CN103333961A - 检测阴道加德纳杆菌的引物、探针及方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测阴道加德纳杆菌的实时荧光定量PCR引物和探针，其序列分别如SEQIDNO.6，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。本发明还提供了使用上述引物和探针进行荧光定量PCR检测阴道加德纳杆菌的方法及其检测试剂盒。本发明的检测方法及其检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

Description

检测阴道加德纳杆菌的引物、探针及方法和试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学体外诊断试剂技术领域，特别是涉及用于检测阴道加德纳杆菌的引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行阴道加德纳杆菌检测的方法和试剂盒。 

背景技术

阴道加德纳杆菌（Gardnerella vaginalis，GV）是细菌性阴道病(Bacterial vaginosis，BV)的主要病原体，可经性接触传播。在BV患者和健康妇女中，阴道加德纳杆菌检出率存在显著差异，在BV的微生物菌群中GV处于优势地位，数量明显高于其他非正常菌群。细菌性阴道炎在妇科门诊中的患病率为18%-20%，发病率45%，居其他阴道炎之首。因此对于阴道加德纳杆菌的检测对于细菌性阴道炎的早期诊断、早期治疗以及预防控制等至关重要。 

    目前对阴道加德纳杆菌的实验室诊断主要有直接涂片革兰染色找线索细胞、细菌分离培养以及PCR等。直接涂片革兰染色找线索细胞和加德纳杆菌法，是临床最常见的检测方法，该方法同时可进行真菌和淋病等检测，是一种相对简便易行的常规方法，由于该方法误判率高、不能作为一种确诊方法，只能作为一种常规筛查。细菌分离培养法是检测GV的金标准，准确可靠，但其培养要求高，阳性检出率低，易受药物等环境因素的影响，且耗时长、花费大。普通PCR技术可以避免这一问题，但是存在灵敏度低、易污染造成假阳性等缺点，同时常规PCR专利已经失去保护，很难形成商品化试剂盒。 

 实时荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。目前国内尚无检测阴道加德纳杆菌的实时荧光PCR技术以及试剂盒的相关专利。 

发明内容

本发明的目的在于提供用于实时荧光PCR检测阴道加德纳杆菌的特异性引物和探针。 

本发明的另一个目的在于提供检测阴道加德纳杆菌的荧光定量PCR方法及其试剂盒。 

为了实现上述目的，本发明筛选出阴道加德纳杆菌的特异性序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。 

本发明提供用于检测阴道加德纳杆菌上述特异序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。其中，探针5’标记荧光基团为FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’标记淬灭基团为TAMRA、DABCYL或BHQ。该特异引物扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。 

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为： 

上游引物：CTTTTCTCGGCAAGCAGGAT，

下游引物：TTCCGTGGCTAAGCGTGT；

探针序列为：FAM-CCTTACAGCCTACCCATCACGCCTCAGC-TAMRA。

    本发明还保护上述引物和探针序列的互补核苷酸序列，或向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。 

    本发明提供一种阴道加德纳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，是以样品总DNA 为模板，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立标准品，根据扩增曲线判定结果。 

本发明的实时荧光定量PCR的反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为： 

。

本发明的实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。 

本发明提供了一种用于阴道加德纳杆菌检测的试剂盒，其包括上述能特异地扩增出如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列或其特异性片段的引物以及配合引物使用的探针。 

本发明试剂盒所用引物序列为： 

上游引物：CTTTTCTCGGCAAGCAGGAT，

下游引物：TTCCGTGGCTAAGCGTGT；

探针序列为：FAM-CCTTACAGCCTACCCATCACGCCTCAGC-TAMRA。

    本发明提供的试剂盒，还包括标准品，所述标准品含有阴道加德纳杆菌基因组DNA。 

    本发明提供用于对阴道加德纳杆菌进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样品中的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中阴道加德纳杆菌DNA含量的目的。本发明所提供的引物和探针可用于临床及科研中对感染细菌性阴道炎的患者携带的阴道加德纳杆菌DNA进行定性、定量分析，对判断阴道加德纳杆菌感染的发生、治疗效果评价以及病情的动态观察具有重要意义，本发明将在临床医学检测领域发挥重要作用。 

    下面结合附图以及具体实施方案对本发明做更详细阐述。 

附图说明

图1为本发明提供的试剂盒的灵敏度实验结果，其中A12-A19对应质粒浓度分别为1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml、阴性对照； 

图2为本发明提供的试剂盒的特异性实验结果，其中A4-A17分别为：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、阴道加德纳杆菌、阴性对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

实施例中所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。 

实施例1 23s rRNA基因标准品的制备

要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。本研究采用阴道加德纳杆菌23s rRNA 作为靶序列。本部分主要采用PCR技术扩增阴道加德纳杆菌23s rRNA 基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-Gv23s，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。

一、模板DNA的制备 

1、提取阴道加德纳杆菌（标准菌株ATCC14018,购自中国医学细菌保藏管理中心）基因组DNA，用作23s rRNA基因PCR扩增的模板

吸取500μl培养的阴道加德纳杆菌菌液加入到1.5ml离心管中10000 rpm离心1分钟，取上清，加入200μl灭菌的 TE buffer，震荡悬浮，然后放入到沸水浴锅中煮沸10分钟后，迅速置于冰上放置5分钟，10000 rpm离心3分钟，转移上清液至新的离心管中-20℃保存。

二、23s rRNA基因片段的PCR扩增 

1、引物的设计与合成

    本发明通过对NCBI数据库中阴道加德纳杆菌23s rRNA 全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。

    本发明选取扩增的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

本发明所设计的外围引物序列如下： 

上游引物：Gv23s979F：5'-GGTTATAGTTACCACCGCCGTT-3'（SEQ ID NO.2）

下游引物：Gv23s1928R：5'-AGCCATCCTTGAAAGAGTGCGT-3'（SEQ ID NO.3）

扩增片段大小为：950bp。

    2、PCR反应体系和反应条件 

    以煮沸法得到的上清液为模板，以上述外围引物Gv23s979F/Gv23s1928R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。

PCR体系： 

。

其中引物采用Gv23s979F/Gv23s1928R，Taq酶采用杭州博日（BSA09M2），PCR扩增仪为西安天隆 PCR model MG96+。 

扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1.5min，35个循环；72℃ 10min，取3μL扩增产物进行1%琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。 

三、重组质粒pMD18-T-Gv23s rRNA的构建和转化 

     1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T（大连宝生物公司）进行连接，采用如下连接体系进行配制：

。

配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。 

、pMD18-T-Gv23s质粒的转化以及PCR鉴定 

①　从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻。

②　取步骤1中制备的连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟。 

③　42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min。 

④　向1.5ml EP管中加入预冷的400ml的LB液体培养基（不含氨苄青霉素）（配方及制备方法参见《分子克隆》）混匀后，37℃ 200转/分钟轻摇培养1h。 

⑤　将上述培养液摇匀后取100μl涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB平板（配方及制备方法参见《分子克隆》）上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜。 

⑥　次日观察，从平板上挑取白色单克隆菌落稀释于50μL无菌水中，吸取2μL作为PCR模板，剩余的稀释菌液加入到20ml的LB液体培养基中37℃ 200转/分钟进行扩大培养。 

⑦　用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。 

引物RV-M/M13-47序列如下： 

    引物 RV-M:  5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’（SEQ ID NO.4）

    引物 M13-47: 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’（SEQ ID NO.5）

体系如下：

。

扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。 

⑧　采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。 

实施例2 实时荧光定量PCR检测阴道加德纳杆菌方法的初步建立

一、特异性引物和探针的设计与合成

    以上述选取的阴道加德纳杆菌的23s rRNA基因的保守片段为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针。

    作为本发明的核心，一组用于阴道加德纳杆菌实时荧光PCR检测的引物和探针核苷酸序列如下： 

  上游引物：Gv23s1337F: 5’-CTTTTCTCGGCAAGCAGGAT-3’（SEQ ID NO.6）  

  下游引物：Gv23s1453R: 5’-TTCCGTGGCTAAGCGTGT-3’ （SEQ ID NO.7）

探针：Gv23s1361P: 5’-FAM-CCTTACAGCCTACCCATCACGCCTCAGC-TAMRA-3’（SEQ ID NO.8）    该引物和探针扩增目标核苷酸序列为：

5’-CTTTTCTCGGCAAGCAGGATCACCGGAATCAGCCTTACAGCCTACCCATCACGCCTCAGCTTAAACATCCCCCGGATTTACCTAGGAGACAGCCCACACGCTTAGCCACGGAA-3’（SEQ ID NO.9）

二、标准品的获取和定量

1、取将冻存的含有重组质粒pMD18-T-Gv23s rRNA的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基（含氨苄青霉素，配方及制备方法参见《分子克隆》），37℃ 200rpm过夜摇床培养。

2、取1ml培养过夜的菌液转种于30ml LB液体培养基，200rpm 增菌培养2-3小时，然后采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒。 

3、利用超微量紫外可见分光光度计对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度，根据A260的吸光度值可计算出样品中质粒DNA的含量，即1OD值相当于50μg/ml双链DNA。 

4、质粒pMD18-T-Gv23s rRNA浓度（拷贝数）计算 

（1）质粒的分子量=3641bp×660（每对碱基的平均分子量）

（2）测得质粒A260=1.469，根据公式可计算出提取的质粒浓度为73.45μg/ml。因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml。

质粒 copies/ml=阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数 

其中阿伏伽德罗常数=6.02×10²³copies/mol

因此提取的质粒浓度copies/ml=73.45μg/ml×10^-6×6.02×10²³copies/mol÷

                           （3641bp×660g/bpmol）

                          =1.84×10¹³copies/ml

10μl质粒+8.4μl的无菌水就得到浓度为1.00×10¹³copies/ml的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。

三、方法评估

1、灵敏度实验

将上述制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml等作为梯度模板。反应体系如下：

。

反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果（见图1）显示当质粒浓度达到1.00×10³copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到1.00×10²copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×10³copies/ml。 

2、特异性实验 

为了证实本发明对阴道加德纳杆菌检测的特异性，我们选取了其他常见病原体和常见污染菌做特异性实验，选取的微生物包括：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、阴道加德纳杆菌。

其中金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌等采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302-02）提取DNA，其余革兰氏阴性菌采用沸水裂解法提取DNA。采用百泰克公司生产的2×real-time PCR Premixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，反应体系如下： 

。

反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图2，具体结果为仅阴道加德纳杆菌检测为阳性，其余易污染微生物和致病菌均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如表1所示。 

。 

3、对比实验 

选取70份待测样品，用细菌分离培养法和本发明的试剂盒分别进行检验。检验结果如下：

细菌分离培养法：22份阳性，48份阴性。

本发明的试剂盒：36份阳性，34份阴性。其中，应用细菌分离培养法检测出的阳性，用本发明的试剂盒全部检出，除此之外，本发明的试剂盒还检测出14份阳性。这是因为本发明的试剂盒灵敏度高（1.00×10³copies/ml），在患者只是携带少量阴道加德纳杆菌时也能检测到，能很好的用于细菌性阴道炎的早期预防。 

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。  

序列表

<110>  兰州百源基因技术有限公司 

<120>  检测阴道加德纳杆菌的引物、探针及方法和试剂盒

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  950

<212>  DNA

<213>  阴道加德纳杆菌

<400>  1

ggttatagtt accaccgccg tttaccgggg cttaaattca ccgcttcacc gaagctaacg     60

gatcctctta accttccggc accgggcagg cgtcagagcg tatacagcgg cttacgcctt    120

cgcacgctcc tgtgtttttg gtaaacagtc gctaccccct agcttgtgcc acccccaaca    180

gctcaacaat gtgaaaccat atcaccatca ggggtctccc ttatgccgaa ggcacgggag    240

taatttgccg agttccttgg ccaggattcg cccgatcgct ttggtatact ctaccagacc    300

accagtgtcg gtttagggta cgagcggaat cacacctcac gttgaagctt ttctcggcaa    360

gcaggatcac cggaatcagc cttacagcct acccatcacg cctcagctta aacatccccc    420

ggatttacct aggagacagc ccacacgctt agccacggaa aaccacctcc gcagccggct    480

acctacccgc gtcactccca cgctaaccta ctaccgatac gctcccaaca ctaaaccaga    540

agaaaacccc gaaagataat caaccagaat aacgaaggtt agtactctca gattcagttc    600

gaacggtgta acaccggtac gggaatatca acccgttcat ccattcgact acgcctgtcg    660

gcctcgcctt aggactcgac tcacccgggg acgacgaacg tggccccgga acccttagtc    720

attcagcgga caggattcac acctgtctct cgctactcat gtctgcattc tcactcccgt    780

atagtccacg acaagttcac actgccgctt caccccatac aggacgctct cctaccccac    840

atgaactaaa tcatgcagcc gcgtcttcgg tggcgtgctt aagccccgct acattgtcgg    900

cgcggaacca ctagaccagt gagctgttac gcactctttc aaggatggct               950

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ggttatagtt accaccgccg tt                                              22

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

agccatcctt gaaagagtgc gt                                              22

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

gagcggataa caatttcaca cagg                                            24

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

cgccagggtt ttcccagtca cgac                                            24

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

cttttctcgg caagcaggat                                                 20

<210>  7

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

ttccgtggct aagcgtgt                                                   18

<210>  8

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

ccttacagcc tacccatcac gcctcagc                                        28

<210>  9

<211>  113

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

cttttctcgg caagcaggat caccggaatc agccttacag cctacccatc acgcctcagc     60

ttaaacatcc cccggattta cctaggagac agcccacacg cttagccacg gaa           113

序列表

<110>  兰州百源基因技术有限公司

<120>  检测阴道加德纳杆菌的引物、探针及方法和试剂盒

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  950

<212>  DNA

<213>  阴道加德纳杆菌

 

<400>  1

ggttatagtt accaccgccg tttaccgggg cttaaattca ccgcttcacc gaagctaacg     60

 

gatcctctta accttccggc accgggcagg cgtcagagcg tatacagcgg cttacgcctt    120

 

cgcacgctcc tgtgtttttg gtaaacagtc gctaccccct agcttgtgcc acccccaaca    180

 

gctcaacaat gtgaaaccat atcaccatca ggggtctccc ttatgccgaa ggcacgggag    240

 

taatttgccg agttccttgg ccaggattcg cccgatcgct ttggtatact ctaccagacc    300

 

accagtgtcg gtttagggta cgagcggaat cacacctcac gttgaagctt ttctcggcaa    360

 

gcaggatcac cggaatcagc cttacagcct acccatcacg cctcagctta aacatccccc    420

 

ggatttacct aggagacagc ccacacgctt agccacggaa aaccacctcc gcagccggct    480

 

acctacccgc gtcactccca cgctaaccta ctaccgatac gctcccaaca ctaaaccaga    540

 

agaaaacccc gaaagataat caaccagaat aacgaaggtt agtactctca gattcagttc    600

 

gaacggtgta acaccggtac gggaatatca acccgttcat ccattcgact acgcctgtcg    660

 

gcctcgcctt aggactcgac tcacccgggg acgacgaacg tggccccgga acccttagtc    720

 

attcagcgga caggattcac acctgtctct cgctactcat gtctgcattc tcactcccgt    780

 

atagtccacg acaagttcac actgccgctt caccccatac aggacgctct cctaccccac    840

 

atgaactaaa tcatgcagcc gcgtcttcgg tggcgtgctt aagccccgct acattgtcgg    900

 

cgcggaacca ctagaccagt gagctgttac gcactctttc aaggatggct               950

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ggttatagtt accaccgccg tt                                              22

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

agccatcctt gaaagagtgc gt                                              22

 

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gagcggataa caatttcaca cagg                                            24

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cgccagggtt ttcccagtca cgac                                            24

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

cttttctcgg caagcaggat                                                 20

 

<210>  7

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

ttccgtggct aagcgtgt                                                   18

 

<210>  8

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

ccttacagcc tacccatcac gcctcagc                                        28

 

<210>  9

<211>  113

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

cttttctcgg caagcaggat caccggaatc agccttacag cctacccatc acgcctcagc     60

 

ttaaacatcc cccggattta cctaggagac agcccacacg cttagccacg gaa           113

Claims (9)

1.一种检测阴道加德纳杆菌的特异性引物，其扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的特异性引物，其核苷酸序列为：

上游引物：CTTTTCTCGGCAAGCAGGAT，

下游引物：TTCCGTGGCTAAGCGTGT；

或其互补核苷酸序列，向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

3.与权利要求1或2所述引物配合使用的荧光探针。

4.根据权利要求3所述的荧光探针，其核苷酸序列为：

FAM-CCTTACAGCCTACCCATCACGCCTCAGC-TAMRA；或

荧光报告基团为TET、JOE、HEX或VIC，荧光淬灭基团为DABCYL或BHQ；

或其互补核苷酸序列，向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

5.一种阴道加德纳杆菌的检测方法，是以样品总DNA 为模板，利用权利要求1 或2 所述的引物和权利要求3 或4 所述探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR的反应体系为：

。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。

8.含有权利要求1 或2 所述引物和/ 或权利要求3 或4 所述探针的试剂盒。

9.根据权利要求8 所述的试剂盒，其还包括标准品，所述标准品含有阴道加德纳杆菌基因组DNA。

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