CN103372218A - 自身免疫性疾病相关的microRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及自身免疫性疾病相关的microRNA及其应用。具体地，本发明高通量microRNA芯片对患有自身免疫性疾病患者的炎症组织进行研究，在大量microRNA中，发现miR-23b在局部炎症组织中普遍下调。本发明进一步发现导入miR-23家族成员能抑制自身免疫性疾病的发生发展，所述家族成员包括miR-23a、miR-23b、和miR-23c；对于已经发病的自身免疫性疾病，导入miR-23家族成员能显著缓解疾病的症状和进程。本发明还发现细胞因子IL-17调控了miR-23b的表达；miR-23b以炎症因子信号通路上的TAB2和TAB3等基因为靶点；抑制TAB2和TAB3的表达可抑制自身免疫性疾病的发病和进展。

Description

自身免疫性疾病相关的microRNA及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体地，本发明涉及自身免疫性疾病相关的microRNA及其应用。
背景技术
自身免疫性疾病是一类机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，通常认为异常炎症反应发生在由各类自身免疫性疾病引发的组织损伤处，如风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)，多发性硬化症(multiplesclerosis，MS)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)。RA的主要特征为滑膜炎症伴随有关节骨和软骨损伤，MS是以中枢神经系统的脱髓鞘现象为特征的一种炎症病变，SLE是一种由免疫复合物沉积。免疫系统慢性激活造成多系统自身免疫性疾病，并常常伴随有肾炎的发生。胶原诱导的类风湿性关节炎(collagen-induce arthritis，CIA)和实验性变态反应性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是由自身抗原诱导产生自身免疫性疾病的小鼠模型，分别对应于RA和MS。而MRL/lpr小鼠则是一种可以自发产生SLE的小鼠模型。
microRNA(miR或miRNA，微小RNA)是一类在较高等的真核生物体内广泛存在的，长度约18-26个碱基的单链RNA分子。它可以通过碱基配对原则特异性地与一些mRNA上的靶位点相结合，引起靶mRNA降解或翻译抑制，进而在转录后水平对靶基因进行调控。
microRNA来源于长度约1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60-80nt的具有茎环结构的miRNA前体。前提miRNA转运至胞质后，被进一步切割成长约18-26nt的双链miRNA。双链miRNA解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其表达。
尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地对所有具有靶位点的mRNA产生调控作用，microRNA在生物体的发育乃至肿瘤的发生、发展过程所起的作用不可小视。
迄今为止，本领域对于自身免疫性疾病与microRNA关系了解甚少，尽管一些miRNA，如miR-155，miR-146a和miR-326主要通过影响T细胞功能调节自身免疫性疾病的发病情况，但原位细胞中的miRNA是怎样在自身免疫性疾病中发挥功能还不很清楚。因此本领域迫切需要对自身免疫性疾病相关的microRNA及其调节网络进行研究。
发明内容
本发明的目的就是提供一类自身免疫性疾病相关的microRNA及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的选自下组的一种或多种活性成分：
(a)miRNA-23家族的微小RNA，所述miRNA-23家族的微小RNA包括：miRNA-23或经修饰的miRNA-23衍生物、和核心序列为UCACAUU、长度为18-26nt、功能与miRNA-23b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的微小RNA；
(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；
(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的微小RNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；
(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂。
在另一优选例中，所述的miRNA-23b为miRNA-23b-3p。
在另一优选例中，(a)中所述的核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列；和/或所述的“功能与miRNA-23b相同或基本相同”是指保留了miRNA-23b-3p的≥40%，且≤500%的抑制自身免疫的功能。
在另一优选例中，所述的抑制自身免疫是指抑制炎症因子介导的信号通路和基因表达。
在另一优选例中，所述的微小RNA来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠。
在另一优选例中，(a)中所述的所述的核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列。
在另一优选例中，(a)中所述的“功能与miRNA-23b相同或基本相同”是指保留了miRNA-23b-3p的≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%、≥100%，且≤500%的抑制自身免疫的功能。
在另一优选例中，(b)中所述的宿主为：人或啮齿动物(如大鼠、小鼠)。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物还有选自下组的miRNA：miRNA-23a-5p和miRNA-23b-5p。
在另一优选例中，(b)中所述的前体miRNA中还含有对应于选自下组的miRNA的序列：miRNA-23a-5p和miRNA-23b-5p。
在另一优选例中，所述的miRNA-23为选自下组的miRNA：miRNA-23a-3p、miRNA-23b-3p、miRNA-23c、miRNA-23a-5p、或miRNA-23b-5p。
在另一优选例中，所述的miRNA-23为选自下组的miRNA：miRNA-23a-3p、miRNA-23b-3p、或miRNA-23c。
在另一优选例中，(a)中所述的miRNA-23包括序列如SEQ ID NO.:1所示的miRNA-23a-3p、如SEQ ID NO.:2所示的miRNA-23b-3p、或如SEQ ID NO.:3所示的miRNA-23c。
在另一优选例中，所述的经修饰的miRNA衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰形式：核苷酸的糖基修饰；核苷酸之间连接方式的修饰，胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。
在另一优选例中，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-O-甲基的糖基修饰、2-O-甲氧乙酯的糖基修饰、2-O-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/或所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或所述的核酸修饰包括“TT”修饰。
在另一优选例中，(a)中所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：
(X)n-(Y)m              式I
在式I中，
各X为(a)中所述的微小RNA；
各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；
n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；
m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；
各“-”表示接头、化学键、或共价键。
在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。
在另一优选例中，所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。
在另一优选例中，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式II
式II中，Seq正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：
Figure BDA00003076580500031
式III，
式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在另一优选例中，所述miRNA-23的激动剂选自下组：促进miRNA-23表达的物质、提高miRNA-23活性的物质、抑制IL-17表达的物质、抑制IL-17活性的物质。
在另一优选例中，抑制IL-17活性的物质包括抗IL-17的抗体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。
在另一优选例中，(d)中所述的表达载体包括：病毒载体和非病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒载体为：腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、或慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的非病毒载体为：质粒或细菌。
在另一优选例中，所述的前体miRNA的序列如SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:5、或SEQ ID NO.:6所示。
在另一优选例中，所述药物组合物用于治疗自身免疫反应疾病。
在本发明的第二方面，提供了一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组：(a)miRNA-23家族的微小RNA，所述miRNA-23家族的微小RNA包括：miRNA-23或经修饰的miRNA-23衍生物、和核心序列为UCACAUU、长度为18-26nt、功能与miRNA-23b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的微小RNA；(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的微小RNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂；所述活性成分用于制备抑制自身免疫反应的抑制剂、制备预防或治疗自身免疫反应疾病的药物。
在另一优选例中，所述的自身免疫反应疾病选自下组：类风湿性关节炎、多发性脑脊髓硬化症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、牛皮癣、硬皮病、慢性溃疡性肠炎、慢性萎缩性胃炎、慢性淋巴性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病、干燥综合征。
在本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗自身免疫反应疾病的方法，给需要的对象施用本发明第一方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的对象包括人。
在本发明的第四方面，提供了一种miRNA-23拮抗剂的用途，用于制备上调自身免疫反应的调节剂。
在另一优选例中，所述的miRNA-23为miRNA-23b-3p。
在本发明的第五方面，提供了一种筛选用于抑制自身免疫的活性成分的方法，包括步骤：
(a)将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miRNA-23的表达水平；
(b)将测试组的miRNA-23与对照组的miRNA-23的表达水平进行比较，所述对照组中未施用所述候选物质；
其中，当测试组的miRNA-23的表达水平显著高于对照组的miRNA-23的表达水平时，则表明该候选物质是抑制自身免疫的活性成分。
在另一优选例中，所述的“显著高于”是指测试组的miRNA-23的表达水平是对照组的miRNA-23的表达水平1.5倍以上(如1.5-5倍，较佳地1.5-3倍)。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(c)：对步骤(b)中获得的抑制自身免疫的活性成分，进一步测定其对炎症因子介导的信号通路或基因表达的抑制作用。
在本发明的第六方面，提供了一种TAB2或TAB3抑制剂的应用，用于制备抑制自身免疫反应疾病的药物。
在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病选自下组：类风湿性关节炎、多发性脑脊髓硬化症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、牛皮癣、硬皮病、慢性溃疡性肠炎、慢性萎缩性胃炎、慢性淋巴性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病、干燥综合征。
在本发明的第七方面，提供了一种检测自身免疫反应疾病的方法，包括步骤：分别检测待测样本和阴性对照样本miR-23b的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-23b的表达水平降低，则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：分别检测待测样本和阴性对照样本miR-30a、和/或miR-146a、和/或miR-214的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-30a的表达水平降低，和/或miR-146a的表达水平提高、和/或miR-214的表达水平提高，则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病选自下组：类风湿性关节炎、多发性脑脊髓硬化症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病、慢性溃疡性肠炎、慢性萎缩性胃炎、慢性淋巴性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病、干燥综合征。
在另一优选例中，所述的降低是指：与阴性对照样本相比，相应miRNA的表达水平的降低幅度≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。
在另一优选例中，所述的提高是指：与阴性对照样本相比，相应miRNA的表达水平的提高幅度≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。
在另一优选例中，所述的自身免疫反应疾病为选自下组的一种或多种：风湿性关节炎、多发性硬化症、或系统性红斑狼疮。
在本发明的第八方面，提供了微小RNA即miR-23b的用途，它被用于制备检测自身免疫反应疾病的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，上述的试剂是芯片、引物、或探针。
在另一优选例中，上述的试剂盒包括使用说明。较佳地，所述使用说明包括对步骤的描述：分别检测待测样本和阴性对照样本miR-23b的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-23b的表达水平降低，则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
在另一优选例中，所述的miR-23b为miRNA-23b-3p。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1表明miR-23b-3p在自身免疫性疾病局部炎症组织中的表达普遍下调；其中，图1a显示了在人类自身免疫性疾病以及相关小鼠自身免疫性疾病模型的炎症组织中筛选到的上调表达前15位和下调表达前15位的miRNA：包括比较四例类风湿性关节炎患者与两例骨关节炎患者和两例正常人(意外受伤)的关节滑膜组织、比较两份胶原诱导的关节炎(CIA)的小鼠样本与两份未处理的对照小鼠样本(每份样本混合了六只小鼠的关节组织)、比较八例新经确诊患有狼疮性肾炎且尚未治疗的红斑狼疮患者的肾脏活检标本同四例肾癌患者的癌旁组织、比较两份MRL/lpr小鼠(每份样本混合了六只小鼠的肾脏组织)和两份正常小鼠样本(每份样本混合了三只小鼠的肾脏组织)以及两份MOG免疫16天的实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)小鼠同两份未处理的对照小鼠样本(每份样本混合了四只小鼠的脊髓组织)；图1b显示了筛选在自身免疫性疾病的炎症组织中普遍调控的microRNA的流程，列出了两个普遍上调的microRNA和两个普遍下调的microRNA。图1c显示，类风湿性关节炎患者(以骨关节炎患者及外伤患者为正常对照)的关节滑膜组织中，类风湿性关节炎患者炎症组织中的miR-23b-3p的表达显著下调；图1d显示，在红斑狼疮患者的肾组织活检标本(以肾癌患者的癌旁肾组织为正常对照)，红斑狼疮患者炎症组织中的miR-23b-3p的表达显著下调；图1e-显示，在II型胶原免疫的DBA/1小鼠关节(混合6只小鼠关节样本)miR-23b的表达显著下调；中图1f显示，在10周龄及40周龄MRL/lpr小鼠肾组织混合样本miR-23b-3p的表达显著下调(图1f)、图1g显示六只MOG免疫14天或28天的C57BL/6小鼠的脊髓混合样本中的miR-23b的表达显著下调。
图2显示IL-17介导了炎症性自身免疫性疾病中miR-23b-3p的下调；其中，图2a显示在类风湿性关节炎患者、骨关节炎患者和正常对照组(意外受伤)的关节滑膜组织中，miR-23b-3p表达同IL-17的表达呈现负相关；图2b显示在红斑狼疮患者的肾脏活检标本以及肾癌患者的癌旁组织中，miR-23b-3p表达同IL-17的表达呈现负相关；图2c显示类风湿性关节炎患者的滑膜组织中炎症因子的表达水平提高，其中样本来自于17例类风湿性关节炎患者，19例骨关节炎患者和3例正常人对照(意外受伤)的关节滑膜组织；图2d显示红斑狼疮患者的肾脏组织中炎症因子的表达水平提高，其中样本来自于18例红斑狼疮患者的肾脏活检样本和9例肾脏肿瘤患者的癌旁组织对照样本；图2e和图2f显示，IL-17的刺激下调miR-23b-3p的表达，检测人类原代成纤维样滑膜细胞(图2e)和小鼠原代培养的肾脏细胞(图2f)，在分别接受人或小鼠重组TNFα(10ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)、IL-17(50ng/ml)、IL-6(20ng/ml)和IFNI(50ng/ml)刺激后的miR-23b水平；图2g显示IL-17通过NF-κB调节miR-23的表达，分别检测WT、Act1-/-和IIII-/-小鼠胚胎成纤维细胞在IL-17(50ng/ml)刺激后的miR-23b-3p水平；图2h显示IL-17可以在体内调节miR-23b-3p表达，分别检测感染了表达IL-17(Ad-IL-17)的腺病毒和感染了携带空载体(Ad-EV)的腺病毒的小鼠关节中miR-23b水平，用qPCR检测IL-17和IC(cxcl1)的表达水平做为阳性对照。
图3显示miR-23家族能抑制炎症因子介导的信号以及基因表达；其中，图3a显示在各个特定时间点给予转染了miR-23b-3p模拟物和模拟物对照的HeLa细胞空白(Mock)、IL-17(50ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)刺激、收集细胞裂解物进行免疫印迹分析，用抗p-IIBI、IIBI、p-p65、p-p38、TAB2、TAB3和I-actin的抗体进行检测，表明miR-23b-3p能抑制炎症因子介导的信号；图3b显示用miR-23b-3p模拟物和模拟物对照转染HeLa细胞，在各个特定时间点给予空白(Mock)、IL-17(50ng/ml)、TNFα(10ng/ml)和IL-1β(10ng/ml)刺激，EMSA实验验证miR-23b-3p抑制NF-κB的活化的功能；图3c-图3e显示在原代成纤维样滑膜细胞(图3c)、原代肾上皮细胞(图3d)、原代星形胶质细胞(图3e)中转染miR-23b-3p模拟物，miR-23b-3p抑制物及其模拟物对照，分别单独或联合使用IL-17(50ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)刺激6小时，参考管家基因Rpl13a进行标准化，检测IC和IL-6的表达；数据整合了四次(图3c)或三次(图3d，图3e)相对独立实验，结果显示miR-23b-3p抑制炎症因子介导的基因表达；图3f显示在原代肾上皮细胞转染miR-23a-3p模拟物及其模拟物对照，分别单独或联合使用IL-17(50ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)刺激6小时，参考管家基因Rpl13a进行归一化，检测IC和IL-6的表达。
图4显示miR-23家族在小鼠模型中可以抑制自身免疫性疾病的发病；其中，图4a显示miR-23b-3p抑制CIA发病，分别在DBA/1小鼠的关节内注射对照组空载腺病毒(Ad-EV)、携带编码miR-23b的腺病毒(Ad-23b)、携带编码miR-23b-3p吸附物的腺病毒(Ad-sponge)以及携带同时编码miR-23b及其吸附物的腺病毒(Ad-23b+Ad-sponge)，在图中所标明的时间点应用II型胶原诱导小鼠关节炎，进行平均临床评分(±标准差)和发病率的计算。图4b显示，在第二次免疫后80天将图3a中小鼠进行后爪micro-CT扫描，结果表明miR-23b-3p的表达抑制了CIA发病中的骨损伤，而miR-23b-3p吸附物则促进了CIA发病中的骨损伤。图4c和图4d显示miR-23b-3p能抑制小鼠自发的狼疮肾炎，在MRL/lpr小鼠6～24周龄期间每三周静脉注射空载腺病毒(Ad-EV)，携带编码miR-23b的腺病毒(Ad-23b)和携带编码miR-23b-3p吸附物的腺病毒(Ad-sp)，24周龄的MRL小鼠注射Ad-EV作为对照，处理组小鼠肾脏组织的损伤程度按照实验方法中的标准进行分级(图3c)；图4d显示，取图4c中处理过的24周龄的小鼠制作H&E染色的肾脏切片，可以看到肾小球细胞增生(上排、中排)和外周单核细胞浸润裂隙(下排)；图4e显示肾脏局部炎症因子的诱导在接受Ad-23b腺病毒的小鼠中受到显著抑制。图4f显示miR-23b-3p抑制EAE发病，分别对c57小鼠尾静脉注射不同腺病毒，包括对照组空载腺病毒(Ad-EV)、携带编码miR-23b-3p的腺病毒(Ad-23b)、携带编码miR-23b-3p吸附物的腺病毒(Ad-sp)以及携带同时编码miR-23b-3p及其吸附物的腺病毒(Ad-23b+sp)，在图中所标明的时间点应用MOG诱导小鼠EAE发病，进行EAE临床评分、并计算其发病率。图4g显示miR-23a-3p抑制EAE发病，分别对c57小鼠尾静脉注射对照组空载(Ad-EV)，携带编码miR-23a的病毒(Ad-23a)，在图中所标明的时间点应用MOG诱导小鼠EAE发病，进行EAE临床评分、并计算其发病率。
图5显示miR-23家族可以有效治疗自身免疫疾病；其中，图5a显示miR-23b-3p可以有效治疗CIA，二型胶原一次免疫后25天/二次免疫后4天起，待DBA/1小鼠开始发病后，每隔两周关节内注射50nM/只的Agomir-miR-23b-3p及对照，共注射3次，每5天进行关节炎评分(±s.e.m.)，*P<0.05；图5b显示miR-23b-3p可以有效治疗EAE，MOG免疫c57小鼠发病后，于11天和15天尾静脉注射100nM/只的Agomir-miR-23b-3p及对照，共注射2次，每天进行脑脊髓炎评分(±s.e.m.)。
图6显示miR-23b-3p控制炎症因子通路中的多个基因；其中，图6a显示通过基因芯片比较分析转染了miR-23b-3p模拟物与转染了模拟物对照的人原代成纤维样滑膜细胞(FLS)的差异表达基因以及联合TargetScan生物信息学分析，找到的由miR-23b-3p调控的11个可能的与炎性反应相关的基因，Rpl13a作为阴性对照，渐变色和数字表示11个基因在转染了miR-23b-3p模拟物和转染了模拟物对照的FLS细胞中的相对表达水平；图6b显示特定的3'UTR报告质粒转染到293T细胞中，分别转染miR-23b-3p或者对照模拟物(NC)，荧光素酶活性检测的结果，结果表明转染miR-23b-3p下调了IIIα、TAB2和TAB3的表达，说明IIIα、TAB2和TAB3是miR-23b-3p作用的目标基因；图6c显示用野生型(wt UTR)或者点突变的3'UTR(mut UTR)报告质粒转染293T，转入miR-23b-3p或者对照模拟物(NC)，检测荧光素酶活性的结果；图6d显示，miR-23b-3p可以降低其作用基因的蛋白水平，检测未转染以及转染了对照mimic和miR-23b-3p的原代成纤维样滑膜细胞(FLS)和293细胞中内源TAB2，TAB3和IIIα水平，β-actin是内参，s代表短曝光，l代表长曝光。
图7显示在自身免疫性疾病中，TAB2和TAB3是miR-23b-3p的作用靶点；其中，图7a显示免疫印迹方法检测正常人、骨关节炎患者、类风湿性关节炎患者的关节滑膜中TAB3、TAB2和IIIα的蛋白表达水平，以β-actin做为内参；图7b显示了在上述样品中miR-23b-3p的水平与TAB3、TAB2和IIIα的蛋白表达水平呈现负相关；图Ic显示免疫印迹方法检测红斑狼疮患者及其对照组的肾脏标本中TAB3，TAB2和IIIα表达水平，以β-actin做为内参；图7d显示了在上述样品中miR-23b-3p的水平与TAB3、TAB2和IIIα的蛋白表达水平呈现负相关；图7e-g应用免疫印迹法显示TAB2，TAB3和IIIα的表达水平在自身免疫性疾病小鼠模性的原位炎症组织中上调，包括比较这三种蛋白在II型胶原免疫30周后的DBA/1小鼠以及未处理对照组小鼠关节组织中的表达(图7e)，比较这三种蛋白在10周龄，40周龄MRL/lpr以及对照MRL小鼠肾脏组织中的表达(图7f)、比较这三种蛋白在MOG免疫14天后以及未处理对照小鼠的脊髓中的表达(图7g)，这些结果显示作为miR-23b-3p的作用靶点、这三种蛋白在人和小鼠的炎症组织中都显著上调了。
图8显示抑制TAB2和TAB3的表达可以抑制自身免疫疾病的发生发展；其中，图8a显示筛选TAB2和TAB3的siRNA序列；图8b显示应用shRNA降低TAB2和TAB3表达水平的效果；图8c和图8d显示降低TAB2和TAB3的表达水平能抑制CIA发病：图8c表明在II型胶原免疫的DBA/1小鼠体内，在箭头所指的时间静脉注射慢病毒介导的同时敲低TAB2和TAB3表达的shRNA(LV-shTAB2/3)以及对照shRNA(LV-shNC)，评估关节炎发病的平均临床评分(±标准差)以及发病率；图8d显示第二次免疫完成后50天取踝部切片进行H&E染色结果；图8e显示重新表达TAB2和TAB3可以逆转miR-23b-3p抑制炎症因子基因表达的作用；在人原代成纤维样滑膜细胞(FLS)中转染miR-23结合位点突变的TAB2和TAB3质粒或空质粒，再用空的或者编码miR-23b的腺病毒感染细胞，用TNFα(10ng/ml)加上IL-17(50ng/ml)刺激6小时。qPCR检测IC和IL-6的基因表达，参考管家基因Rpl13a进行标准化；图8f显示重新表达TAB2和TAB3逆转了miR-23b-3p在CIA进程中的抑制作用；在II型胶原免疫的DBA/1小鼠体内静脉注射携带miR-23b的腺病毒(Ad-miR-23b)或者携带对照质粒的腺病毒(Ad-EV)以及编码TAB2、TAB3但miR-23b结合位点突变质粒(LV-TAB2，LV-TAB3)或者对照质粒(LV-EV)的慢病毒，对关节炎的进程进行平均临床评分(±标准差)和发病率的评估。注射的过程是分几次完成的，如箭头所示时间。
图9显示了制备过表达miR-23b的腺病毒或者制备过表达miR-23b-3p吸附物的腺病毒的方法和效果。图9a显示制备过表达miR-23b的腺病毒(Ad-miR-23b)或者制备过表达miR-23b-3p吸附物的腺病毒(Ad-miR-23-sponge)的示意图，Ad-miR-23b应用的包含mmu-miR-23b的序列如实验方法中所述；miR-23b-3p吸附物的单个片段的序列如图9a所示。图9b显示用GFP报告荧光显示含有空质粒的腺病毒(Ad-EV)，含有编码miR-23b的腺病毒(Ad-miR-23b)以及含有编码miR-23b-3p吸附物的腺病毒(Ad-miR-23-sponge)在小鼠B16黑色素瘤细胞中的感染效率接近100%。图9c和图9d显示检测在关节内注射后(图9c)或者静脉注射后(图9d)特定组织内miR-23b-3p的表达，MicroRNA水平参考snoRNA202的表达进行了标准化；图9e显示用含有miR-23b-3p结合位点的荧光素酶报告质粒(miR-23breporter)检测miR-23b-3p过表达或抑制对其作用位点的抑制以及去抑制的作用效率。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，在大量microRNA中，发现miR-23b在局部炎症组织中普遍下调。本发明进一步发现导入miR-23家族成员能抑制自身免疫性疾病的发生发展，所述家族成员包括miR-23a、miR-23b、和miR-23c；对于已经发病的自身免疫性疾病，导入miR-23家族成员能显著缓解疾病的症状和进程。本发明还发现细胞因子IL-17调控了miR-23b的表达；miR-23b以炎症因子信号通路上的TAB2和TAB3等基因为靶点；抑制TAB2和TAB3的表达可抑制自身免疫性疾病的发病和进展。在此基础上完成了本发明。
miRNA及其前体
本发明提供了一类涉及自身免疫相关的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的miRNA是指：miRNA-23家族的微小RNA，所述miRNA-23家族的微小RNA包括：miRNA-23或经修饰的miRNA-23衍生物、和核心序列为UCACAUU、长度为18-26nt、功能与miRNA-23b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物。
在本发明的一个优选例中，miRNA-23家族包括：miRNA-23b、miRNA-23a、和miRNA-23c；较佳地，miRNA-23b的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示；miRNA-23a的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；miRNA-23c的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中，所述的微小RNA来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠，鼠和人的23家族序列完全一致。核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列。所述的“功能与miRNA-23b相同或基本相同”是指保留了miRNA-23b-3p的≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%的抑制自身免疫的功能。
本发明还包括miRNA变体和衍生物。此外，广义上的miRNA衍生物也可包括miRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA-23进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。
本发明所述的miRNA还包括：miR-30a、miR-146a、miR-214及其变体和衍生物。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式II
式II中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA-23的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：
式III
式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或有效量的选自下组的一种或多种活性成分：(a)miRNA-23家族的微小RNA，所述miRNA-23家族的微小RNA包括：miRNA-23或经修饰的miRNA-23衍生物、和核心序列为UCACAUU、长度为18-26nt、功能与miRNA-23b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的微小RNA；(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的微小RNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂。在本发明的另一优选例中，所述的药物药物组合物还包括TAB2或TAB3抑制剂。
在本发明的另一优选例中，所述的miRNA-23来源于人或非人哺乳动物。人源和属源的miRNA-2核苷酸序列完全一致。所述的miRNA-23为序列选自下组的miRNA：SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、或SEQ ID NO.:3。
在本发明的另一优选例中，所述的经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：
(X)n-(Y)m               式I
在式I中，各X为(a)中所述的微小RNA；各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；各“-”表示接头、化学键、或共价键；在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。
在本发明的另一优选例中，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式II
式II中，Seq正向为能在宿主中被加工成miRNA-23的核苷酸序列；Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：
式III，
式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在本发明的另一优选例中，所述的前体miRNA的序列如SEQ ID NO.:4、SEQ IDNO.:5、或SEQ ID NO.:6所示，更佳地，如SEQ ID NO.:5所示。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备抑制自身免疫反应的抑制剂、制备预防或治疗自身免疫反应疾病的药物。所述的自身免疫反应疾病选自下组：类风湿性关节炎、多发性脑脊髓硬化症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、牛皮癣、硬皮病、慢性溃疡性肠炎、慢性萎缩性胃炎、慢性淋巴性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病、干燥综合征。
诊断方法
本发明还提供了一种检测自身免疫反应疾病的方法。
在一个优选例中，包括步骤：分别检测待测样本和阴性对照样本miR-23b的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-23b的表达水平降低，则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。较佳地，所述的方法还包括步骤：分别检测待测样本和阴性对照样本miR-30a、和/或miR-146a、和/或miR-214的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-30a的表达水平降低，和/或miR-146a的表达水平提高、和/或miR-214的表达水平提高，则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
所述的自身免疫性疾病选自下组：类风湿性关节炎、多发性脑脊髓硬化症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病、慢性溃疡性肠炎、慢性萎缩性胃炎、慢性淋巴性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病、干燥综合征。
所述的降低是指：与阴性对照样本相比，相应miRNA的表达水平的降低幅度≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。所述的提高是指：与阴性对照样本相比，相应miRNA的表达水平的提高幅度≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明提供了局部炎症损伤中存在着一类普遍下调的miR-23b，导入miR23家族，包括miR-23a、miR-23b、和miR-23c，可以预防和治疗多种自身免疫性疾病；
(2)细胞因子IL-17与miR-23b的表达密切相关，miR-23可以同时抑制多种炎症因子信号通路上的相关基因，从而抑制各类自身免疫性疾病的发病。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
疾病患者标本
RA或者OA患者发生关节炎的关节组织标本是在关节整形手术中获得的，RA和OA的诊断参考美国风湿病学院(ACR)的标准；正常的关节组织样本来自于膝关节外伤的健康人；人原代成纤维样滑膜细胞(FLS)从上述RA和OA患者的关节滑膜组织中分离获得。
本发明搜集了18位SLE患者的狼疮性肾炎标本，同时获得9例肾癌患者癌旁组织做为对照，这些SLE患者涵盖了美国风湿病学院分类标准的各个类型。使用SLE临床活动性指数(SLEDAI)评定SLE的临床活动性，研究排除了并发感染的影响。
小鼠
C57BL/6、DBA/1J，MRL/MpJ和MRL/MpJ-Faslpr/J(MRL/lpr)小鼠购买自中国科学院上海斯莱克实验动物中心。所有小鼠均饲养于无特异性病原体(SPF)条件下。一切动物实验均遵循实验动物福利和使用标准，并得到上海生物科学学会(中国科学院)生物医学伦理委员会的批准。
MiRNA芯片和DNA芯片
总RNA使用TRIzol试剂(购于Invitrogen公司)抽提，应用Agilent2100生物分析仪评估质量，只有完整性大于8的样本才被采用。在miRNA表达实验中，通过Taqman低密度芯片v3.0(Applied Biosystems)检测了总计754个人类miRNA和641个小鼠miRNA，该实验在Applied Biosystems real-time仪上按照相关产品的操作步骤完成。检测转染miR-23b和对照细胞中各种mRNA的表达是通过Affymetrix 
Figure BDA00003076580500151
Human Genome U133Plus2.0Array完成的，后续结果由Agilent GeneSpringTM GX10芯片数据分析软件进行处理。
细胞培养
293T细胞、HeLa细胞、人类原代成纤维样滑膜细胞(FLS细胞)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、小鼠原代肾细胞等，购自美国ATCC或者使用本领域通用方法进行纯化，在含有10%(vol/vol)FBS(Hyclone)，100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DEM培养基中进行培养。
EAE诱导及评分
取6～8周龄的市售C57BL/6小鼠，在背部皮下注射含有300μg MOG(35-55)肽端的完全弗氏佐剂(CFA)(Difco)。在免疫当天以及48小时后在小鼠体内注射200μg溶于PBS之中的百日咳毒素。每天检查小鼠的发病情况，使用EAE的分级标准按照疾病严重程度进行评分：0级，没有临床特征；1级，尾部张力降低；2级，轻度瘫痪(虚弱，1～2后肢不完全瘫痪)；3级，下身瘫痪(双后肢完全瘫痪)；4级，后肢瘫痪伴随前肢虚弱或麻痹；5级：濒死状态或死亡。
CIA诱导及评分
取8～10周龄的市售C57BL/6小鼠，将100μg鸡II型胶原(购于Sigma-Aldich公司)乳化于CFA中，分别在第1天和第21天在小鼠尾根部选取几处进行皮内注射。再取8～10周龄的雄性DBA/1J小鼠，在第1天皮内注射100μg乳化于CFA中的鸡II型胶原，第21天注射乳化于不完全弗氏佐剂(IFA)(Difco)中的胶原。每2～5天检查关节炎症并按照以下标准进行评分：0级，正常无红肿现象；1级，踝关节内部轻度肿胀；2级，轻度肿胀，从踝部延伸到掌关节或跖关节；3级，中度肿胀，从踝部延伸至掌指关节或跖趾关节；4级，重度肿胀，从踝部延伸至指端或趾端，可见关节僵硬关节运动消失。4级为每只脚掌关节炎评分的最高级，每只小鼠的最高评分为16分。
组织化学以及肾脏形态学分析
用于组化分析的标本分别取自MOG免疫的C57小鼠、CII免疫的DBA小鼠或MRL/lpr小鼠，标本采集后立即用4%多聚甲醛固定。脊髓标本在石蜡包埋后制成5μm厚的切片进行苏木素-伊红(H&E)染色和Luxol坚牢蓝染色，在光学显微镜下进行观察。小鼠踝部标本首先在10%的甲酸水溶液中脱钙处理2周，再进行石蜡包埋，制成5μm厚的切片进行H&E染色。肾脏组织在石蜡包埋后制成2μm厚的切片进行坚牢蓝染色，再在光学显微镜下进行观察。肾脏形态参考通用的人类狼疮性肾炎的分类标准，根据小鼠肾脏的损伤程度将狼疮性肾炎分为0～3四个等级(正常、轻度、中度和重度)。从肾脏形态学角度上来说，小鼠狼疮性肾炎可以按照人类狼疮性肾炎根据活动性和严重程度分为0级到3级(分别表示正常，轻度，中度和重度)。每只小鼠至少选取10处包含有肾小球肾小管及其间质的视野并根据对肾小球细胞结构、淋巴细胞浸润情况、系膜基质伸展，新月体形成，皮质和髓质中单个核细胞浸润，透明沉积物等指标来计算每个视野下的评分情况，其中坏死与新月体形成的部分系数为2。
Micro-CT
使用GE Healthcare eXplore CT120MicroCT扫描仪对踝关节进行无损三维成像。使用中等分辨率(x,y,和z轴上均为43.5μm像素分辨率)扫描标本。在扫描过程中使用水、空气和标准骨做校正，使观察到的micro-CT图像拥有一致的灰度。扫描完每只小鼠的踝关节骨的图像后使用相关软件形成正中矢状切面图像。使用MicroView软件观察并分析microCT的结果。
腺病毒介导的基因表达
携带miR-23b或其吸附物的腺病毒的构建方法和效果如图9所示。具体来说，为了构建腺病毒载体(Ad-miR-23b)，将genome序列上，mmu-miR-23b的precursor序列及其前后各约100bp的序列(序列如SEQ ID NO.:7所示)通过酶切构建到pAdEasy vector(购自Qbiogen)质粒中，转染市售293A细胞来包装病毒。用PBS稀释至每毫升1010–1011个病毒，通过静脉或者关节内注射来感染小鼠。为了构建Ad-miR-23b-sponge，合成的7个重复吸附物序列(序列如SEQ ID NO.:8所示)：被构建到相同载体中。应用相同的原理和方法构建了Ad-miR-23a，Ad-miR-23a及Ad-IL-17。
MiRNA及其抑制物
MiR-23b-3p模拟物、miR-23a-3p模拟物和miR-23b-3p抑制剂(发夹形抑制物)购自Dharmacon公司(Thermo Fisher 
Figure BDA00003076580500161
c)。MiRNA模拟物是双链RNA寡聚核苷酸，而miRNA发夹形抑制物则是单链寡聚核苷酸。无论是发夹形抑制物，还是模拟物，均使用秀丽隐杆线虫中的cel-miR-67序列做为阴性对照，该序列已被证实同人类、小鼠和大鼠均有最低的序列同源性。
Ago-miRNA
Ago-miR-23a-3p、Ago-miR-23b-3p、Ago-miR-23c-3p为胆固醇修饰的microRNA，购自广州市锐博生物科技有限公司。这些RNA的序列分别如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:3所示，它们的修饰形式为：所有核苷酸的糖基经2-O-甲基化修饰，3'末端连接胆固醇，5'末端两个位点(核苷酸之间连接方式)经硫代磷酸(PS)修饰，3'末端4个位点PS修饰。
ELISA
使用IL-6和IC的ELISA试剂盒(购自R&D Systems公司)，按照说明书的方法检测血清中细胞因子和趋化因子的量。使用已知浓度的纯的重组小鼠细胞因子或趋化因子绘制标准曲线。
免疫印迹
细胞裂解物在电泳后被转印到PVDF膜上，分别用针对IIIα、TAB2、TAI1、p-IκBα、p-p65、p-p38(购自Cell Signaling)、TAB3(购自Abcam)、p-ERI、TRAF6、β-actin(购自Santa Cruz)、Flag(M2)(购自Sigma-Aldrich)，或HA(购自Covance)的抗体来进行检测。
慢病毒介导的基因表达和敲低
将小鼠体内编码TAB2和TAB3的序列克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1(购自Clontech公司)质粒上。用于敲低TAB2基因的两条序列为如SEQ ID NO.:9和SEQID NO.:10所示；用于敲低TAB3基因的两条序列如SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12所示。这些shRNA序列被克隆至市售的pLSLG慢病毒质粒。再分别将这些质粒和辅助质粒一起转染293FT细胞来包装病毒。转染60小时后收集病毒并浓缩，加入10μg/ml聚凝胺(Sigma-Aldrich)来感染细胞或小鼠。
Q-PCR
使用TRIzol(Invitrogen公司)试剂按照制造商说明的方法抽提细胞和小鼠组织中的总RNA。cDNA由PrimeScript RT reagent kit(Takara公司生产)得到。小鼠TNFα、IL-1β、IL-6、IFNγ、IL-17a、Il-17f、CXCL1、CXCL5、CCL2、CCL5、CCL20、GM-CSF、MMP3、MMP13、RANIL、S100A8、IκBζ、以及人TNFα、IL-1β、IL-6、IFNγ、IL-17a、IκBζ、p65、pri-miR-23b的表达水平由SYBR Premix ExTaqkit(Takara公司生产)进行定量实时PCR检测。所有的基因表达均参考管家基因Rpl13a的水平进行了标准化处理。cDNA的扩增在AbiPrism7900HT cycler(Applied Biosystems)上完成的的。使用Applied Biosystems公司的Taqman试剂盒检测成熟miR的表达。
凝胶迁移滞后实验(EMSA)
分别选取IC(cxcl1)和IP-10(cxcl10)基因上NF-κB的结合位点设计探针。合成5'端含有生物素标记的双链寡聚核苷酸(Takara公司合成)。核抽提物使用核抽提试剂盒(Active Motif)获得。使用Gelshift化学发光EMSA试剂盒(ActiveMotif)检测NF-κB的活化。
统计
在对两组监测数据进行统计学分析时选用双侧Student's t检验，在进行较复杂的比较时运用双因素方差分析，再用邦弗朗尼(Bonferroni)事后检验法进行分析。对于非参数统计数据的分析，使用Mann-Whitney检验。取P值为0.05或者更低做为判断结果显著性的标准。
实施例1自身免疫性疾病中miRNA-23b的表达普遍下调
为了确定在各类自身免疫性疾病的炎症损伤部位是否有某种普遍存在的miRNA发挥作用，本实施例取RA和SLE患者以及相关小鼠(CIA对应RA，MRL/lpr对应SLE，EAE对应MS)的炎症组织进行了比较miRNA芯片分析。人类miRNA芯片包含754个miRNA，检测样本包括RA患者以及对照组的滑膜组织，SLE患者及对照组的肾活检组织；小鼠miRNA芯片包括了641个miRNA，分别检测了CIA以及对照小鼠的关节样本，雌性MRL/lpr和对照小鼠的肾组织以及EAE和对照小鼠的脊髓标本。
检测结果如下：同对照组相比，在所有的自身免疫性疾病样本，包括RA、SLE、CIA、MRL/lpr和EAE中，miR-23b-3p(核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示)和miR-30a普遍下调，而miR-146a和miR-214则普遍上调，而miR-23b和miR-30a相比下调现象更为明显(图1a-1b)。因此选择miR-23b-3p来进行一步实施例。接下来对大批的RA、SLE患者以及对照组标本，CIA、MRL/lpr、EAE以及对照的小鼠样本进行了定量实时PCR(qPCR)的检测，结果确认了miR-23b-3p在自身免疫性疾病的炎症组织中普遍下调(图1c-1g)。
发明人同时还检测了miR-23家族其他成员，包括miR-23a-3p、miR-23c，在RA、SLE患者以及对照组标本，CIA、MRL/lpr、EAE以及对照的小鼠样本中的表达，结果显示miR-23a-3p(SEQ ID NO.:1)和miR-23c(SEQ ID NO.:3)在某些自身免疫性疾病的炎症组织中也呈现显著下调。
该实施例表明miR-23家族在自身免疫疾病的炎症组织呈现下调趋势。
实施例2IL-17下调miR-23b的表达
炎症性自身免疫性疾病有一个共同点是局部的慢性炎症，具体表现为炎症因子如TNFα、IL-1β的产生增加，两者在细胞培养中都可以调节miRNA的表达水平。MiR-23b-3p在RA和SLE患者的局部炎症组织中显著下降，而这些组织中的炎症因子包括TNFα、IL-1β、IL-17、IL-6和IFNγ则明显增加(图2c，2d)。
发明人将miR-23b-3p的转录水平和以上这些细胞因子进行线形相关分析，结果表明，miR-23b-3p的表达水平同IL-17水平成反向相关，无论是在RA患者及其对照组(P<0.001)，还是在SLE患者及其对照组(P<0.05)之间都是如此(图2a，2b)，提示炎症组织中IL-17的表达可能调控了miR-23b-3p的下调。
为了进一步确定miR-23b-3p和这些细胞因子之间的关系，发明人分别用TNFα、IL-1β、IL-17、IL-6和IFNγ刺激人原代成纤维样滑膜细胞(FLS)和小鼠原代肾脏细胞，然后对miR-23b-3p水平进行qPCR检测(图2e，2f)。结果表明，在两种细胞中，IL-17的刺激都显著下调了miR-23b-3p的表达。IL-17通过结合Act1和IκB激酶(III)复合物介导NF-κB的活化，发明人发现Act1或者IIIγ的缺失可以抵消IL-17对于miR-23b-3p的调控作用(图2g)，表明IL-17介导的NF-κB激活对于miR-23b-3p的调控非常重要。同原代细胞中得到的实验结果类似，体内实验中IL-17可以抑制小鼠关节miR-23b-3p的表达(图2h)。
以上结果表明，在自身免疫性疾病中IL-17可下调miR-23b-3p的表达。
实施例3MiR-23家族抑制炎症因子介导的信号通路和基因表达
炎症因子介导的NF-κB信号通路的激活在自身免疫性疾病的发病中起重要作用。发明人发现过表达miR-23b-3p显著抑制了TNFα和IL-1β介导的NF-κB的活化以及IL-17介导的NF-κB的活化(图3a，图3b)。接着，发明人在人FLS细胞(图3c)、小鼠原代肾细胞(图3d)和小鼠原代星形胶质细胞(图3e)中均发现miR-23b-3p模拟物可以抑制炎症因子(TNFα、IL-1β和IL-17)对其下游炎症基因如IC和IL-6的诱导表达，而miR-23b-3p抑制物则提高了这种作用。上述结果说明miR-23b-3p抑制了炎症因子介导的信号通路和基因表达。
发明人进一步检测了miR-23家族其他成员，包括miR-23a-3p、miR-23c对炎症因子介导的信号通路的抑制作用。结果表明，miR-23a-3p(图3f)和miR-23c也抑制了炎症因子(TNFα、IL-1β和IL-17)诱导的IC和IL-6的表达，说明miR-23家族具有抑制炎症因子介导的信号通路和基因表达的作用。
实施例4MiR-23家族抑制自身免疫性疾病的发生发展
上述实施例发现miR-23在各种自身免疫性疾病中普遍下调，miR-23的下调会导致促进炎症因子介导的信号通路和基因表达，从而加剧炎症反应。
首先，发明人发现导入miR-23b-3p可以显著抑制自身免疫性疾病的发生。发明人构建了携带miR-23b的腺病毒(Ad-23b)以及携带miR-23b-3p吸附物的腺病毒(Ad-sponge)，通过导入小鼠体内分别提高或降低miR-23b的水平。使用腺病毒将miR-23b或者它的吸附物转入小鼠体内，进一步诱导CIA，结果发现(图4a，4b)：小鼠踝部外源表达miR-23b显著减少了CIA的发病率、延迟了发病时间、减轻了病情严重程度以及骨损伤；而miR-23b吸附物则抵消了miR-23b过表达带来的抑制作用；单独注射表达miR-23b-3p吸附物的腺病毒则显著提升了CIA发病的严重程度和骨损伤。发明人使用腺病毒将miR-23b-3p或者它的吸附物转入MRL/lpr小鼠体内，结果发现(图4c-e)：过表达miR-23b-3p显著降低了MRL/lpr小鼠的肾损伤程度，而转入miR-23b-3p吸附物则增加了肾损伤，说明导入miR-23b-3p能抑制红斑狼疮的发病、缓解病情。发明人使用腺病毒将miR-23b或者它的吸附物转入小鼠体内，进一步诱导EAE，结果发现(图4f)：导入miR-23b-3p能显著延迟EAE发病时间，降低临床评分，而转入miR-23b-3p吸附物则加重EAE的病情。上述实验说明miR-23b-3p能显著预防和减缓自身免疫性疾病的发病和进程。
考虑到miR-23家族成员在序列上高度相似，进一步研究了miR-23家族的其它两个成员，miR-23a-3p和miR-23c对自身免疫性疾病的抑制作用。研究表明，应用腺病毒在小鼠体内导入miR-23a-3p能显著抑制EAE的发病、缓解病情(图4g)，导入miR-23a-3p也能抑制CIA、SLE的病情。研究表明导入miR-23c也能在小鼠模型上抑制多种自身免疫性疾病的发生和发展。
上述实验说明miR-23能预防自身免疫性疾病的发生发展。
实施例5MiR-23家族治疗自身免疫性疾病
本实施例中，发明人进一步研究了对于已经发病的自身免疫性疾病，导入miR-23家族是否能起到有效的治疗作用。
发明人首先发现miR-23b-3p具有治疗自身免疫性疾病的显著效果。如图5所示，诱导小鼠CIA和EAE发病后，导入Ago-miR-23b-3p能显著缓解病情。在自发红斑狼疮的MRL/lpr小鼠中导入携带miR-23b的腺病毒也能起到显著治疗作用(图4c-e)。
考虑到miR-23家族成员在序列上的高度相似性，发明人进一步研究了miR-23a-3p和miR-23c对CIA、EAE、红斑狼疮小鼠的治疗作用，结果表明miR-23a-3p和miR-23c对自身免疫性疾病也具有显著治疗作用。
本实施例表明miR-23家族成员对自身免疫性疾病有显著治疗效果。-
实施例6MiR-23b的靶基因存在于多种促炎因子信号通路中
为了确认miR-23b-3p可能的作用靶点，在本实施例中，发明人应用基因芯片表达分析过表达miR-23b-3p的FLS细胞中下调表达的基因，同时结合结合“targetscan”靶点预测软件(http://www.targetscan.org)和信号通路分析，找到可能受miR-23b-3p调控的11个炎症相关基因(图6a)。其中TAB3,IIIα和TAB2这三个基因的3'UTR报告活性受到了miR-23b-3p的显著抑制，而miR-23b-3p对于其它八个基因的3'UTR活性影响很小或是没有影响(图6b)。将TAB3,IIIα和TAB2三个基因的3'UTR进行突变，结果证实它们是miR-23b-3p的作用位点(图6c)。在原代FLS或293T细胞中过表达miR-23b-3p可以抑制内源TAB3、IIIα和TAB2的蛋白水平，这与报告基因分析的结果是一致的。
本实施例表明TAB3,IIIα和TAB2是miR-23b-3p的作用位点。
实施例7在自身免疫性疾病中，TAB2和TAB3是miR-23b的作用靶点。
为了验证在自身免疫性疾病中miR-23b-3p是否可以在体内靶向调节TAB2和TAB3的功能，发明人检测RA或者SLE患者体内TAB2和TAB3的表达水平。同正常或者OA患者的样本相比，RA患者滑膜组织内TAB2和TAB3的水平显著提高，而miR-23b-3p则显示出明显的下调，miR-23b-3p的另外一个作用靶点IIIα也在RA患者组织中升高(图7a，7b)。SLE患者标本中这些蛋白的水平同对照组相显著上升，而miR-23b-3p的水平显著下降(图7c，7d)。在自身免疫性疾病的小鼠模型中，TAB2、TAB3和IIIα的水平在CIA小鼠的关节，MRL/lpr小鼠的肾脏和EAE小鼠的脊髓中都比对照组小鼠有所增加，同miR-23b-3p的表达水平呈反向相关(图7e-g)。
本实施例表明在自身免疫性疾病的发病炎症组织中，TAB2和TAB3是miR-23b-3p的作用靶点。
实施例8抑制TAB2和TAB3的表达可以抑制自身免疫疾病的发生发展
为了研究TAB2和TAB3可能的生理功能，考虑到这两者的功能存在重叠，我们使用慢病毒表达shRNA来同时沉默TAB2和TAB3。我们在小鼠B16细胞中从一系列siRNA中筛选能够有效沉默TAB2和TAB3的siRNA。最后我们选择了siTAB2-4、siTAB2-5、siTAB3-1和siTAB3-3进行下一步的体内实验(图8a)。我们将可以同时表达抑制TAB2和TAB3的shRNA的慢病毒注射入小鼠的关节之中(图8b)。结果表明，尽管同miR-23b过表达的效果相比略显微弱，但敲低TAB2和TAB3还是显著抑制了CIA的发病程度(图8c)。H&E染色的结果显示无论是淋巴细胞的浸润还是骨损伤都有所减轻(图8d)。
为了进一步证明TAB2和TAB3是miR-23b-3p在自身免疫性疾病中发挥功能的靶点，我们设计了一个回复实验，在过表达miR-23b-3p的CIA小鼠模型中利用慢病毒表达缺少miR-23作用位点的TAB2和TAB3(图8e)。强制性表达的TAB2和TAB3显著的降低了miR-23b-3p对于CIA的抑制作用，说明TAB2和TAB3是miR-23b-3p在自身免疫性疾病中的重要作用靶点(图8f)。
本实施例表明TAB2和TAB3是miR-23b-3p在自身免疫性疾病中的重要作用靶点，抑制TAB2和TAB3的表达可以抑制自身免疫疾病的发生发展。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA00003076581400011

Claims (18)

1.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体和有效量的选自下组的一种或多种活性成分：
(a)miRNA-23家族的微小RNA，所述miRNA-23家族的微小RNA包括：miRNA-23或经修饰的miRNA-23衍生物、和核心序列为UCACAUU、长度为18-26nt、功能与miRNA-23b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的微小RNA；
(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；
(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的微小RNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；
(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(a)中所述的核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列；和/或所述的“功能与miRNA-23b相同或基本相同”是指保留了miRNA-23b-3p的≥40%，且≤500%的抑制自身免疫的功能。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(a)中所述的miRNA-23为选自下组的miRNA：miRNA-23a-3p、miRNA-23b-3p、miRNA-23c、miRNA-23a-5p、或miRNA-23b-5p。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(a)中所述的miRNA-23包括序列如SEQ ID NO.:1所示的miRNA-23a-3p、如SEQ ID NO.:2所示的miRNA-23b-3p、或如SEQ ID NO.:3所示的miRNA-23c。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的经修饰的miRNA衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰形式：核苷酸的糖基修饰、核苷酸之间连接方式的修饰、胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-O-甲基的糖基修饰、2-O-甲氧乙酯的糖基修饰、2-O-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/或
所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或
所述的核酸修饰包括“TT”修饰。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(b)所述的前体miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:5、或SEQ ID NO.:6所示。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式II
式II中，Seq正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：
Figure FDA00003076580400021
式III，
式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(d)中所述的表达载体包括：病毒载体和非病毒载体。
10.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(e)中所述miRNA-23的激动剂选自下组：促进miRNA-23表达的物质、提高miRNA-23活性的物质、抑制IL-17表达的物质、抑制IL-17活性的物质。
11.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。
12.一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组：
(a)miRNA-23家族的微小RNA，所述miRNA-23家族的微小RNA包括：miRNA-23或经修饰的miRNA-23衍生物、和核心序列为UCACAUU、长度为18-26nt、功能与miRNA-23b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的微小RNA；
(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；
(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的微小RNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；
(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂；
其特征在于，所述活性成分用于制备抑制自身免疫反应的抑制剂、制备预防或治疗自身免疫反应疾病的药物。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫反应疾病选自下组：类风湿性关节炎、多发性脑脊髓硬化症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、牛皮癣、硬皮病、慢性溃疡性肠炎、慢性萎缩性胃炎、慢性淋巴性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病、干燥综合征。
14.一种miRNA-23拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备上调自身免疫反应的调节剂。
15.一种筛选用于抑制自身免疫的活性成分的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miRNA-23的表达水平；
(b)将测试组的miRNA-23与对照组的miRNA-23的表达水平进行比较，所述对照组中未施用所述候选物质；
其中，当测试组的miRNA-23的表达水平显著高于对照组的miRNA-23的表达水平时，则表明该候选物质是抑制自身免疫的活性成分。
16.一种微小RNA即miR-23b的用途，其特征在于，用于制备检测自身免疫反应疾病的试剂或试剂盒。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，还包括步骤：分别检测待测样本和阴性对照样本miR-30a、和/或miR-146a、和/或miR-214的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-30a的表达水平降低，和/或miR-146a的表达水平提高、和/或miR-214的表达水平提高，则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
18.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫性疾病选自下组：类风湿性关节炎、多发性脑脊髓硬化症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病、慢性溃疡性肠炎、慢性萎缩性胃炎、慢性淋巴性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病、干燥综合征。
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