CN104073569B - 用于诊断手足口病极重症的分子标记物及其检测方法与试剂盒 - Google Patents

用于诊断手足口病极重症的分子标记物及其检测方法与试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于诊断手足口病极重症的生物标记物，包括有miR-671-5p、miR-16-5p及miR-150-3p。本发明涉及的用于诊断手足口病极重症的生物标记物具有特异性区分能力，稳定性好及效率高的特点，具有较好诊断指标的特性，且本发明涉及的用于诊断手足口病极重症的生物标记物的检测试剂盒成本较低，便于大规模的推广。

Description

用于诊断手足口病极重症的分子标记物及其检测方法与试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术和医学诊断领域，特别是涉及一种用于诊断手足口病极重症的分子标记物及其检测方法与试剂盒。
背景技术
手足口病(Hand,foot,andmouthdisease，HFMD)是一种常见传染病，以婴幼儿发病为主。引起手足口病的病原主要为肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxasckievirus)A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5、13型；埃可病毒(ECHOviruses)和肠道病毒71型(EV71)，其中以EV71及CAl6型最为常见，EV71感染引起重症病例的比例较大。手足口病大多数患者症状轻微，表现为发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹。疾病进程为自限性，一般预后良好，但少数极重症患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别极重症患儿病情进展快，易发生死亡；因此该疾病迫切需要寻找极重症手足口病的特异的生物标记分子，指导医生诊断和临床治疗，从而使极重症手足口病患者达到早发现、早诊断、早治疗的目标，为临床控制和预防极重症手足口病的发生、发展提供科学依据。
MicroRNA(miRNA)是一类生物体内自然形成的小分子非编码RNA，参与调节其特异靶基因的表达，从而达到调控蛋白的目的，具有调节发育时序，细胞增殖，分化，代谢，凋亡与应激以及参与脊椎动物心脏、肌肉以及神经系统的形成，同时具有调控疾病发生、发展的功能。约50％的已知人类miRNA基因定位于和肿瘤及疾病相关的染色体区域，而不断累积的研究成果也已充分证实miRNA的异常表达与疾病的发生，发展密切相关。基因芯片技术近些年来发展迅速，被广泛的应用于各个生命科学领域，包括疾病预测与诊断、基因突变检测、遗传学产前诊断等临床应用中，目前microRNA芯片已经成为筛选miRNA生物标志物的重要手段之一。
生物标记物是指能将机体的生理和疾病状态区分开来的生物分子，筛选到可用于疾病早期发现、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。最新数据显示肿瘤组织普遍具有特征性的miRNA表达谱，即指肿瘤细胞中某些miRNA的表达水平异常，而这种异常的特征性miRNA可以成为用于肿瘤或疾病的诊断，病理分级，临床分期，治疗与预后的生物标志物，显示了较好的临床应用前景。
目前，由于手足口病对于婴幼儿具有很强的传染性，一般是通过临床症状和病毒鉴定来诊断手足口病，但没有明确的分子标记物来区别手足口病轻症和重症，造成许多小孩预后不良的结果。
发明内容
本发明的目的之一提供一种具有特异性区分能力，稳定性好，效率高及成本低的用于诊断手足口病极重症的生物标记物及其应用。
实现上述目的的技术方案如下。
血清中exosome里的miR-671-5p作为快速诊断手足口病极重症分子标记物的应用。
或者，血清中exosome里的miR-671-5p，以及选自miR-16-5p和miR-150-3p中的至少一种作为快速诊断手足口病极重症分子标记物的应用。
快速诊断手足口病极重症的分子标记物，该分子标记物包括有血清中exosome里的miR-671-5p。
进一步地，还包括有miR-16-5p和/或miR-150-3p。
本发明的另一目的，在于提供一种快速诊断手足口病极重症的试剂盒。
实现该目的的技术方案如下。
一种快速诊断手足口病极重症的试剂盒，包括有检测血清中exosome里的miR-671-5p的表达量的试剂。
在其中一个实施例中，进一步还包括有检测血清中exosome里的miR-16-5p和/或miR-150-3p的表达量的试剂。
在其中一个实施例中，进一步还包括有检测内参miR-642a-3p的表达量的试剂。
更进一步地，本发明还提供了一种快速诊断手足口病极重症的荧光定量PCR试剂盒。
一种快速诊断手足口病极重症的荧光定量PCR试剂盒，包括有
(A)针对血清中exosome里的miR-671-5p的反转录引物SEQIDNO:5、以及荧光定量PCR检测引物对SEQIDNO:9和SEQIDNO:10，以及检测内参miR-642a-3p的表达量的试剂。
在其中一个实施例中，还包括有
(B)针对miR-150-3p的反转录引物SEQIDNO:6、以及荧光定量PCR检测引物对SEQIDNO:11和SEQIDNO:10，和/或(C)针对miR-16-5p的反转录引物SEQIDNO:7、以及荧光定量PCR检测引物对SEQIDNO:12和SEQIDNO:10。
本发明的另一目的是提供一种快速诊断手足口病极重症的方法。
实现该目的的技术方案如下。
一种快速诊断手足口病极重症的方法，包括以下步骤：
(1)检测待检测者血清中exosome里的miR-671-5p的表达量，检测内参miR-642a-3p的表达量；
或者包括以下步骤：
(1)检测待检测者血清中exosome里的miR-671-5p的表达量，检测内参miR-642a-3p的表达量；和
(2)检测血清中exosome里的miR-16-5p和/或miR-150-3p的表达量。
本发明通过microRNAMicroarray分析和荧光定量PCR验证等技术，结果均表明：与健康孩子和手足口病轻症患儿相比，手足口病极重症患儿血清中exosome中miR-671-5p，miR-16-5p和miR-150-3p的表达量发生了明显改变，尤其miR-671-5p在正常孩子和手足口病轻症患儿的血清exosome中表达，而在手足口病极重症患儿血清exosome中几乎不表达，因此，miR-671-5p可以单独作为手足口病极重症的分子标记物。此外，miR-16-5p的表达与健康孩子相比、在手足口病轻症和极重症患儿中依次显著上调，miR-150-3p的表达与健康孩子相比，在手足口病轻症和极重症患儿都发生下调，而手足口病极重症患儿与手足口病轻症患儿相比，发生了显著上调，因此，miR-16-5p和miR-150-3p可作为辅助诊断手足口病极重症的分子标记物，根据血清中exosome里的miR-671-5p，miR-16-5p和miR-150-3p表达量的变化，能快速准确诊断手足口病极重症患儿，及时制定治疗方案，避免预后不良的情况的发生。本发明为快速准确的诊断手足口病极重症患儿，提供了一种客观、准确的评价标准，避免耽误治疗或疾病的暂时性潜伏，这也对于临床诊断试剂盒的研制具有极大的应用价值。
附图说明
图1：健康孩子(control)与手足口病轻症(MHFMD)及手足口病极重症患儿(ESHFMD)血清中exosome的特征:(A)透射电镜下健康孩子与手足口病轻症(MHFMD)及手足口病极重症患儿(ESHFMD)血清中exosome的形态特征；(B)与血清(serum,S)相比，exosome(Ex)中两个biomarker蛋白CD63和TSG101的表达量的检测。
图2:5个健康孩子等量血清混合与5个手足口病轻症(MHFMD)及5个手足口病极重症患儿(ESHFMD)等量混合血清中exosome里microRNAMicroarray结果分析。
图3：18个健康孩子(control)与18个手足口病轻症(MHFMD)及18个手足口病极重症患儿(ESHFMD)血清中exosome的miR-671-5p,miR-16-5p和miR-150-3p的荧光定量PCR结果分析。
图4：18个健康孩子(control)与18个手足口病轻症(MHFMD)及18个手足口病极重症患儿(ESHFMD)血清中exosome的miR-671-5p,miR-16-5p和miR-150-3p的ROC曲线图，其中(A)手足口病轻症患儿与正常孩子相比，(B)手足口病极重症患儿与正常孩子相比，(C)手足口病轻症患儿与手足口病极重症患儿相比。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
临床中，手足口病极重症样本非常难收集。本发明的发明人经过多年的临床经验，结合对儿童血清中的exsome中的miRNA分别进行扫描分析，并进行临床样本验证，最后从众多的miRNAs确定3个表达差异的miRNAs。与健康孩子和手足口病轻症患儿相比，手足口病极重症患儿血清中exosome中miR-671-5p，miR-16-5p和miR-150-3p的表达量发生了明显改变，尤其miR-671-5p在正常孩子和手足口病轻症患儿的血清exosome中表达，而在手足口病极重症患儿血清exosome中几乎不表达，因此，miR-671-5p可以单独作为手足口病极重症的分子标记物。miR-16-5p的表达与健康孩子相比、在手足口病轻症和极重症患儿中依次显著上调；miR-150-3p的表达与健康孩子相比，在手足口病轻症和极重症患儿都发生下调，而手足口病极重症患儿与手足口病轻症患儿相比，发生了显著上调，miR-16-5p和miR-150-3p作为辅助诊断手足口病极重症的分子标记物，说明这三个miRNAs(miR-671-5p、miR-16-5p和miR-150-3p)是手足口病极重症的分子标记物，本领域的技术人员通过分析这三个miR-671-5p、miR-16-5p和miR-150-3p在血清中exosome里的表达量的变化，能快速准确诊断手足口病极重症患儿。
(1)实验样本收集
按照2008年手足口病预防控制指南收集手足口病轻症和极重症患儿临床样本各23个(实施例1和实施例2中各分析了5个和18个对应的不同样本)，同时经EV71诊断试剂盒检测均是EV71感染的手足口病，同时收集了23个正常孩子作为对照，手足口病极重症病例除满足手足口病预防控制指南外，还都需要机械通气，并出现脑炎和肺出血等临床症状，此外，这些样本经过临床检查证明没有感染其他疾病。把收集到的血液样本按照1000×g4℃离心10min，收集血清。
(2)实验试剂
RNA提取及qRT-PCR检测过程中所用到的试剂，如TRIZOL,氯仿，异丙醇，75％乙醇等常规生化试剂，miRNA茎环结构反转录引物、PCR正向引物、PCR反向引物。PCR扩增试剂盒(10Xbuffer、dNTPsmixture、Taq)及反转录反应试剂(RNase抑制剂、M-MuLV反转录酶、5×M-MuLV缓冲液以及反转录用dNTP混合物)均购买于TaKaRa公司，基于DNA染料法的荧光定量PCR检测试剂SYBRGreenPCRMasterMix为AB公司产品。exosome提取试剂盒为SBI公司产品。
实施例1
快速准确诊断手足口病极重症患儿的方法，包括以下步骤：
1.分别采集5个健康孩子，5个手足口病轻症和5个手足口病极重症患儿血液，1000×g离心10min后，取出血清；
2.按照exosome提取试剂盒说明，提取血清中的exosome；
3.在透射电镜下观察exosome的形态，呈近圆形，直径在30-100nm之间。此外，用westernBlot检测exosome的两个biomarker蛋白CD63和TSG101的表达。结果显示，exosome中的CD63和TSG101比血清中的要明显富集，以上结果说明我们提取exosome成功，参见图1。
4.用Trizol试剂提取exosome里的RNA,并对其进行浓度和纯度的测定；
5.进行microRNAMicroarray分析；按照上调或下调＞1.5倍的标准，进行了microRNA的初筛；
6.对于筛选出来的microRNAs，进行荧光定量PCR的验证(按常规方法逆转录获取cDNA，然后进行荧光定量PCR反应)。
MiRNA的序列
特异性引物如下表
二.逆转录
1)在去RNase的PCR管中配置以下溶液.
2)将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；
3)在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液
4)将3)溶液加入到1)溶液中，混匀后42℃孵育60min；
5)85℃孵育10min灭活逆转录酶。
荧光定量PCR引物
荧光定量PCR反应体系
荧光定量PCR反应条件：50℃2min；95℃2min；95℃15s，60℃32s读板40cycles；融解曲线分析：温度60℃-95℃。
通过microRNAMicroarray分析得到差异明显的miRNAs(＞1.5倍)，其中包括了miR-671-5p、miR-16-5p和miR-150-3p，请参见图2。
图2的(A)根据microRNAMicroarray结果，按照1.5倍筛选到的差异miRNAs，(B)维恩图显示了健康孩子与手足口病轻症患儿，健康孩子与手足口病极重症患儿，手足口病轻症患儿与手足口病极重症患儿两两比对筛选出来的差异miRNAs，(C)与健康孩子相比，在手足口病轻症患儿，手足口病极重症患儿都发生变化的差异miRNAs。即miR-671-5p在正常孩子和手足口病轻症患儿的血清exosome中表达，而在手足口病极重症患儿血清exosome中几乎不表达，miR-16-5p的表达与健康孩子相比、在手足口病轻症和极重症患儿中依次显著上调，miR-150-3p的表达与健康孩子相比，在手足口病轻症和极重症患儿都发生下调，而手足口病极重症患儿与手足口病轻症患儿相比，发生了显著上调。
实施例2
为了进一步确认这些差异性miRNAs(miR-671-5p、miR-16-5p和miR-150-3p)是否与手足口病极重症的快速准确诊断密切相关，分别提取了18个健康孩子、18个手足口病轻症患儿、18个手足口病极重症患儿血清中exosome的RNA,这几组血清中exosome的RNA通过实施例1所述的荧光定量PCR评估方法进行验证，以健康儿童血清exosome的RNA做对照，结果如图3和图4所示,实验结果显示手足口病极重症患儿miR-671-5p、miR-16-5p和miR-150-3p与健康孩子及手足口病轻症患儿相比，发生了明显的变化，尤其miR-671-5p在正常孩子和手足口病轻症患儿的血清exosome中表达，而在手足口病极重症患儿血清exosome中几乎不表达，miR-671-5p可以单独用来对极重症手足口病患者进行临床筛查和诊断。miR-16-5p的表达与健康孩子相比、在手足口病轻症和极重症患儿中依次显著上调；miR-150-3p的表达与健康孩子相比，在手足口病轻症和极重症患儿都发生下调，而手足口病极重症患儿与手足口病轻症患儿相比，发生了显著上调，miR-16-5p和miR-150-3p作为辅助诊断手足口病极重症的分子标记物。通过统计可以得知(表1-3)，miR-671-5p可以单独作为极重症患者的血清中exosome的标记物，miR-16-5p和miR-150-3p可以对极重症患者辅助诊断。
即miR-671-5p，或miR-671-5p与选自miR-16-5p和miR-150-3p中的至少一种可作为快速诊断手足口病极重症分子标记物的应用。
表1手足口病轻症患者与正常者miR-671-5p,miR-16-5p和miR-150-3p统计参数
miRNA的名称 95％CI specificity sensitivity AUC
miR-671-5p 62.0％-90.9％ 72.22％ 82.35％ 0.791
miR-16-5p 62.9％-91.2％ 72.22％ 83.33％ 0.796
miR-150-3p 73.9％-96.9％ 100％ 77.78％ 0.889
表2手足口病极重症患者和正常者miR-671-5p,miR-16-5p和miR-150-3p统计参数
miRNA的名称 95％CI specificity sensitivity AUC
miR-671-5p 90.3％-100％ 100％ 100％ 1.000
miR-16-5p 86.0％-100％ 100％ 88.89％ 0.975
miR-150-3p 66.5％-93.2％ 100％ 77.78％ 0.827
表3手足口病极重症患者和轻症患者miR-671-5p,miR-16-5p和miR-150-3p统计参数
miRNA的名称 95％CI specificity sensitivity AUC
miR-671-5p 65.0％-92.4％ 83.33％ 77.78％ 0.815
miR-16-5p 58.5％-88.3％ 77.78％ 88.89％ 0.756
miR-150-3p 58.1％-88.4％ 77.78％ 88.24％ 0.755
本发明提供的分子标记物miR-671-5p、miR-16-5p和miR-150-3p在用于快速准确诊断手足口病极重症患儿与目前所使用的各种临床诊断方法相比，它是一种客观的评价方法，具有取材方便、操作简单、稳定性好等优点，因此本发明具有极大的临床应用的可能。本发明涉及的用于诊断手足口病极重症的生物标记物的试剂盒具有特异性区分能力，稳定性好及效率高的特点，具有较好诊断指标的特性，且本发明涉及的用于诊断手足口病极重症的生物标记物的检测试剂盒成本较低，便于大规模的推广。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种快速诊断手足口病极重症的试剂盒，其特征在于，包括有检测血清中exosome里的miR-671-5p的表达量的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括有检测血清中exosome里的miR-16-5p和/或miR-150-3p的表达量的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，还包括有检测内参miR-642a-3p的表达量的试剂。
4.一种快速诊断手足口病极重症的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括有(A)针对血清中exosome里的miR-671-5p的反转录引物SEQIDNO:5、以及荧光定量PCR检测引物对SEQIDNO:9和SEQIDNO:10；以及检测内参miR-642a-3p的表达量的试剂。
5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，还包括有(B)针对miR-150-3p的反转录引物SEQIDNO:6、以及荧光定量PCR检测引物对SEQIDNO:11和SEQIDNO:10，和/或(C)针对miR-16-5p的反转录引物SEQIDNO:7、以及荧光定量PCR检测引物对SEQIDNO:12和SEQIDNO:10。
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