CN101792799A - 蜜蜂欧洲幼虫腐臭病pcr快速检测方法 - Google Patents

Abstract

一种蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法，属于生物领域。本发明目的是建立PCR检测方法，为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法。本发明具有快速、敏感性高、特异性强等优点，可用于快速诊断欧洲蜂幼虫腐臭，尤其对多种病原引起的混合感染的鉴别诊断更为有效。本标准的建立的PCR检测方法，为我国欧洲蜂幼虫腐臭诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的检测方法，以期达到有效控制蜜蜂疾病，提高蜂产品质量具有重要意义。

Description

蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法

技术领域：

本发明属于生物领域。

背景技术：

蜜蜂欧洲幼虫腐臭病，简称欧幼病(European foulbrood，EFB)是蜜蜂幼虫期的一种接触性传染病，主要感染2日龄以下的小幼虫，但是病程延长时封盖幼虫也有死亡的，在这种情况下容易与美腐病棍淆。它的病原菌不形成芽孢，较易治愈。

欧幼病，广泛发生于各养蜂国，属于世界性病害。该病于1885年首次报道，目前广泛发生于世界几乎所有的养蜂生产国。我国于20世纪50年代初在广东省首次发现，60年代初南方诸省相继出现病害，随后蔓延全国。该病不仅西方蜜蜂感染，东方蜜蜂尤其是中蜂也易感染，且感染后发病比西方蜜蜂严重得多。EFB一般只感染小于2日龄的幼虫，通常病虫在4-5日龄死亡。患病后，虫体变色，失去肥胖体态。从珍珠般白色变为淡黄色、黄色、浅褐色，甚至黑褐色。刚变褐色时，通过表皮清晰可见幼虫的气管系统。随着变色，幼虫塌陷，似乎被扭曲，最后在巢房底部腐烂，干枯，成为粘性、易清除的鳞片。虫体腐烂时有难闻的酸臭味。

致病菌为蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton，M.pluton)，为蜜蜂球菌属，该菌单个的形态为披针形，直径0.5～1.0μm，革兰氏染色阳性，常结成链状或成簇排列。主要侵害1～2日龄的蜜蜂幼虫，使幼虫在3～4日龄未卦盖时大量死亡，成为蜜蜂的主要病害之一。欧洲幼虫腐臭病的早期检查有助于防止疾病的蔓延。

面对国际严峻形势，根据世界动物卫生组织对动物重大传染病检疫技术的有关规定，结合我国实际情况研究制订符合国际规则的蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫规程已经成为当务之急。关于蜜蜂欧洲幼虫腐臭的诊断方法，国内还主要根据临床证状来进行诊断，诊断水平还比较低。

目前国内行业标准SN/T 1687-2005蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断方法主要基于蜂房蜜蜂球菌的形态学观察来进行诊断，该标准是将临床上疑似蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的幼虫或死亡的幼虫进行染色直接镜检初步诊断为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病，然后经分离培养后染色镜检，在普通光学显微镜下，蜂房蜜蜂球菌呈单个或成串或头尾相间成对或成短链状或成簇排列的短披针型球菌，大小为0.5mm×10mm即可判定为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病。该方法主要依靠形态学检查，费时较长，判断易受主观因素影响。

发明内容：

本发明目的是建立PCR检测方法，为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法。

本发明步骤是：

a、采用CTAB法或者试剂盒法获得欧洲幼虫腐臭病DNA；

b、欧洲幼虫腐臭病DNA的浓度和纯度的测定：取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280，使A260与A280比值在1.7～2.0之间；

c、引物：

EFB1：5’-CTT TGAACG CCT TAG AGA-3’

EFB2：5’-ATC ATC TGT CCC ACC TTA-3’

EFB3：5’-TTAACC TCG CGG TCT TGC GTC TCT C-3’；

d、采用半巢式PCR扩增方法，根据蜂房蜜蜂球菌16S rRNA基因，设计引物EFB1和EFB2进行第一轮PCR扩增，所得PCR理论扩增产物片断大小为486bp，此步扩增结果可以对蜂房蜜蜂球菌与其它杂菌进行区分，但却无法对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的粪肠球菌进行区分；进而再以所得扩增产物为模板设计第三条引物EFB3，其位置处于EFB1和EFB2引物中间，以EFB1和EFB3为引物进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，理论扩增片断大小为276bp，可以特异性对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的肠球菌进行有效区分；最终通过半巢式PCR扩增方法对蜜蜂幼虫及蜂产品中的蜂房蜜蜂球菌进行特异性检测。

本发明试剂盒成份如下：

本发明具有快速、敏感性高、特异性强等优点，可用于快速诊断欧洲蜂幼虫腐臭，尤其对多种病原引起的混合感染的鉴别诊断更为有效。本标准的建立的PCR检测方法，为我国欧洲蜂幼虫腐臭诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的检测方法，以期达到有效控制蜜蜂疾病，提高蜂产品质量具有重要意义。

附图说明：

图1是本发明16S rRNA基因PCR扩增结果；

图中：1：100bp DNA Ladder Marker；2：蜂房蜜蜂球菌；3：空白对照；4：微孢子虫病原；5：蜜蜂幼虫芽孢杆菌；6：蜜蜂败血杆菌；7：粪肠球菌

图2是本发明蜂房蜜蜂球菌结果；

图中：1：100bp DNA Ladder Marker；2：空白对照；3：粪肠球菌；4：蜂房蜜蜂球菌。

图3是本发明酶切鉴定结果；

图中：1：100bp DNA Ladder Marker；2：蜂房蜜蜂球菌；3：粪肠球菌。

图4是本发明敏感性检测结果；

图中：1：100bp DNA Ladder Marker；2：10^-1；3：10^-2；4：10^-3；5：10^-4；6：10^-5；7：10^-6 8：空白对照。

图5是本发明PCR敏感性检测结果；

图中：1：100bp DNA Ladder Marker；2：10¹；3：10²；4：10³；5：10⁴；6：10⁵；7：10⁶；8：10⁷ 9：10⁸ 10：10⁹ 11：阴性对照。

具体实施方式：

本发明具体步骤是：

a、采用CTAB法或者试剂盒法获得欧洲幼虫腐臭病DNA；

b、欧洲幼虫腐臭病DNA的浓度和纯度的测定：取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280，使A260与A280比值在1.7～2.0之间；

c、引物：

EFB1：5’-CTT TGAACG CCT TAG AGA-3’

EFB2：5’-ATC ATC TGT CCC ACC TTA-3’

EFB3：5’-TTAACC TCG CGG TCT TGC GTC TCT C-3’；

d、采用半巢式PCR扩增方法，根据蜂房蜜蜂球菌16S rRNA基因，设计引物EFB1和EFB2进行第一轮PCR扩增，所得PCR理论扩增产物片断大小为486bp，此步扩增结果可以对蜂房蜜蜂球菌与其它杂菌进行区分，但却无法对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的粪肠球菌进行区分；进而再以所得扩增产物为模板设计第三条引物EFB3，其位置处于EFB1和EFB2引物中间，以EFB1和EFB3为引物进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，理论扩增片断大小为276bp，可以特异性对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的肠球菌进行有效区分；最终通过半巢式PCR扩增方法对蜜蜂幼虫及蜂产品中的蜂房蜜蜂球菌进行特异性检测。

病料和菌种

蜂房蜜蜂球菌NCDO 2443标准株由福建农林大学蜂学院提供，患蜜蜂欧洲幼虫腐臭病料由中国农科院蜂病研究所提供；微孢子虫病原、蜜蜂幼虫芽孢杆菌、蜜蜂败血杆菌、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)本局技术中心实验室保存。

试剂及培养基

细菌基因组DNA小量提取试剂盒(MiniBEST Bacterial GenomicDNA Extraction Kit，Ver.2.0)、TaqHS DNA聚合酶、dNTP(各2.5mmol/L)、10×buffer缓冲液、6×Loading buffer，100bp DNA LadderMarker，HinfI限制性内切酶等购自大连宝生物工程有限公司，PCR引物由大连宝生物工程有限公司合成。

培养基配制：酵母浸出液10g，半胱氨酸2g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，1M KH₂PO₄ PH6.6 100mL，加入琼脂2g，加蒸馏水1000mL，115℃灭菌20min。

CTAB沉淀液：称取5.0g CTAB，2.3376g氯化钠，加水溶解定溶至1L，分装后高压灭菌备用。

实验仪器

高速冷冻离心机(SIGMA 3K30，德国西格马公司)，核酸蛋白分析仪(Gene SpecV，Hitachi NaKa instruments Co.，Ltd.日本)，PCR扩增仪(Biometra Tgradient-96，德国Biometra公司)，电泳仪(SAVANTPS500A美国)，凝胶成像系统(Kodak EDAS290，美国柯达公司)，CO₂培养箱(Thermo Life Science)，生化恒温培养箱，微量移液器(0.1～1000μl BIOHIT芬兰)、恒温水浴锅等。

蜜蜂样品(包括幼虫和成虫)DNA的提取及纯化：

一、CTAB法

称取约200mg用研钵磨碎的样品转入2mL的离心管中。加入1.3mL DNA抽提缓冲液，涡旋震荡30s后，颠倒混合5min(注意不要使样品结块)，65℃水浴30min。室温10000g离心10min，取上层溶液800μL，加入5μL RNase A(10μg/mL)，37℃保温30min。加入等体积的三氯甲烷：异戊醇(24∶1，v/v)，颠倒混匀1min，室温10000g离心10min，取上清液600μL，加入2倍体积的CTAB沉淀液，混匀，室温放置30min。室温8000g离心10min，弃上清液。加入800μL氯化钠(NaCl)(1.2mol/L)溶解沉淀，待沉淀溶解后室温放置5min，加入等体积三氯甲烷：异戊醇(24∶1，v/v)，颠倒混匀。室温10000g离心10min，取上清液600μL，移入1.5mL的Eppendorf管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置30min。4℃，5000g离心10min，弃上清液。70％冷乙醇200μL洗涤沉淀两次，100％冷乙醇200μL洗涤沉淀一次，自然干燥10min。加入50μL TE缓冲液(pH8.0)，溶解DNA沉淀。-20℃长期保存。

二、试剂盒法

可根据需要选用相应的商品化试剂盒，使用时按操作说明书提取DNA。

DNA浓度和纯度的测定

取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按下述公式计算：

c＝A×N×50/1000

公式中：

c——DNA浓度，单位为微克每微升(μg/μL)；

A——260nm处的吸光值；

N——核酸稀释倍数。

当A260/A280比值在1.7～2.0之间时，适用于PCR扩增。

引物设计与合成

采用半巢式PCR扩增方法，根据蜂房蜜蜂球菌16S rRNA基因，设计引物EFB1和EFB2进行第一轮PCR扩增，所得PCR理论扩增产物片断大小为486bp，此步扩增结果可以对蜂房蜜蜂球菌与其它杂菌进行区分，但却无法对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)进行区分(此步粪肠球菌PCR扩增片断大小也为486bp)；进而再以所得扩增产物为模板设计第三条引物(EFB3，其位置处于EFB1和EFB2引物中间)，以EFB1和EFB3为引物进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，理论扩增片断大小为276bp，可以特异性对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的肠球菌(没有扩增产物)进行有效区分。最终通过半巢式PCR扩增方法对蜜蜂幼虫及蜂产品中的蜂房蜜蜂球菌进行特异性检测。

表7-1蜂房蜜蜂球菌PCR引物

PCR检测

PCR反应液须在冰盒中进行配制，配液顺序为：去离子水(ddH₂O)、10×buffer、dNTP、引物、Taq酶、样品DNA。以提取的蜂球囊菌DNA为模板，每次反应均设阴性对照。

反应体系如下表

表7-2反应体系参数

应用德国Biometra公司的Biometra Tgradient-96梯度PCR扩增仪进行扩增反应，其反应步骤包括预变性、变性、退火、延伸，具体参数如表7-3

表7-3循环参数

第一轮PCR检测特异性试验

以微孢子虫病原、蜜蜂幼虫芽孢杆菌、蜜蜂败血杆菌为特异性试验对照，以之前一检测过的蜂房蜜蜂球菌DNA作为阳性样品，并设ddH₂O作为阴性对照，在之前已建立的最佳反应条件和反应体系下进行PCR反应，1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后分析结果并拍照。

第二轮PCR检测特异性试验

以第一轮PCR扩增的产物为模板，用EFB2和EFB3为引物进行第二轮PCR扩增，蜂房蜜蜂球菌理论扩增片断大小为276bp，屎肠球菌无特异性扩增产物，从而达到有效鉴别的目的。

第一轮PCR产物的酶切鉴定

针对第一轮PCR无法对蜂房蜜蜂球菌与粪肠球菌进行鉴别的问题，通过对两株菌的PCR产物序列进行酶切位点的分析，表明可以使用HinfI限制性酶进行酶切鉴别，蜂房蜜蜂球菌第一轮PCR产物经Hinf1酶切后理论片段大小为340bp和146bp，而粪肠球菌第一轮PCR产物经HinfI酶切后理论片段大小为254bp、146bp和86bp三段，因此，可以也通过酶切的方法对这两种菌第一轮PCR产物进行有效的鉴别。

PCR检测敏感性试验

在已确定阳性的幼虫芽胞杆菌悬液用生理盐水作10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍稀释，每个稀释度的菌液各取1mL分别用来进行平板计数和提取DNA。采用倾注法倒平板，在31℃正常大气条件下培养。然后用ISO标准方法估计菌落总数，菌落数在300以上的平板应排除，将各稀释浓度平板所对应提取的DNA用作模板，在最佳反应条件和反应体系下进行PCR检测并观察结果。

蜜蜂欧洲幼虫腐臭病半巢式PCR检测方法的建立与标准化

第一轮PCR检测的特异性试验结果

用所设计的引物EFB1和EFB2对蜂房蜜蜂球菌16S rRNA基因进行第一轮PCR扩增，结果如图1所示。特异性的扩增片段在400bp与500bp之间，约为485bp。

从图1可以看出通过第一轮PCR扩增，蜂房蜜蜂球菌和粪肠球菌在约486bp处均扩增出特异性条带，如图1中第2和第7泳道；而在微孢子虫病原、蜜蜂幼虫芽孢杆菌、蜜蜂败血杆菌未见特异性扩增条带，表明可以通过第一轮PCR检测达到与上述三种蜜蜂病原体鉴别诊断的目的。对于粪肠球菌还需通过后续试验方法进一步鉴定。

第二轮PCR检测的特异性试验结果

以第一轮PCR扩增的产物为模板，用EFB2和EFB3为引物进行第二轮PCR扩增，结果如图2所示，蜂房蜜蜂球菌可见大小为276bp特异性条带，而屎肠球菌无特异性扩增产物，从而达到有效鉴别的目的。

第一轮PCR产物的酶切鉴定

用Hinf1酶对蜂房蜜蜂球菌与粪肠球菌第一轮PCR产物进行酶切鉴别，结果如图3所示，蜂房蜜蜂球菌第一轮PCR产物经Hinf1酶切后理论片段大小为340bp和146bp，而粪肠球菌第一轮PCR产物经Hinf1酶切后理论片段大小为254bp、146bp和86bp三段，因此，可以也通过酶切的方法对这两种菌第一轮PCR产物进行有效的鉴别。

PCR检测敏感性试验结果

在优化好的PCR反应体系和反应条件下，进行敏感性试验。从图4可以看出7号(10⁶模板稀释度)隐约扩出电泳条带，8号(10⁷模板稀释度)则无电泳条带。因此，所建立的PCR方法检测的灵敏性可达10⁶的模板稀释度，相当于最低可以检出7CFU/ml，所以该PCR方法的检测敏感度为7CFU/ml。PCR敏感性检测结果如图4所示。

通过将蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)菌液依次作10倍连续梯度稀释，进行灵敏度试验，方法检测限灵敏度可达到约20fg蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)DNA，结果见图5。

根据Genebank网站公布的蜜蜂欧洲幼虫腐臭病16S rRNA基因序列设计引物EFB1和EFB2进行第一轮PCR扩增，成功扩增出486bp特异性片段，与微孢子虫病原、蜜蜂幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌无交叉反应，但与粪肠球菌有交叉反应，以EFB1和EFB3为引物进行第二轮PCR扩增，可与粪肠球菌鉴别，对第一轮PCR产物用HinfI限制性酶进行酶切可可与粪肠球菌鉴别。最终达到通过半巢式PCR扩增方法对蜜蜂幼虫及蜂产品中的蜂房蜜蜂球菌进行特异性检测的目的。

优化出的蜜蜂欧洲幼虫腐臭病半巢式PCR方法反应体系。

本发明建立的半巢式PCR检测方法，5h内即可报告检测结果，特异性较好，敏感性较好，灵敏度可达到约20fg蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)DNA。

EFB：European Foulbrood of Honey Bees，蜜蜂欧洲幼虫腐臭病。

M.pluton：Melissococcus pluton，蜂房蜜蜂球菌。

DNA：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。

PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。

Hemi-nested PCR：半巢式PCR。

bp：base pair，碱基对。

16S rRNA：16S ribosomal RNA，16S核糖体RNA基因。

CTAB：Hexadecyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。

dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸。

dTTP：deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸。

dCTP：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。

dGTP；deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。

本发明试剂盒成份如下：

【原理】

以16SrRNA的编码基因为引物的半巢式PCR技术来鉴定蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton，M.pluton)，根据Genebank网站公布的蜜蜂蜂房蜜蜂球菌保守序列，应用DNAman软件设计出一对引物EFB₁、EFB₂和EFB₃，序列见附表1。通过半巢式PCR技术的改进和引物的改良，达到在蜜蜂幼虫尚未发病的时候检测出低含量的芽孢。设计引物EFB1和EFB2进行第一轮PCR扩增，所得PCR理论扩增产物片断大小为486bp，此步扩增结果可以对蜂房蜜蜂球菌与其它杂菌进行区分，但却无法对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)进行区分(此步粪肠球菌PCR扩增片断大小也为486bp)；进而再以所得扩增产物为模板设计第三条引物(EFB3，其位置处于EFB1和EFB2引物中间)，以EFB1和EFB3为引物进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，理论扩增片断大小为276bp，可以特异性对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的肠球菌(没有扩增产物)进行有效区分。最终通过半巢式PCR扩增方法对蜜蜂幼虫及蜂产品中的蜂房蜜蜂球菌进行特异性检测。

【规格】

50次。

【试剂盒组成】

-20℃以下保存，保存期6个月，可进行50次检测。

【适用仪器】

PCR仪。

【样品采集】

1.样品的采集和前处理：采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。

2.采样工具：棉拭子；剪刀、镊子；Eppendorf管；研钵。以上取样工具必须经121℃±2℃，15min高压灭菌并烘干。

3.保存与运送：采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，长期保存须在-70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过三次)。样品采集后，将采集的样品密封并编号，采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室。

【样品提取】

蜂房蜜蜂球菌核酸提取，按TaKaRa细菌基因组小量提取试剂盒说明书的方法提取蜂房蜜蜂球菌DNA，-20℃冻存或直接进行PCR。

【试剂准各、加样和PCR扩增】

1.加样：PCR反应液须在冰盒中进行配制，配液顺序为：去离子水(ddH₂O)、10×buffer、dNTP、引物、Taq酶、样品DNA。以提取的蜂球囊菌DNA为模板，每次反应均设阴性对照。

2.第一轮PCR扩增：设定好反应参数：95℃ 2min；95℃ 30s，61℃ 15s，72℃ 60s；40循环；72℃ 5min。

3.第二轮PCR扩增：以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮扩增。设定好反应参数：95℃ 2min；95℃ 30s，56℃ 15s，72℃ 60s；40循环；72℃ 5min。

【结果判断】

1.第一轮阳性对照的特异性扩增片段为486bp，阴性对照无特异性扩增片段；第二轮阳性对照的特异性扩增片段为276bp，阴性对照无特异性扩增片段；

2.第一轮PCR扩增，样品出现特异性扩增片段为486bp，表明样品中可能存在蜂房蜜蜂球菌，同时阴性对照无特异性扩增片段，初步判为阳性；第二轮PCR扩增，样品出现特异性扩增片段为276bp，表明样品中存在蜂房蜜蜂球菌，同时阴性对照无特异性扩增片段，判为阳性；

3.样品无特异性扩增片段，表明样品中无蜂房蜜蜂球菌，阴性对照无特异性扩增片段，判为阴性。

【保存条件及有效期】

-20℃避光保存，有一效期为8个月。

【注意事项】

1.由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。

2.反应液分装时应避免产生气泡，上机前检杳各反应管是否盖紧，以免阳性模板泄漏污染仪器。

3.试剂盒中各溶液使用前应充分融化，混匀冰低速离心。

4.融化后的反应液置于冰上，并尽量避免反复冻融。

5.退火温度可根据所用仪器选择使用最低限量时间。

PCR反应引物及循环参数

PCR检测的引物及反应参数

欧洲幼虫腐臭病EFB1和EFB2扩增序列485bp

CTTTGAACGCCTTAGAGATAAGGTTTCTCCTTCGGGAGCAAAGAGACAGGTGGTGCA

TGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGC

AACCCTTATTGTTAATTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGT

GACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTATGACC

TGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAGAGAGACGCAAGACCGCGAGG

TTAAGCAAATCTCATAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCT

ACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATNNGCACGCCGCGGTGAATACG

TTCNNGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGA

AGTCGGTGAGGTAACCTTAGGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGAT

欧洲幼虫腐臭病EFB1和EFB3扩增序列276bp

CTTTGAACGCCTTAGAGATAAGGTTTCTCCTTCGGGAGCAAAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAATTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAGAGAGACGCAAGACCGCGAGGTTAA

试剂的配制

A1 1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)：

称取121.1g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，溶于800mL水中，搅拌，加入浓盐酸42mL，冷却至室温，用稀盐酸准确调节pH至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。

A2 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)：

在800mL水中加入186.1g乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA·2H₂O)，用磁力搅拌器剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液pH值至8.0(约需20g氢氧化钠颗粒)，然后加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。

A3 DNA抽提缓冲液：

1mol/LTris-HCl            100mL

0.5mol/L EDTA             50mL

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)20.0g

氯化钠                    81.816g

聚乙烯吡咯酮-40(PVP-40)   20g

加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。

A4 CTAB沉淀液：

CTAB  5.0g

氯化钠2.3376g

加水溶解定溶至1L，分装后高压灭菌备用。

A5 1.2mol/L氯化钠溶液：

氯化钠  70.128g

加水溶解定溶至1L，分装后高压灭菌备用。

A6 TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液)：

1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)    10mL

0.5mol/L EDTA(pH 8.0)            2mL

加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。

A7 50×TAE电泳缓冲液：

Tris         484g

冰醋酸       114.2mL

0.5mol/LEDTA 200mL

溶于水后，定溶至2L，分装后高压灭菌备用。

              序列表

<110>吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法

<160>1

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Melissococcus pluton

<400>1

CTT TGAACG CCT TAG AGA

<110>吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法

<160>1

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Melissococcus pluton

<400>1

CTTTGAACGCCTTAGAGA

<110>吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法

<160>1

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>Melissococcus pluton

<400>1

TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC

Claims (2)

1.一种蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法，其特征在于：

a、采用CTAB法或者试剂盒法获得欧洲幼虫腐臭病DNA；

b、欧洲幼虫腐臭病DNA的浓度和纯度的测定：取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280，使A260与A280比值在1.7～2.0之间；

c、引物：

EFB1：5’-CTT TGA ACG CCT TAG AGA-3’

EFB2：5’-ATC ATC TGT CCC ACC TTA-3’

EFB3：5’-TTA ACC TCG CGG TCT TGC GTC TCT C-3’；

d、采用半巢式PCR扩增方法，根据蜂房蜜蜂球菌16S rRNA基因，设计引物EFB1和EFB2进行第一轮PCR扩增，所得PCR理论扩增产物片断大小为486bp，此步扩增结果可以对蜂房蜜蜂球菌与其它杂菌进行区分，但却无法对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的粪肠球菌进行区分；进而再以所得扩增产物为模板设计第三条引物EFB3，其位置处于EFB1和EFB2引物中间，以EFB1和EFB3为引物进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，理论扩增片断大小为276bp，可以特异性对与蜂房蜜蜂球菌亲源关系较近的肠球菌进行有效区分；最终通过半巢式PCR扩增方法对蜜蜂幼虫及蜂产品中的蜂房蜜蜂球菌进行特异性检测。

2.蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测试剂盒，其特征在于：其成份如下：

Images