CN103805696B - 一种诊断类风湿关节炎的microRNA分子标志物及其检测试剂盒 - Google Patents

一种诊断类风湿关节炎的microRNA分子标志物及其检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于诊断类风湿关节炎的9种microRNA(miRNA)分子标记物组合及其在检测试剂盒中的应用，利用这类miRNA分子标记物在类风湿关节炎患者血液中呈现异常表达来诊断类风湿关节炎，该miRNA标志物组合灵敏度和特异性高，取材方便，安全无创，为疾病早期诊断和监测病程提供重要依据。本发明还提供了用于诊断类风湿关节炎的试剂盒以及miRNA标志物在诊断试剂盒中的用途，其特征在于所述试剂盒包含用于检测血浆中9种miRNA组合以及检测这9种miRNA的试剂。

Description

一种诊断类风湿关节炎的microRNA分子标志物及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术诊断领域，涉及用于诊断类风湿关节炎的9种microRNA分子标记物组合及其应用。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis；RA)是一类慢性，系统性的自身免疫性疾病，其主要病理改变为关节滑膜明显增厚并有大量炎症细胞浸润，血管翳形成以及软骨组织的侵蚀与破坏。一直以来，类风湿因子和抗环瓜氨酸蛋白抗体是美国风湿病协会诊断标准中的血清学指标，但敏感性和特异性均不高。目前仍不能阐明RA的发病机制及对疾病进行预测，因此找出疾病早期诊断和监测病程的生物标志物显得十分重要。
miRNA是一类长度约为22个核苷酸，参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，具有高度保守性、时序性和组织特异性。由于miRNA参与机体的各种重要的生理和病理过程，近年来倍受关注。miRNA的出现让人们在对哺乳动物基因组的表达和功能的认识上发生巨大的改变。目前通过不同的实验方法和计算机检测已经证实了在193个物种中存在25141个成熟miRNA(miRBasedatabase，version19.0，August，2012)，到目前为止，在数据库中已经有1223个人类miRN。据估计，一个miRNA可能调控几百到几千个靶基因，因此大约30％-90％的人类基因受到miRNA的调节。miRNA的表达和功能对于不同生理系统的发育和细胞稳态以及机体功能的维持具有重要的作用，寻找疾病诊断的标志物对其准确诊断一直是医学研究领域的重点。miRNA可被分泌释放到细胞外，参与多种炎性和自身免疫性疾病的发病过程。组织细胞内外的miRNA表达图谱的差异使miRNA作为疾病诊断的潜在性生物标志。
发明内容
本发明的目的在于介绍一种用于检测RA的miRNA标志物组合，通过在miRNA的3’端加上一特异性的茎环引物，通过逆转录和荧光定量PCR的方法检测被检样本血浆中这些miRNA的含量，并与正常人血浆中相应miRNA的水平比较来诊断RA。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：一组用于检测RA的miRNA标志物组合，为：miR-9-5p(5’-ucuuugguuaucuagcuguauga-3’，SEQIDNO.1)、miR-122-3p(5’-aacgccauuaucacacuaaaua-3’，SEQIDNO.2)、miR-219-2-3p(5’-agaauuguggcuggacaucugu-3’，SEQIDNO.3)、miR-4634(5’-cggcgcgaccggcccgggg-3’，SEQIDNO.4)、miR-181d(5’-aacauucauuguugucggugggu-3’，SEQIDNO.5)、miR-342-3p(5’-ucucacacagaaaucgcacccgu-3’，SEQIDNO.6)、miR-4764-5p(5’-uggauguggaaggaguuaucu-3’，SEQIDNO.7)、miR-3926(5’-uggccaaaaagcaggcagaga-3’，SEQIDNO.8)、miR-3925-3p(5’-acuccaguuuuaguucucuug-3’，SEQIDNO.9)。
本发明的优点是：筛查出的miRNA的标志物组合用于诊断RA的特异性和灵敏度高。
miRNA标志物组合通过以下步骤得到：
第一步：芯片筛选：选取临床确诊的初发活动期的RA患者5例，健康体检者5例各采集血浆1ml以上使用miRCURYTMLNAArray(version18.0)进行表达谱芯片筛选，得出在RA患者血浆中差异性表达的33种miRNA，其中22种miRNA升高，11种miRNA降低。
第二步：定量PCR初筛：选取临床确诊的RA患者18例，健康体检者14例，通过逆转录和荧光定量PCR的方法检测芯片筛选得出的33种差异性表达的miRNA，经过第一次PCR剔除Ct值高于35的miRNA,初筛得出22种miRNA。
第三步：定量PCR验证：选取临床确诊RA患者57例，健康体检者56例，使用上述相同的检测方法，通过差异性分析找出9种在RA患者血浆中差异性表达的miRNA。这九种miRNA的组合在诊断RA的特异性和灵敏度高。
本发明的再一目的是提供基于上述miRNA集合的检测试剂盒
技术方案是：一种类风湿关节炎的诊断试剂盒，包括以下成分：
(1)miRNA标志物组合：9种用于诊断类风湿关节炎的miRNA标志物，其序列见SEQIDNO.1-9；
(2)提取RNA试剂：mirVanaTMPARISkit(Ambion，AM1556)；另外还包括cel-miR-39和cel-miR-238的控制外参，序列分别为：5’-ucaccggguguaaaucagcuug-3’(SEQIDNO.10)和5’-uuuguacuccgaugccauucaga-3’(SEQIDNO.11)；。
(3)逆转录试剂：5×Buffer、dNTPMixture2.5mM、M-MLVReverseTranscriptase200U/μl、RNaseInhibitor40U/μl、DEPCH2O、miRNA特异性逆转录茎环引物。
(4)荧光定量PCR试剂：SYBRGreenMix、miRNA特异性前向引物、miRNA后向通用引物、DEPCH2O。
本发明的另一目的是基于上述miRNA标志物组合诊断试剂盒的检测方法。
技术方案是：茎环结构的逆转录引物约42-50个核苷酸，其5’端的36-40个核苷酸序列固定，形成一个茎环结构，其3’端的6-8个核苷酸与miRNA互补。荧光定量PCR的特异性前向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18核苷酸与对应的miRNA互补，后向通用引物约23nt，其中15-18个核苷酸对应特异的茎环结构。在miRNA的3’尾端加上茎环结构，通过逆转录及荧光定量PCR的方法来检测被检测者血浆中miRNA的含量并与正常人血浆中miRNA含量比较来诊断类风湿关节炎。
附图说明
图1芯片筛选RA患者血浆中差异性表达的miRNA。
图2：miRNA标志物组合的诊断价值。
Logit(P)=0.964+0.045*miR-9-5p-0.367*miR-122-3p-0.191*miR-219-2-3p+0.083*miR-4634+1.146*miR-181d-3.572*342-3p+0.033*miR-4764-5p-0.313*miR-3926-0.616*miR-3925-3p
具体实施方式
下面结合附图对上述技术方案做具体实施方式的说明。
总体实验方案如下：
收集就诊于江苏大学附属医院并经临床确诊的80例RA患者和75例正常健康体检者外周血2ml于EDTA-K2抗凝管，室温3000r/min离心10min,将上层血浆转移洁净1.5ml离心管，再以4℃16000×g离心10min，吸取上层血浆于洁净1.5ml离心管，-80℃冻存备用。
1.芯片筛选组：选取临床确诊的5例初发活动期的RA患者，5例健康体检者各采集血浆1ml以上送往上海康成生物使用Exiqon公司使用miRCURYTMLNAArray(version18.0)进行表达谱芯片筛选，经过聚类分析按照FoldChange≥1.5且P-value≤0.05筛选出33种候选miRNA(22种miRNA上升，11种miRNA下降)。
2.定量PCR初筛组：选取临床确诊的RA患者18例，健康体检者14例，使用mirVanaTMPARISkit(美国Ambion公司)提取RNA；通过逆转录使用反转录试剂(美国Promega公司)进行逆转录；再使用SYBRGreen(日本TaKaRa公司)进行荧光定量PCR的方法检测33种候选miRNA。所有的miRNAs引物组合(miRNA特异性逆转录茎环引物、miRNA特异性前向引物和miRNA后向通用引物)购于中国广州RiboBio公司；剔除Ct≥35的miRNA,经过定量PCR初筛得出22种候选miRNA。
3.定量PCR验证组：选取临床确诊RA患57例，健康体检者56例，用相同的检测方法，通过差异性分析进一步筛选出9种在RA患者血浆中差异性表达的miRNA。
具体的实验方法和结果如下：
一：芯片筛选组
1.ExiqonmicroRNA芯片筛选
1.1样本RNA提取：使用TRIreagentBD(MRCgene，TB-126)，PolyacrylCarrier(MRCgenecat.no.PC152)，Aceticacid，Chloroform，Isopropanol，Ethanol，Nuclease-freewater，Microcentrifuge(Termo)提取RNA(RNA质量报告见表1)
表1.芯片筛选标本提取RNA质量(使用NanoDropND-1000检测)
1.2miRNA标记：根据miRCURYTMArrayPowerLabelingkit(Cat#208032-A，Exiqon)提供的步骤和试剂进行标记，标记后样本置于4℃进行下一步的杂交。
1.3miRNA芯片杂交：按照Exiqon提供的杂交标准流程和配套试剂。准备杂交混合液(25μl标记样本，90μl2×Hybridizationbuffer，65μlNuclease-freeBuffer)，经过杂交，洗片，烘干等步骤。
1.4miRNA芯片扫描分析：经过杂交的芯片用AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner进行扫描，GenePixproV6.0读取芯片原始数据。
1.5芯片原始数据分析：取一批次实验中在每张芯片上修正值都＞=30的非control探针做标准化，以这部分探针中值(median)作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理，即各个miRNA修正值/median＝NormalizedData(标准值)。采用DifferentiallyExpressedmiRNAs(PassVolcanoPlot)的miRNA的标准值进行聚类分析(hierarchicalclustering)，关系近的样本或miRNA会聚到一起。
1.6实验结果：筛选出33种候选miRNA(22种miRNA上升，11种miRNA下降；见图1)。
2.定量PCR初筛
2.1标本收集：选取临床确诊的RA患者18例，健康体检者14例。
2.1.1试剂盒(mirVanaTMPARISkit)提取RNA：血浆200μtl加入同体积的2×变性溶液混匀后冰浴5min；与人类无同源序列的线虫的cel-miR-39和cel-miR-238各250fmol加入变性后的标本中混匀后冰浴5min；加入400μl氯仿涡旋混匀1min后冰上静置5min；12000r/min低温离心10min；吸取上清液放入过滤柱，加入250μl100％乙醇10000r/min低温离心1min；弃废液，加入700μlwashingsolution110000r/min低温离心1min；弃废液，加入500μlwashingsolution2/310000r/min低温离心1min；重复一遍；弃废液，加入100μl95°预热的RNase-freewater。
2.1.2反转录(RT)：采用50μl反应体系，使用200μl反应管。
将9种miRNA特异性逆转录引物等体积混合作为混合引物工作液。
体系如表2：
表2
以上体系混匀后，瞬时离心，70℃10min；立即冰浴5min，再加入表3所示的以下试剂进行RT反应。
表3
以上体系混匀后，瞬时离心。
RT反应参数值如表4：
表4
产物离心后置于-20℃备用。
2.1.3荧光定量PCR(RT-qPCR)：采用20μl反应体系，使用200μl反应管。
体系如表5：
表5
以上体系混匀后，瞬时离心。
热循环反应参数值如表6：
表6
融解曲线分析：程序设定：95℃15Sec，60℃30Sec，95℃15Sec。
2.1.4数据分析：使用SDSRelativeQuantificationSoftwareversion2.06(LifeTechnologies)进行数据分析。
2.1.5实验结果：剔除Ct值高于35的miRNA,初筛得出22种miRNA。
3.定量PCR验证组：
3.1标本收集：选取临床确诊RA患者57例，健康体检者56例。
3.2用以上相同的检测方法
3.3统计学分析：定量PCR分析以deltaCt(ΔCt)代表各miRNA的表达水平，ΔCtmiR=CtmiR-(Ctcel-miR-39+Ctcel-miR-238)/2；studentttest和Mann-Whitneytest用于组间比较；ROC曲线下面积用于评估被选miRNA的诊断价值；用二元Logisitc回归模型构建miRNA标准物组合；用softwareSPSSversion16.0(SPSS,ChicagoIL，USA)进行统计分析，用GraphPadPrism5.0forWindows(GraphPadSoftwareInc，LaJolla，CA)绘图；以P＜0.05为差异有统计学意义。
3.3实验结果：通过差异性分析进一步筛选出9种在RA患者血浆中差异性表达的miRNA，分别为：miR-9-5p、miR-122-3p、miR-219-2-3p、miR-4634、miR-181d、miR-342-3p、miR-4764-5p、miR-3926、miR-3925-3p(见表7)。各miRNA的AUC范围：0.6254to0.8179(见表8)。miRNA标志物组合联合诊断AUC：0.964(95％CI，0.932-0.997；P＜0.0001)(见图2)。
表7：荧光定量PCR验证组RA患者与健康体检者血浆中9种miRNA的相对表达
表8：miRNA诊断组合中9种miRNA的诊断价值

Claims (2)

1.一组用于诊断类风湿关节炎的miRNA标志物，其特征在于其序列如SEQIDNO.1-9所示。
2.miRNA标志物组合的检测试剂盒，包括以下成分：
(1)miRNA标志物组合：9种用于诊断类风湿关节炎的miRNA标志物，其序列见SEQIDNO.1-9；
(2)提取RNA试剂：采用mirVanaTMPARISkit试剂盒，在其中加入cel-miR-39和cel-miR-238的控制外参，所述cel-miR-39和cel-miR-238的控制外参序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示；
(3)逆转录试剂：5×Buffer、dNTPMixture2.5mM、M-MLVReverseTranscriptase200U/μl、RNaseInhibitor40U/μl、DEPCH2O、miRNA特异性逆转录茎环引物；
(4)荧光定量PCR试剂：SYBRGreenMix、miRNA特异性前向引物、miRNA后向通用引物、DEPCH2O。
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