CN107746839A - 一种高效消化山羊睾丸组织的组合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效消化山羊睾丸组织的组合酶，包括胶原酶、脱氧核糖核酸酶、中性蛋白酶和乙二胺四乙酸。本发明配方简单，使用效果好，能够用于稳定的从山羊睾丸组织获取单细胞，细胞成活率和所得细胞中生殖干细胞所占比例高，且培养后能有典型的生殖干细胞克隆出现。

Description

一种高效消化山羊睾丸组织的组合酶
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高效消化山羊睾丸组织的组合酶。
背景技术
随着现代生物技术的不断发展及进步，新的疾病治疗手段及方式正不断被公众关注。其中干细胞治疗目前被认为是最有潜力、最有前景的治疗方式。但由于现有干细胞在其分化潜能、伦理道德的限制及安全性等方面的限制，利用干细胞开展细胞治疗正受到越来越严格的监管。开发一种新的细胞治疗资源是当前干细胞发展的最迫切的需求。生殖干细胞已经被证明了其具有类似于胚胎干细胞的多能性，然而目前仍然没有关于山羊睾丸组织获取单细胞的稳定的分离方法。因此，需求一种能够从山羊睾丸组织稳定获取单细胞的高效消化山羊睾丸组织的酶。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效消化山羊睾丸组织的组合酶，采用三种酶与乙二胺四乙酸进行组合配合，形成一种组合酶，解决了山羊睾丸组织的酶解的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种高效消化山羊睾丸组织的组合酶，包括胶原酶、脱氧核糖核酸酶、中性蛋白酶和乙二胺四乙酸。
作为本发明的一种优选方案，所述胶原酶、脱氧核糖核酸酶、中性蛋白酶的质量比为100:1:100。
作为本发明的一种优选方案，所述胶原酶的浓度为2mg/mL。
作为本发明的一种优选方案，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为20μg/mL。
作为本发明的一种优选方案，所述中性蛋白酶的浓度为2mg/mL。
作为本发明的一种优选方案，所述脱氧核糖核酸酶与所述乙二胺四乙酸的质量比为20:1。
作为本发明的一种优选方案，所述乙二胺四乙酸的浓度为0.1mg/mL。
通过上述技术方案，本发明技术方案的有益效果是：本发明配方简单，使用效果好，能够用于稳定的从山羊睾丸组织获取单细胞，细胞成活率和所得细胞中生殖干细胞所占比例高，且培养后能有典型的生殖干细胞克隆出现。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为采用实施例1与对比例1、对比例2所得的细胞总数比较图。
图2为采用实施例1与对比例1、对比例2消化的成活率比较图。
图3为采用实施例1与对比例1、对比例2采用生殖干细胞标记Oct4的对比图。
图4为采用实施例1与对比例1、对比例2采用碱性磷酸酶染色显示的对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例采用一种高效消化山羊睾丸组织的组合酶，包括2mg/mL胶原酶、20μg/mL脱氧核糖核酸酶、2mg/mL中性蛋白酶和0.1mg/mL乙二胺四乙酸。
对比例1
对比例1采用现有的一种组合酶，包括2mg/mL胶原酶、20μg/mL脱氧核糖核酸酶和2mg/mL透明质酸酶
对比例2
对比例2采用现有的一种组合酶，包括1mg/mL胶原酶、10μg/mL脱氧核糖核酸酶、1mg/mL透明质酸酶和1mg/mL胰蛋白酶。
对比例1和对比例2为用于睾丸组织分解的两种常用组合酶，将这两种组合酶与本发明的实施例1进行对比。
结合图1至图4，取山羊睾丸组织，用剪刀剪碎山羊睾丸组织至厚约1mm，加入缓冲液，离心弃上清。然后分成3份，分别加入实施例1、对比例1、对比例2进行消化，分解酶消化20min；之后用1mg/mL胰蛋白酶和10μg/mL DNase消化10min，再加入DMEM工作液中止酶消化，室温下离心弃上清，取细胞悬液，倒入细胞瓶中，在室温下进行培养。
对消化后获得的细胞数量进行统计，从图1中可以看出，山羊睾丸组织经过实施例1、对比例1和对比例2的消化，都得到了一定数量的细胞。实施例1在获得细胞数量上没有明显的优势。
培养8h后，对细胞的存活率进行统计，从图2中可以看出，实施例1与对比例1和对比例2进行对比，细胞成活率高于对比例1和对比例2。
采用Oct4进行生殖干细胞标记，从图3中可以看出，生殖干细胞标记Oct4的表达，实施例1明显优于对比例1，而对比例1优于对比例2.
将消化后的细胞培养，第6天时碱性磷酸酶(AP)染色并比较细胞数，结合图4，实施例1培养出细胞集落，实施例1明显优于对比例1和对比例2，说明培养后实施例1能典型的生殖干细胞克隆显著高于对比例1和对比例2。
通过上述具体实施例，本发明的有益效果是：本发明配方简单，使用效果好，能够用于稳定的从山羊睾丸组织获取单细胞，细胞成活率和所得细胞中生殖干细胞所占比例高，且培养后能有典型的生殖干细胞克隆出现。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种高效消化山羊睾丸组织的组合酶，其特征在于，包括胶原酶、脱氧核糖核酸酶、中性蛋白酶和乙二胺四乙酸。
2.根据权利要求1所述的高效消化山羊睾丸组织的组合酶，其特征在于，所述胶原酶、脱氧核糖核酸酶、中性蛋白酶的质量比为100:1:100。
3.根据权利要求1所述的高效消化山羊睾丸组织的组合酶，其特征在于，所述胶原酶的浓度为2mg/mL。
4.根据权利要求2或3所述的高效消化山羊睾丸组织的组合酶，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为20μg/mL。
5.根据权利要求4所述的高效消化山羊睾丸组织的组合酶，其特征在于，所述中性蛋白酶的浓度为2mg/mL。
6.根据权利要求5所述的高效消化山羊睾丸组织的组合酶，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶与所述乙二胺四乙酸的质量比为20:1。
7.根据权利要求5所述的高效消化山羊睾丸组织的组合酶，其特征在于，所述乙二胺四乙酸的浓度为0.1mg/mL。
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