CN105132555A - 一种中国大鲵的感染肺炎克雷伯氏菌的pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种中国大鲵的感染肺炎克雷伯氏菌的pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌的PCR快速检测试剂盒及检测方法,该检测试剂盒，包括：2倍反应混合缓冲液1.0mL；上、下游引物；Taq？DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。该检测方法对感染中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测感染中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌提供了便利条件。

Description

一种中国大鲵的感染肺炎克雷伯氏菌的PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种生物工程技术和分子生物学方法，具体涉及一种感染中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌的检测试剂及检测方法，适用于感染中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌的检测。
背景技术
中国大鲵属于国家二级保护动物，由于其具有较高的科研、营养、及药用价值，人们对它的需求也逐渐增加。然而近年来，栖息地丧失、环境污染和人类过度捕捞等原因，该物种已处于极度濒危的边缘，为了有效保护物种多样性，我国很多地方开始规模化、产业化地进行大鲵的人工繁育与养殖。但是，随着养殖数量的不断增多，随之而来的多种病害对大鲵养殖产业的发展产生严重威胁。目前危害大鲵的病害有10多种,主要病害种类包括细菌病、真菌病、寄生虫病以及其他一些疾病，中国大鲵细菌性疾病是人工养殖过程中常见且危害极大的一类疾病，虽然鲜见国外报道，但是国内对细菌性疾病的研究是中国大鲵人工养殖的一个重点。自1999年王高学等报道了中国大鲵被Ⅰ-型荧光假单胞菌感染导致的“赤皮病”开始，细菌性疾病的相关报道日渐增多。从目前情况来看，感染中国大鲵的细菌大多属于气单胞菌属，其中以嗜水气单胞菌为甚。
肺炎克雷伯氏菌属于肠杆菌科肠道杆菌属，广泛存在于人和动物肠道、呼吸道以及水、土壤、农产品和林产品中。正常情况下,本菌不会引起动物发病，但是当机体抵抗力下降或本菌大量增殖时,就会引起动物发病甚至暴发性流行。肺炎克雷伯氏菌被列为条件致病菌，是目前公认的导致动物和人类发病的克雷伯氏菌。其可引起支气管炎、肺炎,泌尿系统和创伤感染，甚至败血症、脑膜炎、腹膜炎等。近年来，虽然中国经济动物养殖业得到了迅猛发展，但由于养殖户的管理水平、养殖场的硬件和软件设施不能进行规范化管理等原因，已经有多起由该菌引起的人畜感染的报道，且已日益被关注。为了及早发现中国大鲵是否被肺炎克雷伯氏菌感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。
传统病原菌的诊断需要进行显微镜观察，缺乏进行快速、准确、敏感的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种中国大鲵感染肺炎克雷伯氏菌的PCR检测试剂盒及检测方法，采用该试剂盒检测灵敏度高、特异性强，能快速、高效地用于肺炎克雷伯氏菌的检测。
在一实施方案中，本发明的一种检测中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌的PCR检测试剂盒，包含2倍反应混合缓冲液、上游引物、下游引物、Taq酶(即“TaqDNA聚合酶”)、灭菌的ddH2O、阳性对照液和阴性对照液，其中，所述上游引物为K-F：5’–CAGCGATTATGACAGCAAAG–3’，所述下游引物为K-R：5’–TCCAGACCATCCACCAGA–3’。
在上述实施方案中，本发明的PCR检测试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液为1.0mL，包含以下成分：
在上述实施方案中，本发明的PCR检测试剂盒，其中，上游引物和下游引物的浓度均为10μM/L；所述Taq酶为5U/μLTaq酶0.5μL；所述灭菌的ddH2O为1.0mL；所述阳性对照液为感染肺炎克雷伯氏菌的中国大鲵基因组DNA(自制或购得)；所述阴性对照液为ddH2O(即双蒸水)。
在另一实施方案中，本发明还提供了一种采用上述本发明的检测试剂盒检测中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌的方法，包括以下步骤：
(1)大鲵DNA的提取：
①取病中国大鲵的肺脏、肝脏或足部皮肤组织，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置离心管中；
②加入1％-3％的β-巯基乙醇溶液，混匀后在60-70℃下水浴0.5-1h，每隔3-5分钟摇匀一次；
③10000-15000rpm离心3-7min，离心后，移出上清液于另一无菌离心管中，弃沉淀；
④向上清液中加入等体积的按体积比20-30：1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀后，8000-12000rpm离心5-15min，取上清液至另一无菌离心管中；
⑤向上清液加入等体积的氯仿，混匀后8000-12000rpm离心5-15min，再取上清液；
⑥向上清液中加入0.8-1.2倍体积的2-4MNaAc溶液，混匀后再加入1.5-2.5倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后在-18℃以下放置30min以上；
⑦10000-15000rpm离心3-7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下晾干；
⑧用70-80％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE中，加RNaseA，在37℃下消化20-40min，获得DNA之后于-20℃保存；
(2)PCR反应：采用20μL的PCR反应体系，在0.2mLPCR反应管内分别加入2倍反应混合缓冲液10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μLTaq酶0.5μL，大鲵DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水补加至20μL，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪中进行反应；
(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物置于含溴化乙锭0.5μg/mL的1％琼脂糖凝胶上，使用0.5×TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的大小；
(4)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在336bp处出现明亮的条带，而阴性对照液没有目的条带，则为肺炎克雷伯氏菌阳性；若阳性对照液有目的条带，而检测样品无目的条带，则为阴性，表明没有感染肺炎克雷伯氏菌。
在上述另一实施方案中，本发明的检测方法，步骤(2)中，所述PCR反应，其PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸7分钟，最后产物置于4℃保存。
在一具体实施方案中，本发明的一种检测中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌的PCR检测试剂盒，包括：
(1)2倍反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的中国大鲵的基因序列，设计一对特异性检测引物，上游引物K-F：5’–CAGCGATTATGACAGCAAAG–3’，下游引物K-R：5’–TCCAGACCATCCACCAGA–3’，浓度为10μΜ/L；
(3)Taq酶5U/μL0.5μL；
(4)灭菌的ddH2O1.0mL；
(5)阳性对照液：感染肺炎克雷伯氏菌的中国大鲵的基因组DNA；(自制或购得)；
(6)阴性对照液：ddH2O。
一种采用上述检测试剂盒检测中国大鲵肺炎克雷伯氏菌的方法，包括：
(1)中国大鲵DNA的提取：
①取患病大鲵肺脏、肝脏或足部皮肤组织，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置离心管中；
②加入1％-3％的β-巯基乙醇溶液，混匀后60-70℃水浴0.5-1h，每隔3-5分钟取出摇匀一次；
③10000-15000rpm离心3-7min，离心后，移出上清液于另一无菌离心管中，弃沉淀；
④向上清液中加入等体积的按体积比20-30：1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀后，8000-12000rpm离心5-15min，取上清液至另一无菌离心管中；
⑤加入等体积的氯仿，混匀后8000-12000rpm离心5-15min，再取上清液；
⑥向上清液中加入0.8-1.2倍体积的2-4MNaAc溶液，混匀后再加入1.5-2.5倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后-18℃以下放置30min以上；
⑦10000-15000rpm离心3-7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下晾干；
⑧用70-80％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE中，加RNaseA，37℃消化20-40min，获得DNA之后于-20℃保存。
(2)PCR反应：采用20μL的PCR反应体系，在0.2mLPCR反应管内分别加入2倍反应混合缓冲液10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上反应；
(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸7分钟，最后4℃保存；
(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用0.5×TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在366bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为肺炎克雷伯氏菌阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的肺炎克雷伯氏菌。
与现有技术相比，本发明所述的中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌的特异性PCR快速检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：
(1)通过最近几年对中国大鲵流行病学的调查发现，目前细菌性疾病越来越严重，危害越来越大，并成为中国大鲵水产养殖业可持续发展的主要限制因素之一。本发明的检测试剂盒根据中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌的核苷酸序列设计出一对特异性引物，采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对中国大鲵感染肺炎克雷伯氏菌进行定性检测，经检测并测序验证，可用于感染肺炎克雷伯氏菌的中国大鲵的快速、高效检测。
(2)本发明提供了针对上述PCR优化的PCR反应液、反应体系和反应条件。反应时将反应液、酶、引物、模板和适量的水混合，整个反应所需要的时间在3个小时内即可完成。
附图说明
图1为中国大鲵感染肺炎克雷伯氏菌的PCR扩增结果，其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3为感染肺炎克雷伯氏菌的中国大鲵组织样品；标号M为DNAMarkerI(购自北京博迈德生物有限公司)；纵坐标中：bp为碱基对，700、600、500、300、200、100为对应片段的碱基对的数量。
图2为本发明的试剂盒的特异性检测结果，其中，横坐标中：标号1为肺炎克雷伯氏菌；标号2为金黄色葡萄球菌；标号3为腐败希瓦氏菌；标号4为大肠杆菌，标号M为DNAMarkerI；纵坐标中：bp为碱基对，700、600、500、300、200、100为对应片段的碱基对的数量。
图3为6条发病中国大鲵组织样品的PCR扩增结果，其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-8为6尾不同中国大鲵组织样品；标号M为DNAMarkerI；纵坐标中：bp为碱基对，700、600、500、300、200、100为对应片段的碱基对的数量。
图4为3条不同地区中国大鲵组织样品的PCR扩增结果，其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-5为3条不同地区(按顺序分别是四川、贵州、重庆)中国大鲵组织样品；标号M为DNAMarkerI；纵坐标中：bp为碱基对，700、600、500、300、200、100为对应片段的碱基对的数量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例1感染肺炎克雷伯氏菌的中国大鲵的PCR快速检测试剂盒
本实施例所述的感染肺炎克雷伯氏菌的中国大鲵的PCR快速检测试剂盒中所有化学试剂及引物均从专业的试剂公司购买，也可自行配制，上、下游引物也可自行合成。
试剂盒由下列部分构成(9样份)：
(1)2倍反应混合缓冲液(ReactionMixBuffer)共1.0mL，包含以下成分：
(2)检测引物共200μL：上游引物K-F：5’–CAGCGATTATGACAGCAAAG–3’，下游引物K-R：5’–TCCAGACCATCCACCAGA–3’，浓度为10μM/L，上下游引物混合。
(3)Taq酶5U/μL。
(4)灭菌的ddH2O1.0mL。
(5)阳性对照液：感染肺炎克雷伯氏菌的中国大鲵的基因组DNA。
(6)阴性对照液：ddH2O。
(7)操作说明书一份。
(8)长方体盒子，可装上述1～7号部件，9.0×5.0×5.0cm3。
(9)一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，高2.5cm，有2排孔，每排4个孔，孔径1.0cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
阳性对照液(中国大鲵的基因组DNA)的制备：
取100mg感染肺炎克雷伯氏菌的中国大鲵的肺脏、肝脏或足部皮肤组织，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置离心管中；加入1％-3％的β-巯基乙醇溶液，混匀后60-70℃水浴0.5-1h，每隔3-5分钟取出摇匀一次；10000-15000rpm离心3-7min，离心后，移出上清液于另一无菌离心管中，弃沉淀；向上清液中加入等体积的按体积比20-30：1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀后，8000-12000rpm离心5-15min，取上清液至另一无菌离心管中；加入等体积的氯仿，混匀后8000-12000rpm离心5-15min，再取上清液；向上清液中加入0.8-1.2倍体积的2-4MNaAc溶液，混匀后再加入1.5-2.5倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后-18℃以下放置30min以上；10000-15000rpm离心3-7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下晾干；用70-80％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE(Tris-EDTA)中，加RNaseA，37℃消化20-40min，之后于-20℃保存，即得中国大鲵的组织DNA。
试剂盒中，PCR扩增反应体系(20μL)为：
实施例2中国大鲵感染肺炎克雷伯氏菌的PCR检测方法
(1)使用实施例1所述的试剂盒，按下列步骤进行：
①取患病大鲵肺脏、肝脏或足部皮肤组织，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置离心管中；
②加入1％-3％的β-巯基乙醇溶液，混匀后60-70℃水浴0.5-1h，每隔3-5分钟取出摇匀一次；
③10000-15000rpm离心3-7min，离心后，移出上清液于另一无菌离心管中，弃沉淀；
④向上清液中加入等体积的按体积比20-30：1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀后，8000-12000rpm离心5-15min，取上清液至另一无菌离心管中；
⑤加入等体积的氯仿，混匀后8000-12000rpm离心5-15min，再取上清液；
⑥向上清液中加入0.8-1.2倍体积的2-4MNaAc溶液，混匀后再加入1.5-2.5倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后-18℃以下放置30min以上；
⑦10000-15000rpm离心3-7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下晾干；
⑧用70-80％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE中，加RNaseA，37℃消化20-40min，获得DNA之后于-20℃保存。
(2)分别取2倍反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(K-F、K-R)各0.5μL，TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O1μL，DNA模板1.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各1μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上扩增反应。
(3)按下列条件进行PCR扩增反应：95℃预变性5分钟，1个循环；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸7分钟，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加入2μL溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20min后，于紫外仪上观察，若在366bp处出现明亮的反应条带，则为肺炎克雷伯氏菌阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：如图1所示，在标号3(待测样品)的电泳带中366bp处出现明亮的反应条带，在标号2(阳性对照)的电泳带中也出现同样的反应条带，而在标号1(阴性对照)的电泳带中未出现反应条带，表明本PCR试剂盒的检测效果符合预期。
实施例3中国大鲵感染肺炎克雷伯氏菌PCR快速检测试剂盒特异性实验
使用实施例1所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以提取的中国大鲵的DNA作为模板，进行PCR检测。
(2)分别取2倍反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(K-F、K-R)各0.5μL，TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O1μL，模板1.0μL。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上扩增反应。
(3)按下列条件进行PCR扩增反应：95℃预变性5分钟，1个循环；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸7分钟，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20min后，于紫外仪上观察，若在366bp处出现明亮的反应条带，则为肺炎克雷伯氏菌阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：如图2所示，标号1的电泳带在366bp处出现明亮的反应条带，显示肺炎克雷伯氏菌阳性。标号2～4(分别为金黄色葡萄球菌、腐败希瓦氏菌、大肠杆菌)的电泳带在366bp处无反应条带出现，显示肺炎克雷伯氏菌阴性。表明本发明的试剂盒对感染肺炎克雷伯氏菌的大鲵有特异性强。
实施例4本发明的PCR快速检测试剂盒对发病中国大鲵的检测
使用实施例1所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以从发病养殖场中取的6条中国大鲵组织中提取的DNA作为模板，进行PCR检测。
(2)分别取2倍反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(K-F、K-R)各0.5μL，TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O7μL，DNA模板1.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各1μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上扩增反应。
(3)按下列条件进行PCR扩增反应：95℃预变性5分钟，1个循环；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸7分钟，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝中混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20min后，于紫外仪上观察，若在366bp处出现明亮的反应条带，则为肺炎克雷伯氏菌阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
检测所取6条中国大鲵中，5条呈肺炎克雷伯氏菌阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为肺炎克雷伯氏菌，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图3。
实施例5本发明的PCR快速检测试剂盒对不同地区中国大鲵样品的检测
使用实施例1所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以四川、贵州、重庆等地采集的具有被肺炎克雷伯氏菌感染症状的中国大鲵样品，提取组织中的DNA作为模板，进行PCR检测。
(2)分别取2倍反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(K-F、K-R)各0.5μL，TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O7μL，模板1.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各1μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪中扩增反应。
(3)按下列条件进行PCR扩增反应：95℃预变性5分钟，1个循环；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸7分钟，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20min后，于紫外仪上观察，若在366bp处出现明亮的反应条带，则为肺炎克雷伯氏菌阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
检测所取3份样品中，肺炎克雷伯氏菌均为阳性，通过进一步测序表明，标号1～3(分别为四川、贵州、重庆)其检测结果均为肺炎克雷伯氏菌，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图4。

Claims (8)

1.一种检测中国大鲵的肺炎克雷伯氏菌的PCR检测试剂盒，包含2倍反应混合缓冲液、上游引物、下游引物、Taq酶、灭菌的ddH2O、阳性对照液和阴性对照液，其中，所述上游引物为K-F：5’–CAGCGATTATGACAGCAAAG–3’，所述下游引物为K-R：5’–TCCAGACCATCCACCAGA–3’。
2.如权利要求1所述的试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液为1.0mL，包含以下成分：
。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其中，上游引物和下游引物的浓度均为10μM/L。
4.如权利要求1所述的试剂盒，所述Taq酶为5U/μLTaq酶0.5μL；所述灭菌的ddH2O为1.0mL。
5.如权利要求1所述的试剂盒，所述阳性对照液为感染肺炎克雷伯氏菌的中国大鲵基因组DNA。
6.如权利要求1所述的试剂盒，所述阴性对照液为ddH2O。
7.一种采用权利要求1所述的试剂盒检测大鲵感染肺炎克雷伯氏菌的方法，包括以下步骤：
(1)大鲵DNA的提取：
①取患病大鲵的肺脏、肝脏或足部皮肤组织，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置离心管中；
②加入1％-3％的β-巯基乙醇溶液，混匀后在60-70℃下水浴0.5-1h，每隔3-5分钟摇匀一次；
③10000-15000rpm离心3-7min，离心后，移出上清液于另一无菌离心管中，弃沉淀；
④向上清液中加入等体积的按体积比20-30：1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀后，8000-12000rpm离心5-15min，取上清液至另一无菌离心管中；
⑤向上清液加入等体积的氯仿，混匀后8000-12000rpm离心5-15min，再取上清液；
⑥向上清液中加入0.8-1.2倍体积的2-4MNaAc溶液，混匀后再加入1.5-2.5倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后在-18℃以下放置30min以上；
⑦10000-15000rpm离心3-7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下晾干；
⑧用70-80％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE中，加RNaseA，在37℃下消化20-40min，之后于-20℃保存；
(2)PCR反应：采用20μL的PCR反应体系，在0.2mLPCR反应管内分别加入2倍反应混合缓冲液10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μLTaq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水补加至20μL，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上反应；
(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物置于含溴化乙锭0.5μg/mL的1％琼脂糖凝胶上，使用0.5×TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的大小；
(4)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在336bp处出现明亮的条带，而阴性对照液没有目的条带，则为肺炎克雷伯氏菌阳性；若阳性对照液有目的条带，而检测样品无目的条带，则为阴性，表明没有感染肺炎克雷伯氏菌。
8.如权利要求7所述的方法，步骤(2)中，所述PCR反应，其PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸7分钟，最后产物置于4℃保存。
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