CN103550256A

CN103550256A - 自体脂肪间充质干细胞在制备治疗关节疾病药物的应用

Info

Publication number: CN103550256A
Application number: CN201310493985.1A
Authority: CN
Inventors: 金星亮; 郑菊芬; 杨五宁; 刘洁
Original assignee: NANJING YOUER BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: NANJING YOUER BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2013-10-21
Filing date: 2013-10-21
Publication date: 2014-02-05

Abstract

一种自体脂肪间充质干细胞在制备治疗关节疾病药物的应用，其特征在于：采用病人自体脂肪组织中分离和提取的间充质干细胞（Adipose-derivedmesenchymalstemcell,Ad-MSCs），一次大剂量注入病变关节腔；所采用的间充质干细胞，经流式细胞术鉴定具有Ad-MSC的免疫表型表征生物标志，并能定向诱导分化成成骨细胞和软骨细胞。原代细胞直接注射至病变之关节的关节腔治疗多种关节疾病。采用自体脂肪间充质干细胞是原代细胞具有更好的分化潜能和抑制炎症及免疫调节能力。脂肪间充质干细胞移植为治疗骨关节疾病提供了一个新的有效的手段。本方法简单易行，收集细胞量大，创伤小。应用病人自体间充质干细胞，不侵犯相关伦理，避免了免疫排斥和传染病等风险。

Description

自体脂肪间充质干细胞在制备治疗关节疾病药物的应用

技术领域

本发明涉及细胞移植治疗领域，具体地说涉及一种自体脂肪间充质干细胞的提取和治疗关节疾病方法。

背景技术

关节炎是一种常见的慢性疾病，常见关节炎包括骨关节病如老年人性退行性关节炎，运动损伤性关节炎；类风湿性关节炎，引起关节肿痛，行动受限，严重地影响到生活质量。据统计我国目前关节炎患者约有1亿以上。50岁以上人群中半数患骨关节炎；65岁以上人群中90％的女性和80％的男性患骨关节炎；类风湿关节炎在我国的患病率为0.34％～0.36％。目前尚无特效性治疗方法，晚期可发展到关节变形，需手术治疗，甚至关节置换。

干细胞移植治疗学，是一门先进的医学技术,为一些用药物难以治愈的疾病治疗带来了希望。间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞，它的主要特点是容易分离，生长快，具有免疫调节功能，自我更新能力；具有特定的诱导分化潜能。这些特点使它成为细胞治疗学和再生医学的理想的细胞来源。目前间充质干细胞已用于治疗的十余种难治性疾病中，除了用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植可提高疗效和减少异基因HSCT移植的排异反应外，还用于心脑血管病、肝硬化、肌疾病、脑和脊髓神经损伤、老年性痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究

目前已有多个报道间充质干细胞包括脂肪间充质干细胞应用于治疗骨关节疾病，但临床效果不稳定。这是因为还没有一个标准的治疗方案和模型，包括适应症、细胞数量、细胞质量（哪代细胞？）、细胞移植途径、疗程等。大多数报道的间充质干细胞来源于异体的骨髓，脐带及来源于腹部吸脂术的脂肪等。这些异体来源的间充质干细胞必须经过细胞冻存复苏、培养、扩增传代等流程，改变了细胞质量，从而失去了间充质干细胞的治疗作用，甚至产生变异、突变等严重不良后果。进一步说，这些异体来源的、经过扩增后的细胞多通过静脉注射的系统性移植途径，所需要的不同的细胞数量和疗程都可产生不确定性的治疗效果。

本发明专利的目的提出了应用自体脂肪来源的原代间充质干细胞，通过局部大剂量应用的方法治疗多种骨关节疾病的全新概念。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了克服目前间充质干细胞临床用中的缺陷，提供一种自体脂肪间充质干细胞在制备治疗关节疾病药物的应用。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种自体脂肪间充质干细胞在制备治疗关节疾病药物的应用，其特征在于：采用病人自体脂肪组织中分离和提取的间充质干细胞，一次大剂量注入病变关节腔；其中，所述自体脂肪间充质干细胞，

a)为原代细胞，可混伴有内皮细胞和或细胞因子；

b)通过流式细胞术检测，表达了CD44,CD166,CD105，CD73和HLA1，但不表达HLA2，CD45,CD14和CD34；

c)细胞培养扩增后的形态学特征是梭型，贴壁生长;和

d)具有在体外定向诱导分化成为成骨细胞和软骨细胞的能力

优选地，注入病变关节腔的细胞数为：成年人每膝关节5-7千万，腕关节2-4千万，指或趾关节1-2千万，肘关节3-5千万。

优选地，主要适应症：各类创伤性骨关节炎，类风湿性关节炎，骨关节退行性病病人。

有益效果：本发明中提供的一种自体脂肪间充质干细胞在制备治疗关节疾病药物的应用，采用自体脂肪间充质干细胞是原代细胞具有更好的分化潜能和抑制炎症及免疫调节能力。这种自体细胞的局部应用的优点是：不侵犯相关伦理，避免了免疫排斥和疾病交叉传染。脂肪间充质干细胞移植为治疗骨关节疾病提供了一个新的有效的手段。

这种效果也可通过治疗关节炎小鼠模型证实。利用不同剂量鼠脂肪间充质干细胞系并没有表现出显著临床功能；而使用原代鼠脂肪间充质干细胞代替细胞系，单次注射原代鼠源脂肪间充质干细胞可预防骨和软骨的严重不可逆性损伤，抑制杀伤性T细胞增殖、显著降低了炎性细胞因子如TNF-α、IFN-γ等表达量，同时增加了调节性T细胞及IL-l0和IL-4等调节性细胞因子分泌。另一方面，系统性应用脂肪间充质干细胞能够促进CD4_CD25_FoxP3特异性的调节性T淋巴细胞的生成。提示原代细MSC具有更好的分化潜能和抑制炎症及免疫调节能力。

附图说明

图1-A为本发明中人类脂肪间充质干细胞体外培养的正常形态学图；

1-B为流式细胞术分析人类脂肪间充质干细胞的免疫表型生物标志表；

图2为采用本发明的人类脂肪间充质干细胞在体外定向诱导分化为成成骨细胞和软骨细胞；

其中：2-A为肪间充质干细胞体外培养的正常形态学图；

2-B为人类脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞；

2-C为人类脂肪间充质干细胞分化为软骨细胞；

图3为本发明自体脂肪间充质干细胞的获取方法流程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对发明做进一步说明：

本发明一种自体脂肪间充质干细胞在制备治疗关节疾病药物的应用，采用病人自体脂肪组织中分离和提取的间充质干细胞，一次大剂量注入病变关节腔；其中，所述自体脂肪间充质干细胞，

a)为原代细胞，可混伴有内皮细胞和或细胞因子；

b)通过流式细胞术检测，表达了CD44，CD166，CD105，CD73和HLA1，但不表达HLA2，CD45，CD14和CD34；

c)细胞培养扩增后的形态学特征是梭型，贴壁生长；和

d)具有在体外定向诱导分化为成成骨细胞和软骨细胞的能力.

注入病变关节腔的细胞数为：成年人每膝关节5-7千万，腕关节2-4千万，指或趾关节1-2千万，肘关节3-5千万。

主要适应症：各类创伤性骨关节炎，类风湿性关节炎，骨关节退行性病病人。

上述自体脂肪间充质干细胞的提取方法，包括下述步骤：

A) 获取和分离人脂肪组织，局部麻醉下通过脂肪切除或吸脂的方法收集人脂肪组织至少100-200mL脂肪到封闭灭菌容器内；加100-200mL磷酸盐缓冲液（PBS）于37^oC气浴培养箱以100rpm回旋震荡，重复漂洗，每次30分钟，用移液管将组织下层的液体吸出，至所吸出的液体清晰为止（共3-4次）；

B) 胶原酶消化：加入与组织相同体积的0.2-0.4mg/mL I-型胶原酶，使溶液终浓度为0.1-0.2mg/mL，密封，置于37°C恒温摇床中，以200rpm震荡消化30分钟；

C) 加入小牛血清（FetalBovineSerum，FBS），使其最终浓度为10%，中止消化，将消化好的脂肪分装移到50mL离心管中，以离心力1000 x g速度在室温下离心15分钟，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含多种细胞层；

D) 吸出离心管中的上中层，除去。保留下层细胞层，用PBS缓冲液洗涤，室温下以离心力300 x g离心5分钟，移去上层液，重复三次以除去FBS；

E) 将下层细胞再悬浮于PBS缓冲液中，每100mL脂肪所提取的细胞再悬浮于10mLPBS中。每克脂肪可提取1-2x10⁶细胞。此细胞（原代脂肪间充质干细胞）直接可通过局部注射用于治疗；

F) 取100微升自体脂肪间充质干细胞样品作细胞计数，进行细胞分子生物学分析；

G) 以1-5x10⁴/cm²的密度接种作细胞培养扩增，自体脂肪间充质干细胞典型的形态学特征是梭型，贴壁生长，第2-5代细胞常规冻存以备后用；其中扩增的第5代细胞通过了流式细胞术检测，表达了CD44,CD166,CD105，CD73和HLA1，但不表达HLA2，CD45,CD14和CD34；对其中扩增的第5代细胞进行了定向诱导分化研究，自体脂肪间充质干细胞能在体外定向诱导分化为成成骨细胞和软骨细胞。

自体脂肪间充质干细胞的提取：从人下腹部采集约100-200g脂肪组织；加入100-200mL PBS缓冲液,于37^oC气浴回旋震荡培养箱以100rpm震荡，重复三次漂洗，每次30分钟，用移液管将组织下层的液体吸出。如此至所吸出的液体清晰为止。通过I-型胶原酶消化30分钟，离心收集下层细胞；PBS缓冲液重复三次漂洗后，细胞可直接用于局部移植。经此方法100克脂肪可提取5-10千万个细胞。

通过流式细胞术和细胞定向诱导分化研究两种细胞分子生物学的分析方法确定了使用本发明方法获得的自体脂肪间充质干细胞具有下述脂肪间充质细胞生物学特征：

（1）如图1中1-B所示：使用流式细胞术鉴定Ad-MSC的免疫表型表征生物标志物，脂肪间充质干细胞表达CD44,CD166,CD105，CD73和HLA1，但不表达HLA2，CD45,CD14和CD34；

（2）如图2所示：细胞定向诱导分化研究，提取的细胞能在体外定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞；人类脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞的特征是通过碱性磷酸酶染色,见图2-B；通过猩红染色（PicrosiriusRed）证实其中的胶原蛋白的存在，这种胶原蛋白的沉积更明显可见于分化诱导7周后的成软骨细胞结构中,见图2-C。

脂肪间充质干细胞在人类无血清培养基体外培养，达到一定的数量后（2天后），加入成骨细胞诱导剂，或软骨细胞诱导剂继续培养定向分化为成骨细胞或软骨细胞。由此检测肪间充质干细胞定向分化能力。人类无血清培养液(StemPro??MSCSFM)及诱导剂试剂盒(StemPro??ChondrogenesisDifferentiationKit和StemPro??OsteogenesisDifferentiationKit)均购于LifeTechnologies。

对于本发明的一个特点，涉及的制备治疗关节疾病药物的自体脂肪间充质干细胞是原代细胞,在小鼠试验中，原代脂肪间充质干细胞抑制杀伤性T细胞增殖、显著降低了炎性细胞因子如TNF-α、IFN-γ等表达量，同时增加了调节性T细胞及IL-l0和IL-4等调节性细胞因子分泌。另一方面，系统性应用Ad-MSC能够促进CD4_CD25_FoxP3特异性的调节性T淋巴细胞的生成。提示原代细胞具有更好的分化潜能和抑制炎症及免疫调节能力；在诱导小鼠关节炎的同时单次注射原代鼠源脂肪间充质干细胞可预防骨和软骨的严重不可逆性损伤.本发明涉及的获取脂肪间充质干细胞另一个特点，是其整个流程未应用抗生素，避免了抗生素可能引起的副作用。因为本发明的整个流程是严格按照绝对无菌原则的条件下进行，而且本发明的发明人发现应用抗生素对预防污染并没有意义，相反可以引起降低细胞质量，过敏反应等副作用。

实施例1

1. 63岁男性病人，患创伤性膝关节炎15年。在局部麻醉的条件下，从病人下腹部收集100mL脂肪，移到一500mL封闭灭菌容器内；加200mL PBS缓冲液于37^oC气浴回旋震荡培养箱以100rpm震荡，重复三次漂洗，每次30分钟，用移液管将组织下层的液体吸出。如此至所吸出的液体清晰为止；

2. 加入与组织相同体积的含0.175mg/mL I-型胶原酶脂肪组织消化液，此时总量200mL；

3. 密封，置于37°C恒温摇床中，以200rpm，震荡消化30分钟；

4. 加入11mL FBS(最终浓度为5%)中止消化，将消化好的脂肪分4份转移到50mL离心管中，以500 x g速度在室温下离心15分钟，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个细胞的液体；

5. 吸出离心管中的下层液体共40mL，加15mL PBS，室温下300 x g速度离心5分钟，移去上层液，保留沉淀的细胞。再重复三次，但每次加30mL PBS，以除去FBS；

6. 将下层细胞再悬浮于10mL PBS中，最终收集到6600万个细胞。取200微升样品作细胞分子生物学分析，余下细胞（含原代脂肪间充质干细胞）直接用于局部注射治疗两侧膝关节腔；

7. 通过下述分子生物学分析证实了所提取的细胞脂肪间充质干细胞:

1) 取100万个细胞按5x10⁵的密度接种在无血清培养液（购于LifeTechnologies）中作细胞培养扩增。细胞培养的条件是培养条件为37℃恒温、保湿，通入5%O₂+5%CO₂+90%N₂的混合气体。细胞具有典型的间充质干细胞的形态学特征（梭型，贴壁生长），如图1-A。扩增后的第2-5代细胞常规冻存以备后用。

2) 其中扩增的第5代细胞通过了流式细胞术检测，表达了CD44,CD166,CD105，CD73和HLA1，但不表达HLA2，CD45,CD14和CD34；如图1-B；

3) 其中扩增的第5代细胞进行了定向诱导分化研究，能在体外定向诱导分化为成成骨细胞和软骨细胞；如图2-B和2-C。

本发明中从脂肪中分离的间充质干细胞（Adipose-derivedmesenchymalstemcell,Ad-MSCs）能贴壁生长、具有和骨髓、脐带来源的间充质干细胞相似的形态、生物学特点和相似的免疫学表型，并且在体外具有向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞、心肌细胞等分化能力，其诱导分化体系和骨髓、脐带来源的间充质干细胞相似。脂肪组织具有取材方便（如腹部吸脂术）和干细胞含量高的优势,且不侵犯相关伦理，将成为骨髓MSC(BM-MSC)的理想替代物。

Claims

1.一种自体脂肪间充质干细胞在制备治疗关节疾病药物的应用，其特征在于：采用病人自体脂肪组织中分离和提取的间充质干细胞（Adipose-derivedmesenchymalstemcell,Ad-MSCs），一次大剂量注入病变关节腔；其中，所述自体脂肪间充质干细胞，

a)为原代细胞，可混伴有内皮细胞和细胞因子；

c)细胞培养扩增后的形态学特征是梭型，贴壁生长；和

d)具有在体外定向诱导分化成为成骨细胞和软骨细胞的能力。

2.根据权利要求1所述的自体脂肪间充质干细胞在制备治疗关节疾病药物的应用，其特征在于：局部应用，注入病变关节腔的细胞数为：成年人每膝关节5-7千万，腕关节2-4千万，指或趾关节1-2千万，肘关节3-5千万。

3.根据权利要求1所述的自体脂肪间充质干细胞在作为治疗关节疾病药物的应用，其特征在于：主要适应症：各类创伤性骨关节炎，类风湿性关节炎，骨关节退行性病等病人。