CN102242204B - 一种单细胞分子生物学鉴定法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单细胞分子生物学鉴定法，属于生物科学和药物研发领域。该方法步骤主要包括：样品的收集、单个细胞的分离富集、单个细胞cDNA的合成和扩增、分析单个细胞的属性和组织特异性。本方法可以用于鉴定单细胞的属性和组织特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物科学和药物研发领域。
背景技术
靶细胞的分离和富集，在细胞学，分子生物学和免疫学方面有着广泛的应用，专利申请号为：201110005376.8，名称为：一种从组织中分离富集靶细胞的方法，对靶细胞的分离，富集有详细的描述。报导的血液循环癌细胞的临床研究结果显示，癌症患者的血液循环癌细胞的数量可以用于癌症患者的早期检测，诊断，病患的跟踪和预后等。由于癌细胞在癌症患者的血液中以极少量存在，为了能准确检测血液中的癌细胞的存在和数量，需要对血液样品中的癌细胞进行富集，以提高其检测的灵敏度和准确性。近年来，血液循环癌细胞的分离，富集越来越受到科研，临床上的重视。以乳腺癌患者为例，血液中循环癌细胞的数量与患者的临床表现有着密切的关联。在切除肿瘤组织后的最初的一段时间内，临床上就没有多少其他指标可以用来跟踪病患的病情。而乳腺癌的特点之一就是有很高的复发率，有效跟踪病患的病情，在临床上作出及时的处理，血液循环癌细胞的检测可提供一行之有效的指标。
实践证明，光有癌细胞的检测数量指标是不够的，特别是健康普查和诊断时，不仅要知道是否有癌细胞，最好是知道该癌细胞的来源和活性状况，例如，肝癌细胞，肺癌细胞等，以便医生能作出正确的诊断和临床处理。对单个细胞进行基因表达分析，可以在鉴定癌细胞的同时，对癌症的原理解析也是必不可少的。在鉴定癌细胞属性时，在相同的病患体内，可能会有不同的基因型的癌细胞。对单个细胞进行多种基因的表达分析和变异标记物的分析，就可以鉴定细胞的属性和来源。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题而提供了一种单细胞分子生物学鉴定法，该方法可以鉴定单细胞的属性和组织特异性。
本发明所采用的技术方案是：
一种单细胞分子生物学鉴定法，包括以下步骤：
(1)采集样品，将样品保存在适当的缓冲液中；所述样品可以为血液、骨髓液、组织块，生物活检，细胞系细胞等；
(2)用有识别细胞的抗体结合的磁珠分离富集单个细胞；
(3)将分离富集到的单个细胞收集在含有RNA Inhibitor的试管内；
(4)将收集起来的单细胞用细胞裂解缓冲液来裂解单细胞，直接合成单个细胞的cDNA，同时全面扩增该单细胞的cDNA；
(5)用定量PCR来检测单个细胞相关的多种基因的表达水平包括癌细胞相关的基因，组织特异性基因等，根据表达信号的特点，确定单个细胞的属性和组织特异性。
进一步地，所述步骤(3)后，如果不需要马上对单个细胞进行cDNA合成和扩增，则可将样品放在-20℃～-80℃的环境下保存到使用。
优选地，所述步骤(1)中样品为血液和骨髓液时，需要用EDTA或含有固定液的采血管来收集带血液的样品。
进一步地，所述步骤(4)中合成cDNA，同时全面扩增cDNA的引物结构为DNA和RNA的混合引物。
优选地，所述步骤(5)中定量PCR为qRT-PCR。
更优选地，所述单个细胞包括不同的单个癌细胞和血液白细胞。
本发明具有以下优点：
本发明的方法可以分析测定从不同的组织中分离出来的单个癌细胞的相关基因的RNA表达水平，从而用以鉴定单细胞的属性包括组织特异性和基因型，达到既可以鉴定癌细胞本身，又可以获得癌细胞的组织来源等重要信息。对细胞的鉴定，准确的临床诊断以及药物研发有着非常重要的意义，同时为癌症基因组解析提供有效的纯样品配置方法。
附图说明
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本例中用阳性抗体磁珠富聚法收集到的血液循环癌细胞的免疫荧光染色显微镜图。
具体实施方式
实施例1
乳腺癌患者的血液循环癌细胞和骨髓癌细胞的检测和鉴定。
1.1单细胞收集：
(1)用EDTA探血管，采集乳腺癌患者的血液或骨髓液，与EDTA混合好后，置于4℃直到使用。
(2)用上皮细胞粘附分子抗体结合的磁珠(StemCellTechnology)富聚样品中的癌细胞。
(3)收集富聚到的靶细胞(磁珠结合阳性的单个细胞)，放入到有RNase Inhibitor的PCR试管中，保存在-80℃，或直接作为单细胞RNA表达分析之用。
(4)直接用上述单细胞或从-80℃中取出的单细胞样品，加入细胞裂解液(共5uL)，在65℃下，处理5分钟。
(1X细胞裂解液组成成分：20mM Tris-HCl(pH7.5)；150mM NaCl；1mM Na2EDTA；1mM DGTA；1％ Triton；2.5mM Sodium Pyrophoshate；1mMBeta-glycerophosphate；1mM Na3VO4；1ug/mL Leupet in.备：可在使用前，加入1mM PMSF)。
(5)移样品到冰上。
1.2cDNA第一链合成：
(6)加入14uL的第一链cDNA合成混合液(浓度：11x RT buffer；0.5mM dNTP mix；cDNA Primer mix 2.5uM；RNasin 0.5U).
(7)处理样品在42℃，2分钟。
(8)加入1uL Superscriptase。
(9)在42℃下，处理50分钟。
(10)将样品放在冰上。
1.3cDNA第二链合成：
(11)加入20uL的第二链cDNA合成混合液(浓度：Klenow reactionbuffer 1X；DTT 1mM；dNTP mix 0.25mM；RNas in 0.5U；Ecoli RNase H0.01U；Klenow Exo-20U).
(12)在37℃的恒温下，处理30分钟。
(13)在75℃下，处理5分钟。
(14)将样品放在4℃准备cDNA的全面扩增或保存在-80℃为未来备用。
1.4cDNA的全面扩增：
(15)将上述cDNA样品浓缩到5uL。
(16)加入1uL扩增引物混合液(TE buffer，DTT，RNasin，cDNA全面扩增引物)。
(17)加入9uL扩增反应液(Isothermal buffer，dNTPs，RNasein).
(18)加入5uL酶混合液(Isothermal buffer，DTT，BSA，RNasein，Hydridase，Bst DNA Polymerase，T4 gene 32)。
(19)将样品在50℃的恒温下，处理60分钟。
(20)样品可以直接用作基因定量分析或保存在-20℃下备用。
1.5定量PCR分析单个细胞的基因表达水平：
(21)将扩增好的样品，稀释20-50倍。取5uL全面扩增了的cDNA样品于新的PCR试管中。
(22)加入7.5uL的多种基因的PCR引物和基因识别探针，加入12.5uL的PCR主要成分混合液。
(23)用Q-PCR仪器定量分析EpCAM(上皮细胞粘附分子).Cytokeratin(细胞角蛋白)，CD45，MUCINE1等各种基因的表达水平(表1)，鉴定单个细胞的属性和组织特异性。
通过以上步骤，所获结果如表-1所示，有CD45表达的细胞为血液白细胞，有细胞角蛋白(Cytokerat in)或上皮粘附分子表达，但没有CD45表达的为癌细胞。
图1为本实施例中用阳性抗体磁珠富聚法收集到的血液循环癌细胞的免疫荧光染色显微镜图。从图中可以看出癌细胞的蛋白质表达是CD45阴性，细胞角蛋白阳性，细胞核DAPI染色阳性。
表1实施例1中利用基因表达特点鉴定癌细胞
表1中上皮细胞粘附分子：本实验用的是上皮细胞粘附分子抗体磁珠来富集癌细胞，可以认为，除白细胞是用有CD45的抗体磁珠富集，表达CD45蛋白质外，其他的上述细胞都有上皮细胞粘附分子的蛋白质表达，而RNA的表达则可能跟细胞的活性状态和环境变化有关系，因为有些癌细胞并不都表达上皮细胞粘附分子的RNA，但白细胞是不表达上皮细胞粘附分子的。
实施例2
将细胞培养的不同的细胞系的细胞：T47D，SKBR3，MDA231和MCF7细胞加入血样中，用以上相同的方法富集，收集，合成cDNA，扩增cDNA后，用定量PCR方法测定RPS18，CD45，细胞角蛋白(CK8/18/19/7)，上皮细胞粘附分子和MUC1等基因的RNA表达水平。其结果如表2所示。不同的细胞系的癌细胞都不表达CD45，但都表达细胞角蛋白和上皮细胞粘附分子基因。由此，可以鉴别癌细胞和血液细胞。
表2实施例2中不同类型癌细胞的基因表达特点
实施例3
类似实施例2的方法，用结合有上皮细胞粘附分子抗体的磁珠富集，收集的MCF7细胞系(乳腺癌细胞)，HepG2(肝癌细胞)，PC3(前列腺癌细胞)和用结合有CD45抗体的磁珠富集，收集的血液白细胞进行了RNA表达的分析比较。对照RNA(购买的)作为阳性组比较。由表-3可以看出，MUCINE1基因在乳腺组织表达高，在MCF7乳腺癌细胞上得到了确认；PSA是前列腺特异性基因，在PC3前列腺癌细胞上得以确认；肝癌细胞则两者都不表达或仅有低量的MUCINE1表达。这些生物标记基因加上CD45，细胞角蛋白基因，细胞上皮粘附分子等基因表达特点，可以鉴定癌细胞的同时，并推断癌细胞的组织特异性。
表3实施例3中组织特异性的基因表达特点
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (1)
1.一种非诊断目的的单细胞分子生物学鉴定法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将样品保存在适当的缓冲液中；所述样品选自血液、骨髓液、组织块，生物活检，细胞系细胞；
（2）用有识别细胞的抗体结合的磁珠分离富集单个细胞，放入到有RNase Inhibitor的PCR试管中，保存在-80℃，或直接作为单细胞RNA表达分析之用；
（3）直接以分离得到的单细胞或从-80℃中取出的单细胞样品，加入5μL细胞裂解液，在65℃下，处理5分钟；所述细胞裂解液的组成成分为：20mM pH7.5Tris-HCl；150mM NaCl；1mM Na2EDTA；1mM DGTA；1％Triton；2.5mM Sodium Pyrophoshate；1mMBeta-glycerophosphate；1mM Na3VO4；1μg/mL Leupet in；在使用前，加入1mM PMSF；
（4）移样品到冰上；
（5）DNA第一链合成：
加入14μL的第一链cDNA合成混合液，42℃处理2分钟；加入1μL Superscriptase，在42℃下，处理50分钟；
所述第一链cDNA合成混合液为：11x RT buffer；0.5mM dNTP mix；cDNA Primer mix2.5μM；RNasin0.5U；
（6）将样品放在冰上；
（7）cDNA第二链合成：
加入20μL的第二链cDNA合成混合液；37℃的恒温下，处理30分钟；75℃下，处理5分钟；将样品放在4℃准备cDNA的全面扩增或保存在-80℃为未来备用；
所述第二链cDNA合成混合液为：Klenow reaction buffer1X；DTT1mM；dNTP mix0.25mM；RNas in0.5U；Ecoli RNase H0.01U；Klenow Exo-20U；
（8）cDNA的全面扩增：
将步骤（7）得到的cDNA样品浓缩到5μL，加入1μL扩增引物混合液、9μL扩增反应液、5μL酶混合液，在50℃的恒温下，处理60分钟；
所述扩增引物混合液由TE buffer，DTT，RNasin，cDNA组成；所述扩增反应液由Isothermal buffer，dNTPs，RNasein组成；所述酶混合液由Isothermal buffer，DTT，BSA，RNasein，Hydridase，Bst DNA Polymerase，T4gene32组成；
（9）基因定量分析或保存在-20℃下备用。
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