CN107988430A - 对虾野田村病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种对虾野田村病毒RT‑PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括：5×逆转录缓冲液；逆转录酶；随机引物；2×反应混合缓冲液；优选的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。本发明克服了目前对虾野田村病毒检测方法的不足，提供一种新型逆转录‑聚合酶链式反应快速检测试剂盒及检测方法，本发明对对虾野田村病毒临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异、灵敏的优点，满足了临床诊断的要求，为检测对虾野田村病毒提供了便利条件。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种对虾野田村病毒的特异性检测方法，特别是一种采用逆转录-聚合酶链式反应(简称RT-PCR)技术检测对虾野田村病毒的方法。
背景技术
近年来，我国对虾养殖饱受病害的折磨。2014年，中国水产科学研究院黄海水产研究所的科研人员通过组织病理学、人工感染实验、疑似病原基因进化分析、病毒分离纯化和荧光原位杂交等研究手段，证实一种新型的野田村病毒是2009年以来引起对虾急性偷死的主要病原之一，这种新型的野田村病毒属于α野田村病毒属，主要引起养殖30～60d后的对虾发病，累计死亡率可高达80％。目前，我国主要对虾养殖地区发病趋势现象依然非常严重，并呈现出暴发性流行。为了及早发现养殖对虾是否被野田村病毒感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。
目前尚未见对虾野田村病毒检测方法的研究报道。RT-PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种对虾野田村病毒的特异性RT-PCR检测方法，能快速、高效地用于对虾野田村病毒的检测。
本发明通过下述技术方案实现的。
对虾野田村病毒特异性RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)5×逆转录缓冲液
(2)逆转录酶
(3)随机引物
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液，包含以下成分：
KCl
MgCl2
Tris-HCl，pH5.8
dNTP
(5)优选的特异性检测引物：根据对虾野田村病毒的核酸序列，设计用于检测对虾野田村病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对对虾野田村病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-TTGAAGGCTATCTCGTGACAG-3’，下游引物P2：5’-ATTAGCTCGTATTTGCTTGGC-3’；
(6)Taq DNA聚合酶
(7)灭菌的ddH2O
(8)阳性对照液：提取对虾野田村病毒RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将纯化回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；
(9)阴性对照液：以ddH2O作为阴性对照。
对虾野田村病毒特异性RT-PCR检测试剂盒，所述优选的试剂盒包括：
(1)5×逆转录缓冲液100μL；
(2)逆转录酶25μL；
(3)随机引物25μL；
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(5)优选的特异性检测引物：根据对虾野田村病毒的核酸序列，设计用于检测对虾野田村病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对对虾野田村病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-TTGAAGGCTATCTCGTGACAG-3’，下游引物P2：5’-ATTAGCTCGTATTTGCTTGGC-3’，浓度为10μM；
(6)Taq DNA聚合酶 5U/μL；
(7)灭菌的ddH2O 1.0mL；
(8)阳性对照液：提取对虾野田村病毒RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；
(9)阴性对照液：以ddH2O作为阴性对照。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测对虾野田村病毒的方法为：
(1)待测样品RNA的提取：取待检测对虾的鳃丝和肌肉组织，用玻璃匀浆器匀浆后反复冻融三次，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH2O溶解，即为试验用RNA模板；
(2)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃末延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在413bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为对虾野田村病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的对虾野田村病毒。
与现有技术相比，本发明所述的对虾野田村病毒特异性RT-PCR检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：
(1)本发明采用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction,简称RT-PCR)技术检测对虾野田村病毒的方法，适用于对对虾野田村病毒进行快速检测，可广泛应用于对虾野田村病毒的流行病学调查及疾病监控。
(2)与现有技术相比，本发明的有益效果包括：①检测快速、效率高：从核酸提取、逆转录(RT)和聚合酶链反应(PCR)到结果判定仅需要3.5小时；一次可以进行多个样品的检测，具有高效性。②检测准确：检测引物只与对虾野田村病毒特异性地结合，与其他虾类病毒都没有交叉反应。③检测灵敏度高，适合用于对虾野田村病毒的早期监控。
附图说明
图1为感染野田村病毒对虾鳃丝和肌肉组织的RT-PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3为野田村病毒感染对虾鳃丝和肌肉组织样品；标号M为分子量标准DL2000(购自宝生物工程有限公司)；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图2为对不同病原的(RT-)PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为对虾野田村病毒；标号2为白斑综合征病毒；标号3为传染性皮下及造血器官坏死病毒；标号4为对虾杆状病毒；标号5为肝胰腺细小病毒；标号6为黄头病毒；标号7为传染性肌肉坏死病毒；标号8为桃拉病毒，标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图3为不同浓度质粒模板的PCR扩增结果。标号1-7为106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、10copies/μL、1copy/μL的质粒模板；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图4为8尾发病对虾鳃丝和肌肉组织样品的RT-PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-10为8尾不同对虾鳃丝和肌肉组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图5为6份不同地区对虾鳃丝和肌肉组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3-8为6份不同地区对虾鳃丝和肌肉组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例一：对虾野田村病毒特异性RT-PCR检测试剂盒
本实施例所述的对虾野田村病毒特异性RT-PCR检测试剂盒的所有化学试剂及引物均从专业的试剂公司购买。但上述试剂和引物来源不构成对本发明的任何限制，本发明可自行配制有关试剂和合成有关引物。
试剂盒由下列部分构成(12样份)：
(1)5×逆转录缓冲液100μL；
(2)逆转录酶25μL；
(3)随机引物25μL；
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(5)优选的特异性检测引物：根据对虾野田村病毒的核酸序列，设计用于检测对虾野田村病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对对虾野田村病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-TTGAAGGCTATCTCGTGACAG-3’，下游引物P2：5’-ATTAGCTCGTATTTGCTTGGC-3’，浓度为10μM；
(6)Taq DNA聚合酶 5U/μL；
(7)灭菌的ddH2O 1.0mL；
(8)阳性对照液：阳性克隆的重组质粒；
(9)阴性对照液：ddH2O；
(10)操作说明书一份。
(11)长方体盒子，可装上述1～10号部件，10.0×9.0×5.0cm3。
(12)一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，高2.5cm，有4排孔，每排4个孔，孔径1.0cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
上述阳性对照是提取对虾野田村病毒RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；以ddH2O作为阴性对照。
RT体系(10μL)为：
RT反应条件为：
37℃ 15min
85℃ 5sec
最后4℃保存
PCR扩增反应体系(25μL)为：
PCR扩增反应条件为：
实施例二：对虾野田村病毒特异性RT-PCR检测方法
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)取50mg待检对虾鳃丝和肌肉组织样品，加入600uL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心5分钟，取上清，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH2O溶解，即为试验用RNA模板。
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在413bp处出现明亮的反应条带，则为对虾野田村病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
(5)实验结果分析：如图1所示，在标号3(待测样品)的电泳带中413bp处出现明亮的反应条带，在标号2(阳性对照)的电泳带中也出现同样的反应条带，而在标号1(阴性对照)的电泳带中未出现反应条带，表明本PCR试剂盒的检测效果符合预期。
实施例三：对虾野田村病毒特异性RT-PCR快测试剂盒的特异性实验
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以提取的对虾野田村病毒、白斑综合征病毒、传染性皮下及造血器官坏死病毒、对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、黄头病毒、传染性肌肉坏死病毒、桃拉病毒的核酸，进行(RT-)PCR检测。
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在413bp处出现明亮的反应条带，则为对虾野田村病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
(5)实验结果分析：如图2所示，标号1的电泳带在413bp处出现明亮的反应条带，显示对虾野田村病毒阳性。标号2～8(白斑综合征病毒、传染性皮下及造血器官坏死病毒、对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、黄头病毒、传染性肌肉坏死病毒、桃拉病毒)的电泳带在413bp处无反应条带出现，显示对虾野田村病毒阴性。表明本发明所述的试剂盒对对虾野田村病毒的特异性强。
实施例四：对虾野田村病毒特异性RT-PCR快测试剂盒的灵敏性实验
(1)将阳性对照重组质粒进行倍梯度稀释，使其浓度依次为1×106～1copies/μL作为标准品模板，进行PCR检测。
(2)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检测对虾野田村病毒特异性RT-PCR的灵敏度；
检测不同质粒模板浓度，最低检出质粒模板浓度为102copies/μL，PCR检测结果见图3。
实施例五：对虾野田村病毒特异性RT-PCR检测试剂盒对发病对虾的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以从发病池塘中取的8尾发病对虾鳃丝和肌肉组织中提取的RNA作为模板，进行RT-PCR检测；
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在413bp处出现明亮的反应条带，则为对虾野田村病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
检测所取8尾发病对虾，8尾发病虾对虾野田村病毒均呈阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为对虾野田村病毒，且核苷酸同源性都在99％以上，RT-PCR检测结果见图4。
实施例六：对虾野田村病毒特异性RT-PCR检测试剂盒对不同地区发病对虾的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以从广东、广西、福建、海南、江苏、山东等地采集的对虾样品，提取鳃丝和肌肉组织中的RNA作为模板，进行RT-PCR检测；
(2)分别取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，若在413bp处出现明亮的反应条带，则为对虾野田村病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性；
检测所取6份对虾样品中，对虾野田村病毒均为阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为对虾野田村病毒，且核苷酸同源性都在99％以上，RT-PCR检测结果见图5。
Claims (2)
1.对虾野田村病毒特异性RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)5×逆转录缓冲液
(2)逆转录酶
(3)随机引物
(4)2×聚合酶链式反应混合缓冲液，包含以下成分：
KCl
MgCl2
Tris-HCl，pH5.8
dNTP
(5)优选的特异性检测引物：根据对虾野田村病毒的核酸序列，设计用于检测对虾野田村病毒的特异性检测引物，通过对所设计的引物对进行试验筛选，筛选出对对虾野田村病毒具有非常高灵敏性和特异性的一对引物，上游引物P1：5’-TTGAAGGCTATCTCGTGACAG-3’，下游引物P2：5’-ATTAGCTCGTATTTGCTTGGC-3’；
(6)Taq DNA聚合酶
(7)灭菌的ddH2O
(8)阳性对照液：提取对虾野田村病毒RNA，逆转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以Pl、P2为引物，进行PCR扩增，将纯化回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；
(9)阴性对照液：以ddH2O作为阴性对照。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测对虾野田村病毒的方法为：
(1)待测样品RNA的提取：取待检测对虾的鳃丝和肌肉组织，用玻璃匀浆器匀浆后反复冻融三次，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH2O溶解，即为试验用RNA模板；
(2)逆转录合成cDNA：取待测样品的RNA模板7μL，加入PCR反应管中，再加入5×逆转录缓冲液2μL、逆转录酶0.5μL、随机引物0.5μL，反应总体积10μL，充分混匀后，置于PCR仪上，37℃15min逆转录反应，85℃5sec灭活逆转录酶，4℃保存，得到cDNA产物；
(3)PCR扩增：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，cDNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃末延伸10分钟，最后4℃保存；
(4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在413bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为对虾野田村病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的对虾野田村病毒。
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