CN107760802A - 罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107760802A
CN107760802A CN201711252782.8A CN201711252782A CN107760802A CN 107760802 A CN107760802 A CN 107760802A CN 201711252782 A CN201711252782 A CN 201711252782A CN 107760802 A CN107760802 A CN 107760802A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
luohu
virus
detection
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711252782.8A
Other languages
English (en)
Inventor
雷燕
肖洋
张文文
王娟
卢刚
马家好
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGZHOU LIYANG AQUATIC TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
GUANGZHOU LIYANG AQUATIC TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGZHOU LIYANG AQUATIC TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical GUANGZHOU LIYANG AQUATIC TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201711252782.8A priority Critical patent/CN107760802A/zh
Publication of CN107760802A publication Critical patent/CN107760802A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种罗湖病毒特异性RT‑PCR检测试剂盒及检测方法，本发明所述的罗湖病毒逆转录‑聚合酶链式反应快速检测试剂盒，包括：5×逆转录缓冲液；逆转录酶；随机引物；2×反应混合缓冲液；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。本发明克服了现有罗湖病毒检测方法的不足，提供了一种新型逆转录‑聚合酶链式反应快速检测试剂盒及检测方法；本发明对罗湖病毒临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异、灵敏的优点，满足了临床诊断的要求，为检测罗湖病毒提供了便利条件。

Description

罗湖病毒特异性RT-PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，涉及一种罗非鱼罗湖病毒的特异性检测方法，特别是一种采用逆转录-聚合酶链式反应(简称RT-PCR)技术检测罗非鱼罗湖病毒的方法。
背景技术
罗湖病毒(Tilapia Lake Virus，TiLV)，是近年来发现并报道的一种新兴病毒，该病毒最早于2009年在以色列发现，目前已经在哥伦比亚、厄瓜多尔、埃及、以色列和泰国得到确认。虽然该病原体不会引起公共卫生问题，但可以导致受感染种群大量死亡。据报道，该病毒具有较强的传染性，已经给以色列、厄瓜多尔、埃及等国养殖的罗非鱼造成大面积死亡，死亡率高达70％。
据联合国粮农组织发布的消息，罗湖病毒有可能比目前已知的分布范围更广，给全球罗非鱼养殖造成严重威胁，目前已经引起多个国家的重视并进行积极的监视。
罗湖病毒是一种负链RNA病毒，基因组由10个独立的基因片段组成，目前仍未确定其分类地位，极有可能是正粘病毒科的一种新型病毒，罗湖病毒在24-33℃均可以生长，最适生长温度25℃。2017年5月，我们首次从国内养殖的罗非鱼中检测出该病毒。鉴于罗湖病毒引起的高死亡率和重大经济损失，为了及早发现养殖罗非鱼是否被罗湖病毒感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。
目前尚未见罗湖病毒检测方法的研究报道。RT-PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种罗湖病毒的特异性RT-PCR检测方法，能快速、高效地用于罗非鱼罗湖病毒的检测。
本发明通过下述技术方案实现的。
罗湖病毒特异性RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)5×逆转录缓冲液
(2)逆转录酶
(3)随机引物
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液，包含以下成分：
KCl
MgCl2
Tris-HCl，pH5.8
dNTP
(5)优选的特异性检测引物：根据罗湖病毒的核酸序列，设计用于检测罗湖病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对罗湖病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-GAATAATAAAGTGAGCTTAAG-3’，下游引物P2：5’-CAGGGAAAGTACTGCATAGCG-3’；
(6)Taq DNA聚合酶
(7)灭菌的ddH2O
(8)阳性对照液：提取罗湖病毒的RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将纯化回收的扩增产物连接到pMD19-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；
(9)阴性对照液：以ddH2O作为阴性对照。
罗湖病毒特异性RT-PCR检测试剂盒，所述优选试剂盒包括：
(1)5×逆转录缓冲液100μL；
(2)逆转录酶25μL；
(3)随机引物25μL；
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(5)优选的特异性检测引物：根据罗湖病毒的核酸序列，设计用于检测罗湖病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对罗湖病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-GAATAATAAAGTGAGCTTAAG-3’，下游引物P2：5’-CAGGGAAAGTACTGCATAGCG-3’，浓度为10μM；
(6)Taq DNA聚合酶 5U/μL；
(7)灭菌的ddH2O 1.0mL；
(8)阳性对照液：提取罗湖病毒的RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物连接到pMD19-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；
(9)阴性对照液：以ddH2O作为阴性对照。
采用试剂盒检测罗湖病毒的方法为：
(1)待测样品RNA的提取：取待检测罗非鱼的鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织，用玻璃匀浆器匀浆后反复冻融三次，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH2O溶解，即为试验用RNA模板；
(2)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，共循环30次；72℃末延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在499bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为罗湖病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的罗湖病毒。
与现有技术相比，本发明所述的罗湖病毒特异性RT-PCR检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：
(1)本发明采用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction,简称RT-PCR)技术检测罗湖病毒的方法，适用于对罗湖病毒进行快速检测，可广泛应用于罗湖病毒的流行病学调查及疾病监控。
(2)与现有技术相比，本发明的有益效果包括：①检测快速、效率高：从核酸提取、逆转录(RT)和聚合酶链反应(PCR)到结果判定仅需要3.5小时；一次可以进行多个样品的检测，具有高效性。②检测准确：检测引物只与罗湖病毒特异性地结合，与其他鱼类病毒都没有交叉反应。③检测灵敏度高，适合用于罗湖病毒的早期监控。
附图说明
图1为感染罗湖病毒罗非鱼的鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织的RT-PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3为罗湖病毒感染罗非鱼鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织样品；标号M为分子量标准DL2000(购自宝生物工程有限公司)；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图2为对不同病原的(RT-)PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为罗湖病毒；标号2为健康罗非鱼；标号3为野生罗非鱼；标号4为锦鲤疱疹病毒；标号5为鲤疱疹病毒2型；标号6为真鲷虹彩病毒；标号7为传染性脾肾坏死病毒；标号8为草鱼出血病病毒；标号9为鲤春病毒血症病毒；标号10为神经坏死病毒，标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图3为不同浓度质粒模板的PCR扩增结果。标号1-7为1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL、1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL的质粒模板；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图4为同一养殖池塘6尾发病罗非鱼鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织样品的RT-PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-8为6尾不同罗非鱼鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图5为不同养殖池塘20尾发病罗非鱼鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织样品的RT-PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-22为20尾不同养殖池塘罗非鱼鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例一：罗湖病毒特异性RT-PCR检测试剂盒
本实施例所述的罗湖病毒特异性RT-PCR检测试剂盒的所有化学试剂及引物均从专业的试剂公司购买。但上述试剂和引物来源不构成对本发明的任何限制，本发明可自行配制有关试剂和合成有关引物。
试剂盒由下列部分构成(12样份)：
(1)5×逆转录缓冲液100μL；
(2)逆转录酶25μL；
(3)随机引物25μL；
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(5)优选的特异性检测引物：根据罗湖病毒的核酸序列，设计用于检测罗湖病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对罗湖病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-GAATAATAAAGTGAGCTTAAG-3’，下游引物P2：5’-CAGGGAAAGTACTGCATAGCG-3’，浓度为10μM；
(6)Taq DNA聚合酶 5U/μL；
(7)灭菌的ddH2O 1.0mL；
(8)阳性对照液：阳性克隆的重组质粒；
(9)阴性对照液：ddH2O；
(10)操作说明书一份。
(11)长方体盒子，可装上述1～10号部件，10.0×9.0×5.0cm3。
(12)一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，高2.5cm，有4排孔，每排4个孔，孔径1.0cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
上述阳性对照是提取罗湖病毒RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物连接到pMD19-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；以ddH2O作为阴性对照。
RT体系(10μL)为：
RT反应条件为：
37℃ 15min
85℃ 5sec
最后4℃保存
PCR扩增反应体系(25μL)为：
PCR扩增反应条件为：
实施例二：罗湖病毒特异性RT-PCR检测方法使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)取50mg待检罗非鱼的鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织样品，加入600uL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心5分钟，取上清，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH2O溶解，即为试验用RNA模板。
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在499bp处出现明亮的反应条带，则为罗湖病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
(5)实验结果分析：如图1所示，在标号3(待测样品)的电泳带中499bp处出现明亮的反应条带，在标号2(阳性对照)的电泳带中也出现同样的反应条带，而在标号1(阴性对照)的电泳带中未出现反应条带，表明本PCR检测试剂盒的检测效果符合预期。
实施例三：罗湖病毒特异性RT-PCR快测试剂盒的特异性实验
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以提取的罗湖病毒、健康罗非鱼、野生罗非鱼、锦鲤疱疹病毒、鲤疱疹病毒2型、真鲷虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、草鱼出血病病毒、鲤春病毒血症病毒、神经坏死病毒的核酸，进行(RT-)PCR检测。
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA(或DNA)模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在499bp处出现明亮的反应条带，则为罗湖病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
(5)实验结果分析：如图2所示，标号1的电泳带在499bp处出现明亮的反应条带，显示罗湖病毒阳性。标号2～10(健康罗非鱼、野生罗非鱼、锦鲤疱疹病毒、鲤疱疹病毒2型、真鲷虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、草鱼出血病病毒、鲤春病毒血症病毒、神经坏死病毒)的电泳带在499bp处无反应条带出现，显示罗湖病毒阴性。表明本发明所述的试剂盒对罗非鱼罗湖病毒的特异性强。
实施例四：罗湖病毒特异性RT-PCR快测试剂盒的灵敏性实验
(1)将阳性对照重组质粒进行倍梯度稀释，使其浓度依次为1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL、1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL作为标准品模板，进行PCR检测。
(2)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检测罗湖病毒特异性RT-PCR的灵敏度；
检测不同质粒模板浓度，最低检出质粒模板浓度为10fg/mL，PCR检测结果见图3。
实施例五：罗湖病毒特异性RT-PCR检测试剂盒对发病罗非鱼的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以从同一发病池塘中取的6尾发病罗非鱼鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织中提取的RNA作为模板，进行RT-PCR检测；
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在499bp处出现明亮的反应条带，则为罗湖病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
检测所取6尾发病罗非鱼，6尾发病罗非鱼中有5尾罗湖病毒呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果为罗湖病毒，且核苷酸同源性在96％以上，RT-PCR检测结果见图4。
实施例六：罗湖病毒特异性RT-PCR检测试剂盒对不同池塘发病罗非鱼的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以从6个不同发病池塘采集的20尾罗非鱼样品，提取鳃、肝脏、脾脏、肾脏中的RNA作为模板，进行RT-PCR检测；
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在499bp处出现明亮的反应条带，则为罗湖病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
检测所取20尾发病罗非鱼样品中，有6尾病鱼罗湖病毒呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为罗湖病毒，且核苷酸同源性都在96％以上，RT-PCR检测结果见图5。

Claims (2)

1.罗湖病毒特异性RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)5×逆转录缓冲液
(2)逆转录酶
(3)随机引物
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液，包含以下成分：
KCl
MgCl2
Tris-HCl，pH5.8
dNTP
(5)优选的特异性检测引物：根据罗湖病毒的核酸序列，设计用于检测罗湖病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对罗湖病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-GAATAATAAAGTGAGCTTAAG-3’，下游引物P2：5’-CAGGGAAAGTACTGCATAGCG-3’；
(6)Taq DNA聚合酶
(7)灭菌的ddH2O
(8)阳性对照液：提取罗湖病毒的RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将纯化回收的扩增产物连接到pMD19-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；
(9)阴性对照液：以ddH2O作为阴性对照。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测罗湖病毒的方法为：
(1)待测样品RNA的提取：取待检测罗非鱼的鳃、肝脏、脾脏、肾脏组织，用玻璃匀浆器匀浆后反复冻融三次，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH2O溶解，即为试验用RNA模板；
(2)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，共循环30次；72℃末延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在499bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为罗湖病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的罗湖病毒。
CN201711252782.8A 2017-12-01 2017-12-01 罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法 Pending CN107760802A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711252782.8A CN107760802A (zh) 2017-12-01 2017-12-01 罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711252782.8A CN107760802A (zh) 2017-12-01 2017-12-01 罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107760802A true CN107760802A (zh) 2018-03-06

Family

ID=61276634

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711252782.8A Pending CN107760802A (zh) 2017-12-01 2017-12-01 罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107760802A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108315486A (zh) * 2018-04-11 2018-07-24 张薇 一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒
CN108624718A (zh) * 2018-06-20 2018-10-09 上海海洋大学 恒温实时检测罗非鱼湖病毒的rpa试剂盒及其专用引物和探针
CN110592268A (zh) * 2018-06-13 2019-12-20 杭州众测生物科技有限公司 罗湖病毒（TiLV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂
CN110616281A (zh) * 2019-10-29 2019-12-27 周伟光 一种应用实时荧光rt-pcr定量检测罗湖病毒的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104988241A (zh) * 2015-08-07 2015-10-21 广州金水动物保健品有限公司 鱼类类立克次氏体特异性pcr检测试剂盒及检测方法
CN106755595A (zh) * 2017-02-21 2017-05-31 东北农业大学 一种检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104988241A (zh) * 2015-08-07 2015-10-21 广州金水动物保健品有限公司 鱼类类立克次氏体特异性pcr检测试剂盒及检测方法
CN106755595A (zh) * 2017-02-21 2017-05-31 东北农业大学 一种检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. M. CHANDRASHEKHAR等: "Limit of detection of genomic DNA by conventional PCR for estimating the load of Staphylococcus aureus and Escherichia coli associated with bovine mastitis", 《FOLIA MICROBIO》 *
MARINA EYNGOR等: "Identification of a Novel RNA Virus Lethal to Tilapia", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
P TATTIYAPONG等: "Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish", 《J FISH DIS.》 *
韦信贤等: "实时荧光定量PCR技术及其在水生动物病毒病定量检测中的应用", 《水产科学》 *
黄海泉: "实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展", 《湖北农业科学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108315486A (zh) * 2018-04-11 2018-07-24 张薇 一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒
CN110592268A (zh) * 2018-06-13 2019-12-20 杭州众测生物科技有限公司 罗湖病毒（TiLV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂
CN108624718A (zh) * 2018-06-20 2018-10-09 上海海洋大学 恒温实时检测罗非鱼湖病毒的rpa试剂盒及其专用引物和探针
CN110616281A (zh) * 2019-10-29 2019-12-27 周伟光 一种应用实时荧光rt-pcr定量检测罗湖病毒的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107760802A (zh) 罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法
CN104032038B (zh) 鳜鱼弹状病毒的检测试剂盒及检测方法
CN107868816A (zh) 确定未处理的样品中感兴趣的核酸的量的方法
CN104846124B (zh) 鲫鱼鲤疱疹病毒2型特异性pcr检测试剂盒及检测方法
US10519484B2 (en) Lytic composition and application thereof, kit, method for preparing nucleic acid by utilizing lytic composition, and nucleic acid analysis method
CN102776297A (zh) 一种登革病毒/黄热病毒/西尼罗病毒/基孔肯雅病毒鉴别检测试剂盒
CN110567951A (zh) 基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法
CN102154497A (zh) 霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法
CN109439801B (zh) 一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
JP6466725B2 (ja) ウナギの種の同定補助方法
CN107974515B (zh) 一种罗非鱼罗湖病毒的恒温快速检测试剂盒
CN100404689C (zh) 柑桔溃疡病菌实时荧光pcr检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法
CN107988383B (zh) 一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的lamp引物组和方法
JP2008529548A (ja) ウイルスを用いることによる試料中の生細胞を検出するための方法
CN111235261B (zh) 用于检测人类血小板特异性抗原hpa 1～29基因分型的试剂盒
de Carvalho et al. Technical and economic efficiency of methods for extracting genomic DNA from Meloidogyne javanica
CN108004349A (zh) 鲤春病毒血症病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN1837364B (zh) 小麦矮腥黑穗病菌实时荧光pcr固相化试剂盒及其检测方法
CN116121408A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用
CN104388587A (zh) 乙型流感病毒一步法检测试剂盒及乙型流感病毒检测方法
CN105063038B (zh) 一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号的rpa引物及试剂盒
CN109628640B (zh) 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的rpa-lfd引物、方法和试剂盒
CN112853004A (zh) 对虾白斑综合症病毒lamp检测简并引物组、试剂盒及方法
CN103397106B (zh) 杂交鳢弹状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN108018377B (zh) 一种罗湖病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180306

RJ01 Rejection of invention patent application after publication