CN103484534A - 一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光pcr检测的引物和探针及其应用 - Google Patents

一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光pcr检测的引物和探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，并具体公开了上游引物NG16s169F、下游引物NG16s235R和探针NG16s210P的核苷酸序列。本发明的用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点。

Description

一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地，涉及一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针及其应用。
背景技术
淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）是常见的泌尿生殖系统传播疾病病原体。淋病菌感染引起的临床表现取决于感染的程度，机体的敏感性，细菌的毒力，感染的部位及感染时间的长短，同时和身体的健康状况。其潜伏期短、传染性强，最常见的是有症状的泌尿生殖系统的感染，如尿道炎、宫颈炎、附睾炎、前列腺炎、输卵管炎等，如不及时治疗，淋球菌可侵犯眼睛、眼部、皮肤、直肠、盆腔等部位，甚至可经血液传播到全身其他部位，形成淋病性关节炎、腱鞘炎、脑膜炎、败血症等。同时还有5%-20%的男性和60%的女性病人呈现出无症状感染。因此，淋球菌的实验室检测对淋病的临床辅助诊断具有重要作用。
常规检测方法包括涂片检查和培养法。双球菌涂片主要针对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者检测时阳性率在90%左右，但对于女性患者阳性率仅为50-60%且有假阳性。主要原因是女性宫颈分泌物中杂菌多，敏感性和特异性较差，因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人。淋球菌培养是诊断的重要佐证，培养法对症状很轻或无症状的男性、女性病人都是较敏感的方法，特异性为100%，只要培养阳性就可确诊。在基因诊断问世以前，培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法。培养阳性率男性80-95%，女性80-90%。培养法的阳性率大于涂片法，后者对女性淋病尤其是无症状带菌者检出率较低，容易漏检。由于约50%的女性淋病患者都没有明显症状，因此女性淋病的实验室检查主要依靠培养法。与男性淋病患者有过性接触的女性，应每周做1次宫颈分泌物涂片和培养，连续3次，都是阴性者才能排除。
全世界每年约有600多万人感染此病传统的临床检测方法是使用细菌培养法，但是该方法操作难度大，耗时长，标本运送条件极为严格，并且还存着检出率低的缺点，容易导致漏诊误诊。此外，该方法还需侵入式的获取样本，对患者造成较大的痛苦。常规的PCR检测方法可以避免这一问题，并已有一些利用核酸扩增的方法检测淋病奈瑟氏菌的商业试剂盒，但是常规PCR存在灵敏度低、易污染等缺点，同时常规PCR专利已经失去保护，很难形成商品化试剂盒。
实时荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。
实时荧光定量PCR技术有很多分支，其定量方式也不同，主要分为荧光染料嵌入技术、荧光探针技术和自身淬灭荧光技术等。荧光染料嵌入技术是利用SYBR green I 嵌入DNA双链是荧光强度增加的特性，将荧光信号引入双链DNA，该方法特异性较差，结果常受到引物二聚体的存在的干扰而导致假阳性等问题，因此不适合用于临床，目前国内已有应用自身淬灭荧光技术检测淋病奈瑟菌方法的专利，专利号为200510020234.3，然而该专利设计的引物针对于淋病奈瑟菌隐蔽性质粒（cppB基因GenBank 登录号L40552）为模板，近年研究表明cppB基因在一些淋病奈瑟菌株存在交叉反应以及靶序列在一些淋病奈瑟菌株中缺乏，因此Bruisten等认为cppB基因不宜作为淋病奈瑟氏菌扩增的靶基因。荧光探针技术如Taqman技术、分子信标技术等因为其特异性比荧光染料嵌入技术和自身淬灭荧光技术要好，因此更适合临床使用。。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，它具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：
上游引物NG16s169F：5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’ 
下游引物NG16s235R：5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’
探针NG16s210P：5’-FAM-TCGGGCCTTGCGCTATCCGA-TAMRA-3’
其中，所述探针NG16s210P中的FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
上述探针NG16s210P中的荧光报告基团FAM可替换为TET、JOE、HEX或VIC中的一种。
上述探针NG16s210P中的荧光淬灭基团TAMRA可替换为DABCYL或BHQ。
本发明的用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针在制备淋病奈瑟氏菌检测试剂盒中的应用。
本发明还提出了一对用于扩增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段的引物，所述引物的核苷酸序列如下：
上游引物NG16s111F：5'-CGGGTGAGTAACATATCGGAAC-3'
下游引物NG16s674R：5'-CACCTCCCTCTGACACACTCG-3'。
上述用于扩增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段的引物在扩增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供用于对淋病奈瑟氏菌进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样品中的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中淋病奈瑟氏菌DNA含量的目的。本发明所提供的引物和探针可用于临床及科研中对感染淋病奈瑟氏菌的患者携带的淋病奈瑟氏菌DNA进行定性、定量分析，对判断淋病奈瑟氏菌感染的发生、治疗效果评价以及病情的动态观察具有重要意义，本发明在临床医学检测领域发挥重要作用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针体系优化实验结果图；
图2是灵敏度实验结果示意图；
在图2中，A3-A10对应质粒浓度分别为1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml、1.00×103copies/ml、1.00×102copies/ml、阴性对照。
图3是特异性实验结果示意图；
在图3中，A2-A14分别为：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、阴性对照。
具体实施方式
本发明目的在于设计一组淋病奈瑟菌特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于临床的快速、灵敏、特异性好的用荧光定量PCR检测方法。本发明采用基因克隆技术，将淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有16srRNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据淋病奈瑟氏菌16s rRNA的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。
本发明通过以下技术方案予以实现：提供一对用于扩增淋病奈瑟氏菌（NG）16s rRNA保守片段序列的引物，称其为外围引物，用于标准品的制备。
本发明所提供的外围引物，其上游引物为5'-CGGGTGAGTAACATATCGGAAC-3'，下游引物为5'-CACCTCCCTCTGACACACTCG-3'。采用该引物以淋病奈瑟氏菌标准菌为模板进行PCR扩增，扩增产物为564bp。
本发明还提供了用于对淋病奈瑟氏菌进行定量检测的一组引物和探针，探针采用Taqman探针，上游引物为5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’，下游引物为5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’，
探针为5’-FAM-TCGGGCCTTGCGCTATCCGA-TAMRA-3’。
上述引物和探针的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，同时还可以向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。探针5’端的荧光报告基团是FAM，同时也可以标记其他的荧光报告基团如TET、JOE、HEX、VIC中的一种；3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA，也可为DABCYL或BHQ等。
本发明还提供了基于上述设计的引物和探针的一种检测淋病奈瑟氏菌的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明所提供的试剂盒包括用于淋病奈瑟氏菌进行定性、定量检测的引物和探针。
以下将通过实验具体说明：
下述实验例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。
实验一 16s rRNA基因标准品的制备
要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。本研究采用淋病奈瑟氏菌16s rRNA 作为靶序列。本部分主要采用PCR技术扩增淋病奈瑟菌标准菌株 16s rRNA 基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-NG16s，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
一、模板DNA的制备
提取淋病奈瑟氏菌（标准菌株ATCC49226，购自中国医学细菌保藏管理中心）基因组DNA，用作16s rRNA基因PCR扩增的模板
吸取500μl培养的淋病奈瑟氏菌菌液加入到1.5ml离心管中10000 rpm离心1分钟，取上清，加入200μl灭菌的 TE buffer，震荡悬浮，然后放入到沸水浴锅中煮沸10分钟后，迅速置于冰上放置5分钟，10000 rpm离心3分钟，转移上清液至新的离心管中-20℃保存。
二、16s rRNA基因片段的PCR扩增
    1、引物的设计与合成
    本发明通过对NCBI数据库中淋病奈瑟氏菌16s rRNA全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。
    本发明选取的扩增序列（淋病奈瑟氏菌16s rRNA 基因片段）如下（如序列表SEQ ID NO.1）： 
Figure 2013102432912100002DEST_PATH_IMAGE001
该外围引物序列如下：
上游引物NG16s111F：5'-CGGGTGAGTAACATATCGGAAC-3'
下游引物NG16s674R：5'-CACCTCCCTCTGACACACTCG-3' 
扩增片段大小为：564bp。
    2、PCR反应体系和反应条件
    以煮沸法得到的上清液为模板，以上述外围引物NG16s111F/NG16s674R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR体系：
。
其中引物采用NG16s111F/NG16s674R，Taq酶采用杭州博日（BSA09M2），PCR扩增仪为西安天隆 PCR model MG96+。
扩增程序/反应条件：
94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min，取3μL扩增产物进行1%琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用AXYGEN公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。
三、重组质粒pMD18-T-NG16s rRNA的构建和转化
1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T（大连宝生物公司）进行连接，采用如下连接体系进行配制：
。配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。
 2、pMD18-T-16s质粒的转化以及PCR鉴定
（1）从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻。
（2）取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟。
（3）42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min。
（4）向1.5ml EP管中加入预冷的400ml的LB液体培养基（不含氨苄青霉素）混匀后，37℃ 200转轻摇培养1h。
（5）将上述培养液摇匀后取100ul涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜。
（6）次日观察，从平板上挑取白色单克隆菌落稀释于50μL无菌水中，吸取2μL作为PCR模板，剩余的稀释菌液加入到20ml的LB培养基中进行扩摇。
（7）用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。
引物RV-M/M13-47序列如下：
    引物 RV-M:  5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’
    引物 M13-47: 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
2、  体系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。
（8）采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
实验二、实时荧光定量PCR检测淋病奈瑟氏菌方法的初步建立
一、特异性引物和探针的设计与合成
    以上述选取的淋病奈瑟氏菌的16s rRNA基因的保守片段为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针。
    作为本发明核心，一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针的核苷酸序列如下：
上游引物NG16s169F：5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’ 
下游引物NG16s235R：5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’ 
探针NG16s210P：5’-FAM-TCGGGCCTTGCGCTATCCGA-TAMRA-3’
    该引物和探针扩增目标核苷酸序列为（如序列表SEQ ID NO. 2）：
5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGAGGGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCCGAGCGGCCGATATCTGATTAGCTGGTTGGC-3’
二、标准品的获取和定量  
1、取将冻存的含有重组质粒pMD18-T-16s rRNA的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃ 200rpm过夜摇培。
2、取1ml培养过夜的菌液转种于30ml LB液体培养基，200rpm 增菌培养2-3小时，然后采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒。
3、利用超微量紫外可见分光光度计对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度，根据A260的吸光度值可计算出样品中质粒DNA的含量，即1OD值相当于50μg/ml双链DNA。
4、质粒pMD18-T-16s rRNA浓度（拷贝数）计算
（1）质粒的分子量=3256bp×660（每对碱基的平均分子量）
（2）测得质粒A260=2.752，根据公式可计算出提取的质粒浓度为137.6μg/ml。因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml。
10μl质粒+28.5μl的无菌水就得到浓度为1.00×1013copies/ml的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。
三、实时荧光定量 PCR条件优化
以浓度为1.00×106copies/ml的阳性质粒为模板，采用百泰克公司生产的2×real-time PCR Premixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，实验采用的实时荧光定量PCR仪为西安天隆公司生产的TL-988-Ⅱ实时荧光定量PCR仪。反应体系采用20ul 体系，其中引物和探针的量采用表1组合进行反应。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。结果参照图1，数据显示20ul 体系时，引物（5uM）和探针（5uM）分别加入1.5ul，Ct值最小，荧光信号最强。
四、方法评估
1、灵敏度实验
将上述制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml、1.00×103copies/ml、1.00×102copies/ml等作为梯度模板。反应体系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果（如图2）显示当质粒浓度达到1.00×103copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到1.00×102copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×103copies/ml。
    2、特异性实验
为了证实本发明对淋病奈瑟菌检测的特异性，我们选取了其他常见病原体和常见污染菌做特异性实验，选取的微生物包括：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。
其中金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌等采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302-02）提取DNA，其余革兰氏阴性菌采用沸水裂解法提取DNA。采用百泰克公司生产的2×real-time PCR Premixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，反应体系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图3，具体结果为仅淋病奈瑟氏菌检测为阳性，其余易污染微生物和致病菌均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如下表2所示。
。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 
序列表
<110>  兰州百源基因技术有限公司
<120>  一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针及其应用
<160>  1     
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  564
<212>  DNA
<213>  淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）
<400>  1
CGGGTGAGTA ACATATCGGA ACGTACCGGG TAGCGGGGGA TAACTGATCG AAAGATCAGC       60
TAATACCGCA TACGTCTTGA GAGGGAAAGC AGGGGACCTT CGGGCCTTGC GCTATCCGAG      120
CGGCCGATAT CTGATTAGCT GGTTGGCGGG GTAAAGGCCC ACCAAGGCGA CGATCAGTAG      180
CGGGTCTGAG AGGATGATCC GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA      240
GGCAGCAGTG GGGAATTTTG GACAATGGGC GCAAGCCTGA TCCAGCCATG CCGCGTGTCT      300
GAAGAAGGCC TTCGGGTTGT AAAGGACTTT TGTCAGGGAA GAAAAGGCTG TTGCCAATAT      360
CGGCGGCCGA TGACGGTACC TGAAGAATAA GCACCGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG      420
GTAATACGTA GGGTGCGAGC GTTAATCGGA ATTACTGGGC GTAAAGCGGG CGCAGACGGT      480
TACTTAAGCA GGATGTGAAA TCCCCGGGCT CAACCCGGGA ACTGCGTTCT GAACTGGGTG      540
ACTCGAGTGT GTCAGAGGGA GGTG                                             564
<210>  2
<211>  89
<212>  DNA
<213>  淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）
<400> 2
GCTAATACCG CATACGTCTT GAGAGGGAAA GCAGGGGACC TTCGGGCCTT GCGCTATCCG       60
AGCGGCCGAT ATCTGATTAG CTGGTTGGC                                         89
 
<110>  兰州百源基因技术有限公司
       
<120>  一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针及其应用
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  564
<212>  DNA
<213>  淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）
 
<400>  1
 
CGGGTGAGTA ACATATCGGA ACGTACCGGG TAGCGGGGGA TAACTGATCG AAAGATCAGC       60
 
TAATACCGCA TACGTCTTGA GAGGGAAAGC AGGGGACCTT CGGGCCTTGC GCTATCCGAG      120
 
CGGCCGATAT CTGATTAGCT GGTTGGCGGG GTAAAGGCCC ACCAAGGCGA CGATCAGTAG      180
 
CGGGTCTGAG AGGATGATCC GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA      240
 
GGCAGCAGTG GGGAATTTTG GACAATGGGC GCAAGCCTGA TCCAGCCATG CCGCGTGTCT      300
 
GAAGAAGGCC TTCGGGTTGT AAAGGACTTT TGTCAGGGAA GAAAAGGCTG TTGCCAATAT      360
 
CGGCGGCCGA TGACGGTACC TGAAGAATAA GCACCGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG      420
 
GTAATACGTA GGGTGCGAGC GTTAATCGGA ATTACTGGGC GTAAAGCGGG CGCAGACGGT      480
 
TACTTAAGCA GGATGTGAAA TCCCCGGGCT CAACCCGGGA ACTGCGTTCT GAACTGGGTG      540
 
ACTCGAGTGT GTCAGAGGGA GGTG                                             564
 
 
 
 
<210>  2
<211>  89
<212>  DNA
<213>  淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）
 
<400> 2
 
GCTAATACCG CATACGTCTT GAGAGGGAAA GCAGGGGACC TTCGGGCCTT GCGCTATCCG       60
 
AGCGGCCGAT ATCTGATTAG CTGGTTGGC                                         89

Claims (6)

1.一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列如下：
上游引物NG16s169F：5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’ 
下游引物NG16s235R：5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’
探针NG16s210P：5’-FAM-TCGGGCCTTGCGCTATCCGA-TAMRA-3’
其中，所述探针NG16s210P中的FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述探针NG16s210P中的荧光报告基团FAM可替换为TET、JOE、HEX或VIC中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述探针NG16s210P中的荧光淬灭基团TAMRA可替换为DABCYL或BHQ。
4.权利要求1-3任一项所述一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针在制备淋病奈瑟氏菌检测试剂盒中的应用。
5.一对用于扩增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：
上游引物NG16s111F：5'-CGGGTGAGTAACATATCGGAAC-3'
下游引物NG16s674R：5'-CACCTCCCTCTGACACACTCG-3'。
6.权利要求5所述用于扩增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段的引物在扩增淋病奈瑟氏菌16s rRNA基因片段中的应用。
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