CN104818264A - 一种消化酶组合物及其制剂、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞分离技术领域，特别涉及一种消化酶组合物及其制剂、应用。该消化酶组合物包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。本发明提供的消化酶组合物能够高效地从胎盘组织块中分离MSC，提高了胎盘MSC的分离效率；本发明提供的消化酶组合物能够减少对细胞的损伤，从而使细胞活率高，同时具有较强的增殖能力，提高细胞收获量。

Description

一种消化酶组合物及其制剂、应用
技术领域
本发明涉及干细胞分离技术领域，特别涉及一种消化酶组合物及其制剂、应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一群非造血功能的，主要存在与结缔组织和器官间质中的一类同种多能干细胞。体外培养的实验研究发现，在不同的诱导条件下，胎盘MSC可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经元，并表达特异性标志，如osteopontin、PPAR-γ2、collagenⅡ、NSE等，诱导体系与骨髓MSC没有太大的差别，表明胎盘MSC同样具有广泛的分化潜能。近年来，已有具有干/祖细胞特征的间充质细胞自骨髓、外周血、密质骨、软骨、肌肉等组织中分离出来，这些组织的一个共同特征就是来源于胚胎发育期的中胚层，胎盘由滋养细胞及大量起源于胚外中胚层的间充质和血管共同组成，提示胎盘中存在间充质干细胞(MSC)成分。科学家们经过证实确定胎盘中含有大量丰富的MSCs。而且，胎盘MSC与骨髓MSC在细胞形态，细胞表面标志表达和基因表达模式上非常相似。由于胎盘MSCs的数量很大，在今后的试验和临床应用上，胎盘已经成为一种无伦理学争议和简便获得的MSCs的新来源。
MSCs的分离一般采用胰蛋白酶消化，具体方法为：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5％的CO2培养箱培养，培养液中含10％FBS，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素。脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
从胎盘组织中分离MSC还有采取胶原酶消化组织块的办法。李铎于2011年报道了应用胶原酶消化法对人脐带间充质干细胞进行分离培养。
CN104284976A中采用胰蛋白酶和DNase I对胎盘干细胞进行了分离培养，具体为：在含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)的平衡盐溶液(HBSS)中，将35至40g胎盘绒毛组织用0.15％胰蛋白酶和0.02％DNase I在37℃下水浴消化30min，重复3次。在最后两次消化中，静置组织碎片，用200uM孔径尼龙筛网过滤上清液，至多45mL细胞悬液分层在5mL FCS血清上，室温1000Xg离心10min。
又如文献(姚旺祥等.兔胎盘源性间充质干祖细胞的分离方法比较.生物医学工程与临床.2007年02期)采用Ⅱ型胶原酶+DNaseⅠ对胎盘组织进行消化。
但上述方法存在细胞收获率低或者细胞活力低的问题。因此，提供一种细胞收获率高、细胞活力高的胎盘间充质干细胞的分离培养方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种消化酶组合物及其制剂、应用。本发明提供的消化酶组合物能够高效地从胎盘组织块中分离MSC，提高了胎盘MSC的分离效率；本发明提供的消化酶组合物能够减少对细胞的损伤，从而使细胞活率高，同时具有较强的增殖能力，提高细胞收获量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种消化酶组合物，包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。
本发明使用胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶联合消化胎盘组织，使得消化酶组合物产生了协同增效作用，提高了细胞的收获量及活率，减少了对细胞的损伤，提高了增殖速率。
作为优选，胶原酶I、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶体积比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)。
优选地，胶原酶I、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶体积比为1：0.5：2。
本发明还提供了一种消化酶混合液，包括本发明提供的消化酶组合物和PBS；该消化酶组合物包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶；作为优选，胶原酶I、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶的体积比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)；优选地，胶原酶I、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶体积比为1：0.5：2。
作为优选，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为0.1～10μg/mL，中性蛋白酶的浓度为0.1～10μg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为0.1～10μg/mL。
在本发明提供的一些实施例中，胶原酶I的规格为125CDU/mg。
在本发明提供的一些实施例中，中性蛋白酶的规格为50000U/g。
在本发明提供的一些实施例中，脱氧核糖核酸酶的规格2000Kunitzunits/mg。
在本发明提供的一些实施例中，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为1μg/mL，中性蛋白酶的浓度为0.5μg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为2μg/mL。
在本发明提供的另一些实施例中，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为0.1μg/mL，中性蛋白酶的浓度为1μg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为10μg/mL。
在本发明提供的另一些实施例中，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为5μg/mL，中性蛋白酶的浓度为10μg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为0.1μg/mL。
在本发明提供的另一些实施例中，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为10μg/mL，中性蛋白酶的浓度为0.1μg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为1μg/mL。
本发明还提供了本发明消化酶组合物或消化酶混合液在分离间充质干细胞中的应用；该消化酶组合物包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶；作为优选，胶原酶I、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶的体积比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)；优选地，胶原酶I、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶的体积比为1：0.5：2；
本发明消化酶混合液包括本发明消化酶组合物和PBS；作为优选，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为0.1～10μg/mL，中性蛋白酶的浓度为0.1～10μg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为0.1～10μg/mL。
在本发明提供的一些实施例中，间充质干细胞为胎盘间充质干细胞。
本发明还提供了一种分离胎盘间充质干细胞的方法，采用本发明消化酶组合物，或者采用本发明消化酶混合液消化胎盘组织。
作为优选，消化的温度为36～38℃。
优选地，消化的温度为37℃。
作为优选，消化的时间为10～60min。
优选地，消化的时间为30min。
本发明提供了一种消化酶组合物及其制剂、应用。该消化酶组合物包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。本发明至少具有如下优势之一：
本发明提供的消化酶组合物能够高效地从胎盘组织块中分离MSC，提高了胎盘MSC的分离效率；
本发明提供的消化酶组合物能够减少对细胞的损伤，从而使细胞活率高，同时具有较强的增殖能力，提高细胞收获量。
附图说明
图1示分离获得的MSCs的形态(P1代)；A(40倍)和B(100倍)示用消化酶混合液1获得的人MSCs，并用Gimsa染色观察其细胞形态；C(40倍)和D(100倍)用消化酶混合液2获得的人MSCs并用Gimsa染色观察其细胞形态；
图2示流式细胞术检测胎盘贴壁细胞表型，表面抗原包括CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105；其中2-1示消化酶混合液1消化获得细胞表型；2-2示消化酶混合液2消化获得细胞表型；
图3示两种消化酶所获得的细胞收获量。
具体实施方式
本发明公开了一种消化酶组合物及其制剂、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的消化酶组合物及其制剂、应用中所用试剂、仪器均可由市场购得。其中，胶原酶I的规格为125CDU/mg，中性蛋白酶的规格为50000U/g，脱氧核糖核酸酶的规格为2000Kunitz units/mg，胰蛋白酶的规格为1800U/g，II型胶原酶的规格为125CDU/mg。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1消化酶混合液的制备
消化酶混合液组成如下：
实施例2消化酶混合液的制备
消化酶混合液组成如下：
实施例3消化酶混合液的制备
消化酶混合液组成如下：
实施例4消化酶混合液的制备
消化酶混合液组成如下：
实施例5胎盘MSC的分离培养
试验分为试验组、对照组1、对照组2、对照组3、对照组4。试验组采用实施例1的消化酶组合液对MSC进行消化，对照组1采用胶原酶I，对照组2采用胰蛋白酶进行消化，对照组3采用胰蛋白酶+DNase I进行消化，对照组4采用Ⅱ型胶原酶+DNaseⅠ进行消化。试验分组情况具体如表1所示：
表1试验分组及消化酶用量
组别 消化酶种类 消化酶用量
试验组 实施例1消化酶 100mL
对照组1 5μg/mL胶原酶I 100mL
对照组2 2.5ug/mL胰蛋白酶 100mL
对照组3 0.25μg/mL胰蛋白酶+1μg/mL DNase I 100mL
对照组4 1μg/mLⅡ型胶原酶+1μg/mL DNaseⅠ 100mL
试验方法：在无菌条件下将胎盘母体部分的绒毛膜，羊膜和蜕膜去除，将胎盘小叶剪下，用PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘中残留的血液。再用含有12.5U/mL的肝素钠，50U/mL和50U/mL的青霉素和链霉素的低糖DMEM冲洗胎盘小叶。将胎盘小叶剪成1cm3大小的组织块，再次用PBS冲洗。
各组加入如表1所示的消化酶在37℃孵育30分钟，将组织块用铜网过滤同时用注射器研磨。用含有10％FBS的MesenCultTM MSC专用培养基重悬消化液。剩余组织再次加入相应消化酶液在37℃孵育30分钟，将组织块用铜网过滤同时用注射器研磨。用含有10％FBS的MesenCultTM MSC专用培养基重悬消化液再次重悬消化液中止消化。收集两次的过滤后的消化液。
将上述得到的消化液PBS洗涤两次后，用MesenCultTM MSC专用培养基悬浮所获得的细胞按5×104个细胞/孔接种于六孔板，37℃、5％CO2全湿条件下培养48h，换液去除未贴壁悬浮细胞，继续培养，每隔3天换液一次。待早期散在细胞形成克隆后，将各克隆挑出用MSC培养基分别培养，1：4传代。
(一)细胞活率检测
检测各组活细胞数量、总细胞数量，计算细胞活率，计算公式为：
细胞活率＝(活细胞数量/总细胞数量)×100％。
结果如下表所示：
表2细胞活率检测结果
组别 活细胞数量 总细胞数量 细胞活率
试验组 1.27×108 1.34×108 94.78％
对照组1 1.00×108 1.06×108 94.34％
对照组2 0.92×108 1.25×108 73.60％
对照组3 1.01×108 1.43×108 70.62％
对照组4 1.02×108 1.19×108 85.71％
根据五组所提取出来细胞数量及活力来看，对照组2～4细胞活力偏低，不作进一步的研究，故对实施例1和对照组1作进一步的实验研究。
(二)细胞收获量测定
试验方法：取6块等重胎盘组织，3块用实施例1消化酶混合液1消化，余3块用对照组1消化酶混合液2消化，分离培养方法参照实施例5第一部分。比较细胞形态、表面抗原(CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105)、细胞连续培养至P5代的收获量。细胞形态见图1，表面抗原检测结果见图2，细胞收获量见表3、图3。
表3两种消化酶所获得的细胞收获量
组别 P1 P2 P3 P4 P5
对照组1 1.0×105 1.2×106 1.3×106 4.0×108 1.2×108
试验组 1.0×105 1.0×105 1.1×106 2.3×108 0.9×108
结果显示，两者的细胞形态无明显差异；表面抗原亦无明显差异；但是试验组的细胞收获量明显高于对照组。
取实施例2至4的消化酶消化胎盘组织，比较细胞形态、表面抗原(CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105)、细胞连续培养至P5代的收获量。结果与实施例1的消化酶相近。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种消化酶组合物，其特征在于，包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。
2.根据权利要求1所述的消化酶组合物，其特征在于，所述胶原酶I、所述中性蛋白酶与所述脱氧核糖核酸酶体积比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)。
3.根据权利要求1所述的消化酶组合物，其特征在于，所述胶原酶I、所述中性蛋白酶与所述脱氧核糖核酸酶体积比为1：0.5：2。
4.一种消化酶混合液，其特征在于，包括如权利要求1至3中任一项所述消化酶组合物和PBS。
5.根据权利要求4所述的消化酶混合液，其特征在于，在消化酶混合液中，所述胶原酶I的浓度为0.1～10μg/mL，所述中性蛋白酶的浓度为0.1～10μg/mL，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为0.1～10μg/mL。
6.如权利要求1至3中任一项所述消化酶组合物或如权利要求4或5所述消化酶混合液在分离间充质干细胞中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为胎盘间充质干细胞。
8.一种分离胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，采用如权利要求1至3中任一项所述消化酶组合物，或者采用如权利要求4或5所述消化酶混合液消化胎盘组织。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述消化的温度为36～38℃。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述消化的时间为10～60min。
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