CN117025758B - 环状rna在制备诊断孤独症的生物标志物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了环状RNA在制备诊断孤独症的生物标志物中的应用,属于生物医学领域。本发明提供了能够用于辅助诊断孤独症的环状RNA,其为hsa_circ_0054602、hsa_circ_0004566和hsa_circ_0085145中至少两种的组合。经实验发现,hsa_circ_0054602和hsa_circ_0004566的组合效果最佳,灵敏度为60.87%,特异度为94.79%。本发明发现了对孤独症有诊断价值的生物标志物,对孤独症患者的早期识别和辅助诊断提供了新的思路,有利于孤独症的早期发现及治疗,具有巨大的临床价值和社会经济意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,特别是涉及环状RNA在制备诊断孤独症的生物标志物中的应用。
背景技术
孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder,ASD)是一组神经发育失调所致的儿童精神疾病,表现为不同程度的社交障碍、语言障碍及行为方式刻板等。目前,孤独症已成为6岁以下儿童致残的主要原因。75%的患儿智力低下,成年后仍然有50%~70%的患者社会适应不良,生活不能自理,终生需要照顾。孤独症严重危害了儿童身心健康,亦给社会和家庭带来沉重的负担。
目前,ASD尚无有效的药物或方法彻底治愈,只能通过一些药物或方法缓解患者的核心症状,提升患者神经系统发展和生活自理能力,从而提高生存质量。因此,及早发现病症,早期诊断,有助于早期采取干预措施。现今临床诊断ASD的方法主要是使用相关量表(如孤独症行为量表、儿童孤独症评定量表、孤独症诊断观察量表、孤独症诊断访谈量表等)对患儿的言语、行为等进行观察和评估,偏主观化,容易产生误差造成漏诊或误诊。而且临床评估诊断要历经系统性、复杂的过程,需要多方协作,耗时长。对于症状不典型的ASD患者,需要更长时间才能诊断,将会耽误最佳的干预时机。因此,ASD的早期筛查与诊断亟需客观的、快速的实验指标。
环状RNA(circular RNA,简称circRNA)是新兴的一类不具有游离的5'端帽子和3'端poly(A)尾巴,以共价键形成环形结构的特殊非编码RNA分子。circRNA不易被RNA核酸外切酶降解,比线性RNA更加稳定,大量存在于真核细胞的细胞质中,具有一定的组织性、时序性和疾病特异性,是一种表达稳定的潜在生物标志物。准确地确定患者的表观遗传数据,是精准医疗的前提,对孤独症患儿进行孤独症相关circRNA的检测,是早期有效诊断孤独症患者的必要前提。但是,目前对于孤独症没有一个早期、客观的诊断的方法。发明一种新型、非侵入性、生物学客观的孤独症检测方法,以期为ASD诊断寻找客观的、微侵袭性的生物标志物,将对ASD的诊断和早期干预具有重大的社会经济意义以及临床价值。
发明内容
本发明的目的是提供环状RNA在制备诊断孤独症的生物标志物中的应用,以解决上述现有技术存在的问题,本发明明确了用于孤独症辅助诊断的环状RNA,该环状RNA具有灵敏度高和特异性强的优势,为早期诊断孤独症具有重要价值。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供环状RNA在制备辅助诊断孤独症的生物标志物中的应用,所述环状RNA为hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145中至少两种的组合。
本发明还提供检测环状RNA的引物组在制备孤独症生物标志物检测试剂中的应用,所述环状RNA为hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145中至少两种的组合,所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-6所示。
本发明还提供检测环状RNA的引物组在制备辅助诊断孤独症的试剂盒中的应用,所述环状RNA为hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145中至少两种的组合,所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-6所示。
优选的是,所述hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9-11所示。
优选的是,所述环状RNA为hsa_circ_0004566和hsa_circ_0054602的组合。
本发明公开了以下技术效果:
本发明提供了hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145三个环状RNA不同组合在辅助诊断孤独症方面的应用,经实验发现,hsa_circ_0054602和hsa_circ_0004566的组合效果最佳,灵敏度为60.87%,特异度为94.79%。本发明针对目前对于孤独症没有一个早期、客观的、灵敏度高、特异性强的诊断标志物,通过实验发现一种孤独症的生物标志物,为孤独症患者的早期识别和辅助诊断提供新的思路和诊断标志物。本发明生物标志物的发现有利于孤独症的患者的早期发现及治疗,具有巨大的临床价值和社会经济意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为病例组与对照组血清circRNA相对表达水平比较结果;
图2为单个circRNA的ROC曲线图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
1、血清中环状RNA的表达量检测
1.1血清中总RNA的提取
采用Trizol法,按照RNA提取方法严格、规范地提取ASD病人血清中RNA,具体步骤如下:
①1.5mL无酶EP管里放入200μL血清,加1000μL Trizol,静置5min;
②加200μL氯仿剧烈震颤15s,冰上静置2min;
③4℃,10000rpm离心15min,取上清液移至新无酶EP管中;
④加500μL异丙醇,混匀后-20℃放置10min;
⑤4℃,10000rpm离心12min,吸去上清液;
⑥加1000μL 75%酒精,混匀;
⑦4℃,8000rpm离心5min,吸去上清液;
⑧干燥8~10min,加入20μL DEPC水;
⑨50~60℃水浴,5min。
1.2血清总RNA纯度和浓度测定
测定步骤如下:
①打开酶标仪,DEPC水清洗检测板2次,擦净;
②2μL DEPC水校零;
③2μL待测样本滴至检测孔检测;OD260/OD280在1.8~2.0范围,则提取的RNA合格。
1.3环状RNA逆转录
设定逆转录反应总量为10μL,反应所需试剂及用量见表1。反应条件是25℃,反应5min;42℃,反应60min;95℃,反应5min;4℃forever。
表1使用的试剂
1.4环状RNA实时荧光定量PCR
qPCR检测hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602、hsa_circ_0085145及GAPDH,引物由Primer Premier 5.0软件设计,引物信息如表2所示。反应体系总体积为20μL,反应所需试剂如表3所示。反应条件如表4所示,并进行熔解曲线检测。3个环状RNA的序列信息记载在circBase数据库中(http://circbase.org/)。
表2引物序列信息
表3反应所需试剂
表4反应条件
上述hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602、hsa_circ_0085145的序列信息如下表5所示:
表5
1.5数据处理
以GAPDH作为内参基因,使用ΔCt法计算目标circ RNA的表达量,2-△△Ct计算目标circ RNA的相对表达量,ΔCt=Ct(目标circRNA)-Ct(GAPDH),ΔΔCt=ΔCt(病例组)-ΔCt(对照组)。
2、结果与分析
2.1ASD病例组血清中环状RNA的表达水平
如图1所示,与对照组相比,ASD病例组血清中hsa_circ_0054602表达升高,是对照组的1.61倍;hsa_circ_0004566和hsa_circ_0085145表达降低,分别是对照组的0.55倍和0.80倍,差异均具有统计学意义(P<0.05)。
2.2单个环状RNA诊断ASD的价值
为评估hsa_circ_0054602、hsa_circ_0004566和hsa_circ_0085145作为孤独症的诊断标志物的潜力,采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristiccurve,ROC)进行分析。ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标,是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系,它通过将连续变量设定出多个不同的临界值,从而计算出一系列灵敏度(sensitivity,简写SEN)和特异度(specificity,简写SPE),再以灵敏度为纵坐标、(1-特异度)为横坐标绘制成曲线。曲线下面积越大,诊断准确性越高。在ROC曲线上,最靠近坐标图左上方的点为敏感性和特异性均较高的临界值。ROC曲线下的面积值(AreaUnder the Curve,AUC)在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下,AUC越接近于1,说明诊断效果越好。AUC在0.5~0.7时有较低准确性,AUC在0.7~0.9时有一定准确性,AUC在0.9以上时有较高准确性。结果如图2所示,hsa_circ_0054602、hsa_circ_0004566和hsa_circ_0085145的AUC分别为0.79(95%CI:0.74~0.83,P<0.001)、0.74(95%CI:0.68~0.79,P<0.001)和0.68(95%CI:0.63~0.74,P<0.001),灵敏度分别为65.8%、89.1%和89.1%,特异度分别为81.3%、55.2%和45.3%。可见hsa_circ_0054602、hsa_circ_0004566和hsa_circ_0085145可作为诊断孤独症的可靠的、有潜力的生物标志物,为孤独症相关环状RNA的研究提供指导意义。
2.3联合试验的诊断效果分析
hsa_circ_0054602、hsa_circ_0004566和hsa_circ_0085145单项指标的灵敏度和特异度并不都是很理想,仅是灵敏度或特异度较高,而且约登指数、kappa值偏低,为了提高疾病诊断效率,应增加特异度,采用串联试验将2项或3项指标联合进行检测。串联试验时当样本中全部指标为阳性才判断该样本为阳性,可提高特异度,但却降低了灵敏度。在全部样本中,hsa_circ_0054602和hsa_circ_0004566组合的AUC为0.80(95%CI:0.73~0.84,P<0.001),灵敏度为60.87%,特异度为94.79%,约登指数为0.56、符合率为78.19%和Kappa值为0.56,诊断效果最好,见表6。
表6各指标不同串联方式诊断ASD的效果评价
注:A:hsa_circ_0054602;B:hsa_circ_0004566;C:hsa_circ_0085145。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.检测环状RNA的引物组在制备孤独症生物标志物检测试剂中的应用,其特征在于,所述环状RNA为如下任一项组合:
(1)hsa_circ_0004566和hsa_circ_0054602的组合;
(2)hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145的组合;
(3)hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145的组合;
所述引物组的核苷酸序列为:扩增所述hsa_circ_0004566的引物如SEQ ID NO:1-2所示,扩增所述hsa_circ_0054602的引物如SEQ ID NO:3-4所示,扩增所述hsa_circ_0085145的引物如SEQ ID NO:5-6所示。
2.检测环状RNA的引物组在制备辅助诊断孤独症的试剂盒中的应用,其特征在于,
所述环状RNA为如下任一项组合:
(1)hsa_circ_0004566和hsa_circ_0054602的组合;
(2)hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145的组合;
(3)hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145的组合;
所述引物组的核苷酸序列为:扩增所述hsa_circ_0004566的引物如SEQ ID NO:1-2所示,扩增所述hsa_circ_0054602的引物如SEQ ID NO:3-4所示,扩增所述hsa_circ_0085145的引物如SEQ ID NO:5-6所示。
3.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述hsa_circ_0004566、hsa_circ_0054602和hsa_circ_0085145的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9-11所示。
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