CN116716387B - 一种用于糖尿病分子病理诊断的引物组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于诊断试剂技术领域，公开了一种用于糖尿病分子病理诊断的引物组合物及试剂盒。该用于糖尿病分子病理诊断的引物组合物，包括：用于扩增APOC3基因、ABCG8基因、NUTF2基因、HMGA2基因、TBXA2R基因的引物对中的至少一种；用于扩增CHCHD9基因、ZBED3基因、LIPC基因、CETP基因、ABCA1基因的引物对中的至少一种；用于扩增ABCC8基因、CHN2基因、SOD2基因、REN基因、TBC1D4基因的引物对中的至少一种。该引物组合物能够有效地对2型糖尿病进行分子病理评估，实现了对患病个体进行分子病理病因的分析。
Description
技术领域
本发明属于诊断试剂技术领域，具体涉及一种用于糖尿病分子病理诊断的引物组合物及试剂盒。
背景技术
现代遗传医学、生物学研究已经表明，糖尿病具有明显遗传基因易感性(尤其是临床上最常见的2型糖尿病)。研究发现，有糖尿病家族史的人群，其糖尿病患病率显著高于没有糖尿病家族史的人群；而父母都患有糖尿病，其子女患糖尿病的概率则是普通人的15～20倍。糖尿病已经成为严重威胁居民健康的疾病类型。
糖尿病虽然临床表征都为血糖失控，但病理可能完全不同。经过分子病理学技术的不断发展及医学界的多年努力，糖尿病的发病机理、遗传基因已被广泛研究，糖尿病并非单一的疾病，是一个综合征，拥有多样化成因，且具有高度遗传异质性。但是传统的糖尿病分类方法无法区分糖尿病的个体化病理病因，具有很大局限性，特别是2型糖尿病，占所有糖尿病患者的90％以上，都统归为非胰岛素依赖型糖尿病，并没有对患病个体进行病理病因的分析。
随着分子生物学的发展，基因多态性与糖尿病并发症相关性的研究也日趋增多，从而为糖尿病的精准诊疗提供了新思路。本发明希望利用分子病理学方法，对糖尿病进行分子病理评估，从而快速确定分子病理类型，辅助糖尿病的检测与治疗。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于糖尿病分子病理诊断的引物组合物及试剂盒。该引物组合物能够有效地对糖尿病进行分子病理评估，将2型糖尿病在分子水平细分为胰岛素相对不足导致的糖尿病、肥胖及胰岛素抵抗导致的糖尿病、器官衰老及退化导致的糖尿病，实现了对患病个体进行分子病理病因的分析。
本发明提供了一种用于糖尿病分子病理诊断的引物组合物，包括：
检测胰岛素相对不足导致的糖尿病的引物对，用于扩增APOC3基因、ABCG8基因、NUTF2基因、HMGA2基因、TBXA2R基因中的至少一种；
检测肥胖及胰岛素抵抗导致的糖尿病的引物对，用于扩增CHCHD9基因、ZBED3基因、LIPC基因、CETP基因、ABCA1基因中的至少一种；
检测器官衰老及退化导致的糖尿病的引物对，用于扩增ABCC8基因、CHN2基因、SOD2基因、REN基因、TBC1D4基因中的至少一种。
优选地，所述检测胰岛素相对不足导致的糖尿病的引物对，选自以下引物对1-5中的至少一种：
扩增APOC3基因SNP位点rs2854116的引物对1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；扩增ABCG8基因SNP位点rs6544713的引物对2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示；扩增NUTF2基因SNP位点rs2271293的引物对3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示；扩增HMGA2基因SNP位点rs1531343的引物对4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7-8所示；扩增TBXA2R基因SNP位点rs1131882的引物对5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9-10所示。
优选地，所述检测肥胖及胰岛素抵抗导致的糖尿病的引物对，选自以下引物对6-10中的至少一种：
扩增CHCHD9基因SNP位点rs13292136的引物对6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11-12所示；扩增ZBED3基因SNP位点rs4457053的引物对7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13-14所示；扩增LIPC基因SNP位点rs261332的引物对8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15-16所示；扩增CETP基因SNP位点rs708272的引物对9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17-18所示；扩增ABCA1基因SNP位点rs4149274的引物对10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19-20所示。
优选地，所述检测器官衰老及退化导致的糖尿病的引物对，选自以下引物对11-15中的至少一种：
扩增ABCC8基因SNP位点rs3792267的引物对11，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21-22所示；扩增CHN2基因SNP位点rs17756941的引物对12，其核苷酸序列如SEQ ID NO：23-24所示；扩增SOD2基因SNP位点rs4880的引物对13，其核苷酸序列如SEQ ID NO：25-26所示；扩增REN基因SNP位点rs2368564的引物对14，其核苷酸序列如SEQ ID NO：27-28所示；扩增TBC1D4基因SNP位点rs9565164的引物对15，其核苷酸序列如SEQ ID NO：29-30所示。
本发明还提供了上述引物组合物在制备糖尿病分子病理诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种糖尿病分子病理诊断试剂盒，包含上述引物组合物。
本发明还提供了上述糖尿病分子病理诊断试剂盒的应用方法，所述应用方法不以疾病的诊断为目的，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)以所述样品DNA为模板，加入糖尿病分子病理诊断试剂盒中的引物对构建反应体系；
(3)采用所述反应体系进行PCR扩增，收集扩增产物进行检测。
优选地，步骤(1)中所述样品选自血液、毛发、唾液或脱落细胞。
优选地，步骤(2)中所述反应体系包含以下组分：模板、扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、引物对、Mg2+和水。
优选地，步骤(3)中采用Touch Down PCR方法进行所述PCR扩增。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明所述引物组合物及其所制得的试剂盒用于2型糖尿病的分子病理分类时，能够对胰岛素相对不足导致的糖尿病、肥胖及胰岛素抵抗导致的糖尿病和器官衰老及退化导致的糖尿病进行有效区分，快速确定糖尿病分子病理类型，检出率和准确率高，具有很好的辅助糖尿病分类、分析糖尿病致病因素的效果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种糖尿病分子病理诊断试剂盒，包括如表1所示的15组引物对。
表1各基因SNP位点引物序列
表1中各基因SNP位点信息及其所对应糖尿病分子病理类型见表2。
表2各基因SNP位点及对应糖尿病分子病理类型信息表
实施例2
本实施例提供了实施例1中糖尿病分子病理诊断试剂盒的应用方法，包括以下步骤：
(1)样品DNA提取：使用血液样本DNA抽提试剂盒(Mag en HiPure Tissue&BloodDNA Kit D3018-03)抽提标本DNA，具体步骤按照试剂盒说明书上操作。样品DNA使用Thermo公司的Nanodrop进行定量和质控。
(2)样品DNA的PCR扩增：PCR反应体系使用Taq DNA Polymerase(Vazyme，P101)，其中包含10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTP Mix(10mM)。对于每个位点，构建一个PCR反应体系。
反应体系(100μL)组成为：10×扩增缓冲液10μL；4种dNTP混合物各200μmol/L；正义链引物、负义链引物各100pmol；模板(即样品DNA)1μg；Taq DNA聚合酶2.5μL；Mg2+1.5mmol；双蒸水加至体系总体积为100μL。
(3)PCR反应条件：使用Touch DownPCR方法保证扩展的特异性，并且在后面15个循环，使用较低的退火温度，保证扩展效率，PCR程序步骤具体设置如下：
1.94℃5min
2.94℃15s
3.66℃30s(每个循环，降低0.5℃)
4.72℃30s
(2-4步骤重复20个循环)
5.94℃15s
6.55℃30s(每个循环，降低0.5℃)
7.72℃30s
(5-7步骤重复15个循环)
8.72℃5min
9.4℃保存产物。
(4)基因位点扩增产物进行二代测序检测，样品送测序公司进行二代测序，测序平台可为Illumina HiSeq1000二代测序平台。
判定标准依据：
当检测结果显示APOC3基因SNP位点rs2854116、ABCG8基因SNP位点rs6544713、NUTF2基因SNP位点rs2271293、HMGA2基因SNP位点rs1531343和TBXA2R基因SNP位点rs1131882中存在3个或3个以上的位点突变，则判断为胰岛素相对不足导致的糖尿病；
当检测结果显示CHCHD9基因SNP位点rs13292136，ZBED3基因SNP位点rs4457053，LIPC基因SNP位点rs261332，CETP基因SNP位点rs708272和ABCA1基因SNP位点rs4149274中存在3个或3个以上的位点突变，则判断为肥胖及胰岛素抵抗导致的糖尿病；
当检测结果显示ABCC8基因SNP位点rs3792267，CHN2基因SNP位点rs17756941，SOD2基因SNP位点rs4880，REN基因SNP位点rs2368564和TBC1D4基因SNP位点rs9565164中存在3个或3个以上的位点突变，则判断为器官衰老及退化导致的糖尿病；
当某样品的检测结果同时满足上述两种及以上的判定标准时，则可判断其患有多种类型的2型糖尿病。
产品效果测试
从医院中获得900例已确诊为糖尿病的患者的血液样本，900例已确认未患糖尿病的对照样本，即共1800例样本。依照实施例2的方法进行检测，基因测序结果分析如表3所示。
表3 1800例样本基因测序结果分析
根据表3结果可以得出，上述基因的SNP位点确实可作为糖尿病的检测位点。
另外，根据900例糖尿病患者各基因测序结果，对900例糖尿病患者进行糖尿病分子病理评估，具体的分子病理评估结果总结如表4。
表4糖尿病分子病理评估结果分析统计表
为了进一步验证实施例2中糖尿病分子病理评估的准确性，采用糖尿病相关生理指标进行糖尿病的传统分类与之比较，具体方法如下所示：
对上述900例已确诊为糖尿病的患者的各项生化指标进行收集，包括胰岛素自身抗体(IAA)、胰岛细胞抗体(ICA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)、蛋白酪氨酸磷酸酶2抗体(IA-2A)、锌转运体8抗体(ZnT8A)、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹C肽(FCP)、空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FPG)等。
采用HOMA稳态模型评估法获得每位糖尿病患者的胰岛β细胞功能、胰岛素抵抗水平及胰岛素敏感性，HOMA评价方法如下：
评价胰岛素抵抗水平：
HOMA-IR＝FINS×FPG/22.5
评价胰岛素敏感性：
HOMA-IS＝1/HOMA-IR
评价胰岛β细胞功能：
HOMA-β＝20×FINS/(FPG-3.5)
常规生理指标进行糖尿病分类的分类标准如表5所示。
表5常规生理指标进行糖尿病分类
利用上述糖尿病相关生理指标对900例已确诊为糖尿病的患者进行传统的糖尿病病情评估，并采用K-means聚类分析法对传统评估方法和糖尿病分子病理评估方法所得到的评估结果进行重合度分析，测试结果如表6。
表6K-mean聚类分析
由表6可知，这两种评估方法得到的糖尿病病理分析的重合度在81％～92％之间，说明利用本申请实施例1中试剂盒对糖尿病进行的分子病理评估具有科学性和可靠性。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (1)
1.一种用于糖尿病分子病理诊断的引物组合物在制备糖尿病分子病理诊断试剂盒中的应用，其特征在于，由检测胰岛素相对不足导致的糖尿病的引物对、检测肥胖及胰岛素抵抗导致的糖尿病的引物对和检测器官衰老及退化导致的糖尿病的引物对组成；
所述检测胰岛素相对不足导致的糖尿病的引物对，用于扩增APOC3基因、ABCG8基因、NUTF2基因、HMGA2基因和TBXA2R基因；
所述检测胰岛素相对不足导致的糖尿病的引物对，由以下引物对1-5组成：
扩增APOC3基因SNP位点rs2854116的引物对1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；扩增ABCG8基因SNP位点rs6544713的引物对2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示；扩增NUTF2基因SNP位点rs2271293的引物对3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示；扩增HMGA2基因SNP位点rs1531343的引物对4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7-8所示；扩增TBXA2R基因SNP位点rs1131882的引物对5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9-10所示；
所述检测肥胖及胰岛素抵抗导致的糖尿病的引物对，用于扩增CHCHD9基因、ZBED3基因、LIPC基因、CETP基因、ABCA1基因；
所述检测肥胖及胰岛素抵抗导致的糖尿病的引物对，由以下引物对6-10组成：
扩增CHCHD9基因SNP位点rs13292136的引物对6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11-12所示；扩增ZBED3基因SNP位点rs4457053的引物对7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13-14所示；扩增LIPC基因SNP位点rs261332的引物对8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15-16所示；扩增CETP基因SNP位点rs708272的引物对9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17-18所示；扩增ABCA1基因SNP位点rs4149274的引物对10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19-20所示；
所述检测器官衰老及退化导致的糖尿病的引物对，用于扩增ABCC8基因、CHN2基因、SOD2基因、REN基因、TBC1D4基因；
所述检测器官衰老及退化导致的糖尿病的引物对，由以下引物对11-15组成：
扩增ABCC8基因SNP位点rs3792267的引物对11，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21-22所示；扩增CHN2基因SNP位点rs17756941的引物对12，其核苷酸序列如SEQ ID NO：23-24所示；扩增SOD2基因SNP位点rs4880的引物对13，其核苷酸序列如SEQ ID NO：25-26所示；扩增REN基因SNP位点rs2368564的引物对14，其核苷酸序列如SEQ ID NO：27-28所示；扩增TBC1D4基因SNP位点rs9565164的引物对15，其核苷酸序列如SEQ ID NO：29-30所示。
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