CN104873493B - 2‑羟基泽兰内酯在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化工领域及医药领域，涉及2‑羟基泽兰内酯在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了2‑羟基泽兰内酯在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，即将2‑羟基泽兰内酯加入肿瘤细胞的培养液中。2‑羟基泽兰内酯是中草药佩兰的提取物，属于天然产物，生物利用度高、性质比较稳定,具有临床使用价值。

Description

2-羟基泽兰内酯在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于化工领域及医药领域，涉及2-羟基泽兰内酯在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。我国的肿瘤病例数相当庞大，有资料显示占全世界病例数的55%。

良性肿瘤对机体的影响较小，主要表现为局部压迫和阻塞症状。恶性肿瘤由于分化不成熟、生长较快，浸润破坏器官的结构和功能，并可发生转移，因而对机体影响严重。恶性肿瘤除可引起与上述良性肿瘤相似的局部压迫和阻塞症状外，还可有发热、顽固性疼痛，晚期可出现严重消瘦、乏力、贫血和全身衰竭的状态。

中医认为，癌症的起因首先是人体内阴阳平衡，组织细胞在不同的致癌因素长期作用下，细胞突变而引起的。其实癌组织也是人体的一部分，只有在人本阴阳平衡失调，五行生克乘侮发生变化的前提下，人体的免疫监控系统才会对其失去监控，任其发展。中草药能够以调理气血、调整阴阳平衡、维持正常生命体征而保命；以培补正气、产生抗体，清理″毒源″而治本。因而，中草药提取物成为治疗肿瘤一个重要方向。

佩兰为菊科植物佩兰（兰草）的地上部分，以全草入药。其功能主治为外感暑湿;寒热头痛；湿润内蕴；恶心呕吐；口中甜腻。用于湿浊中阻，脘痞呕恶，口中甜腻，口臭，多涎，暑湿表症，头胀胸闷。又名：鸡骨香、水香、兰、兰草、水香、都梁香、大泽兰、兰泽、燕尾香、香水兰、孩儿菊、千金草、省头草、女兰、香草、醒头草、石瓣、针尾凤。

也有报道称，佩兰的鲜叶或干叶的醇浸出物含有一种有毒成分，具有急性毒性，家兔给药后，能使其麻醉，甚至抑制呼吸，使心率减慢，体温下降，血糖过多及引起糖尿诸症。动物试验表明，口服佩兰能引起小鼠动情周斯暂停，排卵受到抑制。对佩兰的化学成分进行分离提纯，分门别类的研究其药理作用，将大大降低使用佩兰可能产生的副作用。

2-羟基泽兰内酯是中草药佩兰的提取物，属于天然产物，生物利用度高、性质比较稳定,具有临床使用价值。随着人们对其的化学和生物学研究的深入,其分子作用机制将逐步明确,这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究,并有助于提高佩兰的药用价值。

发明内容

本发明的目的是提供2-羟基泽兰内酯的新的药物用途。

一方面，本发明提供了2-羟基泽兰内酯在制备抗肿瘤药物中的应用。其中，2-羟基泽兰内酯的CAS号为72229-33-5。

所述的2-羟基泽兰内酯的结构如下所示：

所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌药物，也可以是抗血癌药物。

实验结果表明，2-羟基泽兰内酯能够抑制多种癌细胞生长。其中部分的IC50达到了微摩（μmol/L或者μM）级。

该抗肿瘤药物可以为针剂或者片剂。

2-羟基泽兰内酯能够导致肿瘤细胞的G1期阻滞，尤其是肝癌细胞的G1期阻滞。

在本发明的一个优选例中，2-羟基泽兰内酯能够导致SMMC-7721细胞的G1期阻滞。

另一方面，本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，即将2-羟基泽兰内酯加入肿瘤细胞的培养液中。

所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞、血癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞或者胰腺癌细胞。在本发明的优选例中，上述方法中，所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞或者血癌细胞。

更优选的，所述的肿瘤细胞是SMMC-7721、K562、HGC或者Hela。

本发明中，加入2-羟基泽兰内酯的终浓度为1-100μM。例如，1-5μM，1-10μM，2-12μM，2-20μM，2-30μM，2-60μM，40-90μM，60-80μM，10-50μM，5-60μM，等等。

另一方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物的活性成分是2-羟基泽兰内酯。

在本发明的优选例中，上述抗肿瘤药针对的肿瘤是肝癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞或者白血病细胞。

本发明提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物的活性成分是2-羟基泽兰内酯。所述的肿瘤可以是肝癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞或者血癌细胞。

本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。

利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与2-羟基泽兰内酯发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明及其抑制剂、拮抗剂等，在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的2-羟基泽兰内酯为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的2-羟基泽兰内酯可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的2-羟基泽兰内酯还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的2-羟基泽兰内酯被用作药物时，可将治疗有效剂量的2-羟基泽兰内酯施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了2-羟基泽兰内酯在制备抗肿瘤药物中的应用。2-羟基泽兰内酯是天然产物，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

附图说明

图1：SMMC-7721细胞的细胞周期分布比例。

图2：10微摩浓度的2-羟基泽兰内酯对SMMC-7721细胞的细胞周期的影响。

图3：20微摩浓度的2-羟基泽兰内酯对SMMC-7721细胞的细胞周期的影响。

图4：2-羟基泽兰内酯对QGY细胞的细胞周期的影响。图4为图1-图3的柱状图。

上图表明，2-羟基泽兰内酯能导致细胞周期的G1期阻滞。

具体实施方式

实验方法：

1.细胞复苏

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。PANC-1细胞培养在含10%Gibico胎牛血清的DMEM高糖培养基中，K562、HGC细胞细胞培养在含10%胎牛血清的1640培养基中，SK-hep1等细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基中含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

2.细胞传代培养

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至约90%汇合时传代，约每隔2-4天传代一次。一瓶传代成三瓶，或一个25cm²传代于一个75cm²的培养瓶中。方法：

1)用1×磷酸缓冲液洗涤细胞一次。

2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。

3)用含10-15%的Gibico胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。

3.细胞冻存

1)取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10%DMSO，40%DMEM和50%Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。

3)将冻存管放入冻存盒置-80℃速冻，5小时后移入液氮罐中保存。

4.药物准备：

2-羟基泽兰内酯溶于DMSO(二甲基亚砜),配制成100mM或50mM的母液备用。

2-羟基泽兰内酯的具体性质参数如下：

【产品名称】2-羟基泽兰内酯

【英文名称】2-Hydroxyeupatolide

【分子式】C15H20O3

【分子量】248.31

【C A S号】72229-33-5

【化学分类】Lactones内酯类

【来源】菊科植物佩兰Eupatorium fortunei Turcz.

【供应商】上海楚柏实验室设备有限公司

2-羟基泽兰内酯的结构如下所示：

实施例1MTS法测定2-羟基泽兰内酯对肿瘤细胞的生长抑制作用

SK-HEP1细胞（购自中国科学院细胞库）3×10³/孔接种至96孔板,培养24小时使之贴壁后加入2-羟基泽兰内酯，设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5%CO₂条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒（Promega公司）测定细胞存活率。

测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照100μl/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液（10ml无血清培养基中加入2ml溶液1和100μl溶液2，充分混匀）。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值（参考波长630-700nm，测定波长490nm），计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算2-羟基泽兰内酯对Sk-hep1细胞的IC50值。

IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为SK-HEP1细胞数量为对照的一半时2-羟基泽兰内酯的浓度。IC50的计算一般需要测定5个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。

结果：2-羟基泽兰内酯对Sk-hep1细胞的IC50值为45.26μmol/L。

用同样的方法测试QGY细胞（购自中科院细胞库），结果2-羟基泽兰内酯对QGY细胞的IC50值为约62.21μM（微摩）；对hela细胞的IC50值为约4.32μM，对hep-G2细胞的IC50值为约63.50μM，对MCF-7的IC50值为约25.70μM，对SMMC-7721的IC50值为约8.86μM。

实施例22-羟基泽兰内酯对人白血病细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞的生长抑制作用

利用cck-8试剂盒（日本同仁化学研究所）检测。

步骤：

1)将K562细胞（购自中国科学院细胞库）均匀的种在96孔板里，每孔细胞数为10⁴个。

2)待贴壁，过夜后加药，加药（2-羟基泽兰内酯浓度分别为50、16.67、5.56、1.85、0.62μM），每个浓度有3个复孔。

3)培养48小时，将完全培养基替换成无血清培养基与CCK8的混合物(10：1)，于37℃培养箱孵育2小时。

4)以450nm为测量波长，以650nm为对照波长，于酶标仪上测出读数。

结果：2-羟基泽兰内酯对K562细胞的IC50值为2.11μM。

用同样方法检测2-羟基泽兰内酯对人胃癌细胞、胰腺癌细胞的生长抑制作用，结果显示，2-羟基泽兰内酯对HGC和PANC-1的IC50值分别为1.38、44.22μM。

实施例3：流式细胞术检测2-羟基泽兰内酯对肿瘤细胞的细胞周期的影响

实验材料：RNase A及PI均购自Sigma公司。

实验方法：

取对数生长期的SMMC-7721细胞，按5×10⁴个细胞/孔的密度接种12孔板，24h后待细胞进入对数生长期后加入2-羟基泽兰内酯。24h后，胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，并用预冷PBS清洗细胞两次，重悬于含0.03％的Triton X-100，200mg/ml RNase A和50μg/mlPI的PBS中。避光室温孵育15min后，流式细胞术检测。实验中不加2-羟基泽兰内酯（0微摩）为阴性对照。

实验结果：如图1-图4所示，SMMC-7721细胞经过10μM、20μM2-羟基泽兰内酯处理24h后，相比于不加入2-羟基泽兰内酯的细胞，G1期细胞比例增加，这种作用随着浓度的增加而增强。

实验证实，2-羟基泽兰内酯能够导致细胞周期阻滞，例如是G1期阻滞。

Claims (8)

1.2-羟基泽兰内酯在制备抗肿瘤药物中的应用；所述的肿瘤源自肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞或者血癌细胞。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗血癌药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，该抗肿瘤药物为针剂或者片剂。

5.一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于，将2-羟基泽兰内酯加入肿瘤细胞的培养液中；所述的肿瘤细胞是肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞或者血癌细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是SMMC-7721、K562或者HGC细胞。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，加入2-羟基泽兰内酯的终浓度为2-100μM。

8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的活性成分是2-羟基泽兰内酯，所述的肿瘤源自肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞或者白血病细胞。