CN106492223A - microRNA‑34a‑5p抑制剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用 - Google Patents

microRNA‑34a‑5p抑制剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了microRNA‑34a‑5p抑制剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。免疫系统的紊乱和失衡是引起自身免疫病发生和发展的主要原因，而microRNA在免疫调节中发挥着重要作用。本发明提出microRNA‑34a‑5p抑制剂可以作为生物免疫抑制剂治疗类风湿关节炎。本发明涉及核酸干扰治疗方法对于类风湿关节炎的治疗价值，并且可以抑制体内的过度免疫活化状态，本发明的提出旨在为类风湿关节炎的生物治疗提供一条新途径。

Description

microRNA-34a-5p抑制剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的 应用
技术领域
本发明涉及一种新型的自身免疫性疾病的生物治疗方法，特别涉及microRNA-34a-5p抑制剂在类风湿关节炎治疗中的应用。本发明属于生物与新医药技术领域。
背景技术
自身免疫性疾病是指由于机体对自身抗原发生免疫应答而导致自身组织损害所引起的疾病。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的自身免疫性疾病，该病会导致进行性关节畸形和功能丧失，继发多系统并发症，减短患者寿命，同时给社会经济带来沉重的负担。近年来，随着多种新型生物制剂的出现，该类疾病得到更好的控制，但是仍然有一些难治性患者应用现在的治疗无效，此外，药物的不良反应也不可小觑，所以，进一步探索该类疾病的发病机制并且为患者提供新的治疗药物仍是一项重大任务。
免疫系统的紊乱和失衡是引起自身免疫病发生和发展的主要原因。Th1以及Th17效应性细胞及其分泌的细胞因子在多种自身免疫性疾病的发病以及疾病进展中发挥着重要作用，Th1细胞分泌的TNF-α以及Th17细胞分泌的IL-17A和IL-17F可以活化白细胞以及滑膜成纤维细胞、抑制调节性T细胞的功能、激活破骨细胞、介导软骨和骨的吸收。
微小RNA(microRNAs)是指长度为18-22个核苷酸的单链非编码内源性小RNA，是处于转录后水平的重要调节因子，可以通过与信使RNA的3’非翻译区(untranslated region，UTR)结合使其降解或者使其丧失翻译为蛋白的能力，从而发挥调节作用。
目前，对于microRNA-34a-5p(以下简称miR-34a-5p)在类风湿关节炎中的应用尚无报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的类风湿关节炎的生物治疗方法，为了达到该目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明利用miR-34a-5p与免疫应答紧密相关的特性，将其抑制剂应用到RA等自身免疫性疾病的治疗中，并应用动物模型验证了该治疗方法的可行性。
具体的，本发明的技术方案是，利用miR-34a-5p的免疫学作用，将其抑制剂应用于胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠的关节炎治疗。
首先，合成小鼠来源的miR-34a-5p抑制剂。然后，构建类风湿关节炎动物模型CIA关节炎小鼠模型，应用该抑制剂在造模后对小鼠进行治疗，从关节炎评分观察治疗的疗效，并分析该治疗对T淋巴细胞亚群分布、炎症性细胞因子的表达的影响。
在上述研究的基础上，本发明提出了miR-34a-5p抑制剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。
在本发明中，优选的，所述的miR-34a-5p抑制剂的核苷酸序列是：5’ACAACCAGCUAAGACACUGCCA3’(SEQ ID NO.1所示)。
在本发明中，优选的，可对所述的miR-34a-5p抑制剂进行修饰。
在本发明中，优选的，所述的修饰包括对miR-34a-5p抑制剂(SEQ ID NO.1所示)的全链进行甲基化修饰，同时在5'端和3'端分别有2个和4个碱基硫代修饰，并在3'端连接有高亲和性胆固醇修饰。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1.本发明所涉及的抑制物为经过胆固醇等分子修饰的小分子量的核酸序列，可以有效的减少RNA酶对该抑制物的降解，同时脂溶性的增强可以使其更容易进入到细胞内发挥作用，为类风湿关节炎的生物治疗提供了有效的方法，具有极大的社会和经济效益价值。
2.本发明中所涉及的miR-34a-5p抑制物能够延迟小鼠关节炎的发病，改善关节炎症状。
3.研究显示应用miR-34a-5p抑制物治疗类风湿关节炎能够广泛的降低免疫细胞的活化，减少病灶局部炎症性细胞因子的表达。
附图说明
图1为miR-34a-5p抑制剂的结构示意图；
图2为miR-34a-5p抑制剂可以延迟CIA小鼠的发病，改善关节炎症状；
图3为miR-34a-5p抑制剂可以降低CIA小鼠关节病灶局部炎症性细胞因子的表达；**p<0.01,***p<0.001；
图4为miR-34a-5p抑制剂可以减少CIA小鼠淋巴结各Th细胞亚群转录因子的表达；**p<0.01,***p<0.001,ns无统计学意义；
图5为miR-34a-5p抑制剂可以对CIA小鼠脾脏各Th细胞亚群产生抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例一 miR-34a-5p抑制剂的设计与合成
本发明中的miR-34a-5p抑制剂的核苷酸序列为：5’mAmCmAmAmCmCmAmGmCmUmAmAmGmAmCmAmCmUmGmCmCmA3’，其中m表示甲基化修饰，同时在5'端和3'端分别有2个和4个碱基硫代修饰，并在3'端连接有高亲和性胆固醇修饰。miR-34a-5p抑制剂的结构示意图如图1所示。
修饰后的miR-34a-5p抑制剂由生物公司进行合成。
实施例二 应用miR-34a-5p抑制剂对CIA小鼠的治疗效果
1、胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型的建立：
所有造模小鼠，第0天和21天于尾根部皮下注射100μg牛II型胶原。
2、miR-34a-5p抑制剂治疗CIA小鼠：
用100μl生理盐水溶解50nmol miR-34a-5p抑制剂，在造模第28、31、35、38、41天尾静脉注射，对照组CIA小鼠用100μl生理盐水溶解等量的无意义的抑制物对照物进行尾静脉注射作为参考。
3、CIA小鼠的关节炎评价：
CIA小鼠造模后每隔一天对CIA小鼠进行关节炎评分。评分采用双盲法，评分标准：
0分 正常；
1分 红肿涉及一个指关节；
2分 ≥2个指关节或整个足爪轻度红肿；
3分 整个足爪红肿较重；
4分 重度红肿，僵直，缺乏弹性。
4、结果
对照组以及治疗组的小鼠的关节炎评分结果如图2所示，从图2可以看出miR-34a-5p抑制剂可以延迟CIA小鼠的发病，改善关节炎症状。
实施例三 应用miR-34a-5p抑制剂对CIA小鼠滑膜的细胞因子、淋巴结的转录因子的表达以及外周免疫细胞亚群分布的影响
1、胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型的建立：
所有造模小鼠，第0天和21天于尾根部皮下注射100μg牛II型胶原。
2、miR-34a-5p抑制剂治疗CIA小鼠：
用100μl生理盐水溶解50nmol miR-34a-5p抑制剂，在造模第28、31、35、38、41天尾静脉注射，对照组CIA小鼠用100μl生理盐水溶解等量的无意义的抑制物对照物进行尾静脉注射作为参考。
3、CIA小鼠滑膜的细胞因子、淋巴结的转录因子的表达以及外周免疫细胞亚群分布的测定
1)第43天处死小鼠，分离髌骨和邻近的滑膜组织，获取脾脏以及关节的引流淋巴结。
2)Real time RT-PCR检测滑膜髌骨中细胞因子的表达。
3)Real time RT-PCR检测淋巴结中转录因子的表达。
4)流式细胞术检测脾脏各Th亚群的分布。
4、结果
CIA小鼠关节炎病灶局部炎症性细胞因子的表达情况如图3所示，其中图3A为炎症性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-21、IL-1β以及IFN-γ的表达情况，图3B为炎症性细胞因子IL-10、IL-4以及IL-35的表达情况。从图3结果可以看出，miR-34a-5p抑制剂可以降低CIA小鼠关节炎病灶局部炎症性细胞因子的表达。
CIA小鼠淋巴结各Th细胞亚群转录因子的表达情况如图4所示。从图4结果可以看出，miR-34a-5p抑制剂可以减少CIA小鼠淋巴结各Th细胞亚群转录因子的表达。
CIA小鼠脾脏各Th亚群的含量如图5所示，从图5结果可以看出，miR-34a-5p抑制剂可以对CIA小鼠脾脏各Th细胞亚群产生抑制作用。

Claims (4)

1.microRNA-34a-5p抑制剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的microRNA-34a-5p抑制剂的核苷酸序列是：5’ACAACCAGCUAAGACACUGCCA3’。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，对所述的microRNA-34a-5p抑制剂进行修饰。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的修饰包括对microRNA-34a-5p抑制剂的全链进行甲基化修饰，同时在5'端和3'端分别有2个和4个碱基硫代修饰，并在3'端连接有高亲和性胆固醇修饰。
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