。

本发明所提及的病原菌由中国科学学院南京土壤研究所和常州进出口免疫处提供：大肠杆菌(Escherichia coli)：ATCC 25922；沙门氏菌(salmonella)：鼠伤寒沙门氏菌(S.typhi)ATCC50071、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)50073、肠炎沙门氏菌(S.enteria)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：ATCC 25923、A号ATCC、MH，福氏志贺菌(Sh.flexneri)51302；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)。所有菌株均接种于牛肉膏蛋白胨营养琼脂斜面上(Luria Bertani，LB)，37℃培养18-24h，平皿转接3次后备用

本发明所用主要试剂及试剂盒：TaqDNA聚合酶、dNTP、引物、50bp DNALadder(上海生工生物工程技术服务有限公司)，100bp DNA Ladder(上海生工生物工程技术服务有限公司)，琼脂糖(中国惠兴生化试剂有限公司)，SPIN Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，Solon，OH，USA)。

本发明所用主要仪器：PTC-100PCR仪(MJ Research，Waltham，MA，USA)，高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，DYY-8B型电泳仪(北京市六一仪器厂)，凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories，Segrate，Italy)，FastPrepTMFP120核酸提取仪(Bio 101，Carlsbad，CA，USA)。

本发明所用的土壤中细菌的DNA提取方法：采用

SPIN Kit for Soil试剂盒和FastPrep^TM FP120核酸提取仪提取和纯化土壤样品总DNA，具体方法参见生产商使用说明。主要过程为称取500mg新鲜土壤样品到含有陶瓷和硅土微粒的裂解管中，再加入978μL磷酸钠缓冲液和122μL微管缓冲液，将管子放入FastPrep^TM FP120核酸提取仪，设置速度为6.0并运行40秒，最后用硅胶柱过滤并洗脱总DNA进行纯化，提取的总DNA分装分别置于4℃和-20℃保存。

本发明根据文献基于每种病原菌的毒素基因、高度保守性基因及特异性基因合成6对特异性引物，见表1。

表1特异性引物信息

本发明所述多重PCR扩增体系和反应参数如下：

多重PCR扩增土壤中病原菌的phoA、ttrBCA、vicK、virA或ipaH、ecfX基因的反应体系为：总体系30μL，超纯水9.5μL，10×PCR缓冲液3μL；Mg²⁺(25mmol/L)1.5μL；dNTP(2.5mmol/L)2.5μL；引物(10μmol/L)phoA正向、phoA反向、各0.5μL，virA-F、virA-R或ipaH-U1、ipaH-L1各1μL、ECF1、ECF2各1μL，vicK1、vicK2各1.5μL，ttrC-13、ttrB-1各2μL；DNA1μL；TaqDNA聚合酶2.5U。

多重PCR反应参数：95℃5min；(95℃1min，55℃1min，72℃1min)30个循环；72℃10min，10℃保存。

有益效果：土壤环境比较复杂，影响因子较多，传统的检测方法无法对土壤中难培养或不可培养的致病菌进行检测，而且特异性不高、灵敏度低、操作烦琐、耗时，还不能实现有效的监测、预防作用。本发明所建立的多重PCR技术能克服以上不足，多重PCR扩增结果表明6对特异性引物：致病性大肠杆菌phoA正向、phoA反向，沙门氏菌ttrC-13、ttrB-1，金黄色葡萄球菌vicK1、vicK2，志贺氏菌ipaH-U1、ipaH-L1和virA-F、virA-R，铜绿假单胞菌ECF1、ECF2都具有较高的检测特异性和灵敏度。对土壤中存在的典型病原菌进行全面、系统、准确的检测与鉴定；所有反应可在同一PCR管中进行，操作简单、快速，具很高的特异性和敏感度，为快速检测与鉴定病原菌提供了有效的手段，可以推广应用于环境监测、土壤质量检测等领域；并为其它土壤中不同致病菌检测组合提供技术模式，可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，具有显著的经济与社会效益。

四、附图说明

图1为多重PCR扩增检测土壤中病原菌结果：M：DNA Maker(100bp)；泳道1～15分别对应：1、大肠杆菌+铜绿假单胞菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；2、大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；3、大肠杆菌+福氏志贺氏菌；4、大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+福氏致贺氏菌；5、大肠杆菌+铜绿假单胞菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；6、大肠杆菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；7、大肠杆菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌；8、大肠杆菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；9、大肠杆菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；10、大肠杆菌；11、沙门氏菌；12、金黄色葡萄球菌；13、福氏志贺氏菌；14、福氏志贺氏菌；15、铜绿假单胞菌。

五、具体实施方式

实施例1：

土壤样品的采集及预处理：取距离土层表面1～5cm的土壤，装入灭菌封口塑料袋中。去除样品中带有的植物残体、沙石等大颗粒，研磨过筛(20目筛)，称取100g土样-80℃保存备用。

土壤中菌体DNA提取：采用

SPIN Kit for Soil试剂盒和FastPrep^TMFP120核酸提取仪(Bio 101，Carlsbad，CA，USA)提取和纯化土壤样品总DNA，具体方法参见生产商使用说明。主要过程为称取500mg新鲜土壤样品到含有陶瓷和硅土微粒的裂解管中，再加入978μL磷酸钠缓冲液和122μL微管缓冲液，将管子放入FastPrep^TM FP120核酸提取仪，设置速度为6.0并运行40秒，最后用硅胶柱过滤并洗脱总DNA进行纯化，提取的总DNA分装分别置于4℃和-20℃保存备用。

PCR扩增总体系25μL，在200μLPCR小管中依次加入9.5μL超纯水；2.5μL10×PCR缓冲液；1.5μL Mg²⁺(25mmol/L)；2.5μL dNTP(2.5mmol/L)；引物(10μmol/L)phoA正向、phoA反向、各0.5μL，virA-F、virA-R或ipaH-U1、ipaH-L1各1μL、ECF1、ECF2各1μL，vicK1、vicK2各1.5μL，ttrC-13、ttrB-1各2μL；DNA1μL；最后加Taq DNA聚合酶2.5U，手指轻弹混匀，3000rpm离心30s，放入PCR仪。

引物序列如下：致病性大肠杆菌上下游引物分别为phoA正向：5′-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3′，phoA反向：5′-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3′，扩增片段长度为622bp；沙门氏菌上下游引物分别为：ttrC-13：5′-ACTGCCGATAAATGCACGTT-3′，ttrB-1：5′-CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA-3′，扩增片段长度为418bp；金黄色葡萄球菌上下游引物分别为：vicK1：5′-CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA-3′，vicK2：5′-TCCTGCACAATCGTACTAAA-3′，扩增片段长度为289bp；福氏志贺菌两对上下游引物分别为：virA-F：5′-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA-3′，virA-R：5′-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3′，和ipaH-U1：5′-CCTTTTCCGCGTTCCTTGA-3′，ipaH-L1：5′-CGGAATCCGGAGGTATTGC-3′，扩增片段长度分别为215bp和112bp；铜绿假单胞菌上下游引物分别为：ECF1：5′-ATGGATGAGCGCTTCCGTG-3′，ECF2：5′-TCATCCTTCGCCTCCCTG-3′，扩增片段长度为528bp。

设置PCR扩增反应参数：95℃5min；(95℃1min，55C 1min，72℃1min)30个循环；72℃10min，10℃保存。

PCR扩增结束后，电泳检测PCR扩增产物：以0.5×TBE缓冲液配制2％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至50-60℃，倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入倒有TBE缓冲液的电泳槽中；再将8μL PCR扩增产物与2μL6×上样缓冲液的混合液依次加入加样孔内；200V恒压电泳25-35min；切断电源，取出琼脂糖凝胶，置于1μg/ml的溴化钇锭中浸泡10～15min，取出置于紫外凝胶成像系统中观察分析结果，见图1。

如图1，M：DNA Maker(100bp)；泳道1～15分别对应：1、大肠杆菌+铜绿假单胞菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；2、大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；3、大肠杆菌+福氏志贺氏菌；4、大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+福氏致贺氏菌；5、大肠杆菌+铜绿假单胞菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；6、大肠杆菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；7、大肠杆菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌；8、大肠杆菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；9、大肠杆菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；10、大肠杆菌；11、沙门氏菌；12、金黄色葡萄球菌；13、福氏志贺氏菌；14、福氏志贺氏菌；15、铜绿假单胞菌。

序列表

<110>中国科学院南京土壤研究所

<120>土壤中病原细菌的多重PCR检测方法

<130>

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>1

tacaggtgac tgcgggctta tc 22

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>2

cttaccgggc aatacactca cta 23

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>沙门氏菌

<400>3

actgccgata aatgcacgtt 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>沙门氏菌

<400>4

cttttttccg ccagtgaaga 20

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>5

ctaatactga aagtgagaaa cgta 24

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>6

tcctgcacaa tcgtactaaa 20

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>志贺氏菌

<400>7

ccttttccgc gttccttga 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>志贺氏菌

<400>8

cggaatccgg aggtattgc 19

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>志贺氏菌

<400>9

ctgcattctg gcaatctctt caca 24

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>志贺氏菌

<400>10

tgatgagcta acttcgtaag ccctcc 26

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>铜绿假单胞菌

<400>11

atggatgagc gcttccgtg 19

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>铜绿假单胞菌

<400>12

tcatccttcg cctccctg 18

Claims

1.一种土壤中病原菌多重PCR快速检测方法，其特征在于，采用多重PCR一次性同时扩增致病性大肠杆菌phoA、沙门氏菌ttrBCA、金黄色葡萄球菌vicK、铜绿假单胞菌ecfX、和福氏志贺菌的特异性基因ipaH或virA，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其中引物为：

致病性大肠杆菌引物为：

phoA正向：5′-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3′，

phoA反向：5′-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3′；

沙门氏菌引物为：

ttrC-13：5′-ACTGCCGATAAATGCACGTT-3′，

ttrB-1：5′-CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA-3′；

金黄色葡萄球菌引物为：

vicK1：5′-CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA-3′，

vicK2：5′-TCCTGCACAATCGTACTAAA-3′；

福氏志贺菌引物为：

virA-F：5′-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA-3′，

virA-R：5′-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3′；或

ipaH-U1：5′-CCTTTTCCGCGTTCCTTGA-3′，

ipaH-L1：5′-CGGAATCCGGAGGTATTGC-3′；

铜绿假单胞菌引物为：

ECF1：5′-ATGGATGAGCGCTTCCGTG-3′，

ECF2：5′-TCATCCTTCGCCTCCCTG-3′。

2.一种如权利要求1所述的多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增土壤中病原菌特异性基因，包括如下步骤：

(2)DNA模板提取：

反应体系：总体系30μL

H₂O 9.5μL；

缓冲液10×PCR 3.0μL；

MgCl₂25mM 1.5μL；

dNTP 2.5mM 2.5μL；

phoA正向10μmol/L 0.5μL，

phoA反向10μmol/L 0.5μL；

ttrC-13 10μmol/L 2μL，

ttrB-1 10μmol/L 2μL；

vicK1 10μmol/L 1.5μL，

vicK2 10μmol/L 1.5μL；

virA-F 10μmol/L 1μL，

virA-R 10μmol/L 1μL；或

ipaH-U1 10μmol/L 1μL，

ipaH-L1 10μmol/L 1μL；

ECF1 10μmol/L 1μL，

ECF2 10μmol/L 1μL；

模板DNA 1μL，

TaqDNA聚合酶5U/μL 0.5μL；

引物：

致病性大肠杆菌引物为：

phoA正向：5′-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3′，

phoA反向：5′-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3′；

沙门氏菌引物为：

ttrC-13：5′-ACTGCCGATAAATGCACGTT-3′，

ttrB-1：5′-CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA-3′；

金黄色葡萄球菌引物为：

vicK1：5′-CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA-3′，

vicK2：5′-TCCTGCACAATCGTACTAAA-3′；

福氏志贺菌引物为：

virA-F：5′-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA-3′，

virA-R：5′-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3′；或

ipaH-U1：5′-CCTTTTCCGCGTTCCTTGA-3′，

ipaH-L1：5′-CGGAATCCGGAGGTATTGC-3′；

铜绿假单胞菌引物为：

ECF1：5′-ATGGATGAGCGCTTCCGTG-3′，

ECF2：5′-TCATCCTTCGCCTCCCTG-3′；

(4)PCR反应循环参数如下：

95℃5min；以95℃1min，55℃1min，72℃1min为1个循环，共进行30个上述循环；72℃10min；10℃保存；

(5)电泳检测鉴定：