CN108004349A - 鲤春病毒血症病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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CN108004349A CN201711252779.6A CN201711252779A CN108004349A CN 108004349 A CN108004349 A CN 108004349A CN 201711252779 A CN201711252779 A CN 201711252779A CN 108004349 A CN108004349 A CN 108004349A
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Abstract

本发明涉及水产养殖技术领域，具体公开了鲤春病毒血症病毒的逆转录‑聚合酶链式反应检测试剂盒，本发明所述的鲤春病毒血症病毒逆转录‑聚合酶链式反应快速检测试剂盒，包括：5×逆转录缓冲液；逆转录酶；随机引物；2×反应混合缓冲液；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O；本发明克服了现有鲤春病毒血症病毒检测方法的不足，提供一种新型逆转录‑聚合酶链式反应快速检测试剂盒及检测方法，本发明对鲤春病毒血症病毒临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测鲤春病毒血症病毒提供了便利条件。

Description

鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，涉及一种鲤春病毒血症病毒的检测方法，特别是一种采用逆转录-聚合酶链式反应(简称RT-PCR)技术检测鲤春病毒血症病毒的方法。
背景技术
鲤春病毒血症是一种由弹状病毒科水泡病毒属的鲤春病毒血症病毒(SpringViremia of Carp Virus，SVCV)引起的疫病，该病主要在欧洲的鲤鱼养殖中广泛传播，并造成了巨大的经济损失，是世界动物卫生组织(OIE)规定的需要向OIE申报的疫病之一。近年来，我们对鲤鱼病害的调查了解发现，SVCV在我国养殖的鲤鱼中也存在流行。
SVCV病毒粒子呈弹状，为弹状病毒典型的形态学特征，大小为(90-180)nm×(60-90)nm，基因组长度为11019个核苷酸。鲤鱼是SVCV最易感的宿主。受感染鱼的临床症状表现为体色发黑，腹部膨大，鳃丝苍白，眼球突出，肛门红肿，皮肤、鳃和眼球常有出血斑点。解剖可见体内出血、腹膜炎以及出现腹水，肠道严重发炎，其他内脏上也有出血斑点，其中以鳔最为常见。该疾病的暴发取决于水温、鱼类的年龄和生理状态、种群密度以及生长压力因子等。水温是SVCV感染的关键环境因素，高死亡率发生在水温10-17℃时，但当水温17℃以上时，鱼苗和成鱼很少发生显性感染。为了尽早以及在隐性感染阶段发现养殖鲤鱼是否被SVCV感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。
传统诊断鲤春病毒血症病毒的方法是进行病毒分离，细胞培养，电镜观察以及免疫检测等方法，缺乏对病毒进行快速、准确、敏感的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种鲤春病毒血症病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，能快速、高效地用于鲤春病毒血症病毒的检测。
本发明通过下述技术方案实现的
鲤春病毒血症病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)5×逆转录缓冲液
(2)逆转录酶
(3)随机引物
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液，包含以下成分：
KCl
MgCl2
Tris-HCl，pH5.8
dNTP
(5)优选的特异性检测引物：根据鲤春病毒血症病毒的核酸序列，设计用于检测鲤春病毒血症病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对鲤春病毒血症病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-GTGATTACAGATGGTACGGAC-3’，下游引物P2：5’-GCCAAATAACTCAAATCCACT-3’；
(6)Taq DNA聚合酶
(7)灭菌的ddH2O
(8)阳性对照液：提取鲤春病毒血症病毒总RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将纯化回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；
(9)阴性对照液：以ddH2O作为阴性对照。
鲤春病毒血症病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测试剂盒，所述优选的试剂盒包括：
(1)5×逆转录缓冲液100μL；
(2)逆转录酶25μL；
(3)随机引物25μL；
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(5)优选的特异性检测引物：根据鲤春病毒血症病毒的核酸序列，设计用于检测鲤春病毒血症病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对鲤春病毒血症病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-GTGATTACAGATGGTACGGAC-3’，下游引物P2：5’-GCCAAATAACTCAAATCCACT-3’，浓度为10μM；
(6)Taq DNA聚合酶 5U/μL；
(7)灭菌的ddH2O 1.0mL；
(8)阳性对照液：提取鲤春病毒血症病毒总RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；
(9)阴性对照液：以ddH2O作为阴性对照。
采用试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法为：
(1)待测样品RNA的提取：解剖待检测的鱼样品，取肝、脾、肾等组织进行匀浆，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH2O溶解，即为试验用RNA模板；
(2)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性40秒，57℃退火35秒，72℃延伸50秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在715bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为鲤春病毒血症病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的鲤春病毒血症病毒。
与现有技术相比，本发明所述的鲤春病毒血症病毒逆转录-聚合酶链式反应快速检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：
(1)本发明采用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction,简称RT-PCR)技术检测鲤春病毒血症病毒的方法，适用于对鲤春病毒血症病毒进行快速检测，可广泛应用于鲤春病毒血症病毒疫病的监控。
(2)与现有技术相比，本发明的有益效果包括：①检测快速、效率高：从核酸提取、逆转录(RT)和聚合酶链反应(PCR)到结果判定仅需要4小时；一次可以进行多个样品的检测，具有高效性。②检测准确：检测引物只与鲤春病毒血症病毒特异性地结合，与其他鱼类病毒都没有交叉反应。③检测灵敏度高，适合用于鲤春病毒血症病毒的早期监控以及鲤春病毒血症病毒隐性感染阶段的检测。
附图说明
图1为感染鲤春病毒血症病毒鲤鱼内脏组织的RT-PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3为鲤春病毒血症病毒感染鲤鱼内脏组织样品；标号M为分子量标准DL2000(购自宝生物工程有限公司)；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图2为对不同病原的RT-PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为鲤春病毒血症病毒；标号2为锦鲤疱疹病毒；标号3为草鱼出血病病毒；标号4为斑点叉尾鮰疱疹病毒；标号5为鲫鱼疱疹病毒2型；标号6为鳜鱼弹状病毒；标号7为病毒性出血败血症病毒；标号8为真鲷虹彩病毒；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图3为6尾鲤鱼组织样品的RT-PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-8为6尾不同鲤鱼组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图4为4尾不同地区鲤鱼组织样品的RT-PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-6为4尾不同鲤鱼组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例一：鲤春病毒血症病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测试剂盒
本实施例所述的鲤春病毒血症病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测试剂盒的所有化学试剂及引物均从专业的试剂公司购买。但上述试剂和引物来源不构成对本发明的任何限制，本发明可自行配制有关试剂和合成有关引物。
试剂盒由下列部分构成(12样份)：
(1)5×逆转录缓冲液100μL；
(2)逆转录酶25μL；
(3)随机引物25μL；
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(5)优选的特异性检测引物：根据鲤春病毒血症病毒的核酸序列，设计用于检测鲤春病毒血症病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对鲤春病毒血症病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-GTGATTACAGATGGTACGGAC-3’，下游引物P2：5’-GCCAAATAACTCAAATCCACT-3’，浓度为10μM；
(6)Taq DNA聚合酶 5U/μL；
(7)灭菌的ddH2O 1.0mL；
(8)阳性对照液：阳性克隆的重组质粒；
(9)阴性对照液：ddH2O；
(10)操作说明书一份。
(11)长方体盒子，可装上述1～10号部件，10.0×9.0×5.0cm3。
(12)一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，高2.5cm，有4排孔，每排4个孔，孔径1.0cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
上述阳性对照是提取鲤春病毒血症病毒总RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；以ddH2O作为阴性对照。
RT体系(10μL)为：
RT反应条件为：
37℃ 15min
85℃ 5sec
最后4℃保存
PCR扩增反应体系(25μL)为：
PCR扩增反应条件为：
94℃ 5min
1个循环
94℃ 40s
57℃ 35s
72℃ 50s
35个循环
72℃ 10min
1个循环
扩增产物4℃保存。
实施例二：鲤春病毒血症病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)取50mg待检鱼的肝、脾、肾等组织样品，加入600uL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心5分钟，取上清，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH2O溶解，即为试验用RNA模板。
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性40秒，57℃退火35秒，72℃延伸50秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在715bp处出现明亮的反应条带，则为鲤春病毒血症病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
(5)实验结果分析：如图1所示，在标号3(待测样品)的电泳带中715bp处出现明亮的反应条带，在标号2(阳性对照)的电泳带中也出现同样的反应条带，而在标号1(阴性对照)的电泳带中未出现反应条带，表明本PCR试剂盒的检测效果符合预期。
实施例三：鲤春病毒血症病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测试剂盒特异性实验
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以提取鲤春病毒血症病毒、锦鲤疱疹病毒、草鱼出血病病毒、斑点叉尾鮰疱疹病毒、鲫鱼疱疹病毒2型、鳜鱼弹状病毒、病毒性出血败血症病毒、真鲷虹彩病毒的核酸，进行RT-PCR检测。
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性40秒，57℃退火35秒，72℃延伸50秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在715bp处出现明亮的反应条带，则为鲤春病毒血症病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
(5)实验结果分析：如图2所示，标号1的电泳带在715bp处出现明亮的反应条带，显示鲤春病毒血症病毒阳性。标号2～8(锦鲤疱疹病毒、草鱼出血病病毒、斑点叉尾鮰疱疹病毒、鲫鱼疱疹病毒2型、鳜鱼弹状病毒、病毒性出血败血症病毒、真鲷虹彩病毒)的电泳带在715bp处无反应条带出现，显示鲤春病毒血症病毒阴性。表明本发明所述的试剂盒对鲤春病毒血症病毒的特异性强。
实施例四：鲤春病毒血症病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测试剂盒对发病鲤鱼的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以从发病池塘中取的6尾发病鲤鱼组织中提取的RNA作为模板，进行RT-PCR检测。
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性40秒，57℃退火35秒，72℃延伸50秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在715bp处出现明亮的反应条带，则为鲤春病毒血症病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
检测所取6尾鲤鱼，6尾鲤鱼鲤春病毒血症病毒均呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为鲤春病毒血症病毒，且核苷酸同源性都在99％以上，RT-PCR检测结果见图3。
实施例五：鲤春病毒血症病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测试剂盒对对不同地区发病鲤鱼样品的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以从广东、河南、四川、辽宁等地采集的具有鲤春病毒血症病毒病的鲤鱼样品，提取组织中的RNA作为模板，进行RT-PCR检测。
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性40秒，57℃退火35秒，72℃延伸50秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在715bp处出现明亮的反应条带，则为鲤春病毒血症病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
检测所取4份鲤鱼样品，4份鲤鱼样品鲤春病毒血症病毒均呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为鲤春病毒血症病毒，且核苷酸同源性都在99％以上，RT-PCR检测结果见图4。

Claims (2)

1.鲤春病毒血症病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)5×逆转录缓冲液
(2)逆转录酶
(3)随机引物
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液，包含以下成分：
KCl
MgCl2
Tris-HCl，pH5.8
dNTP
(5)优选的特异性检测引物：根据鲤春病毒血症病毒的核酸序列，设计用于检测鲤春病毒血症病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对鲤春病毒血症病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-GTGATTACAGATGGTACGGAC-3’，下游引物P2：5’-GCCAAATAACTCAAATCCACT-3’；
(6)Taq DNA聚合酶
(7)灭菌的ddH2O
(8)阳性对照液：提取鲤春病毒血症病毒总RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将纯化回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；
(9)阴性对照液：以ddH2O作为阴性对照。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法为：
(1)待测样品RNA的提取：解剖待检测的鱼样品，取肝、脾、肾等组织进行匀浆，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH2O溶解，即为试验用RNA模板；
(2)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性40秒，57℃退火35秒，72℃延伸50秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在715bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为鲤春病毒血症病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的鲤春病毒血症病毒。
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