CN1680596A - 淋病奈瑟菌荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含：标准阳性模板、阳性对照品、阴性对照品、荧光聚合酶链式反应液、DNA提取液，荧光聚合酶链式反应液中含有自身淬灭引物和下游引物。该试剂盒利用一条自身淬灭荧光引物(同时作为PCR上游扩增引物)和一条PCR下游扩增引物，在定量PCR仪上反应，可以精确定量标本中淋病耐瑟氏菌的含量。该试剂盒采用最新的荧光探针技术——自身淬灭引物(self quenched primer)，具有灵敏度高，特异性高，反应快速，成本低等优点，可以用于临床及科研中患者尿道分泌物淋病耐瑟氏菌的定性和定量检测，用以早期辅助诊断、指导治疗及提示预后。

Description

淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒

                               技术领域

本发明属生物医学技术领域，具体涉及一种用于定量检测淋病奈瑟菌的荧光定量PCR试剂盒，可为临床诊断、治疗泌尿道、生殖道的淋病奈瑟菌感染提供信息。

                               技术背景

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)是泌尿生殖系统传播疾病(STD)最常见的病原体。临床对淋病奈瑟菌的检测常利用培养法，但是由于淋病奈瑟菌非常脆弱，必须要采取床旁接种，即使这样，也导致培养法的检测阳性率偏低。常规PCR方法虽然直接检测淋病奈瑟菌的DNA，可以提高阳性检出率，但是常规PCR在PCR反应后要开盖进行后续检测，常存在污染和非特异性扩增导致的假阳性，而且操作比较烦琐。近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)技术，从常规PCR定性检测迈上了可以量化的台阶，它的技术更先进，操作更便捷，利用荧光定量PCR技术能达到实时监测、绝对定量和快速检测的目的，它与核酸分子杂交等技术一起领导着基因诊断的发展趋势，目前已经广泛应用于临床检验的多项指标中。开发淋病奈瑟菌荧光定量PCR试剂盒，将能定量检测淋病奈瑟菌DNA的复制数量，不但可以为临床提供更准确和更有价值的诊断信息，还可为临床上的疗效观察、用药剂量、用药时间等提供依据。

荧光定量PCR技术有很多分支，其定量方法多种多样，其中主要分为荧光染料嵌入技术和荧光探针技术。荧光染料嵌入技术是利用染料SYBR green I嵌入DNA双链荧光强度增加的特性，将荧光信号引入双链DNA，但是此方法特异性不高，不适合用于临床，而荧光探针技术如Taqman技术、分子信标技术、杂交探针技术等因为其特异性比荧光染料嵌入技术好，因此适合临床使用，但是，现有的荧光探针技术主要存在的问题是：都必须在一对PCR扩增引物外，再单独合成一段甚至两段有荧光物质和淬灭物质双标记的寡核苷酸链作为探针，因此，增加了反应体系的扩增难度，同时，由于要进行荧光物质和淬灭物质双标记，使得探针的合成成本较高，直接影响其市场推广以及病人承受能力及接受度

                             发明内容

本发明的目的是提供一种淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒，以准确、灵敏、快速检测淋病奈瑟菌，并能够极大地降低成本。

本发明所述的淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒，包含标准阳性模板、阳性对照品、阴性对照品、Taq DNA聚合酶、荧光聚合酶链式反应液、DNA提取液，荧光聚合酶链式反应液中含有自身淬灭引物和下游引物，自身淬灭引物序列为：5’-gaccgCCAGCATTCGCTTCTCGGtC-3’，3’端的第二个碱基t标记荧光素FAM，5’端的gaccg可以与3’端最后5个碱基形成自身配对，下游引物序列为：5’-ATTGCCCAGTCGAGAACAGC-3’，标准阳性模板的核苷酸序列为：

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所述标准阳性模板是含有插入淋病奈瑟菌特异性核酸序列的PGEM-11zf(+)质粒载体，该载体可在大肠杆菌DH5α和JM109中增殖。

荧光聚合酶链式反应液中还含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、H₂O。

DNA提取液包括无菌生理盐水和1％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液。

阳性对照品为含有淋病奈瑟菌DNA的DNA样品。

阴性对照品为不含淋病奈瑟菌DNA的DNA样品。

本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明采用的是最新的自身淬灭引物(self quenched primer)技术，该技术只需要一对扩增引物，引物中的某一条3’端经过荧光标记(该引物即为自身淬灭引物)，同时自身淬灭引物5’端连接有几个和3’自身配对的碱基，自身淬灭引物是通过自身构象的变化实现荧光信号的淬灭和荧光信号的产生。PCR开始前引物处于游离状态，自身淬灭引物5’端和3’端自身配对，形成发夹结构，这种结构的构象可以导致标记的荧光物质发生淬灭，此时荧光信号很弱，当PCR反应开始后，自身淬灭引物在变性温度下解链，形成单链结构，在退火阶段，自身淬灭引物和模板杂交，并进行延伸反应，引物(自身淬灭探针)延伸导致其构象发生变化，荧光淬灭效应减弱，此时可以产生强烈的荧光信号，随着PCR反应进行，有更多的自身淬灭引物构象发生改变，荧光信号也不断增强(见图1)。

自身淬灭引物法是直接将荧光物质标记在一条扩增引物上，在保证高灵敏度和高特异性的前提下，巧妙的将引物和荧光探针融为一体，在反应体系中不需要单独合成和标记探针，同时该技术利用引物自身二级结构实现荧光淬灭，因此只标记荧光物质即可，而不需要标记淬灭物质。荧光定量PCR的成本主要在于探针的标记(包括荧光物质和淬灭物质的标记)，而自身淬灭引物法只需要单标记荧光物质，不需要标记淬灭物质(其他荧光探针技术都要做双标记)，这都能大大降低使用成本，且使得反应体系容易优化，扩增反应容易进行，本试剂盒就是使用这种荧光技术检测淋病奈瑟菌，取得了很好的检测效果。自身淬灭引物和其它荧光探针技术的比较如表1所示：

          表1    自身淬灭引物和其它荧光探针技术的比较

	其它荧光探针技术	自身淬灭引物
			引物和探针个数标记反应体系成本	一对引物，一个或两个探针双标记成分多，影响体系优化和扩增进行高	一对引物，无需探针单标记成分少，扩增容易进行低

本发明所述试剂盒利用自身淬灭引物技术检测分泌物中淋病奈瑟菌，并经检测淋病患者标本，获得了很好的检测效果，该试剂盒能够准确、灵敏、快速检测淋病奈瑟菌，并能够极大地降低成本。

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为自身淬灭引物荧光强度变化的原理图，其中横坐标代表自身淬灭引物构象，纵坐标代表相对荧光强度。该图表明，随着自身淬灭引物构象的变化，相对荧光强度逐渐增强。

图2为将本发明试剂盒阳性标准模板进行梯度稀释后，实施荧光定量PCR所得荧光曲线，横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度，图中平行于横坐标的直线代表荧光阈值。

图3为将本发明试剂盒阳性标准模板进行梯度稀释后，实施荧光定量PCR所得标准曲线，横坐标代表不同稀释度阳性标准模板的浓度，纵坐标代表荧光阈值。

                           具体实施方式

该淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒，包含标准阳性模板、阳性对照品、阴性对照品、Taq DNA聚合酶、荧光聚合酶链式反应液、DNA提取液淋病奈瑟菌。荧光聚合酶链式反应液中含有自身淬灭引物、下游引物、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、H2O；DNA提取液包括无菌生理盐水和1％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液；阳性对照品为含有淋病奈瑟菌DNA的DNA样品，阴性对照品为不含淋病奈瑟菌DNA的DNA样品；标准阳性模板是含有插入淋病奈瑟菌特异性核酸序列的PGEM-11zf(+)质粒载体，该载体可在大肠杆菌DH5α和JM109中增殖。

荧光定量PCR检测试剂盒的配制

一、材料：

质粒PGEM-11zf(+)购自Promega公司，PCR用Taq酶、dNTPs、Buffer、MgCl₂购自大连宝生物技术公司，PTC-200 PCR仪为Perkin Elmer产品，RG-3000为Corbett Research产品。

二、引物的设计合成：

以淋病奈瑟菌隐蔽性质粒(GenBank登陆号L40552)为模板，使用primerpremier5.0设计标准阳性模板制备用引物，再利用LUX^TM Designer软件，自主设计检测用自身淬灭探针和下游引物。

自身淬灭引物序列为：

5’-gaccgCCAGCATTCGCTTCTCGGtC-3’

3’端的第二个碱基t标记荧光素FAM，5’端的gaccg可以与3’端最后5个碱基形成自身配对，由invitrogen公司合成。

下游引物序列为：

5’-ATTGCCCAGTCGAGAACAGC-3’

三、标准阳性模板制备：

淋病奈瑟菌阳性标本100ul加800ul无菌生理盐水充分混匀，13000rpm，离心10分钟，弃上清留沉淀，加100ul 1％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，100℃沸水浴5分钟，立即放冰上，13000rpm离心5分钟，上清即含淋病奈瑟菌DNA。

普通PCR反应：反应体系含10×缓冲液10μl，10mmol/L dNTPs混合物2μl，标准阳性模板制备用上下游引物(5μmmol/L)各5μl，25mmol/LMgCl₂ 4μl，Taq酶1μl，含淋病奈瑟菌模板DNA2μl，加水至50μl、扩增条件为94℃5min，95℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，40个循环。

PGR产物电泳检测后，切胶回收，定量，经BamHI和HindIII双酶切后，克隆进同样经BamHI和HindIII双酶切的PGEM-11zf(+)载体，转化入DH5α，并将阳性克隆测序鉴定，经上海生工生物有限公司测序，结果为：

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测序结果与插入序列完全一致，阳性标准模板制备成功，质粒提取后即含有阳性标准模板，紫外测浓度为并换算成拷贝数/体积，最后稀释到10⁹copies/ul。

四、本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为1×10²-1×10⁹copies/ul。

DNA提取：待检标本100ul加800ul无菌生理盐水充分混匀，13000rpm，离心10分钟，弃上清留沉淀，加100ul 1％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，100℃沸水浴5分钟，立即放冰上，13000rpm离心5分钟，上清即含淋病奈瑟菌DNA。

荧光定量PCR检测：在荧光定量PCR仪上进行，总体积20ul，其中17.8ul荧光聚合酶链式反应液，2ul待测标本(DNA、标准阳性模板、阳性对照品和阴性对照品)，0.2ul Taq酶。反应条件：95℃预变性2分钟，95℃ 15秒、60℃30秒并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得标准曲线，计算得到各待测标本中淋病奈瑟菌的量(copies/ul)。

自身淬灭探针荧光定量PCR检测淋病奈瑟菌试剂盒的性能评价

一、标准曲线制备及线性范围

取梯度稀释的阳性标准模板(浓度为10⁹-10²copies/ul)进行荧光定量，总体积20ul，其中17.8ul PCR反应液，2ul梯度稀释的标准品(10⁹-10²copies/ul)，0.2ul Taq酶。反应条件：95℃预变性2分钟，95℃ 15秒、60℃ 30秒并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线和标准曲线，荧光曲线和标准曲线见图2及图3，计算得到各标准品中淋病奈瑟菌的实际检测值(copies/ul)，并计算相关系数(R)和变异系数(CV)，并得出线性范围。结果为；

阳性标准模板在浓度10⁹-10²copies/ul之间均有良好的线性关系，R＝0.99839，R²＝0.99679，表明标准曲线的相关性很好。同时阳性标准模板的理论值与实测值间差别(变异系数)较小。不同浓度阳性标准模板的理论值与实测值间差别见表2：

表2  不同浓度阳性标准模板的理论值与实测值间差别

标本类型	给定浓度(copies/ul)	实测浓度(copies/ul)	变异系数(CV)	循环阈值(Ct)
					阳性参控品	1.00E+09	1.51E+09	30.95％	4.69
阳性参控品	1.00E+08	6.96E+07	30.45％	9.12
					阳性参控品	1.00E+07	7.53E+06	24.69％	12.32
阳性参控品	1.00E+06	7.66E+05	23.39％	15.61
					阳性参控品	1.00E+05	1.63E+05	62.74％	17.84
阳性参控品	1.00E+04	1.07E+04	6.87％	21.76
					阳性参控品	1.00E+03	8.83E+02	11.74％	25.35
阳性参控品	1.00E+02	1.08E+02	7.55％	28.38

二、重复性实验

批内重复性：取梯度稀释的阳性标准模板(浓度为10⁹-10²copies/ul)，并带一个已知的高浓度淋病奈瑟菌样品和一个低浓度淋病奈瑟菌样品，并且两个样品一次各重复做10个平行管，进行荧光定量，总体积20ul，其中17.8ulPCR反应液，2ul梯度稀释的阳性标准模板或已知浓度的样品(10⁹-10²copies/ul)，0.2ul Taq酶。反应条件：95℃预变性2分钟，95℃ 15秒、60℃ 30秒并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得标准曲线，并计算得到高浓度和低浓度样品中淋病奈瑟菌的量(copies/ul)，将高浓度和低浓度各自10个平行管的结果计算出变异系数(CV)。天间重复性：取梯度稀释的阳性标准模板(浓度为10⁹-10²copies/ul)，并带一个已知的高浓度淋病奈瑟菌样品和一个低浓度淋病奈瑟菌样品，，进行荧光定量，连续10天每天分别分别测定一次。总体积20ul，其中17.8ul PCR反应液，2ul梯度稀释的阳性标准模板或已知浓度的样品(浓度为10⁹-10²copies/ul)，0.2ul Taq酶。反应条件：95℃预变性2分钟，95℃ 15秒、60℃ 30秒并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得标准曲线，计算得到高拷贝和低拷贝样品中中淋病奈瑟菌的量(copies/ul)，将连续10天的结果计算出各自变异系数(CV)。结果为：高浓度和低浓度样品的批内重复性和天间重复性均较好。高浓度和低浓度样品的重复性实验结果见表3：

        表3  高浓度和低浓度样品的重复性实验结果

	高浓度样品	低浓度样品
			批内重复性(CV)天间重复性(CV)，	1.8％3.2％	1.0％2.6％

三、特异性实验

为了证实本发明对淋病奈瑟菌检测的特异性，我们选取了其它常见病原体和常见污染微生物做特异性实验，选取的微生物包括：解脲支原体、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、乳杆菌、大肠杆菌。

取梯度稀释的阳性标准模板(浓度为10⁹-10²copies/ul)，，进行荧光定量，总体积20ul，其中17.8ul PCR反应液，2ul梯度样品(阳性标准模板、淋病奈瑟菌DNA样品及解脲支原体、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、乳杆菌和大肠杆菌的DNA)，0.2ul Taq酶。反应条件：95℃预变性2分钟，95℃ 15秒、60℃ 30秒并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果为：对于淋病奈瑟菌，本试剂盒检测为阳性，对于其它可导致污染的微生物和病原体，试剂盒检测均为阴性，表明本试剂盒检测淋病奈瑟菌的特异性好。特异性实验结果见表4：

   表4  特异性实验结果

	检测结果
		淋病奈瑟菌解脲支原体金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌甲型链球菌乙型链球菌乳杆菌大肠杆菌	阳性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性

四、标本检测

标本来自临床确诊或拟诊病人，总例数64例，其中13例确诊淋病人标本。

对照诊断标准为培养法：用血琼脂培养基培养、分离、鉴定，并做氧化酶试验。

待检标本100ul加800ul无菌生理盐水充分混匀，13000rpm，离心10分钟，弃上清留沉淀，加100ul 1％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，100℃沸水浴5分钟，立即放冰上，13000rpm离心5分钟，上清即含淋病奈瑟菌DNA。

荧光定量：总体积20ul，其中17.8ul PCR反应液，2ul待测标本(待测标本、阳性标准模板、阴性对照和阳性对照)，0.2ul Taq酶。反应条件：95℃预变性2分钟，95℃ 15秒、60℃ 30秒并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得标准曲线，计算得到各待测标本中淋病奈瑟菌的量(copies/ul)。

结果为：

(1)荧光定量PCR的阳性率为60.9％(39/64)，明显高于培养法42.1％(27/64)，统计学处理有显著性差异(P＜0.01)，且在以培养法阳性的27例标本中，荧光定量PCR检测权威阳性(100％)；

(2)13例确诊淋病患者中，荧光定量PCR全部为阳性，二者符合率为100％，而培养法阳性率为70％(9/13)，符合率为70％。

SEQUENCE LISTING

<110>尹一兵  罗进勇

<120>淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

gaccgccagc attcgcttct cggtc                                      25

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

attgcccagt cgagaacagc                                             20

<210>3

<211>577

<212>DNA

<213>淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)

<400>3

tctaactcgg ctgccaagct cgctagctgc tgcgctaaac tcgtgttttc ctgctctagc 60

tctgccaacc tttcgcccaa gtgcgttaag gctttcatca ttcgctgctc gattgctgcg 120

tgattgctct ctaattccgc taacgcgtcc agcattcgct tctcggtcgc tacgcatacc 180

cgcgttgctt tgctgttctc gactgggcaa ttttccagtg tcaaaccttt ggtcttggtt 240

tccaacaggt ctagggtgcg ctctgcttcg gctctctgct gtttcaagtc gtccagctcg 300

ttcttgacgc tccatatcgc tatgaacagc cctgctatga ctatcaaccc tgccgccgat 360

atacctagca agctccacag atagggcttg aatactgcct tgctcatgcg taactgccgg 420

gcgtttatat cggcggttat tttctgctcg ctttgcttca atgcctcgtt gatatttttc 480

cgtaacgtct ctaagtctgc tttcgtttgt tgctctatgc tggcggcttc ggtgcgtgat 540

gtctgctcga aggtctt                                                557

Claims (2)

1、一种淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒，包含标准阳性模板、阳性对照品、阴性对照品、Taq DNA聚合酶、荧光聚合酶链式反应液、DNA提取液，其特征在于：荧光聚合酶链式反应液中含有自身淬灭引物和下游引物，自身淬灭引物序列为：5’-gaccgCCAGCATTCGCTTCTCGGtC-3’，3’端的第二个碱基t标记荧光素FAM，5’端的gaccg可以与3’端最后5个碱基形成自身配对，下游引物序列为：5’-ATTGCCCAGTCGAGAACAGC-3’，标准阳性模板的核苷酸序列为：

tctaactcggctgccaagctcgctagctgctgcgctaaactcgtgttttcctgctctagctctg

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ctctatgctggcggcttcggtgcgtgatgtctgctcgaaggtctt

2、根据权利要求1所述的淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述标准阳性模板是含有插入淋病奈瑟菌特异性核酸序列的PGEM-11zf(+)质粒载体，该载体可在大肠杆菌DH5α和JM109中增殖。

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