CN102286625B - 一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合及其应用 - Google Patents
一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102286625B CN102286625B CN201110252889.9A CN201110252889A CN102286625B CN 102286625 B CN102286625 B CN 102286625B CN 201110252889 A CN201110252889 A CN 201110252889A CN 102286625 B CN102286625 B CN 102286625B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- mirna
- refining
- essence
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 137
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 136
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 title abstract description 13
- 108091031103 miR-181a stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108091046591 miR-181a-4 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108091049627 miR-181a-5 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108091090583 miR-34c stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108091084066 miR-34c-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108091048101 miR-374b stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108091057331 miR-509 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108091091880 miR-509-1 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108091051359 miR-509-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000007670 refining Methods 0.000 claims description 58
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 13
- 108091032623 miR-513a-1 stem-loop Proteins 0.000 claims description 11
- 108091080923 miR-513a-2 stem-loop Proteins 0.000 claims description 11
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 claims description 9
- 108091051828 miR-122 stem-loop Proteins 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 18
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 39
- 230000006870 function Effects 0.000 description 32
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 7
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 7
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- -1 miR-146b-5p Proteins 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- 206010003495 Aspermia Diseases 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 1
- 108091080995 Mir-9/mir-79 microRNA precursor family Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 201000001880 Sexual dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructopyranose Chemical compound OC[C@]1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000469 anti-sperm effect Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical class [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006589 gland dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108091028606 miR-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091045790 miR-106b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091070946 miR-128 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091063348 miR-193 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091036762 miR-193a stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091073055 miR-193a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091040345 miR-193a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091037787 miR-19b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091031190 miR-495 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091056921 miR-532 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091088997 miR-890 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091047084 miR-9 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 1
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 1
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 231100000872 sexual dysfunction Toxicity 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004336 spermatogonium Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 201000004822 varicocele Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合及其应用。该miRNA组合包括下列miRNA：miR-34c-5p，miR-181a，miR-374b和miR-509-5p。该组合可用于制备诊断或监测男性生殖功能障碍的试剂。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸(microRNA，简称miRNA)组合及其应用。
背景技术
据WHO统计，不育(孕)夫妇约占育龄夫妇的10％～15％，其中男性因素约占30％～40％[1，2]。近年来，男性不育的比例呈上升趋势，而人们对优生优育的要求越来越高，因此为了有效诊断和治疗男性不育，寻找临床价值更高的男性不育标志物迫在眉睫。目前国内临床实验室通过检测精液中精子的密度和活力、精浆生化指标、血液中性激素水平、染色体核型和Y染色体微缺失等方法来判断男性睾丸的生精功能。但目前的临床检测手段对许多无、少精子症的病因无法作出解释和判断，给临床治疗带来了极大的困扰。精液中除精子外，绝大部分是精浆。精浆由附睾、精囊、前列腺、睾丸网及尿道旁腺的分泌物组成，其化学成分中除90％的水外，还有糖、脂质、蛋白质、肽类激素、胺类、有机酸、有机碱以及无机离子等多种成分。研究表明，相对于正常男性，男性生殖功能障碍患者的精液，特别是精浆中的化学成分往往会发生一定程度的改变。目前开展的常规精浆检测项目包括果糖、α-葡糖苷酶、酸性磷酸酶、锌和肉毒碱以及一些免疫学指标，包括抗精子抗体和抗弓行虫抗体等，这些检测项目仅有助于诊断有限的几种男性附属性腺功能异常及个别免疫学因素，不能直接反映睾丸的生精功能和全面评价精液质量[3]。
因此亟待找到一种比现有方法更可靠同时又简单易行的新方法来鉴定男性睾丸的生精功能以及判断附属性腺的病理。
miRNA是真核生物中一类长约22个核苷酸并参与基因转录后水平调控的非编码单链小核糖核酸分子。miRNA通过与靶mRNA的3’端非翻译序列完全或部分互补结合，导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制来调控靶基因的表达[4]。它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中。近五年来，在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种miRNA分子。miRNA存在于几乎每一种组织细胞中，对各种生命过程包括生殖、发育都会产生潜在影响，人体30％的蛋白质编码基因都由miRNA调控[5，6]。
睾丸是男性的主要生殖器官，睾丸的精子中也存在miRNA。在各级生精细胞中一些特定的miRNA高度表达，表明这些miRNA参与精子的发生，对精原细胞的增殖和精子生成起着重要作用[7-9]。因此，对这些miRNA进行研究就有可能寻找到一些与男性生殖功能，特别是与睾丸生精功能密切相关的miRNA作为标志物，进而用于男性生殖功能障碍的临床诊断和预测。
发明内容
本发明的目的是提供一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合。
本发明的另一个目的是提供上述精浆微小核糖核酸组合的应用。
本发明人发现精浆中能够检测到高表达丰度的miRNA，特别是发现其中一组miRNA的表达异常与生殖功能有关，例如它们在精浆中的表达水平与睾丸的生精功能密切相关。因此，本发明通过研究男性生殖功能障碍过程中精浆miRNA的特异性变化，筛选出在不育及正常生育状态下表达差异显著的精浆miRNA，通过检测这些miRNA，为诊断男性生殖功能障碍提供新的信息和标志物，对提高男性生殖功能障碍的发现率，病程监控、预后和药效评价过程中的针对性以及疗效都具有积极的意义。
本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的：
一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合，该miRNA组合包括下列miRNA：miR-34c-5p，miR-181a，miR-374b和miR-509-5p。
所述的精浆微小核糖核酸组合，该miRNA组合还包括miR-146-5p和miR-513a-5p，进一步，该miRNA组合还包括miR-122。
所述的精浆微小核糖核酸组合，其中男性生殖功能障碍是指无精、少精和/或弱精。
所述的精浆微小核糖核酸组合，其中与无精和/或弱精相关的精浆微小核糖核酸组合包括miR-34c-5p，miR-181a，miR-374b和miR-509-5p。进一步地，该组合为miR-34c-5p，miR-181a，miR-374b，miR-509-5p，miR-122，miR-146-5p和miR-513a-5p。
所述的精浆微小核糖核酸组合，其中与少精相关的精浆微小核糖核酸组合包括miR-34c-5p，miR-181a，miR-374b和miR-509-5p。进一步地，该组合为miR-34c-5p，miR-181a，miR-374b，miR-509-5p，miR-146-5p和miR-513a-5p。
上述的精浆微小核糖核酸组合在制备诊断或监测男性生殖功能障碍的试剂中的应用，其中男性生殖功能障碍是指无精、少精和/或弱精。
上述miRNA组合的筛选方法包括以下步骤：
(1)收集生育正常男性以及生殖功能障碍男性的精浆，并提取总RNA；
(2)采用高灵敏度、精确性和高重复性的Solexa测序技术(Solexa sequencingtechnology)，对上述RNA进行检测，初筛选出生殖功能障碍与正常男性精浆中表达差异显著的一组miRNA；
(3)进一步用适时荧光定量PCR方法验证。
具体来说(结合图1及实施例)，上述筛选方法包括以下步骤：(1)分别收集正常生育男性及生殖功能障碍男性的精浆，并提取总RNA，其中所述生殖功能障碍包括无精(非梗阻性)、少精或弱精；(2)根据已知的人全部成熟miRNA，对上述RNA进行测序和检测，初筛出生殖功能障碍男性与正常男性精浆中表达差异明显的一组miRNA；(3)将抽提的RNA逆转录为cDNA，采用荧光定量PCR(TaqMan探针法)方法进一步对初筛出的miRNA进行复筛和验证，挑选出稳定、特异表达的一组miRNA，进行临床价值评估。
本发明使用的检测方法可以选自：RT-PCR方法、Solexa测序技术(Solexasequencing technology)、Real-time PCR方法以及生物芯片方法中的一种或几种，这些方法是本领域技术人员熟知的方法，采用的试剂均可从商业途径得到。例如，精浆中miRNA分子的检测方法包括以下步骤：
(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取精浆总RNA；
(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA；
(3)根据人全部成熟体miRNA设计引物进行PCR反应；
(4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
(5)EB染色后在紫外灯下观察结果。
在所述步骤(5)之后还可以包括下列步骤：用TaqMan探针法检测并比较精浆样本相对于正常男性精浆中miRNA的量的变化。
本发明提供了一种用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的miRNA组合，其包括下列miRNA的组合：
| miRNA | 对应的核苷酸序列 | 序列编号 |
| miR-34c-5p | AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC | SEQ ID NO.1 |
| miR-181a | AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU | SEQ ID NO.2 |
| miR-374b | AUAUAAUACAACCUGCUAAGUG | SEQ ID NO.3 |
| miR-509-5p | UACUGCAGACAGUGGCAAUCA | SEQ ID NO.4 |
上述组合可以进一步包括以下三种miRNA：
| miRNA | 对应的核苷酸序列 | 序列编号 |
| miR-122 | UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG | SEQ ID NO.5 |
| miR-146-5p | UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU | SEQ ID NO.6 |
| miR-513a-5p | UUCACAGGGAGGUGUCAU | SEQ ID NO.7 |
本发明所述男性生殖功能障碍包括男性不育。具体而言，所述男性生殖功能障碍是生精功能障碍以及其他原因导致的男性不育，例如无精(非梗阻性)、少精或弱精。
本发明的有益效果：
本发明所述的miRNA组合可应用于男性生殖功能障碍的检测中，例如为男性生殖功能障碍补充新的检测指标、用于病程监测、预后和药效评价之中。本发明所提供的上述miRNA组合具有以下几个方面的有益效果：
首先，精浆相对其它组织较易获得，与睾丸活检或者睾丸穿刺相比，属于无创性检查，极大地方便了医疗人员的使用，减轻了患者的痛苦；
其次，精浆中的miRNA反映的是整个生精阶段的病理、生理情况，其检测结果具有临床指导意义；
第三，精浆miRNA检测能在分子水平上反映精子发生过程中基因转录后调控状态，提高了检测的准确水平，并为男性生殖功能障碍，尤其是生精功能障碍的治疗提供了潜在靶点。
综上所述，检测精浆中的特定miRNA，简单易行且效果优越，本发明从精浆miRNA的特异性变化这一新角度出发，发现疾病并且区分男性生殖功能障碍，从而建立起一种检测生精功能障碍的新技术并提供与男性生殖功能障碍相关的标志物。该技术仅仅需要病人的精浆而不需要任何其它组织，通过最精简的miRNA组合来检测特定miRNA的变化趋势，再通过该变化趋势监测男性生殖功能障碍发生的可能性，指导诊断和治疗。由此可见，检测精浆miRNA水平能拓展男性生殖功能障碍，例如睾丸生精功能的诊断或监测指标，提高检测的灵敏度，丰富诊断男性生殖功能障碍的手段，这些精浆miRNA的水平有望成为诊断男性不育的重要标志物，具有极重要的临床应用潜力和价值。
附图说明
图1为本发明的主要流程图。
图2为TaqMan探针定量PCR方法的标准曲线。
图3为TaqMan探针定量PCR方法的重复性。
A.miRNA提取方法的重复性；B.定量PCR方法的重复性。
图4为筛选出的miRNA在少精患者与正常生育中的ROC曲线(A-D)。
图5为筛选出的miRNA在无精或弱精患者与正常生育中的ROC曲线。
A-G.无精症组与正常组；H-N.弱精症组与正常组；O-U.无精症组与弱精症组；
图6为几种常规生化指标包括锌、果糖、α-葡糖苷酶、酸性磷酸酶在不育患者与正常生育中的ROC曲线。
A-C.锌，其中A：无精症组与正常组；B：弱精症组与正常组；C：无精症组与弱精症组。
D-F.果糖，其中D：无精症组与正常组；E：弱精症组与正常组；F：无精症组与弱精症组。
G-I.α-葡糖苷酶，其中G：无精症组与正常组；H：弱精症组与正常组；I：无精症组与弱精症组。
J-L.酸性磷酸酶，其中J：无精症组与正常组；K：弱精症组与正常组；L：无精症组与弱精症组。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例中所用的引物、探针均为美国ABI公司的商业化产品。
实施例1：生殖功能障碍的特异miRNA表达谱筛选
(1)研究对象为结婚后未采取任何避孕措施2年以上不育男性(其配偶检查正常，本身无性功能障碍、精索静脉曲张，无心脑血管、恶性肿瘤、肝肾功能异常等疾病。患者年龄在24-34岁之间，病程1～7年)，以年龄匹配的已育不超过两年的男性为正常对照(精液质量正常，无全身性疾病，年龄在24-34岁之间)，所有受试者禁欲3～7天后留取精液，用WLJY-9000伟力彩色精子质量检测系统(北京伟力公司)进行精子质量和功能分析。分析标准均按世界卫生组织标准进行(“人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册[M]”(第4版)，世界卫生组织编，谷群等译，北京：人民卫生出版社，2001.5.1)。经精子分析将受试者分为以下4类：无精：精子密度＝0；少精：精子密度＜20×106/ml，a级精子＞25％或(a+b)级精子＞50％；弱精：精子密度＞20×106/ml，a级精子＜25％或(a+b)级精子＜50％；正常：精子密度＞20×106/ml，a级精子＞25％或(a+b)级精子＞50％。
精子分析后将精液1500g离心10min，再12,000g离心5min，收集精浆。
(2)收集非梗阻性无精(经重复精液质量检测或睾丸穿刺活检确诊)、弱精以及正常生育者精浆标本分别45例、58例和100例，三组中的标本分别混合，三组总体积均为120ml。分别提取三组混合精浆中的RNA，具体方案为：利用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，得到的上清液使用酚氯仿三步法进一步去除蛋白等杂质提纯RNA。
(3)对三组精浆总RNA进行Solexa测序分析。
具体方案为：Solexa测序法的基础是单分子克隆阵列技术，能够在整个基因组水平上区分单个碱基的差别，从而区分个体间的差异。先将接头连接到小分子RNA片段上，再经PCR扩增后制成库。随后在含有接头的芯片上加入已连接接头的小分子RNA，经反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被CCD采集，CCD快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。最后再比对序列，筛选出所要得到的miRNA的拷贝数。
(4)miRNA表达谱分析。
人类miRNA数据库(版本miRbase 12.0和Sanger data)中包含的miRNA共有692个，采用Solexa技术检测精浆中所有692个miRNA序列和拷贝数值，拷贝值反映各个miRNA的表达量。若拷贝数＝0表示精浆中没有该miRNA，拷贝数值越大，其相对的miRNA的表达量越多。
若miRNA在正常组中的拷贝数大于50，且在三组间的差异大于2.0倍，被认为变化明显，否则视为不变化。结果发现，在检测的692种miRNA中，共有19种符合该条件(详见表1)。无精组中14个miRNA拷贝数下降，5个上升；弱精组中7个下降，12个上升。
表1.Solexa测序初筛出的在不育患者精浆中变化明显的miRNA
实施例2：精浆中miRNA的RT-PCR实验
将表1中初筛出的miRNA，再进一步用定量PCR方法进行复筛和验证，筛选出表达差异显著的miRNA。
首先将提取的精浆总RNA反转录成cDNA。针对每一种miRNA，设计一个含相同茎环结构的基因特异性反向引物(ABI公司产品)，利用miRNA特异性反向引物进行逆转录，得到含共同茎环结构但属于特定miRNA的cDNA。
仪器使用的是ABI Prism 7300荧光定量PCR仪。
本实验以不同浓度人工合成的每种miRNA成熟体作标准曲线。人工合成的miRNA成熟体原液逆转录成cDNA，用DEPC水稀释成10fmol/L到105pmol/L之间的浓度梯度。miRNA的cDNA需单独逆转，反应体系为：2μl RNA、2μl 5×AMV缓冲液、1μl 10mmol各种dNTP混合物(Takara公司)、0.5μl AMV(Takara公司)以及1μl miRNA成熟体逆转录引物(美国ABI公司提供，专用于miRNA逆转录)，用3.5μl DEPC水补足体积至10μl。
用作标准曲线的miRNA成熟体荧光定量PCR反应体系：1μl cDNA、0.3μl Taq酶(Takara公司)、0.33μl TaqMan探针(由ABI公司提供，专用于miRNA荧光定量)、1.2μl 25mM MgCl2、0.4μl 2.5m M各种dNTP混合物(Takara公司产品)、2μl 10×PCR缓冲液以及14.77μl DEPC水。
待测标本中的每种miRNA检测时所采用的逆转录体系和荧光定量PCR反应体系同用作标准曲线的人工合成的miRNA成熟体，不过每种miRNA用各自特有的逆转录引物和TaqMan探针(由ABI公司提供)。数据处理方法为绝对定量法，即每次进行荧光定量PCR时，将所需检测的样本与标准曲线同时进行PCR扩增，扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值，然后根据标准品的浓度及每个浓度对应的Cq值绘制标准曲线(图2)(此标准曲线以合成的每种miRNA成熟体绘制的标准曲线；Cq值的计算是公知的；图中的R指代的是pearson相关系数，可以从侧面反映出所作直线的斜率，计算方式可以通过Excel绘制散点图并添加趋势线得到，也可通过其他常用统计软件如spss13.0，statistics6.0等计算)并根据此标准曲线及待测样本的Cq值计算出该样本所需测定的miRNA绝对含量。
评估所采用的定量PCR方法的重复性：1.miRNA提取方法的重复性：取20例正常人精浆，混合后分成相同的两份(每份500μl)，分别提取其总RNA，然后用定量PCR方法测定表达水平从低到高的16种miRNA(包括miR-1，miR-106b，miR-122，miR-128，miR-146b-5p，miR-181a，miR-193a-3p，miR-19b，miR-34c-5p，miR-374b，miR-495，miR-509-5p，miR-513a-5p，miR-532-5p，miR-890，miR-9)。这16种miRNA是随机选择的，包含表达量由低到高的三类miRNA，是为了说明提取各种浓度的miRNA都有较好的重复性。每种miRNA重复测定3次，取平均值。相关性分析显示，两份标本所测结果的相关系数(pearson’s系数)接近1(R2＝0.9692)(图3A)，提示miRNA提取方法重复性好。2.定量PCR方法的重复性：另取20例正常人精浆，混合后提取总RNA，将RNA分成相同的两份，然后用定量PCR方法测定上述16种miRNA。同样，每种miRNA重复3次，取平均值。相关性分析显示，两份RNA所测结果的相关系数接近1(R2＝0.9776)(图3B)，表明本发明所采用的定量PCR方法具有很好的重复性。
实施例3：定量PCR方法对初筛出的血清miRNA复筛
男性不育者共60例，其中非梗阻性无精症30例、弱精症30例，以年龄匹配的生育能力正常的男性24例作对照。患者和正常人的筛选标准同实施例1。测试者的临床信息见表2。用TaqMan定量PCR方法对受试者精浆标本进行逐个检测，从Solexa方法初筛出的19种miRNA中筛选出患者组与对照组之间表达差异显著的miRNA(具体步骤参见实施例2)。结果发现，初筛出的19种miRNA中有7种miRNA在患者组中表达量与对照组相比有显著差异(p＜0.01)，它们在无精组中均显著降低，而在弱精组中均明显升高，这7种miRNA是miR-34c-5p，miR-122，miR-146b-5p，miR-181a，miR-374b，miR-509-5p和miR-513a-5p(见表3)。
表2.复筛组和验证组所有受试者的临床信息
*数据以mean±SD表示.P1：无精vs正常；P2：弱精vs正常；P3：无精vs弱精；b：以two-sided x2test表示.
表3.定量PCR方法复筛出的miRNA*
*miRNAs浓度以mean±SEM(fM/L)表示.P1：无精组vs对照组；P2：弱精组vs对照组；P3：无精组vs弱精组.
实施例4：定量PCR方法对复筛出的精浆miRNA的临床验证
将复筛出的7种miRNA(包括miR-34c-5p，miR-122，miR-146b-5p，miR-181a，miR-374b，miR-509-5p和miR-513a-5p)进一步用定量PCR方法在大批量临床标本中进行验证，筛选出稳定的、表达差异显著的miRNA。临床研究的受试者无精者43例，弱精者49例，以正常44例作对照(患者和正常人的筛选标准同实施例1，详细临床信息见表2)。验证结果证实，复筛出的7种miRNA在两患者组中的变化趋势更加明显，即在无精组中显著降低，而在弱精组中明显升高(结果见表4)。这7种miRNA有助于无精和弱精的诊断。
此外，也测定了34例少精患者精浆中这些miRNA水平，发现除miR-122外，其他6种miRNA在少精者精浆中的浓度均低于正常对照，其中4种(包括miR-34c-5p、miR-181a、miR-374b和miR-509-5p)与正常对照组相比有显著差异(至少P＜0.05)，但降低幅度不如无精者(表5)，因此这4种miRNA有助于少精症的诊断。
表4.定量PCR方法对复筛出的miRNA进一步验证结果*
*miRNAs浓度以mean±SEM(fM/L)表示.P1：无精组vs对照组；P2：弱精组vs对照组；P3：无精组vs弱精组.
表5.定量PCR方法检测少精患者的结果*
*miRNAs浓度以mean±SEM(fM/L)表示.
实施例5：筛选出的miRNA临床价值评估
根据4种在少精患者精浆浓度显著降低的miRNA(包括miR-34c-5p、miR-181a、miR-374b和miR-509-5p)浓度绘制ROC曲线(图4)，并计算曲线下面积(AUC)(表6)以评估筛选出的miRNA对少精诊断的准确性。结果发现，这4种miRNA的AUC在0.628～0.721之间(见表6)。
将复筛组和验证组精浆标本综合起来(无精n＝73，弱精n＝79，正常n＝68)，根据每份标本精浆miRNA的浓度绘制ROC曲线(图5)并计算曲线下面积(AUC)(表7)以评估筛选出的miRNA对无精或弱精诊断的准确性。结果发现这7种miRNA的AUC在0.733～0.921之间(见表7)。
我们同时也对目前临床上常规精浆生化指标(包括锌、果糖、α-葡糖苷酶、酸性磷酸酶)的AUC进行了分析(图6)。这5种现有的生化指标AUC在0.510～0.622之间(见表8)。
通过比较可明显看出，我们所选择的miRNA对无精、弱精或少精诊断的准确性明显高于目前临床上所使用的生化指标。
表6.4种miRNA的ROC曲线下面积(AUC)(少精患者与对照组)
表7.7种miRNA的ROC曲线下面积(AUC)(无精或弱精组与对照组)
表8.几种常规生化指标的ROC曲线下面积(AUC)
参考文献：
1.Lian J，Zhang X，Tian H，Liang N，Wang Y，Liang C，et al.Altered microRNA expressionin patients with non-obstructive azoospermia.Reproductive Biology and Endocrinology2009；7：13.
2.Feng HL.Molecular biology ofmale infertility.Arch Androl 2003；49：19-27.
3.Huang S，Li H，Ding X，Xiong C.Presence and characterization of cell-free seminal RNAin healthy individuals：Implications for noninvasive disease diagnosis and gene expressionstudies ofthe male reproductive system.Clinical Chemistry 2009；55：1967-6.
4.Stark A，Bushati N，Jan CH，Kheradpour P，Hodges E，Brennecke J，et al.A single Hoxlocus in Drosophila produces functional microRNAs from opposite DNA strands.GenesDev 2008；22：8-13.
5.Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function.Cell2004；116：281-97.
6.Rosenfeld N，Aharonov R，Meiri E，Rosenwald S，Spector Y，Zepeniuk M，et al.MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin.Nat Biotechnol 2008；26：462-9.
7.He Z，Kokkinaki M，Pant D，Gallicano GI，Dym M.Small RNA molecules in theregulation of spermatogenesis.Reproduction 2009；137：901-11.
8.Yan N，Lu Y，Sun H，Qiu W，Tao D，Liu Y，et al.Microarray profiling of microRNAsexpressed in testis tissues ofdeveloping primates.J Assist Reprod Genet 2009；26：179-86.
9.Bouhallier F，Allioli N，Lavial F，Chalmel F，Perrard MH，Durand P，et al.Role ofmiR-34c microRNA in the late steps of spermatogenesis.RNA 2010；16：720-31.
10.Lian J，Zhang X，Tian H，Liang N，Wang Y，Liang C，et al.Altered microRNA expressionin patients with non-obstructive azoospermia.Reprod Bio Endocrin 2009；7：13.
Claims (3)
1.一种精浆微小核糖核酸组合在制备诊断或监测男性生殖功能障碍的试剂中的应用，所述的精浆微小核糖核酸组合包括下列miRNA：miR-34c-5p,miR-181a,miR-374b和miR-509-5p；所述的男性生殖功能障碍是指无精、少精和/或弱精；所述的miR-34c-5p的序列为SEQ ID NO.1，miR-181a的序列为SEQ ID NO.2，miR-374b的序列为SEQ ID NO.3，miR-509-5p的序列为SEQ ID NO.4。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于与无精或弱精相关的精浆微小核糖核酸组合为miR-34c-5p,miR-181a,miR-374b，miR-509-5p，miR-122,miR-146-5p和miR-513a-5p；所述的miR-122的序列为SEQ ID NO.5，miR-146-5p的序列为SEQ IDNO.6，miR-513a-5p的序列为SEQ ID NO.7。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于与少精相关的精浆微小核糖核酸组合为miR-34c-5p,miR-181a,miR-374b，miR-509-5p，miR-146-5p和miR-513a-5p；所述的miR-146-5p的序列为SEQ ID NO.6，miR-513a-5p的序列为SEQ ID NO.7。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110252889.9A CN102286625B (zh) | 2011-08-30 | 2011-08-30 | 一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110252889.9A CN102286625B (zh) | 2011-08-30 | 2011-08-30 | 一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102286625A CN102286625A (zh) | 2011-12-21 |
| CN102286625B true CN102286625B (zh) | 2014-06-18 |
Family
ID=45333380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110252889.9A Expired - Fee Related CN102286625B (zh) | 2011-08-30 | 2011-08-30 | 一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102286625B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104450707B (zh) * | 2014-12-25 | 2017-08-29 | 厦门大学 | 一种血清miRNA生物标志物的应用 |
| CN104450702B (zh) * | 2014-12-25 | 2017-08-29 | 厦门大学 | 一种血清miRNA生物标志物组合物与应用 |
| GB201504772D0 (en) * | 2015-03-20 | 2015-05-06 | Univ Aston | Preeclampsia |
| CN110760576B (zh) * | 2019-11-08 | 2021-07-09 | 河北医科大学第一医院 | 用于男性生育力诊断的试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101555518A (zh) * | 2008-04-10 | 2009-10-14 | 上海市肿瘤研究所 | 小核糖核酸及其应用 |
| EP2354246A1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-10 | febit holding GmbH | miRNA in the diagnosis of ovarian cancer |
-
2011
- 2011-08-30 CN CN201110252889.9A patent/CN102286625B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101555518A (zh) * | 2008-04-10 | 2009-10-14 | 上海市肿瘤研究所 | 小核糖核酸及其应用 |
| EP2354246A1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-10 | febit holding GmbH | miRNA in the diagnosis of ovarian cancer |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Patterns of microRNA expression in normal and early Alzheimer’s disease human temporal cortex: white matter versus gray matter;Wang-Xia Wang等;《Acta Neuropathol》;20101010;第121卷;193–205 * |
| Wang-Xia Wang等.Patterns of microRNA expression in normal and early Alzheimer’s disease human temporal cortex: white matter versus gray matter.《Acta Neuropathol》.2010,第121卷193–205. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102286625A (zh) | 2011-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20180127835A1 (en) | Gene expression signature for classification of tissue of origin of tumor samples | |
| CN102369294B (zh) | 非小细胞肺癌标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 | |
| CN101942502B (zh) | 胰腺癌标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 | |
| CN102333888B (zh) | 用于肿瘤样本起源组织分类的基因表达签名 | |
| US20150376704A1 (en) | Biomarker assay for diagnosis and classification of cardiovascular disease | |
| US20200157631A1 (en) | CIRCULATING miRNAs AS MARKERS FOR BREAST CANCER | |
| US20100178653A1 (en) | Gene expression signature for classification of cancers | |
| US8911940B2 (en) | Methods of assessing a risk of cancer progression | |
| CN101851682B (zh) | 一种用于检测食管鳞状细胞癌的微小核糖核酸组合及其应用 | |
| CN105483218A (zh) | 检测和/或预测男性生殖功能障碍的精浆piRNA标志物或其组合及其应用 | |
| CN102782151A (zh) | 作为用于前列腺癌诊断和分期的非侵入性标志物的循环miRNA | |
| CN101988061A (zh) | 乳腺癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 | |
| CN101988059A (zh) | 胃癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 | |
| CN105603101A (zh) | 检测8个miRNA表达量的系统在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用 | |
| CN102286625B (zh) | 一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合及其应用 | |
| CN101555519A (zh) | 一种基因芯片及其应用 | |
| CN106755343A (zh) | 胰腺癌预后诊断分子标记物 | |
| CN111424085B (zh) | tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用 | |
| CN101988062A (zh) | 宫颈癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 | |
| CN108300788A (zh) | 一种用于检测轻型脑外伤的微小核糖核酸组合及其应用 | |
| CN109563548A (zh) | 用于鉴定胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤的体外方法 | |
| CN108611417A (zh) | 一种用于膀胱癌诊断的特异性表达图谱及分析系统 | |
| CN116287252B (zh) | 长链非编码rna apcdd1l-dt在制备检测胰腺癌的产品中的应用 | |
| CN107988355A (zh) | 用于检测与有机磷农药相关的ⅱ型糖尿病易感基因试剂盒 | |
| US10011876B2 (en) | Method and system for prognosis and treatment of diseases using portfolio of genes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140618 Termination date: 20150830 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |