CN104651513A - 一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法,痛风血清miRNAs生物标志物包括hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p，这些标志物作为血清重要的生物学检测指标，能用于制备痛风诊断试剂或生物芯片等工具，在痛风临床早期准确诊断有重要价值，为以后从分子水平诊断痛风及痛风血清miRNAs的研究提供了理论依据，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。

Description

一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法

技术领域：

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法。

背景技术：

痛风是一种与遗传有关的长期嘌呤代谢障碍或尿酸排泄障碍，导致血尿酸持续增高和尿酸盐结晶沉积，引起组织损伤的一组临床综合征。痛风性关节炎是慢性高尿酸血症形成的尿酸结晶在关节腔内沉积而引发的关节炎，是痛风的最重要病症。随着人们生活方式的改变，痛风在我国发病率不断上升，南方和沿海经济发达地区发病率尤高，因此越来越受到医学界的重视。痛风引起的不可逆的关节破坏和功能障碍给人们的健康带来了极大的危害。痛风不仅能引起关节肿胀，而且可诱发和加重脂代谢紊乱、糖尿病及心血管疾病等，增加心脑血管疾病、代谢综合征及肾脏疾病病人的病死率。因此，痛风已成为严重威胁人类健康的常见病、多发病。近年来，随着人们生活水平的提高，高尿酸血症的患病率越来越高，而痛风的发病率也同样有明显的升高，但目前临床尚缺乏有效的治疗药物，亟需更多的研究进一步研究分析痛风的发病机制和检测方法。

目前痛风最准确的检测方法为关节滑液或痛风石的抽吸物中的尿酸盐晶体检测，偏振光显微镜下表现为负性双折光的针状或杆状的单钠尿酸盐晶体，是当前检测痛风不可替代的金标准，急性发作期，单钠尿酸盐晶体可见于关节滑液中白细胞内、外，也可见于痛风石的抽吸物中；在发作间歇期，单钠尿酸盐晶体也可见于曾受累关节的滑液中，但是尿酸盐晶体检测不仅会带给患者创伤和较重的疼感，而且关节滑液的穿刺吸取比较困难，所以，痛风的分子生物学研究日益受到国内外的重视，需要敏感而特异性的无创性的血清学指标，从分子水平上提高对痛风的检测水平。

MicroRNAs(miRNAs)是一类分布广泛的非编码的单链小分子RNA，其通过对mRNA降解或抑制其翻译，在转录后对靶基因的表达水平进行调节，从而参与细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能。目前研究证实miRNAs在很多疾病中具有重要作用，而且与一些炎症性疾病的发病紧密相关。研究表明，机体内组织、器官的代谢异常或器质性病变可能导致特定疾病状态下某些血清miRNAs表达水平的升高或降低。近年来发现血清中存在大量丰富且稳定的miRNAs，通过对患者血清中miRNAs表达谱与对照组进行对比分析，发现不同疾病中具有特定的表达谱，可为疾病的无创性早期检测提供一条新的途径。miRNAs在血液中可长期稳定存在，反复冻融、长期保存等各种处理方法均不会造成血清miRNAs的损失，而外周血标本的获得却十分简便，在血液中检测出痛风特异性的miRNAs并将其作为痛风的生物学标志具有重要的意义，目前还未见有关痛风血清miRNAs的公开报道。因此，提供一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法，确定痛风miRNAs表达谱，筛选痛风特异表达的miRNAs，建立血清miRNAs诊断模型，有助于实现对痛风的无创准确诊断及早期治疗。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供提供一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法，建立痛风血清miRNAs表达谱，揭示血清miRNAs对痛风检测的价值，为临床上痛风患者的无创准确诊断提供支持。

为了实现上述目的，本发明涉及的痛风血清miRNAs生物标志物包括上调表达的hsa-miR-3146、hsa-miR-4449和hsa-miR-4531以及下调表达的hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p。

本发明涉及的痛风血清miRNAs为来自外周静脉血的血清。

本发明涉及的痛风血清miRNAs生物标志物能用于制备痛风诊断试剂或生物芯片等工具。

本发明涉及的痛风血清miRNAs生物标志物的表达量的检测方法如下：

(1)逆转录：采用逆转录试剂盒和miRNAs特异性茎环结构逆转录引物进行miRNAs逆转录反应，反应体系包括3uL 5*的逆转录引物、1.5uL 10*的逆转录缓冲液、0.20uL的RNA抑制剂、0.15uL 100mmol/L的dNTP和dTTP混合物、1uL逆转录酶，每个反应体系中加入9.15uL RNA，总反应体系为15uL；该方法的反应条件为：16℃反应30分钟，42℃反应30分钟，最后85℃孵育5分钟；

(2)实时荧光定量PCR：反应体系包括：0.25uL 20*miRNA检测探针、2.5uL 2*Master Mix、1.25uL双蒸水、1uL稀释后的cDNA,共5uL,每个miRNA检测实施3平行；使用ABI Prism 7900荧光定量PCR仪检测，其反应条件：95℃ 10分钟、95℃ 15秒、60℃ 1分钟，以上阶段进行40个循环,完成对痛风血清miRNAs生物标志物的表达量的检测。

本发明采用microRNA Microarray芯片对急性痛风性关节炎、单纯高尿酸血症及健康对照者血清标本的miRNAs表达谱进行高通量的对比分析，筛选出20个候选miRNAs，然后采用预先设计的反转录引物和前向反向检测引物，通过逆转录-实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法，扩大样本量对20个候选miRNAs在痛风性关节炎及对照者血清中的表达丰度进行验证，建立痛风特异血清miRNAs表达谱；然后采用ROC(Receiver OperatorCharacteristic Curve)分析方法评价血清miRNAs表达谱对于痛风患者的早期诊断以及不同临床分级、分期的痛风患者的诊断价值。

本发明与现有技术相比，涉及的用于检测痛风的生物标志物hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p作为血清重要的生物学检测指标，在痛风临床早期准确诊断有重要价值，为以后从分子水平诊断痛风及痛风血清miRNAs的研究提供了理论依据，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。

附图说明：

图1为本发明实施例涉及的miRNAs在急性痛风病例和单纯高尿酸血症对照血清中的表达差异谱。

图2为本发明实施例涉及的miRNAs在急性痛风病例和健康对照血清中的表达差异谱。

图3为本发明实施例涉及的hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531和hsa-miR-4654在痛风病例和健康对照血清中的表达。

图4为本发明实施例涉及的hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p在痛风病例和健康对照血清中的表达。

图5为本发明实施例涉及的hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p对痛风的诊断ROC曲线。

具体实施方式：

下面通过实施例并结合附图对本发明进行详细说明，实施例中未注明的条件和方法等均按照常规条件进行。

本实施例将痛风血清miRNAs生物标志物用于检测痛风，其具体过程为：

1.采用Microarray芯片筛选候选的痛风相关miRNAs：

收集4例急性痛风性关节炎、4例单纯高尿酸血症及4例健康对照者的血清，使用凝血管采集全血，采血后两小时内分离血清，采血后轻轻倒转采血管混合4-5次，直立置于室温待血液完全凝固，1000g离心10分钟，分离血清；将分离出的血清转移至单独的冻存管，按照每500ul/管分装好；再利用exqion的LNA^TM microRNA Microarray对痛风血清的表达谱进行高通量的筛选；根据预设的条件，从中筛选出痛风miRNAs特异表达谱，然后依次进行血清总RNA的抽提与纯化、miRNA荧光标记、miRNA芯片杂交后以AxonGenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片，并以GenePix pro V6.0读取芯片各探针的原始荧光强度，最后进行数据分析，从而建立痛风患者血清miRNAs特异表达谱，筛选出痛风血清候选miRNAs；筛选标准为：1)表达水平变化倍数(Fold Change)>2(低表达时低于0.5)；2)P值<0.05；3)检测率大于75％；4)通过差异表达的火山图(Volcano Plot)；筛选出在痛风患者中高表达或低表达的20个miRNAs，其中表达上调6个，包括hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-3611、hsa-miR-652-5p和hsa-miR-4654；表达下调的有14个，包括hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-4763-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-589-5p、hsa-miR-3907、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-361-5p和hsa-miR-30c-5p(见表1，及图1和图2)；上述20个miRNAs的序列见表2。

表1：痛风患者血清中高表达及低表达的miRNAs

(注：Foldchanges大于1为高表达；低于1为低表达)

表2：20个痛风特异表达miRNAs的序列

2、痛风血清候选miRNAs的实时荧光定量PCR验证

在痛风患者中6个血清miRNAs表达量上调(hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-3611、hsa-miR-652-5p和hsa-miR-4654)和14个血清miRNAs表达量下调(hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-4763-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-589-5p、hsa-miR-3907、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-361-5p和hsa-miR-30c-5p)作为诊断痛风的标志物，进行下一步的荧光定量PCR验证分析；选定RNU6B和外源性cel-miR-39作为内参基因，并对其表达水平的稳定性进行检验；收集30例新发急性痛风性关节炎病例，同时收集30例在年龄和性别上相匹配的健康对照，病例收集于在医院经过尿酸盐晶体检查诊断的病例，对照来自于进行流行病学调查的健康人群，所有研究对象均从医院采集血清样本，同时系统收集完整的人口学和临床检验资料，分别采集200uL血清，采用实时荧光定量PCR检测血清中miRNAs的表达量；具体检测过程为：

(1)逆转录：采用逆转录试剂盒和miRNAs特异性茎环结构逆转录引物进行miRNAs逆转录反应，反应体系包括3uL 5*的逆转录引物、1.5uL 10*的逆转录缓冲液、0.20uL的RNA抑制剂、0.15uL 100mmol/L的dNTP和dTTP混合物、1uL逆转录酶，每个反应体系中加入9.15uL RNA，总反应体系为15uL。该方法的反应条件为：16℃反应30分钟，42℃反应30分钟，最后85℃孵育5分钟；

(2)实时荧光定量PCR：反应体系包括：0.25uL 20*miRNA检测探针、2.5uL 2*Master Mix、1.25uL双蒸水、1uL稀释后的cDNA,共5uL,每个miRNA检测实施3平行。使用ABI Prism 7900荧光定量PCR仪检测，其反应条件：95℃ 10分钟、95℃ 15秒、60℃ 1分钟，以上阶段进行40个循环；

(3)CT值代表一种目的miRNA分子达到实验设计阈值所需要的PCR循环的次数，当CT值>35时，认为样本中不含有该miRNA；在目的miRNA与内参扩增效率相同的情况下可以直接得到目的miRNA相对于内参的定量ΔCT＝CT目的-CT内参，ΔΔCT＝ΔCT病例-ΔCT对照，其中ΔCT＝CTmiRNA-CT内参基因；采用2^-ΔΔCT表示病例组miRNA表达相对于对照组变化的倍数，实验设立阴性对照和重复实验，所有荧光定量PCR均做3次重复；采用SPSS17.0软件做进一步的统计分析，Nonparametric Mann-Whitney test方法统计miRNAs在不同组之间的差异表达水平(统计学上认为P<0.05时，具有显著性差异)，差异表达的miRNAs数据处理结果以平均值+标准误表示，并绘制含误差线的散点图；采用ROC曲线分析判断单个血清miRNA诊断痛风的敏感性和特异性；结果显示，痛风患者血清hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531和hsa-miR-4654的表达水平明显高于对照组，差异具体明显统计学意义(P<0.05)，其他miRNAs在病例和对照之间没有明显差异(见图3)；痛风患者血清hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p的表达水平明显低于对照组，差异具体明显统计学意义(P<0.05)(见图4)；

3.评价血清miRNAs对于痛风的诊断价值

分析hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-4654、hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p对急性痛风性关节炎的诊断价值，绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC来评价上述miRNAs诊断急性痛风性关节炎的敏感性和特异性；发现hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p作为血清重要的生物学检测指标，在痛风临床早期准确诊断有重要价值；ROC分析结果如图5所示，A：hsa-miR-3146的曲线下面积为0.92(95％CI：0.82-0.97)，敏感性76％，特异性85％；B：hsa-miR-4449的曲线下面积为0.89(95％CI：0.77-0.95),敏感性72％，特异性80％；C：hsa-miR-4531的曲线下面积为0.91(95％CI：0.82-0.97),敏感性74％，特异性83％；D：hsa-miR-451a的曲线下面积为0.75(95％CI：0.62-0.85),敏感性69％，特异性68％；E：hsa-miR-223-3p的曲线下面积为0.84(95％CI：0.72-0.92),敏感性72％，特异性65％；F：hsa-miR-589-5p的曲线下面积为0.81(95％CI：0.69-0.90),敏感性62％，特异性68％；G：hsa-miR-885-5p的曲线下面积为0.88(95％CI：0.77-0.95),敏感性71％，特异性81％；上述结果说明对急性痛风具有较好的无创明确诊断价值，可用于制备急性痛风检测试剂盒中的应用。

Claims (4)

1.一种痛风血清miRNAs生物标志物，其特征在于痛风血清miRNAs生物标志物包括hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p。

2.根据权利要求1所述痛风血清miRNAs生物标志物，其特征在于痛风血清miRNAs为来自外周静脉血的血清。

3.根据权利要求1所述痛风血清miRNAs生物标志物，其特征在于所述痛风血清miRNAs生物标志物能用于制备痛风诊断试剂或生物芯片。

4.一种如权利要求1所述痛风血清miRNAs生物标志物的表达量的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)逆转录：采用逆转录试剂盒和miRNAs特异性茎环结构逆转录引物进行miRNAs逆转录反应，反应体系包括3uL 5*的逆转录引物、1.5uL 10*的逆转录缓冲液、0.20uL的RNA抑制剂、0.15uL 100mmol/L的dNTP和dTTP混合物、1uL逆转录酶，每个反应体系中加入9.15uLRNA，总反应体系为15uL；该方法的反应条件为：16℃反应30分钟，42℃反应30分钟，最后85℃孵育5分钟；

(2)实时荧光定量PCR：反应体系包括：0.25uL 20*miRNA检测探针、2.5uL 2*Master Mix、1.25uL双蒸水、1uL稀释后的cDNA,共5uL,每个miRNA检测实施3平行；使用ABI Prism 7900荧光定量PCR仪检测，其反应条件：95℃ 10分钟、95℃ 15秒、60℃ 1分钟，以上阶段进行40个循环,完成对痛风血清miRNAs生物标志物的表达量的检测。