CN108159063A - 木通皂苷d在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用。本发明试验证明，木通皂苷D能够促进间充质干细胞向软骨细胞分化，减轻骨关节炎关节软骨损伤。

Description

木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地说，本发明涉及木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病。骨关节炎以严重的、局限性软骨破坏，深达骨质为特点。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质构成，由于软骨内无血管、淋巴管及神经组织，同时软骨细胞增殖能力有限，不能迁移，因此关节软骨损伤后其自我修复能力很弱。并且骨关节炎的发展常与严重的炎症并行。随着社会老龄化的快速进展，关节软骨损伤和退变患者越来越多，骨关节炎的患病率逐年增高，骨关节疾病已成为导致长期慢性疼痛和劳动力丧失的主要疾病，对患者生活质量和社会经济有很大影响。

骨关节炎的治疗包括药物治疗和外科手术等。其中治疗药物可分为：快作用缓解症状的药物，主要是非甾体类药物，但引起胃肠道明显的不良反应以及可能破坏软骨细胞基质限制了它的长期应用；慢作用缓解骨关节炎炎症的药物及软骨保护剂，如补充软骨基质的氨基葡萄糖类及IL-1抑制剂如双醋瑞因，软骨保护剂如透明质酸，但因价格昂贵而限制了使用。迄今还没有一种治疗方法能完全阻断骨关节炎的病理进展过程。中医药防治骨关节炎实验研究取得了很大成绩，但是复方研究居多，寻找有效成分明确、质量可控且安全高效的组分中药具有显著的实用价值。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有强大的增殖能力、多向分化潜能及低免疫原性，在免疫调节、减轻炎症反应、损伤修复方面表现出广阔的应用前景，以间充质干细胞为种子细胞的组织工程学技术为治疗关节软骨损伤提供了新的方法与思路间充质干细胞具有向软骨细胞分化的潜能，研究发现间充质干细胞向软骨细胞分化并可修复动物的软骨缺损。运用间充质干细胞防治关节软骨损伤，不仅能在结构上影响组织修复，同时可以进行有效的免疫修饰及抗炎。但是，如何使间充质干细胞更有效的向软骨细胞分化是目前有待解决的问题。现在实验室常规使用的促进间充质干细胞分化增值的诱导剂是各种细胞因子，如转化生长因子TGF-β、胰岛素样生长因子IGF-1，然而这些细胞因子具有高浓度、高价格、高不良反应的缺点，而且人体的内环境是很难靠细胞因子来模拟的故寻找一种天然、安全、高效且可替代生长因子的药物成为当务之急。

木通皂苷D(Akebia Saponin D，ASD)是一种三萜皂苷类化合物，是中药续断的主要活性成分。续断是我国传统中药，为川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall.的干燥根，因能“续折接骨”而得名。续断始载于《神农本草经》，列为上品，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、定经络等功效。木通皂苷D能够促进前成骨细胞分化为成骨细胞，促进间充质干细胞成骨分化，但对软骨的保护作用未见报道，木通皂苷D作为骨关节炎防治药物的作用未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的一个目的是提供一种木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用。

优选的是，所述的木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用，其特征在于，所述木通皂苷D用于促进间质干细胞分化为软骨细胞。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供了木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用。本发明试验证明，木通皂苷D能够促进间充质干细胞向软骨细胞分化，减轻骨关节炎关节软骨损伤。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为实施例一中假手术组的骨关节软骨照片；图2为实施例一中模型组的骨关节软骨照片；图3为实施例一中间充质干细胞组的骨关节软骨照片；图4为实施例一中木通皂苷D组的骨关节软骨照片；图5为实施例一中混合注射组I的骨关节软骨照片；图6为实施例一中混合注射组II的骨关节软骨照片；图7为实施例一中混合注射组III的骨关节软骨照片；

图8为实施例二中2倍镜下正常组间充质干细胞的照片；图9为实施例二中2倍镜下诱导组间充质干细胞的照片；图10为实施例二中2倍镜下加入木通皂苷D处理后间充质干细胞的照片；图11为实施例二中2倍镜下加入诱导剂及木通皂苷D处理后间充质干细胞的照片；图12为实施例二中40倍镜下正常组间充质干细胞的照片；图13为实施例二中40倍镜下诱导组间充质干细胞的照片；图14为实施例二中40倍镜下加入木通皂苷D处理后间充质干细胞的照片；图15为实施例二中40倍镜下加入诱导剂及木通皂苷D处理后间充质干细胞的照片；

图16为实施例三中醋酸引起小鼠扭体实验及木通皂苷D的干预作用的实验结果；

图17为实施例五中角叉菜胶引起大鼠足趾肿胀实验及木通皂苷D的干预作用的实验结果；

图18为实施例六中甲醛引起大鼠足趾肿胀实验及木通皂苷D的干预作用的实验结果；

图19为实施例七中腹腔通透性实验及木通皂苷D的干预作用的实验结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明提供了木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用。

优选地，所述的木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用，其特征在于，所述木通皂苷D用于促进间质干细胞分化为软骨细胞。

本发明还提供了促进骨关节炎软骨修复的药物，所述药物包含木通皂苷D或者含木通皂苷D的木通总皂苷，还包含药学上可接受组分和/或载体或常规食用辅料。所述药物为口服制剂(包括片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、滴丸、缓释剂、控释剂或靶向制剂)、胃肠外给药制剂(栓剂、注射剂、粉针剂)或外用制剂等。

实施例一

Wistar大鼠用苯巴比妥钠麻醉(37.8mg/kg)，常规备皮消毒左后肢膝关节，取髌旁内侧切口显露膝关节，显露髌骨后将髌骨向外侧脱位，尽量屈曲膝关节显露前交叉韧带，在直视下切断前交叉韧带，取出内侧半月板，彻底止血，将髌骨复位，1号丝线逐层闭合关节腔。术后3d每天每只大鼠肌肉注射青霉素20万单位预防感染。假手术对照，经同样方式进入膝关节，将髌骨脱位，屈曲膝关节显露前交叉韧带，然后复位髌骨，闭合关节腔。1周后，将手术大鼠随机分为模型组、木通皂苷D(单独注射木通皂苷D，10mg/kg)组、间充质干细胞组(单独注射间充质干细胞MSC，1×10⁶个/只)、混合注射组I(注射木通皂苷D低剂量1mg/kg以及MSC 1×10⁶个/只)、混合注射组II(注射木通皂苷D中剂量3mg/kg以及MSC 1×10⁶个/只)、混合注射组III(注射木通皂苷D高剂量10mg/kg以及MSC 1×10⁶个/只)，关节腔注射，每周一次，注射8周。

矢状位切取约3mm厚带软骨下骨质的软骨标本，4％多聚甲醛固定24h，15％EDTA脱钙4周，常规脱水、浸蜡后石蜡包埋，6μm连续切片，HE染色，拍照(见图1至图7)。

结果显示：假手术组(见图1)：关节形态正常，未见损伤。模型组(见图2)：关节面软骨严重损伤，局部关节面软骨完全缺损，损伤深达骨质，缺损部位纤维组织增生，损伤部位可见炎症反应；局部(损伤部位)软骨内可见血管翳形成，局部软骨组织增生造成关节面凸凹不平；关节腔及周围软组织可见炎症反应。木通皂苷D组(见图4)，关节面软骨有损伤，局部关节面软骨缺损，损伤部位可见炎症反应。间充质干细胞组(见图3)：关节面软骨有损伤，局部关节面软骨缺损，损伤部位可见炎症反应。混合注射组I(间充质干细胞加木通皂苷D1mg/kg组)：关节面软骨严重损伤，局部关节面软骨完全缺损，损伤深达骨质，未见软骨下骨组织明显受损，缺损部位关节面凸凹不平；关节面缺损范围：25～50％。混合注射组II(间充质干细胞加木通皂苷D 3mg/kg组)：关节面软骨明显损伤，局部关节面表层软骨缺损，关节面缺损部位未达骨质；关节面缺损范围＜25％。混合注射组III(间充质干细胞加木通皂苷D10mg/kg组)：局部关节面软骨磨损变薄，磨损面可见软骨组织增生，局部伴(或不伴轻微炎症)，整个关节面未见软骨缺损。结果表明：木通皂苷D能够促进间充质干细胞向软骨细胞分化，减轻骨关节炎关节软骨损伤。

实施例二

间充质干细胞长到90％融合时，PBS冲洗，胰酶消化，取5×10⁵个细胞置于15mL离心管中，500g离心5min，弃去上清液，加入成软骨分化培养基进行诱导培养：DMEM、10％FBS、100nM地塞米松、50μg/mL维生素C、10ng/mL TGF-β3、1％ITS(l00X)。给药组在加入诱导液的同时加入ASD(100μM)，每3天换液一次，诱导21d。诱导的细胞团用PBS洗，4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，5μm切片脱腊至水，用1％的阿利新蓝染色。光镜下观察并拍照，比较各组细胞分化的差异(见图8至图15)。

结果显示：正常组(见图8)：间充质干细胞没有阿里新兰着色。诱导组(见图9)：间充质干细胞呈淡蓝色。木通皂苷D组(见图10)：间充质干细胞呈淡蓝色，即在木通皂苷D的干预作用下间充质干细胞向软骨细胞分化。诱导组加木通皂苷D组(见图11)：间充质干细胞呈深蓝色，即在木通皂苷D的干预作用下间充质干细胞向软骨细胞的分化进一步被加强。

结果表明：木通皂苷D能够促进间充质干细胞向软骨细胞分化。

实施例三

选用健康昆明种小鼠50只，雄性，(20±2)g，随机分为5组，模型组、阳性药组(阿司匹林片，100mg/kg)，木通皂苷D(分别给药50、150、450mg/kg)3个剂量组。各组均灌胃给药，连续6d。末次给药后1h，腹腔注射0.8％醋酸溶液，0.1ml/10g。观察记录各组小鼠15min内扭体次数，比较各组动物扭体次数差异(见图16)。

结果显示：模型组平均扭体次数38.86±4.33次，阳性药阿司匹林组平均扭体次数9.12±6.71次，木通皂苷D 50mg/kg组平均扭体次数32.28±6.49次，150mg/kg组平均扭体次数7.75±6.52次，450mg/kg平均扭体次数1.71±1.70次。

结果表明：木通皂苷D能够减轻醋酸引起的疼痛。并且随着木通皂苷D用量的增加，对由醋酸引起的疼痛的缓解作用增强。

实施例四

经55℃热板筛选痛阈值5-30s昆明小鼠50只，随机分成5组，每组10只，分别为模型组，阿司匹林组(100mg/kg)、木通皂苷D组(给药量分别为50、150、450mg/kg)。各小鼠测2次痛阈值，取均值作为基础痛阈值，然后各组小鼠分别灌胃给药，每天1次，连续5天。末次给药后1、2、4h分别测定小鼠痛阈值，测定结果见表1。

结果显示：模型组小鼠痛阈值(4h)为12.50±4.31s，阿司匹林组19.57±4.93s，木通皂苷D组(给药量50mg/kg)痛阈值(4h)为15.75±3.65s，木通皂苷D(给药量150mg/kg)痛阈值(4h)为17.33±5.92s，木通皂苷D(给药量450mg/kg)痛阈值(4h)为22.71±5.82s。

结果表明：木通皂苷D能够增加热板引起的痛阈值。

表1

实施例五

取健康SD大鼠50只，雄性，随机分为5组，即空白对照组(0.9％氯化钠溶液)、阳性药组(阿司匹林100mg/kg)、木通皂苷D组(给药量分别为30、100、300mg/kg)5个剂量组。5组均灌胃给药7d，于最后1d给药后1h，于大鼠右后足趾皮下注入1％角叉菜胶0.1ml/只，致炎后0.5、1、2、4、6h分别测定足趾厚度，计算肿胀率，分别比较各时间点给药组与模型组之间的差异(见图17)。

研究发现：注射角叉菜胶后，模型组大鼠足趾变厚，并基本平稳。阿司匹林组大鼠随时间推移，变厚的足趾炎症逐渐减少。木通皂苷D给药各组呈浓度依赖性地减少角叉菜胶引起的足趾肿胀。

研究表明：木通皂苷D能够减少角叉菜胶引起的足趾肿胀，减轻炎症反应。

实施例六

取健康SD大鼠50只，雄性，随机分为5组，即空白对照组(0.9％氯化钠溶液)、阳性药组(阿司匹林100mg/kg)、木通皂苷D组(给药量分别为30、100、300mg/kg)5个剂量组。5组均灌胃给药7d，于最后1d给药后1h，于大鼠右后足趾皮下注入2.5％甲醛0.1ml/只，致炎后0.5、1、2、4、6h分别测定足趾厚度，计算肿胀率，分别比较各时间点给药组与模型组之间的差异(见图18)。

研究发现：注射甲醛后，模型组大鼠足趾变厚，并随时间越来越厚。阿司匹林组大鼠随时间推移，变厚的程度比模型组小。木通皂苷D给药各组呈浓度依赖性的减少甲醛引起的足趾肿胀。

研究表明：木通皂苷D能够减少甲醛引起的足趾肿胀，减轻炎症反应。

实施例七

选用健康昆明种小鼠50只，雄性，(20±2)g，随机分为5组，模型组、阳性药组(阿司匹林片，100mg/kg)，木通皂苷D组(给药量分别为50、150、450mg/kg)5个剂量组。各组均灌胃给药，连续6d。末次给药后1h，尾静脉注射1％Evans blue，0.1ml/10g，同时腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/20g，30min后处死，用6ml生理盐水冲洗腹腔，洗液放置1h后离心15min(3000rpm/min)，取上清液于540nm比色(见图19)。

研究发现：模型组比色值最高，反映腹腔通透性最高。阿司匹林组能够明显降低比色值。木通皂苷D能够呈浓度依赖性的降低比色值，减少腹腔通透性。

研究表明：木通皂苷D能够减少腹腔通透性，减轻炎症反应。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (2)

1.木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的木通皂苷D在制备促进骨关节炎软骨修复的药物中的应用，其特征在于，所述木通皂苷D用于促进间质干细胞分化为软骨细胞。