CN101613763A - 诊断沙眼衣原体、淋球菌及解脲支原体感染的荧光pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于诊断沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)及解脲支原体(UU)感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)检测方法，属于体外核酸诊断领域。本发明包括一个以荧光PCR技术为基础的多重聚合酶链式反应(PCR)体系，包含针对CT/NG/UU的正、反向引物和荧光探针，在适合的PCR条件下可在一个反应管中同时检测CT/NG/UU等3种病原体的DNA。本发明可以简便快速地在临床样品中诊断诊断CT/NG/UU感染，灵敏度高，特异性强，对相关的泌尿生殖道感染的早期防治、阻断传染源、减少相关病原体的感染均有重要的临床价值。

Description

诊断沙眼衣原体、淋球菌及解脲支原体感染的荧光PCR方法

技术领域

本发明是一种在临床样品中同时检测沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)及解脲支原体(UU)感染的荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法。属于体外核酸诊断领域。

背景技术

性传播疾病(STD)是一组全球性传染病，主要通过性接触传播，部分STD则可通过非性接触传播，比如通过共用针头、哺乳甚至接触传播。

目前STD在我国的发病率呈不断上升的趋势，由淋球菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)和解脲支原体(Ureaplasma urealyticum，UU)三种病原体引起的泌尿生殖道感染(淋病和非淋球菌性尿道炎)已成为医院妇科、皮肤性病科、泌尿生殖科的常见疾病，为我国重点防治的对象。而由于CT、NG和UU之间存在混合感染，故对泌尿生殖系统感染的病人最好能同时检测这三种病原体，以利于诊断和治疗。因此，开发能准确、迅速、简便及廉价而又能同时检测这3种病原体的方法有着显著的临床意义。

荧光PCR检测技术融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，是目前临床检验中认同程度很高的一种检测技术，已广泛应用于科学研究和临床。但多重荧光PCR技术由于其技术难度在临床上的应用则方兴未艾。

本项目开发的STD CT/NG/UU三联核酸检测试剂盒，采用多重荧光PCR技术，能在同一PCR反应管中同时检测并鉴定CT、NG和UU。该产品对样本需要量少、成本低、操作简便、检验效率高，是目前国内外检测CT、NG和UU的唯一多重荧光PCR核酸检测试剂，不仅适合各种研究机构实验室研究和医院临床诊断使用，而且也可为流行病学调查、人群健康普查及检验检疫、STD病患者的早期治疗及控制等方面提供快速准确的检验参考依据，具有极大的社会和经济意义。

发明内容

本发明特别涉及一种利用多重荧光PCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时检测CT/NG/UU三种基因型的诊断方法。

一般PCR仅采用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段。本发明则采用多重PCR法(Multiplex PCR，多重核酸扩增法)，即在同一PCR反应体系里加上二对以上的引物，各对引物对各自特异的靶序列同时扩增的PCR反应(Phillip S.Bemard，Real-time PCR Technology for Cancer Diagnostics.ClinicalChemistry.2002；48：1178-1185.)。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。本发明的反应体系中包含3条TaqMan MGB探针(TaqMan MGB探针相对于普通TaqMan探针可以设计得更短，不但有有效地降低了合成成本，也使得设计的成功率大为提高。此外，TaqMan MGB探针提高配对与非配对序列间Tm值的差异，有利于进行更多重的PCR)和3条上游引物，3条下游引物，分别针对CT/NG/UU的DNA靶序列。能在同一反应管内同时检出CT/NG/UU三种病原体，可大大节省时间，降低成本，为临床提供更多更准确的诊断信息，更贴近临床检测需求。

由于需要同时扩增3种不同的DNA靶序列，体系中需要添加9条引物和探针，系统的复杂性(由此导致大量引物二聚体的产生)将大大降低PCR的效率，因而需要在保证特异性的前提下尽可能降低系统的复杂程度。具体方法如下：使用软件Primer Express 3.0，针对CT/NG/UU的保守区域(NG引物设计在16srRNA基因上；CT引物设计在内源性质粒序列上；UU引物设计在Urease基因上)。

具体实施方法

1.引物和探针设计(见核苷酸或氨基酸序列表与表1)与合成

引物和探针均委托专业公司合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。探针5’端标记报告基团，3’端结合淬灭基团。

表1.核苷酸或氨基酸序列表中对应扩增产物之靶序列基因库编号和位置

基因型	基因库编号(GI No.)	靶序列位置	扩增产物长度(bp)
				CT	FM865442	2160-2649	480
NG	AM921674	60-540	481
				UU	AF085729	241-720	480

2.质粒参考品的制备

使用特异性引物扩增靶序列，将经过纯化的PCR产物连接至pGEM-T载体上(Promega pGEM-Tvector system连接试剂盒)，然后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，通过蓝白斑筛选，分别构建CT/NG/UU三种重组质粒DNA作为灵敏度参考品，构建的重组质粒经双向DNA测序鉴定。

3.样本采集

男性：男性尿道炎急性期患者以常规消毒棉签取脓性分泌物，非急性期以棉签轻轻插入尿道2～4cm深处，转动取出。男性取尿道分泌物前可1～2小时禁尿，以晨间首次排尿前取样阳性率高。有前列腺症状者可取前列腺按摩液。精液标本同普通取样。

女性：成年女性患者先用无菌试纸擦去宫颈口分泌物，再用另一试纸或消毒棉杆插入宫颈内1-2cm处停留约数秒后轻轻旋转取出分泌物。婴幼女取外阴脓性分泌物。

患结膜炎的新生儿：取结膜分泌物。

体液和其他分泌物：体液标本包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心或加生理盐水后离心取沉淀物提取核酸。咽部感染者，从鼻咽部或扁桃腺窝内取材。播散性淋病可取血液、关节液或心包液等。此类标本由临床医生按照需要采集。

将从患者不同部位取样后的棉拭子等放入含1mL无菌生理盐水的无菌离心管内震荡洗涤片刻，在壁上挤干后丢弃棉拭子。盖紧离心管后，密闭送检。或者冰箱保存备，在4℃保存不超过24小时，用-20℃保存不超过6个月或-70℃长期保存。运输采用加冰密封运输。如果是水样标本则直接密闭送检或保存。

4.标本处理及DNA提取

将置于离心管中的液体标本或经生理盐水处理过的标本，12000rpm/min离心10min。尽可能吸去上清后，沉淀加核酸提取液50μL，充分振荡混匀，快速离心后100度干浴或沸水浴10min。12000rpm/min离心2min，取上清液2μL加入PCR反应管进行PCR反应。如果不立刻进行PCR反应，则将核酸提取液处理过的标本液置于-20℃保存，下次PCR反应之前应振荡离心处理。

5.对照品选择

使用人基因组DNA(30μg/ml)为阴性对照；CT/NG/UU混合重组质粒(各2.0×10⁵copies/μl)为强阳性对照；CT/NG/UU混合重组质粒(各2.0×10³copies/μl)为临界阳性对照。

6.PCR反应组成

按下表(表2)配制PCR反应液并加入DNA模板(每次试验必须包含阴性、临界阳性及强阳性对照)。配制配制完毕稍作混匀并离心后上机反应。

表2.PCR反应组成

原料名称	终浓度
		PCR Buffer	(0.8-2)×
MgCl2	2-5mM
		dNTP	0.1-0.5mM
引物	各0.01-0.50μM
		探针	各0.01-0.50μM
UNG	0.05-1U
		Taq酶	0.5-3U
H2O	适量
		DNA模板	2μl
终体积	40μl

7.反应程序设定

设置收集FAM/VIC/ROX荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪开始扩增，反应程序如下(以ABI7000为例)：

表3.PCR程序设定

8.结果判断

对ABI7000，基线范围为6-15循环或由软件自动选择(Auto baseline)，设定阈值(threshold)使之超过无规则扩增曲线的最高值。

9.质控标准(表4)

表4.质控品标准检测结果(以ABI7000为例)

10.结果报告(表5)

表5.报告样本检测结果(以ABI7000为例)

11.本方法主要适用于：

(1)检测CT/NG/UU等导致的泌尿生殖道感染的病原体

(2)泌尿生殖道感染患者的随访。

检测结果应与其它诊断学方法获得的临床信息及适当的身体检查结合使用。

诊断沙眼衣原体、淋球菌及解脲支原体感染的荧光PCR方法.ST25SEQUENCE LISTING

<110>港龙生物科技有限公司

<120>诊断沙眼衣原体、淋球菌及解脲支原体感染的荧光PCR方法

<130>1

<160>9

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>CT探针

<400>1

aaagatatgg acaaatcg          18

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>NG探针

<400>2

cgggtctgag aggatgatcc gcc      23

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>UU探针

<400>3

agagaagcaa aagtaatca          19

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>CT正向引物

<400>4

gttgttaaca ggatagcacg ctcg    24

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>CT反向引物

<400>5

gccttccctt tatacgctca agc    23

<210>6

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<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>NG正向引物

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cttctcgggt ggcgagtgg         19

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

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<223>NG反向引物

<400>7

ccagtaattc cgattaacgc tcg    23

<210>8

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<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>UU正向引物

<400>8

ctgtcgcttt aattactgac cacg   24

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>UU反向引物

<400>9

ctttacgttc tttgtcttcg tttcc    25

Claims (3)

1.一种诊断沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)及解脲支原体(UU)感染的荧光PCR方法，包括以下部分：

(1)与CT/NG/UU DNA互补的寡核苷酸序列用于PCR扩增临床样品中获得DNA的引物；在这里，引物序列包含：

(a)一个能与CT基因对应的靶序列上游第一个位点杂交的正向引物；

(b)一个能与CT基因对应的靶序列下游第二个位点杂交的反向引物；

(c)一个能与NG基因对应的靶序列上游第一个位点杂交的正向引物；

(d)一个能与NG基因对应的靶序列下游第二个位点杂交的反向引物；

(e)一个能与UU基因对应的靶序列上游第一个位点杂交的正向引物；

(f)一个能与UU基因对应的靶序列下游第二个位点杂交的反向引物；

(g)正向引物和反向引物不限于本说明书序列表明的序列。

(2)用于检测CT/NG/UU的荧光标记一个或多个寡核苷酸序列探针，该探针能与位于靶序列中上述第一和第二个位点杂交之间的序列杂交。探针序列可以是SEQ ID No.1-3的序列或其互补序列。还可包括由所列序列或其互补序列衍生出来的差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列。

(3)对取得的样品进行了PCR扩增，其特征在于包括一对或多对引物及探针，以CT、NG或UU DNA作为模板，一个反应体系中扩增一个或多个DNA目标靶序列片段。通过检测PCR反应体系中一个或多个不同荧光信号的变化，确定样品中是否感染CT、NG、UU或混合感染，以及其含量。

2.根据权利要求1所述的荧光检测，其特征在于所述用于多重检测的荧光探针为TaqMan或MolecularBacon探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团(包括但不限于以下几种：FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、Oregon Green、CAL Red、Red 640、Texas Red)，3’端为一种荧光淬灭基团(包括但不限于以下几种：TAMRA、DABCYL、ECLIPSE、NFQ)，探针的3’端可以是带有DNA小沟复合物(MGB，Minor Groove Binder)修饰。

3.根据权利2要求所述的反应体系中，可使用一个或多个荧光探针，所标记的荧光报告基团可以为一种或多种。