CN105274227B - 基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测用SDA反应液 - Google Patents

基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测用SDA反应液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测用SDA反应液；本发明利用发夹型DNA模板合成银纳米团簇，并将其作为新型分子信标，在引物垂悬端富G序列介导的链取代等温扩增反应中，借助杂交产生的富G荧光增强效应，实现对胃癌血浆microRNA标志物的单个检测；特异性高、反应时间短、用料少、操作步骤简便，为建立快速简便的新型microRNA检测方法开辟了新方向。

Description

基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测用SDA反应液
技术领域
本发明涉及医学和分子诊断领域，是一种基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测法，特别是涉及一种基于发夹型DNA模板合成银纳米团簇探针结合链取代等温扩增的单个microRNA检测方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21nt的内源非编码小RNA分子，其可通过与mRNA之间精确或非精确互补配对，参与调控mRNA的表达水平。多个miRNA可协同调控一个mRNA，或一个miRNA也可同时影响多个靶基因，从而形成一个高度复杂的调控网络，影响着从分子到细胞再到组织水平的一系列生物功能。miRNA表达异常与疾病及癌症发生密切相关。尤为重要的是，已发现多种miRNA标志物可用于癌症早期诊断、预后及进程监控。其中，上海交通大学崔大祥课题组用微阵列芯片miRNA全基因组扫描结合qRT-PCR技术筛选得到miR-16-5p和miR-19b-3p两种血浆miRNA标志物，并指出二者可用于指示胃癌发生发展进程(Zhang,J.,Song,Y.,Zhang,C.,et al.(2015)Circulating miR-16-5p and miR-19b-3p as twonovel potential biomarkers to indicate progression ofgastriccancer.Theranostics,5,733-745.)。其中，qRT-PCR是进行miRNA定量检测的金标准，但由于其需分步进行逆转录和热循环扩增及检测，导致该法耗时且费力。所以仍有必要进一步发展便捷快速的miRNA检测新方法。
等温扩增技术的出现使核酸扩增技术因摆脱了热循环变性步骤和仪器的束缚，而受到了众多研究者的关注。作为第一代等温扩增技术，链取代扩增Strand-displacementamplification(SDA)受DNA修复中碱基切除修复机制的启发迅速发展起来，至今，已发展出包括多引物SDA(multiply primed SDA)，剪切诱导SDA(nicking-initiated SDA)，环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification(LAMP))和结构转换诱发SDA(structure-switching-triggered SDA)等多种亚型。其中，由于结构转换诱发SDA不需要特殊设计剪切位点和额外使用剪切酶，而仅通过待测靶核酸与发夹结构探针的结合并导致后者打开而诱导SDA反应，特别适合对短链核酸分子及miRNA进行检测。目前，常用于结构转换诱发SDA的检测探针是一端连接有荧光染料及另一端连接荧光淬灭子的发夹型DNA分子信标(molecular beacon(MB))，但由于其需要对DNA进行偶联修饰，使检测成本增高，检测应用受限。
随着以DNA模板合成银纳米团簇(DNA-templated silver nanoclusters(AgNCs/DNA))的兴起，使得可能发展出除荧光染料或量子点修饰以外的新型核酸荧光探针。银纳米团簇是仅由几个或几十个银原子组成的直径小于1nm的集合体，其易于合成，且荧光可调控。更重要的是，AgNCs/DNA中由于DNA模板的引入，可仅通过改变DNA序列、长度和构象来获得特定的光物理学特性。近来，已有多种DNA序列合成AgNCs用于核酸或miRNA检测。Yang和Shah以5’-CCTCCTTCCTCC-3’为AgNCs成核区序列，并连接以miRNA杂交序列，借助该探针的荧光淬灭效应，对miR-160和miR-172进行了检测(Yang,S.W.and Vosch,T.(2011)Rapiddetection ofmicroRNAby a silver nanocluster DNAprobe.Anal.Chem.,83,6935-6939.)。Liu利用指数等温扩增反应生成用于红色荧光AgNCs合成的DNA模板，并借助荧光强度与DNA模板浓度间关系，对miR-141进行了测定。这些检测或借助荧光淬灭效应，或分别进行信号扩增和信号检测，导致特异性不好，或操作繁琐(Liu,Y.-Q.,Zhang,M.,Yin,B.-C.andYe,B.-C.(2012)Attomolar ultrasensitive microRNA detection by DNA-scaffolded silver-nanocluster probe based on isothermalamplification.Anal.Chem.,84,5165-5169.)。而随着Yeh报道了杂交介导的富G序列对AgNCs/DNA的荧光增强效应，使建立基于light-up信号的核酸检测平台成为可能(Yeh,H.C.,Sharma,J.,Han,J.J.,Martinez,J.S.and Werner,J.H.(2010)A DNA-silvernanocluster probe that fluoresces upon hybridization.Nano Lett.,10,3106-3110.)。但是，单纯的杂交检测虽然简便，却也很难确保较好的特异性。因而，为进一步提高检测特异性，简化操作步骤，我们首次将基于AgNCs/DNA的富G序列荧光增强效应与结构转换诱发SDA扩增技术结合，并研究二者的相互作用，以期实现可调控、简便及高特异检测。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于AgNCs/HpDNA探针的miRNA SDA检测法，具体是一种基于发夹型DNA模板合成银纳米团簇(AgNCs/HpDNA)探针结合SDA反应对miRNA进行检测的方法，即针对前期筛选得到的miRNA标志物miR-16-5p，设计并构建AgNCs/HpDNA探针，验证该探针的富G序列荧光增强性能，在此基础上，对该miRNA标志物进行单个检测，及单个碱基错配检测。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种HpDNA，序列如SEQ ID NO：1所示。
第二方面，本发明提供一种所述HpDNA的AgNCs/HpDNA，所述AgNCs/HpDNA是通过如下方法制备：
将AgNO3溶液、NaBH4溶液加入HpDNA中，震荡，静置，即得AgNCs/HpDNA。
优选地，HpDNA、AgNO3、NaBH4的终摩尔浓度之比为1:25:25；所述震荡为剧烈震荡，剧烈震荡的时间为45s-1min；所述静置具体指于暗环境中室温放置18h。
第三方面，本发明提供一种所述的AgNCs/HpDNA在检测胃癌血浆miRNA标志物miR-16-5p中的应用，所述miR-16-5p的序列如SEQ ID NO：2所示。
第四方面，本发明提供一种基于所述AgNCs/HpDNA的胃癌血浆miRNA标志物miR-16-5p SDA检测方法，所述检测方法包括：以所述AgNCs/HpDNAs为分子探针，在含富G序列垂悬端的引物作用下进行SDA反应，借助富G序列杂交荧光增强效应，实现miR-16-5p检测，所述引物序列如SEQ ID NO：3所示。
优选地，所述SDA反应的总体积为50μL，其中，
优选地，所述缓冲液1×Nb2.1包括50mM NaAc、10mM Tris-HAc、10mM Mg(Ac)2和100μg/mLBSA，缓冲液pH 7.9(25℃)。
优选地，所述SDA反应的反应条件为55℃环境中孵育55min，荧光检测的激发波长为580nm。
第五方面，本发明提供一种所述的检测方法在单个碱基错配核酸序列检测中的应用。
本发明所采用的技术方案是：
如图1所示，用于合成AgNCs的发夹型探针(RED 16(7s)C)含三个区，分别为颈区HpS、环区HpL和3’垂悬区HpRO。其中，特别设计的垂悬区富含C序列用于合成AgNCs，且HpRO(5’-CCCTTAATCCCC-3’)在杂交作用下与互补链中的富G垂悬序列靠近而得到红色荧光增强信号。用于miR-16-5p检测的探针为RED 16(7s)C，其序列如SEQ ID NO：1所示。
而待测miRNA序列分别与5’端颈部HpS部分序列及环区HpL互补，对应序列区域分别为MSc和MLc，该设计有利于更好地打开发夹结构，相应的靶miRNA为miR-16-5p，其序列如SEQ ID NO：2所示。
引物序列也由两个区域组成，分别为颈区互补区(PRSc,5’-TA-3’)和富G序列垂悬区(PO:5’-GGGTGGGGTGGGGTGGGG-3’)，相应HpDNA的引物为Pri2，其序列如SEQ ID NO：3所示。
miRNA的检测机制如下。首先，在发夹型探针上生成AgNCs，AgNCs/RED 16(7s)C探针在580nm波长激发下无荧光发射或较弱。在有靶miRNA时，其通过与AgNCs/HpDNA杂交，而打开发夹结构。随后，引物杂交至发夹探针颈部3’端，在聚合酶和dNTP的共同作用下，引导聚合酶链反应，延伸得到HpDNA的互补链HpDNAc(RED16(7s)G，其序列如SEQ ID NO：4所示)，从而使杂交双链AgNCs/HpDNA-HpDNAc中富G垂悬互补序列与AgNCs靠近，并得到位于该波长处的探针的荧光增强信号。同时，先前与HpDNA结合的靶miRNA序列被取代并释放，进入下一个循环反应。相反，在没有靶miRNA时，HpDNA保持闭合状态，引物无法结合，进而也无法扩增生成HpDNAc，最终，无法获得该波长处的荧光增强信号。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
第一，基于AgNCs/HpDNA探针及其富G序列荧光增强效应，可实现miRNA的高特异性检测。相比SYBR Green随意插入双链核酸，及MB只要发夹探针打开即可产生荧光信号响应的机制，本发明所用探针仅在形成带富G垂悬序列的互补序列并与之杂交后，才会生成荧光增强信号，发夹探针打开及任何中间体杂交双链均不会产生该信号，因而具有高特异性。
第二，发夹型DNA既作为SDA反应的模板，又作为AgNCs的生成模板，缩短了反应时间并节省了反应材料。通过将AgNO3与NaBH4按照一定比例与发夹型DNA混合，即可制备得到AgNCs/HpDNA探针。尽管该探针需要静置18h以使AgNCs充分老化，但其可以一次性大量制备并长期储存，且静置时间也可缩短至4h。在此基础上，SDA反应时间仅一步完成，时长55min，也可进一步缩短至30min。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为检测原理示意图；
其中，①HpDNA模板上生成AgNCs；②靶miRNA杂交互补于HpDNA的5’颈区和环区；③HpDNA打开；④富G垂悬引物结合于HpDNA3’颈区；⑤在聚合酶作用下延伸形成富G垂悬互补链HpDNAc；⑥靶miRNA释放，进入下一循环SDA反应；
图2为富G序列杂交荧光增强效应验证；其中，
A：AgNCs/RED 16(7s)C探针及其杂交产物荧光发射谱；
RED 16(7s)C-Pri2：AgNCs/RED 16(7s)C与Pri2杂交，
RED 16(7s)C-Pri2-h16：AgNCs/RED 16(7s)C与Pri2及miR-16-5p杂交；
RED 16(7s)C-G：AgNCs/RED 16(7s)C与RED 16(7s)G杂交；
B：图A中反应产物凝胶电泳图；
泳道1-3依次为不含AgNCs的核酸标志物RED 16(7s)C，RED 16(7s)G及RED16(7s)C-G；泳道4-6依次为RED 16(7s)C、RED 16(7s)C-Pri2、RED 16(7s)C-Pri2-h16及RED 16(7s)C-G)；
图3为梯度浓度单个miRNA检测；其中，
A、B：580nm波长激发下miR-16-5p检测荧光发射光谱及荧光发射峰增强值与待测核酸浓度间关系；
图4为单个碱基错配检测；其中，
A、B：580nm波长激发下基于RED 16(7s)C探针的错配miRNA检测的荧光发射光谱及荧光发射峰增强值；h16指miR-16-5p，h19b指miR-19b-3p，h16DMⅠ,Ⅱ分别指1个碱基错配的miR-16-5p的拟似物；
图5为基于RED 16(7s)C探针检测miR-16-5p和错配核酸的凝胶电泳图；
其中，miR-16-5p浓度依次为0(泳道4)，0.5μM(泳道5)，2.5μM(泳道6)，错配核酸为0.5μM miR-19b-3p(泳道7)及h16DMⅠ(泳道8)和h16DMⅡ(泳道9)，泳道1-3依次为不含AgNCs的核酸标志物RED 16(7s)C、RED 16(7s)G及RED 16(7s)C-G。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本申请所涉序列如下：
RED 16(7s)C(SEQ ID No.1)：tatacgccaat atttacgtgctgcta attggcgtatacccttaatcccc
hsa-miR-16-5p(SEQ ID No.2)：uagcagcacg uaaauauugg cg
Pri2(SEQ ID No.3)：gggtggggtggggtgggg ta
RED 16(7s)G(SEQ ID No.4)：gggtggggtggggtgggg tatacgccaattagcagcacgtaaat attggcgtata
h16DMⅠ(SEQ ID No.5)：tagcagcacgtaaat atgggcg
h16DMⅡ(SEQ ID No.6)：tagcagcatgtaaat attggcg
实施例1、检测方案可行性验证
(1)AgNCs/HpDNAs探针合成
按照Yeh文中方法进行合成。HpDNAs(RED 16(7s)C)，AgNO3，NaBH4起始浓度分别为100μM，1mM和1mM。磷酸盐缓冲液储备浓度为200mM(Pi,pH8.0)。等摩尔的AgNO3和NaBH4依次按照1RED 16(7s)C:25AgNO3:25NaBH4的比例加入到HpDNA中，使三者终浓度分别为15μM,375μM和375μM(Pi,20mM,pH8.0)。其中，NaBH4需要新鲜配置，并最后在30s内快速加入到Ag+/HpDNA的混合液中，之后，剧烈震荡45s～1min。所得溶液于暗环境中室温下放置18h，以得到稳定的AgNCs/HpDNAs探针。
(2)富G序列杂交荧光增强效应验证
向所得到的探针AgNCs/RED 16(7s)C中，分别加入相应的一定量的引物Pri2，或引物Pri2与靶miRNA(miR-16-5p)的混合物，或互补链HpDNAc(RED 16(7s)G,SEQ ID NO：4)，使得到等摩尔的探针与上述核酸的混合液，之后在55℃环境中孵育55min。最后，4℃暗环境中放置1h以上，即可在荧光分光光度计上进行荧光检测。
(3)结果
在SDA反应中，除HpDNAc外，引物、靶miRNA均可与AgNCs/HpDNA杂交，为此，我们分别测定了上述杂交产物的荧光。如图2所示，AgNCs/RED 16(7s)C探针仅在与其互补链杂交形成RED 16(7s)C-G时，才会在580nm ex/640nm em处产生显著的荧光增强，而其它核酸的杂交包括引物及靶miRNA均不会得到如此显著的增强信号(图2(A))。同时，凝胶电泳结果显示AgNCs/HpDNA-HpDNAcs形成最明亮的双链条带，而靶miRNA的加入也可形成少量双链样条带，引物的加入不会产生双链样条带(图2(B))。上述结果表明，富G序列荧光增强效应仅发生在AgNCs/HpDNA-HpDNAcs上，而不会出现于SDA反应的任何中间体上，且确实由靶miRNA而非引物打开HpDNA，证实该检测策略可行。
实施例2、单个miRNA检测
(1)AgNCs/RED 16(7s)C探针合成
按照(1)中所述步骤制备AgNCs/RED 16(7s)C探针，但RED 16(7s)C终浓度为5μM，AgNO3和NaBH4加入量仍按1RED 16(7s)C:25AgNO3:25NaBH4进行。
(2)单个miRNA检测
每个反应管中为50μLSDA反应液，包含以下成分：1×Nb2.1自制缓冲液(缓冲液pH7.9@25℃)(50mM NaAc、10mM Tris-HAc、10mM Mg(Ac)2和100μg/mL BSA)200μM dNTPs、10UBsu聚合酶(无DTT)、AgNCs/RED 16(7s)C(2.5μM HpDNA)、不同浓度的靶miRNA(0.05-2.5μM miR-16-5p)以及2.5μM引物Pri 2。所得反应液置于55℃条件下孵育55min，随后于4℃暗环境中保存，即可在荧光分光光度计上进行荧光检测，实验重复3次。
(3)结果
梯度浓度单个miRNA检测结果如图3所示。随着miR-16-5p浓度的增加，反应产物在580nm波长激发下荧光逐渐增强，绘制点图后，可以看到变化呈线性。基于上述探针的miR-16-5p检测限为0.1μM(λex＝580nm)。
凝胶电泳结果显示梯度浓度0μM，0.5μM和2.5μM的反应液双链产物AgNCs/HpDNA-HpDNAcs条带逐渐明亮，剩余单链AgNCs/HpDNA条带逐渐变微弱(图5)，也表明了基于探针AgNCs/RED 16(7s)C的单个miRNA检测SDA反应的顺利进行。
实施例3、单个碱基错配核酸检测
(1)单个碱基错配核酸检测
按照实施例2中(1，2)所述步骤进行，仅将待测核酸改为0.5μM错配核酸，即基于AgNCs/RED 16(7s)C探针检测miR-19b-3p，h16DMⅠ(序列SEQ ID NO：5)和h16DMⅡ(序列SEQID NO：6)。
(2)结果
错配核酸检测结果如图4所示。可以看到，在基于AgNCs/RED 16(7s)C探针的检测中，仅miR-16-5p(λex＝580nm)显示了最高的荧光增强信号，其余样本在该激发波长处的荧光增强均较弱，尤其，h16DMⅠ在580nm波长激发下反而出现荧光淬灭。综上可见，基于AgNCs/RED 16(7s)C探针的检测表现出很好的特异性。
凝胶电泳结果显示错配核酸样品条带与空白样品条带一致(图5)，进一步验证了该检测方法的特异性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种HpDNA，其特征在于，所述HpDNA的序列如SEQ ID NO：1所示；所述HpDNA含三个区，分别为颈区HpS、环区HpL和3’垂悬区HpRO；其中，垂悬区富含C序列用于合成AgNCs，且HpRO在杂交作用下与互补链中的富G垂悬序列靠近而得到红色荧光增强信号；HpRO序列为5’-CCCTTAATCCCC-3’。
2.一种基于权利要求1所述HpDNA的AgNCs/HpDNA，其特征在于，所述AgNCs/HpDNA通过如下方法制备：
将AgNO3溶液、NaBH4溶液加入HpDNA中，震荡，静置，即得AgNCs/HpDNA。
3.根据权利要求2所述的AgNCs/HpDNA，其特征在于，所述HpDNA、AgNO3、NaBH4的终摩尔浓度之比为1:25:25；
所述震荡的时间为45s-1min；
所述静置具体指于暗环境中室温放置18h。
4.根据权利要求2所述的AgNCs/HpDNA在制备检测胃癌血浆miRNA标志物miR-16-5p用SDA反应液中的应用，所述miR-16-5p的序列如SEQ ID NO：2所示。
5.一种基于权利要求2所述AgNCs/HpDNA的胃癌血浆miRNA标志物miR-16-5p SDA检测用SDA反应液，其特征在于，
所述SDA反应液的总体积为50μL，其中，
所述引物的序列由两个区域组成，分别为颈区互补区PRSc和富G序列垂悬区PO，其序列如SEQ ID NO：3所示；所述颈区互补区序列为5’-TA-3’；所述富G序列垂悬区序列为5’-GGGTGGGGTGGGGTGGGG-3’；
所述缓冲液1×Nb2.1包括50mM NaAc、10mM Tris-HAc、10mM Mg(Ac)2和100μg/mLBSA，缓冲液pH 7.9；
所述检测包括：以所述AgNCs/HpDNA为分子探针，在含富G序列垂悬端的上述引物作用下进行SDA反应，借助富G序列杂交荧光增强效应，在580nm波长激发下，实现miR-16-5p检测。
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