CN103642910A

CN103642910A - 定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用

Info

Publication number: CN103642910A
Application number: CN201310614228.5A
Authority: CN
Inventors: 车团结; 李琳; 尤崇革
Original assignee: Individual
Current assignee: Suzhou Baiyuan Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: CN103642910B

Abstract

本发明公开了一种定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用，引物的核苷酸序列为序列表中序列3和序列4；探针的核苷酸序列为序列表中序列5。本发明的有益效果为：本发明提供的肺炎克雷伯氏菌特异性引物和探针序列，可用于对肺炎克雷伯氏菌进行定性、定量检测，通过提取待检测样品中的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中肺炎克雷伯氏菌DNA含量的目的，可用于食品检测、科研及临床诊断，针对于食品样品、患者咽拭子、鼻咽分泌物、人痰液标本、血样等样品中肺炎克雷伯氏菌DNA进行定性、定量分析，对判断肺炎克雷伯氏菌感染的发生、治疗效果评价以及病情的动态观察具有重要意义，同时将在临床医学检测领域发挥重要作用。

Description

定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用。

背景技术

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）属于革兰氏阴性肠杆菌科（Enterobacteraceae）克雷伯氏菌（Klebsiella）属，分3个亚种：肺炎亚种（subsp.pneumoniae）、鼻炎亚种（subsp.azaenae）和鼻硬结亚种（subsp.rhinoscleromatis）。广泛分布与自然界，是人和动物肠道、呼吸道的条件致病菌，当机体免疫力降低或长期大量使用抗生素导致菌群失调时引起感染，可引起肺炎、支气管炎、败血症、脑膜炎、肝脓肿、眼内炎、泌尿系统发炎，或是伤口感染等，若治疗不当则死亡率极高，目前是除大肠杆菌外的医源性感染最重要的条件致病菌。

目前，国内食品卫生微生物检验的方法主要采用国家标准（GB/T）和行业标准（SN/T），该类标准主要由传统的分离培养、镜检观察、生化鉴定等实验组成，操作步骤繁杂，工作量大，从培养到生化鉴定耗时5-8天，同时检测精准度低，已远远不能满足现代检测的要求。临床检测需要痰培养或血培养等检测，检测周期长，不能满足治疗的需求。常规PCR技术目前存在操作繁琐、易交叉污染导致假阳性等缺点。免疫学检测技术具有以实现快速简便低成本等优势，但是要求高质量高稳定性的单克隆抗体，目前存在特异性差、灵敏度低等准确性不高等缺点，只能作为辅助检测手段。近些年兴起的环介导恒温扩增技术具有操作简便、快捷、灵敏度高、不依赖昂贵设备等优点，非常适合基层实验室使用，但是存在着引物设计困难、准确性和敏感性差、假阳性率偏高等缺点，市场不成熟。

实时荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，相对于普通PCR耗时更少，只需2小时即可完成全部检测，近几年实时荧光定量PCR技术已在各大医院、检测机构、科研部门得到了很好的推广和实用，因此非常适合临床检测。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一组肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于临床的快速、灵敏、特异性好的用荧光定量PCR检测方法。

本发明采用基因克隆技术，将肺炎克雷伯氏菌RecA基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有RecA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据肺炎克雷伯氏菌RecA基因片段设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行有效性评估试验。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一对用于肺炎克雷伯氏菌RecA基因保守片段序列的引物，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列1和序列2，称其为外围引物，用于标准品的制备，所述外围引物为：上游引物为5’-TTCTTCTGCGTCGTTGCC-3’，下游引物为5’-GCTGGCGGGTAACCTGAA-3’，采用该引物以肺炎克雷伯氏菌标准菌（ATCC4352）的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物为499bp。

本发明的第二个目的是提供了一组用于定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列3和序列4；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列5。探针为Taqman探针，该组引物和探针是根据上述RecA基因保守片段设计，其中上游引物为5’-TTCTTCTGCGTCGTTGCC-3’，下游引物为5’-GCGATCACCTGGCTGAAAG-3’，探针为5’-TCTGGCTTCGCATCCTGATTGTTGA-3’。

本发明的第三个目的是提供了一组如上所述的用于定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针的衍生序列，所述引物的衍生序列包括引物序列的互补链序列、引物序列向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列；所述探针的衍生序列包括探针5’端标记有荧光报告基团FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。

本发明的第四个目的是提供了一种用于检测肺炎克雷伯氏菌的实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述引物和探针。

本发明的第五个目的是提供了上述的一组用于定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针在定量检测肺炎克雷伯氏菌中的应用。

本发明的第六个目的是提供了上述的一组用于定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针的衍生序列在定量检测肺炎克雷伯氏菌中的应用。

本发明的第七个目的是提供了上述的一种用于检测肺炎克雷伯氏菌的实时荧光定量PCR试剂盒在定量检测肺炎克雷伯氏菌中的应用。

本发明的有益效果为：本发明提供的一组肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）特异性引物和探针序列，可用于对肺炎克雷伯氏菌进行定性、定量检测，通过提取待检测样品中的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中肺炎克雷伯氏菌DNA含量的目的，可用于食品检测、科研及临床诊断，针对于食品样品、患者咽拭子、鼻咽分泌物、人痰液标本、血样等样品中肺炎克雷伯氏菌DNA进行定性、定量分析，对判断肺炎克雷伯氏菌感染的发生、治疗效果评价以及病情的动态观察具有重要意义，同时将在临床医学检测领域发挥重要作用。

附图说明

图1为灵敏度实验结果。

其中A12-A19对应质粒浓度分别为1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、

1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、

1.00×10²copies/ml、阴性对照。

图2为特异性实验结果。

其中A4-A17分别为：大肠埃希菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、福氏志贺菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯氏菌、阴性对照。

具体实施方式

下述实验例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。

实施例1：

RecA基因序列标准品的制备：

为建立实时荧光定量PCR方法，要先制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。本发明采用肺炎克雷伯氏菌RecA基因序列保守区作为靶序列。主要采用PCR技术扩增肺炎克雷伯氏菌RecA基因序列，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-KpRecA，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。

一、模板DNA的制备：

1、提取肺炎克雷伯氏菌基因组DNA，用作PCR扩增的模板：

吸取500μl培养的肺炎克雷伯氏菌（编号ATCC 10031）菌液加入到1.5ml离心管中10000rpm离心1分钟，取上清，加入200μl灭菌的TE buffer，震荡悬浮，然后放入到沸水浴锅中煮沸10分钟后，迅速置于冰上放置5分钟，10000rpm离心3分钟，转移上清液至新的离心管中-20℃保存。

二、ITS序列片段的PCR扩增：

1、引物的设计与合成：

本发明通过对NCBI数据库中肺炎克雷伯氏菌RecA基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primer express3软件、PrimerPremier6软件以及Oligo7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。

本发明选取的扩增序列如下：

5’-TTCTTCTGCGTCGTTGCCGTCAACAACGAAGTCTGGCTTCGCATCCTGATTGTTGAGCAGCAGTTCGCGCACTTTCTTCTCAATCTCTTTCGCCGCCGCCGGGTTCTCTTTCAGCCAGGTGATCGCGTTCGCTTTACCCTGACCGATTTTGTCGCCGTTGTAGCTATACCAGGCACCCGCTTTCTCAATCAGCTTCTCTTTTACGCCGAGGTCTACCAGCTCGCCGTAGAAGTTGATGCCTTCGCCGTAGAGGATCTGGAATTCGGCCTGTTTAAACGGCGCGGCGATCTTGTTTTTCACCACTTTGACGCGGGTTTCGCTGCCGACGACATTGTCGCCCTCTTTCACCGCGCCGATGCGGCGAATGTCCAGACGCACAGAGGCGTAGAACTTCAGCGCGTTACCACCGGTAGTGGTTTCCGGGTTACCGAACATCACGCCAATTTTCATACGGATCTGGTTGATAAAGATCAGCAGCGTGTTGGACTGCTTCAGGTTACCCGCCAGC-3’。

该外围引物序列如下：

上游引物：KprecA19F：5’-TTCTTCTGCGTCGTTGCC-3’；

下游引物：kprecA527R：5’-GCTGGCGGGTAACCTGAA-3’；

扩增片段大小为：508bp。

2、PCR反应体系和反应条件：

以提取得到的DNA溶液为模板，上述外围引物KprecA19F/kprecA527R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。

PCR体系如表1所示。

表1

成分	体积
		10×PCR buffer	5μl
dNTP（2.5μM）	1.5μl
		引物F（5μM）	1μl
引物R（5μM）	1μl
		模板DNA	2μl
Taq酶（5U）	1μl
		ddH₂O	38.5μl
总体积	50μl

其中，引物采用KprecA19F/kprecA527R，Taq酶采用杭州博日（BSA09M2），PCR扩增仪为西安天隆PCR model MG96+。

扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。

取5μL扩增产物进行1%琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。

三、重组质粒pMD18-T-KpRecA的构建和转化：

1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T（大连宝生物公司）进行连接，采用如下表2中的连接体系进行配制。

表2

成分	体积
		pMD18-T vector	1μL
回收DNA	2μL
		Solution1	5μL
ddH₂O	2μL
		总体积	10μL

配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。

2、pMD18-T-KpRecA质粒的转化以及PCR鉴定：

①从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻；

②取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；

③42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min；

④向1.5ml EP管中加入预冷的400ml的LB液体培养基（不含氨苄青霉素）混匀后，37℃，200转轻摇培养1h；

⑤将上述培养液摇匀后取100μl涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；

⑥次日观察，从平板上挑取白色单克隆菌落稀释于50μL无菌水中，吸取2μL作为PCR模板，剩余的稀释菌液加入到20ml的LB培养基中进行扩摇；

⑦用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。

引物RV-M/M13-47序列如下：

引物RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，

引物M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。

反应体系如表3所示。

表3

成分	体积
		10×PCR buffer	2.5μL
dNTP（2.5μM）	0.5μL
		引物F（5μM）	0.5μL
引物R（5μM）	0.5μL
		模板	2μL
Taq酶（5U）	0.5μL
		ddH2O	18.5μL

扩增程序/反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min。

⑧采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。

实施例2：

实时荧光定量PCR检测肺炎克雷伯氏菌方法的初步建立：

一、特异性引物和探针的设计与合成：

以上述选取的肺炎克雷伯氏菌的ITS序列的保守片段为靶目标，应用Primer express3软件、Primer Premier5软件以及Oligo7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针。

作为本发明的核心，一组用于肺炎克雷伯氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针核苷酸序列如下：

上游引物：KprecA19F：5’-TTCTTCTGCGTCGTTGCC-3’，

下游引物：KprecA144R：5’-GCGATCACCTGGCTGAAAG-3’。

探针：KprecA51P：5’-FAM-TCTGGCTTCGCATCCTGATTGTTGA-TAMRA-3’。

该引物和探针扩增目标核苷酸序列为：

5’-TTCTTCTGCGTCGTTGCCGTCAACAACGAAGTCTGGCTTCGCATCCTGATTGTTGAGCAGCAGTTCGCGCACTTT

CTTCTCAATCTCTTTCGCCGCCGCCGGGTTCTCTTTCAGCCAGGTGATCGC-3’。

二、标准品的获取和定量：

1、取将冻存的含有重组质粒pMD18-T-KpRecA的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃200rpm过夜摇培；

2、取1ml培养过夜的菌液转种于30ml LB液体培养基，200rpm增菌培养2-3小时，然后采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；

3、利用超微量紫外可见分光光度计对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度，根据A260的吸光度值可计算出样品中质粒DNA的含量，即1OD值相当于50μg/ml双链DNA；

4、质粒pMD18-T-KpRecA浓度（拷贝数）计算：

（1）质粒的分子量=3190bp×660（每对碱基的平均分子量）；

（2）测得质粒浓度为64.35μg/ml，因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml；

质粒copies/ml=阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数，

其中阿伏伽德罗常数=6.02×10²³copies/mol。

提取的质粒浓度copies/ml=64.35μg/ml×10^-6×6.02×10²³copies/mol÷（3190bp×660g/bp·mol）=1.84×10¹³copies/ml。

10μl质粒+8.4μl的无菌水就得到浓度为1.00×10¹³copies/ml的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。

实施例3：

评估实验：

1、灵敏度实验：

将上述制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为

1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、

1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml等作为梯度模板。反应体系如表4所示。

表4

成分	体积
		2×premix	10μl
Primer F（5uM）	1.5μl
		Primer R（5uM）	1.5μl
Probe（5uM）	0.75μl
		模板	2μl
ddH₂O	补至20μl

反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果如图1所示，显示当质粒浓度达到1.00×10³copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到

1.00×10²copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×10³copies/ml。

2、特异性实验：

为了证实本发明对肺炎克雷伯氏菌检测的特异性，选取了其他常见病原体和常见污染菌做特异性实验，选取的微生物包括：大肠埃希菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、福氏志贺菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯氏菌。

其中金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌等采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302-02）提取DNA，其余革兰氏阴性菌采用沸水裂解法提取DNA。采用百泰克公司生产的2×real-time PCR Premixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，反应体系如表5所示。

表5

成分	体积
		2×premix	10μl
Primer F（5uM）	1.5μl
		Primer R（5uM）	1.5μl
Probe（5uM）	1.5μl
		模板	2μl
ddH₂O	补至20μl

反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果如图2所示，具体结果为仅肺炎克雷伯氏菌检测为阳性，其余易污染微生物和致病菌均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如表6所示。

表6

菌株名称	Ct值	判读结果
			大肠埃希菌	无	阴性
奇异变形杆菌	无	阴性
			铜绿假单胞菌	无	阴性
流感嗜血杆菌	无	阴性
			淋病奈瑟菌	无	阴性
金黄色葡萄球菌	无	阴性
			粪肠球菌	无	阴性
乙型溶血性链球菌	无	阴性
			鼠伤寒沙门氏菌	无	阴性
副溶血弧菌	无	阴性
			福氏志贺菌	无	阴性
脑膜炎奈瑟菌	无	阴性
			肺炎克雷伯氏菌	25.88	阳性
空白对照	无	阴性

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 车团结

<120> 定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttcttctgcg tcgttgcc 18

<160> 1

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctggcgggt aacctgaa 18

<160> 1

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcttctgcg tcgttgcc 18

<160> 1

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgatcacct ggctgaaag 19

<160> 1

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctggcttcg catcctgatt gttga 25

Claims

1.一对用于肺炎克雷伯氏菌RecA基因保守片段序列的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列1和序列2。

2.一组用于定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列3和序列4；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列5。

3.一组如上述权利要求2所述的用于定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针的衍生序列，其特征在于，所述引物的衍生序列包括引物序列的互补链序列、引物序列向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列；所述探针的衍生序列包括探针5’端标记有荧光报告基团FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。

4.一种用于检测肺炎克雷伯氏菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1和2所述的引物和探针。

5.权利要求2所述的一组用于定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针在定量检测肺炎克雷伯氏菌中的应用。

6.权利要求3所述的一组用于定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针的衍生序列在定量检测肺炎克雷伯氏菌中的应用。

7.权利要求4所述的一种用于检测肺炎克雷伯氏菌的实时荧光定量PCR试剂盒在定量检测肺炎克雷伯氏菌中的应用。