CN104531861A - 一种阪崎肠杆菌的分子检测方法及其应用 - Google Patents
一种阪崎肠杆菌的分子检测方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种阪崎肠杆菌的分子检测方法，采用单引物等温扩增方法，阪崎肠杆菌ompA基因序列为靶序列，SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号；本发明还涉及所述的检测方法在婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌检测中的应用。本发明提供的扩增方法具有特异性强、灵敏度高、快速、简便的优点，同时对模板DNA要求较低，因此能够用于检测效果明显、成本低廉的检测体系的建立，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阪崎肠杆菌的分子检测方法及其应用。
背景技术
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii )是肠杆菌属的一种条件性致病菌，在极其微量的情况下都有致病性，该菌可导致婴幼儿（尤其是新生儿）脑膜炎、小肠结肠炎和败血症，甚至遗留神经系统后遗症或导致死亡，死亡率高达20 %～50 %。尽管阪崎肠杆菌可以从多种食品中检出，但在新生儿感染该菌事件的调查中发现婴儿配方奶粉是主要的感染渠道。即使是婴儿配方奶粉中大肠菌群污染水平符合相应的微生物学标准，也可能存在阪崎肠杆菌的污染。FAO/WHO在2004年召开了两次国际相关会议，倡导采用国际通用的分子生物学方法来检测阪崎肠杆菌，以弥补传统方法的局限性。因此检测阪崎肠杆菌的方法是否灵敏、特异及快速至关重要。目前对阪崎肠杆菌的检测方法主要有FDA推荐的传统检测方法，免疫学方法和各种PCR方法。传统检测方法操作繁琐，检测时间长，而且灵敏度较低；免疫学方法的特异性和灵敏度均较低；PCR方法敏感、准确、快速，可替代传统检测方法，但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程以及对检测人员较高的技术要求，而使其难以普及和推广。近年来，阪崎肠杆菌的生化及分子检测方法取得重要进展，基于保守序列如16S rRNA、23S rRNA以及16S - 23S rRNA间区序列( ITS) 等，以及基于其特异性基因的分子检测技术也相继建立。但是目前还没有建立一种稳定检测实际样品中阪崎肠杆菌的分子分型技术。高旗利等（高旗利,张霞,罗茂凰等.奶粉中阪崎肠杆菌PCR 检测方法研究[J]. 检验检疫科学, 2005, 15(4):4-8.）利用细菌 16S 和 23S rDNA 的保守区作为通用引物，对 6 株阪崎肠杆菌 16S~ 23S rDNA 区间序列( ISR) 进行了扩增和测序，建立了奶粉中阪崎肠杆菌 PCR 检测方法，奶粉样品中阪崎肠杆菌检测低限为2. 2~ 5. 4cfu/ 100g。Seo等（Seo K H, Brackett R E. Rapid, Specific Detection of Enterobacter sakazakii in Infant Formula Using a Real-Time PCR Assay[J]. Journal of Food Protection, 2005,68（1）:59-63.）建立了阪崎肠杆菌实时荧光定量 PCR 方法，灵敏性为 100CFU/mL PBS，增菌后检测限可达到 0.6 CFU/g婴儿配方奶粉。张霞等（张霞, 高旗利, 罗茂凰等.实时荧光PCR对奶粉中坂崎肠杆菌的检测[J]. 中国卫生检验杂志,2006, 16(2):214-241.）建立的实时荧光 PCR 方法检测灵敏度可达到 1.1 CFU/100 g。 张朝等（张朝;荧光定量PCR检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌研究[D];河北农业大学;2007年）以阪崎肠杆菌的16S rRNA基因为靶基因，建立的加入内标荧光定量PCR检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的方法，灵敏度可以达到8.624拷贝/μL，2.7CFU/mL；人工污染检测限可以达到14.117拷贝/μL，3.5CFU/100g婴儿配方奶粉。张宏伟等（张宏伟,于佳,郑文杰等.利用环介导等温扩增技术对奶粉中阪崎肠杆菌进行检测[J].食品研究与开发, 2009,30(6):114-117.）建立的奶粉中阪崎肠杆菌中环介导等温扩增方法，检测低限为1.2 CFU/100 g。
单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification，SPIA）是近年报道的一种新型线性核酸等温扩增技术。该技术具有操作设备简单、高忠实性、高效率和有效防污染等优点。美国的NuGEN公司已经开发出专门用于RNA扩增的Ribo-SPIA相关产品。Potash等成功应用Ribo-SPIA技术从生物样品中扩增全基因组cDNA对重组病毒EcoHIV感染小鼠后感染应激基因表达情况进行研究。Whitworth等在分析猪胚胎不同发育阶段基因表达差异时也应用了Ribo-SPIA技术进行mRNA的扩增和转录。目前应用较成熟的单引物等温扩增技术均以病毒作为对象，其扩增后的检测方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用此种方法检出的灵敏度低，易产生沉淀，且结果假阳性高，尤其不适应于原核微生物的扩增检出。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作方便快速、灵敏度高、特异性强、检测成本低的阪崎肠杆菌检测方法及其应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案为：
一种阪崎肠杆菌的分子检测方法，其采用单引物等温扩增方法，以SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号，即以实时荧光定量PCR检测扩增信号，具体过程包括如下步骤：
（1）取含阪崎肠杆菌的待检样品，提取基因组DNA；
（2）建立阪崎肠杆菌的实时荧光单引物等温扩增的25 μL反应体系：
其中RNA/DNA组合引物为2.8 μmol/L、Blocker为0.2 μmol/L、Mg2+为5.0 mmol/L、dNTPs为1.0 mmol/L、BST DNA聚合酶为20U、RNase H酶为2.5U、RNase Inhibitor为32U、SYBER GreenⅡ为0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；
所述SYBER GreenⅡ为300倍稀释；
将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上55℃ 反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；
（3）检测分析：分析检测数据；
所述引物选用GGUCCGAC-TCACGAAAGCC 5’端8nt碱基为RNA序列，3’端11nt碱基为DNA序列；Blocker选用CGACGACCACGACA ，3’端用生物素修饰，中间随机加上两个IXNA修饰。
优选的，所述IXNA包括A，C，G，T，U，mC六种堿基中的一种。
优选的，步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。
优选的，所述提取DNA方法采用商业化试剂盒法。
本发明还提供所述检测方法在婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌检测中的应用。
本发明所述XNA，即LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物，包括A，C，G，T，U，mC六种堿基。XNA结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构。一般可见于A-DNA或RNA。
本发明所述的普通热裂解法步骤如下：
（1）取1 mL菌液转入1.5 mL Eppendorf离心管中5000-8000 rpm，离心5 min，弃上清。
（2）加入200 uL无菌DEPC水，振荡混匀，5000-8000 rpm，离心5 min，弃上清，重复操作一次。
（3）加入100 uL无菌DEPC水，振荡混匀，100℃水浴10 min，12000 rpm离心10 min，取上清，-20 ℃保存备用。
本发明所述的蛋白酶K法步骤如下：
①将1mL培养液以12，000 rpm，离心10分钟。弃去上清液，沉淀加蛋白酶K消化液50～100 μL，混匀，55℃水浴1～3 h。
②加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿/异戊醇（49：1）抽提一次。
③上清加1/10体积4℃预冷的3 mol/L NaAC（pH 5.2），加2.5倍体积预冷的无水乙醇或等体积的异丙醇，-20℃放置5～10 min，14，000 rpm,离心15 min。
④小心吸弃或倒掉上清，沉淀加75%冰冷乙醇15，000 rpm，离心5 min洗涤1～2次。
⑤弃去上清，室温干燥后加DEPC水50 μL溶解，-20℃保存备用。
本发明所述的饱和酚提取法步骤如下：
①将1mL培养液以离心12000 rpm，10 min，收集菌体，加入裂解液50 μL，100℃水浴15 min，然后离心12000 rpm，10 min。
②取上清，加入等体积饱和酚混匀，室温15 min，稍加振荡，4℃离心12000 rpm ，30 min，吸取上层水相，此水相反复用酚抽提二次后，吸水相加入0.1 mL，3 mol/L醋酸钠(pH5.5)及0.2 mL 20℃预冷的无水乙醇，混匀后放置于20℃，至少1 h。
③4℃离心12000 rpm ，10 min，小心倒去上清，加入灭菌DEPC水溶解DNA，-20℃保存备用。
本发明所述的商业化试剂盒法步骤如下：
选用天根细菌基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书进行基因组DNA的提取。
⑴将1mL培养液10,000rpm，离心1min，尽量吸净上清液。
⑵向菌体沉淀中加入200μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
⑶向管中加入20μlProteinase K 溶液，混匀。
⑷加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min, 溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑸加入220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec,此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑹将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30sec，弃去收集管中的全部废液。将吸附柱CB3放回收集管中。
⑺向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑻向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑼重复操作步骤⑻。
⑽将吸附柱CB3放入收集管中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
⑾将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱冲液TE，室温放置2-5min，12,000离心,2min，将溶液收集到离心管中。-20℃保存备用。
本发明的发明构思为：在单引物等温扩增技术的基础上加入荧光染料，建立实时荧光单引物等温扩增方法，可通过实时荧光检测仪对荧光信号进行实时检测，具有操作简单、耗时短、实时监控等优点。阪崎肠杆菌外膜蛋白A 基因(ompA)，具有高度保守性，能够很好地将阪崎肠杆菌与肠杆菌科其他属、种区分。
本发明的积极效果在于：
SPIA技术相对于其它检测方法有明显优势，首先是等温扩增，其反应无需温度循环等温条件下即可实现扩增反应使反应更方便省时；其次SPIA扩增具有较高的效率，因为在同一个模板分子上RNase H不需要等前一次合成结束即可进行引物RNA切割，新引物可以不断结合引发多个合成反应同时进行；然后该方法可以有效防污染，扩增产物污染造成假阳性的现象是常规核酸扩增技术（如PCR）常常出现的问题，而SPIA能有效防止这种污染，因为SPIA的DNA扩增产物缺少5’端引物区大部分序列，因此这些产物无法与引物结合进行扩增反应，从而有效避免了扩增产物污染的可能性；最后SPIA独特的依赖RNase H的特点，使其对RNA序列无直接扩增作用，因此可以在存在大量mRNA的情况下特异扩增基因组DNA序列，可以用于基因量的准确定量。SPIA技术的缺点是其引物合成相对复杂，因为引物为DNA和RNA组成的混合引物，因此在合成是较常规的单纯DNA或RNA引物合成相对复杂；且需要碱基修饰，因为blocker需要对碱基修饰以增强其与模板的结合力。
本发明在普通SPIA的基础上，采用加入特异性结合单链DNA的荧光染料SYBER GreenⅡ，以ompA基因为靶序列，利用荧光仪进行实时监测扩增情况，建立了实时荧光SPIA检测方法。本发明可省去烦琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测过程，比PCR技术和普通SPIA技术省时省力，成为可以替代PCR的核酸扩增新技术。本发明应用实时荧光SPIA检测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌的研究，建立了一种更为特异、敏感的分子检测实际样品中阪崎肠杆菌的新技术。本文建立的实时荧光SPIA法检测方法，其反应时间仅为40min，对阪崎肠杆菌纯培养的灵敏度为1个拷贝/SPIA 反应，在检测婴儿配方奶粉模拟污染样品时其检出限是1.5CFU/100g，与环介导等温扩增方法的灵敏度相当，具有特异性强、灵敏度高、快速、简便的优点。
本发明中，当反应体系中只添加组合引物时，SPIA反应仍然能进行。在一些不需要特定位点终止的扩增反应中，可以不加任何引起链终止的序列，如扩增较短的核酸序列时，DNA聚合酶到模板末端自然终止。
本发明选用XNA，即LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物，这类核酸可以增加引物或探针的融解温度，加强其稳定性。
本发明建立的阪崎肠杆菌实时荧光SPIA方法具有很好的敏感性和特异性，同时对模板DNA要求较低，因此能够用于检测效果明显、成本低廉的检测体系的建立。随着对SPIA技术研究的不断深入，本发明的检测方面将发挥更大地优势，得到更全面的应用，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明阪崎肠杆菌实时荧光SPIA组合引物和Blocker扩增结果，图1中曲线1为阪崎肠杆菌，曲线2为DEPC H2O。
图2-5为阪崎肠杆菌实时荧光SPIA方法特异性检测结果，
图2中，1:阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii(ATCC29544);2-4: 阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii; 5-7: 单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes 、空肠弯曲杆菌Campylobacter jejuni、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium; 8:空白对照(DEPC H2O)；
图3中，1: 阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii;2-7: 大肠杆菌O157:H7 Escherichia coli O157：H7、宋内志贺氏菌Shigella sonnei、福氏志贺氏菌Shigella flexneri、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus、小肠结肠炎耶儿森氏菌Yersinia enterocolitica、乙型溶血性链球菌Streptococcus hemolytic-β;8:空白对照(DEPC H2O)；
图4中，1: 阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii;2-7: 大肠埃希氏菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida、河生肠杆菌Enterobacter amnigenus; 8:空白对照(DEPCH2O)；
图5中，1: 阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii; 2-7: 粘质沙雷氏菌Serratia marcescens、粪肠球菌Enterococcus faecalis、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii、肺炎克雷伯Klebsiella pneumoniae pneumoniae、奇异变形杆菌Proteus mirabilis、雷氏普罗威登斯菌Providencia rettgeri; 8:空白对照(DEPC H2O)。
图6为不同方法提取阪崎肠杆菌模板DNA检测效果比较，图6中1、商业化试剂盒法；2、普通热裂解法；3、蛋白酶K法；4、饱和酚提取法；5、空白对照(DEPCH2O)。
图7为阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法灵敏性试验，图7中：1、阪崎肠杆菌基因组DNA阳性对照；2、1.0×102copies；3、1.0×101copies；4、1.0×100copies；5、1.0×10-1copies；6、空白对照(DEPCH2O)。
图8为阪崎肠杆菌实时荧光SPIA对模拟样品中阪崎肠杆菌的检出限的检测图，图8中：1、阪崎肠杆菌基因组DNA阳性对照；2、1.5×102copies；3、1.5×101copies；4、1.5×100copies；5、1.5×10-1copies； 6、空白对照 (DEPC H2O)。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的附图和具体实施方式，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实验均由河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心生物实验室完成。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1试验菌株
本试验所用菌株见表1。
表 1试验用菌株
| 菌株编号 | 菌种名称 | 菌种来源 |
| 1 | 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii) | ATCC29544 |
| 2 | 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii ) | ATCC51329 |
| 3 | 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii ) | ATCC29004 |
| 4 | 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii ) | CICC21548 |
| 5 | 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) | ATCC19114 |
| 6 | 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) | ATCC33291 |
| 7 | 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium ) | CICC22956 |
| 8 | 大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157：H7) | CICC21530 |
| 9 | 宋内志贺氏菌(Shigella sonnei) | CICC21679 |
| 10 | 福氏志贺氏菌(Shigella flexneri) | CICC21678 |
| 11 | 蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus) | CICC10468 |
| 12 | 小肠结肠炎耶儿森氏菌(Yersinia enterocolitica) | CICC21609 |
| 13 | 大肠埃希氏菌(Escherichia coli) | CMCC44102 |
| 14 | 乙型溶血性链球菌(Streptococcus hemolytic-β) | CMCC10373 |
| 15 | 金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) | ATCC6538 |
| 16 | 嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) | ATCC 13637 |
| 17 | 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) | ATCC 21424 |
| 18 | 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) | ATCC 17485 |
| 19 | 河生肠杆菌 ( Enterobacter amnigenus ) | ATCC 51816 |
| 20 | 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) | ATCC 14756 |
| 21 | 粪肠球菌(Enterococcus faecalis) | ATCC 29212 |
| 22 | 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii) | ATCC 10787 |
| 23 | 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae pneumoniae) | ATCC 4352 |
| 24 | 奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) | ATCC 29906 |
| 25 | 雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri) | ATCC29944 |
注：ATCC购自美国菌种保藏中心；CICC购自中国工业微生物菌种保藏中心；CMCC购自中国药检所。
1.1.2主要试剂
BstDNA聚合酶、RNase H、RNA酶抑制剂、MgCl2、dNTPs、SYBER GreenⅡ等购自于上海生工生物工程有限公司；基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；试验中所有培养基均购自北京陆桥有限责任公司；试验中所用到的婴儿配方奶粉均购自当地超市。
1.1.3主要设备
C7型实时荧光定量PCR仪（GNM-C7-8，北京金诺美生物技术有限公司）、PCR扩增仪（Whatman T Gradient 基因扩增仪，德国Biometra公司）、核酸蛋白分析仪（Eppendorf Biophotometer plus，德国Eppendorf公司）等。
1.1.4RNA/DNA组合引物和Blocker的设计和合成
根据Genebank中阪崎肠杆菌ompA基因（基因号：AY702093 ）己知序列，对其进行同源性分析，确定其保守序列，用Primer premier5.0设计组合引物和相应链终止序列，如表2所示。组合引物和Blocker均由大连TAKARA公司合成。
用于SPIA扩增的组合引物的设计要合理，要充分考虑其长度及组成。一般引物的总长度在10～40nt，最佳长度为20～25nt，其中DNA部分最佳长度为7～12nt，RNA部分最佳长度为5～10nt。引物的组成需要符合引物设计的一般原则，如GC含量和Tm适中。
链终止多聚核苷酸（Blocker）能与模板紧密结合，起终止DNA聚合酶延伸合成、决定扩增终止位点的作用。Blocker序列的长度一般为10～15nt，其与靶序列结合的位置位于靶序列的5’端外部。在碱基组成上，blocker序列通常掺有一个或多个修饰碱基，用于增强其与模板的结合力。修饰的方法较多，如使用带有G夹杂环的胞嘧啶，或使用高GC含量序列等。Blocker 3’-OH需要经过替代或修饰处理，如用小分子生物素阻塞3’端，抑制其作为引物引发非特异扩增的功能。
表2实时荧光SPIA设计的引物
XNA，即LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物，包括A,C,G,T,U,mC六种堿基。XNA结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构。一般可见于A-DNA或RNA。这类核酸可以增加引物或探针的融解温度（Tm值），加强其稳定性，可应用在实时聚合酶链反应（real-time PCR）等技术中。
1.2 试验方法
1.2.1 阪崎肠杆菌的培养
取保藏的阪崎肠杆菌（ATCC29544）在营养琼脂培养基中进行斜面划线，恒温箱37℃培养12h，传代培养2次。挑取传代培养菌落接种至新鲜无菌的营养肉汤培养基中，37℃振荡过夜培养。
1.2.2 阪崎肠杆菌基因组DNA的提取
采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚提取法和商业化试剂盒法对纯培养的阪崎肠杆菌进行基因组DNA的提取，并测定浓度。
1.2.3 阪崎肠杆菌实时荧光SPIA反应体系和反应条件的建立
建立阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测25 μL反应体系，针对设计的组合引物和Blocker组合，优化反应体系中RNA/DNA组合引物、Blocker、Bst DNA polymerase、RNaseH、dNTPs、Mgcl2、RNase Inhibitor和SYBER GreenⅡ的使用浓度，以期筛选出最佳的引物和Blocker组合，以及最佳的反应体系，从而建立阪崎肠杆菌实时荧光SPIA最佳检测方法。
将阪崎肠杆菌基因组DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在C7型实时荧光定量PCR仪上55-65℃，反应40min（2400s）。反应过程中实时监测荧光信号，以期确定最佳反应温度，建立阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法。
1.2.4阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法的特异性分析
取表1中25株过夜培养菌悬液1 mL, 用热裂解法提取基因组DNA作为模板, 根据1.2.3中建立的最佳反应条件对所建立的实时荧光SPIA方法进行扩增特异性分析。
1.2.5不同基因组DNA提取方法对实时荧光SPIA检测结果的影响
使用1.2.2中四种方法提取阪崎肠杆菌基因组DNA，并作为模板进行实时荧光SPIA检测，以分析不同方法提取的DNA对检测结果的影响。
1.2.6 阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性分析
挑取营养琼脂上，37 °C培养12 h的阪崎肠杆菌单菌落，制备成一定浓度菌悬液。用生理盐水进行10倍系列稀释, 采用稀释平板法，测定其纯培养物活菌数为1.6×109CFU/mL； 同时取1 mL纯培养物直接用热裂解法提取阪崎肠杆菌基因组DNA, 测得DNA浓度为5.0×101ng/μL，换算成基因拷贝数为1.0×1010copies，用灭菌DEPC水进行10倍系列稀释，进行SPIA灵敏性试验。
1.2.7阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法在模拟样品中检出限分析
在婴儿配方奶粉中添加阪崎肠杆菌作为模拟污染样品进行检出限分析。进行添加前，婴儿配方奶粉样品已按GB 4789.40-2010[常规检验法证实阪崎肠杆菌阴性。挑取营养琼脂上，37 °C培养12 h的阪崎肠杆菌单菌落，制备成一定浓度菌悬液，用生理盐水进行10倍系列稀释后，选取适当系列浓度菌悬液1mL分别添加到婴儿配方奶粉溶液中（100g婴儿配方奶粉已均质于44°C，900mL灭菌缓冲蛋白胨水中）。采用稀释平板法计数，确定添加模拟样品中活菌数为1.5×105CFU/100g-1.5×10-2CFU/100g。
各取1mL模拟样品，直接用热裂解法提取阪崎肠杆菌基因组DNA，并将获得的系列浓度DNA模板，用于检测限分析。本试验重复3次。
2 结果与分析
2.1阪崎肠杆菌实时荧光SPIA反应体系和反应条件的建立
如图1所示，经过各种反应体系和条件的优化，设计合成的套组合引物及Blocker（Pbrn1+Blocker1）对阪崎肠杆菌出现典型的荧光扩增曲线，且最佳反应体系为：RNA/DNA组合引物为2.8 μmol/L、Blocker为0.2 μmol/L、Mg2+为5.0 mmol/L、dNTPs为1.0 mmol/L、BST DNA聚合酶为20U、RNase H酶为2.5U、RNase Inhibitor的为32U、SYBER GreenⅡ最佳稀释倍数为0.3μL（300倍稀释），其余用灭菌DEPC水补足体系；最佳反应条件为55.0℃，反应40min。
2.2 阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法的特异性分析
在C7型实时荧光定量PCR仪上采用Pbrn1+Blocker1对4株阪崎肠杆菌及21株食源性肠道细菌进行检测, 如图2-5所示，Enterobacter sakazakii出现典型的荧光扩增曲线，其他细菌检测均未产生荧光扩增曲线。结果表明建立的阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法对阪崎肠杆菌有很好的特异性。
2.3不同模板DNA提取方法对实时荧光SPIA检测结果的影响
如图6所示，本文所建立的实时荧光SPIA方法对四种不同方法提取的阪崎肠杆菌模板DNA检测结果没有明显差异，均出现典型的扩增曲线。研究表明，可以选择经济、快捷又简便的普通热裂解法提取阪崎肠杆菌DNA作为模板，用于实时荧光SPIA扩增，有利于实时荧光SPIA扩增方法在基层的推广。
2.4 阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性试验
如图7所示，当模板用量为1.0×102-1.0×100copies时，反应均出现典型的扩增曲线；当模板用量为1.0×10-1copies时，则无扩增曲线。所以将建立的实时荧光SPIA检测方法对阪崎肠杆菌的检测灵敏度确定为1 copy。
2.5 阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法在模拟样品中的检出限试验
如图8所示，当模拟样品中细菌浓度为1.5×100 CFU/100g时，反应出现典型的扩增曲线；当模拟样品中细菌浓度为1.5×10-1 CFU/100g时，则无扩增曲线。因此阪崎肠杆菌实时荧光SPIA检测方法在模拟样品中检出限为1.5×100 CFU/100g。
Claims (7)
1.一种阪崎肠杆菌的分子检测方法，其特征在于，采用单引物等温扩增方法，阪崎肠杆菌ompA基因序列为靶序列，SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号。
2.根据权利要求1所述的一种阪崎肠杆菌的分子检测方法，其特征在于，其具体过程包括如下步骤：
（1）取含阪崎肠杆菌的待检样品，提取基因组DNA；
（2）建立阪崎肠杆菌的实时荧光单引物等温扩增的25 μL反应体系：
其中RNA/DNA组合引物为2.8 μmol/L、Blocker为0.2 μmol/L、Mg2+为5.0 mmol/L、dNTPs为1.0 mmol/L、BST DNA聚合酶为20U、RNase H酶为2.5U、RNase Inhibitor为32U、SYBER GreenⅡ为0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；
所述SYBER GreenⅡ为300倍稀释；
将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上55℃ 反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；
（3）检测分析：分析检测数据。
3.根据权利要求2所述的一种阪崎肠杆菌的分子检测方法，其特征在于，所述组合引物选用GGUCCGAC-TCACGAAAGCC ，5’端8nt碱基为RNA序列，3’端11nt碱基为DNA序列；Blocker 为CGACGACCACGACA，3’端用生物素修饰，中间随机加上两个IXNA修饰。
4.根据权利要求3所述的一种阪崎肠杆菌的分子检测方法，其特征在于，所述IXNA包括A，C，G，T，U，mC六种堿基中的一种。
5.根据权利要求2所述的一种阪崎肠杆菌的分子检测方法，其特征在于，步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。
6.根据权利要求4所述的一种阪崎肠杆菌的分子检测方法，其特征在于，所述提取DNA方法采用商业化试剂盒法。
7.一种权利要求1-6任一项所述的检测方法在婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌检测中的应用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN111662961A (zh) * | 2020-06-16 | 2020-09-15 | 河北农业大学 | 一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004059289A2 (en) * | 2001-05-22 | 2004-07-15 | Epicentre Technologies | Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase |
| CN101319249A (zh) * | 2008-06-10 | 2008-12-10 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法 |
| CN102154451A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-08-17 | 广东省微生物研究所 | 阪崎肠杆菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒 |
| CN103966200A (zh) * | 2013-07-10 | 2014-08-06 | 哈尔滨德歌生物科技有限公司 | 基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法 |
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2014
- 2014-12-23 CN CN201410803701.9A patent/CN104531861B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004059289A2 (en) * | 2001-05-22 | 2004-07-15 | Epicentre Technologies | Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase |
| CN101319249A (zh) * | 2008-06-10 | 2008-12-10 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法 |
| CN102154451A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-08-17 | 广东省微生物研究所 | 阪崎肠杆菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒 |
| CN103966200A (zh) * | 2013-07-10 | 2014-08-06 | 哈尔滨德歌生物科技有限公司 | 基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 彭涛: "《核酸等温扩增技术及其应用》", 30 June 2009 * |
| 马丽敏等: ""核酸等温扩增技术研究进展"", 《浙江预防医学》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111662961A (zh) * | 2020-06-16 | 2020-09-15 | 河北农业大学 | 一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法 |
| CN114182029A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-15 | 石家庄君乐宝乳业有限公司 | 一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用 |
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