CN1904037A - 一种新的肉瘤细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的肉瘤细胞系的建立方法、由该方法得到的肉瘤细胞系以及该肉瘤细胞系的应用。所述新的肉瘤细胞系的建立方法为(1)将胚胎肌肉细胞进行原代培养，用组织块培养法或酶消化培养法；(2)细胞生长至融合时进行传代培养；(3)在原代培养后的2－7个月后，培养物中出现增殖旺盛的克隆，细胞获得不死性，恶性转化为肿瘤细胞，得到新的肉瘤细胞系。所述新的肉瘤细胞系表达波形蛋白和结蛋白，p16基因失活，不表达p16蛋白。采用该方法能够容易建立永生化的肉瘤细胞系，比传统的肉瘤细胞系建立方法简单，省时、省力，所建立的新的肉瘤细胞系对于肉瘤的研究和抗肉瘤药物的筛选有广泛的应用前景。

Description

一种新的肉瘤细胞系及其建立方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地是涉及一种新的肉瘤细胞系的建立方法、由该方法得到的肉瘤细胞系以及该肉瘤细胞系的应用。

背景技术：

体外培养的肿瘤细胞是研究肿瘤细胞生物学特性、癌变机理和癌症治疗的良好生物学模型。肿瘤细胞系的常规建立方法是应用肿瘤组织进行培养，如果在体外长期培养获得不死性，即为永生化的肿瘤细胞系。另外一种肿瘤细胞系的建立方法是对正常细胞进行培养，然后在细胞中导入癌基因如端粒酶基因[Biochem Biophys Res Commun.2004；315(3)：643-51.]、SV40大T抗原[Biochim Biophys Acta.2005；1722(1)：6-14.]、myc基因[Cancer Res.2005；65(6)：2179-85.]和人类乳头瘤病毒基因等[Int J Cancer.2004；110(3)：313-9.]，细胞才能长期存活，获得不死性，使细胞获得恶性表型。这两种建立永生化的肿瘤细胞系的方法成功率都很低。体外长期培养的人类成年正常细胞也能够发生恶性转化形成肿瘤，但这种恶性转化的机率较低[Cancer Res 2005；65(8)：3035-9]。

最近的研究证明，小鼠骨髓基质细胞经过多次传代后，细胞的增殖突破限制，转化为恶性表型，裸鼠体内移植形成纤维肉瘤。骨髓基质细胞恶性转化的机制与传代次数的增加、染色体异常的累积、端粒酶表达的逐渐升高和c-myc基因表达的升高有关[Stem Cell，2006，]。对人类的基质细胞的研究证明，成人的干细胞在体外的短期培养是安全的(4-8周)，而人类基质细胞长期培养会随机发生恶性转化(4-5月)，支持了癌症干细胞起源假说[Cancer Res 2005；65(8)：3035-9]。

体外培养的人类细胞具有两个控制点调节细胞的存活寿命：衰老期和危机期。衰老与中等程度的端粒缩短有关，细胞周期阻滞。如果细胞能够渡过此期，细胞继续增殖直到端粒变得极短，细胞进入危机期。此时细胞表现为无显著特点的染色体不稳定性，导致细胞大量调亡。[Cell 1999；97：527-38.]如果此时的细胞能够渡过危机期，就可能获得永生化。人类细胞体外自发永生化的机率极低，对体外自发转化有一定的抵抗。

以前国内可见对人类胚胎肌肉细胞的长期培养研究，但未见培养细胞发生随机恶性转化的研究报告[柳霞，等.第四军医大学学报2004，25(13)；高振南，等.华西口腔医学杂志2005，23(2)；王守立，等.生物医学工程学杂志，2004，21(2)；陈晓萍，等.生理学报2003，55(4)；杨志明，等.中国修复重建外志2001，15(05)]。目前国际上也无利用人类的胚胎肌肉组织培养，细胞恶性转化为肉瘤细胞系的报告，也没有利用这种方法建立的肿瘤细胞系。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的肉瘤细胞系的建立方法。

所述新的肉瘤细胞系的建立方法包括以下步骤：

1将哺乳动物的胚胎肌肉细胞进行原代培养，用组织块培养法或酶消化培养法；

2细胞生长至融合时代进行传代培养；

3在体外培养2-7个月后，培养物中出现增殖旺盛的克隆，细胞获得不死性，恶性转化为肿瘤细胞。

所述的肉瘤细胞系的建立方法还包括：

4恶性转化后经过4～30次传代后，应用克隆培养法获得单克隆的细胞株；

5采用免疫细胞化学的方法或分子生物学方法对肿瘤细胞进行鉴定；

6将获得不死性的细胞裸鼠皮下移植，证明其致瘤性。

步骤(3)中在体外培养的时间优选为3-5个月后，培养物中出现增殖旺盛的克隆，细胞获得不死性，恶性转化为肿瘤细胞，即得到新的肉瘤细胞系。

所述培养基中含有血清的成分。

所述的培养基最优选为含10％小牛血清的DMEM/F12的培养基。

所述的胚胎肌肉细胞来源于人类的胎龄从孕期7周到出生的胚胎组织。

本发明的另一目是提供一种的新的肉瘤细胞系，该肉瘤细胞系由哺乳动物的胚胎肌肉细胞进行培养，经上述肉瘤细胞系的建立方法制备得到，其还具有以下特征：该肉瘤细胞系表达波形蛋白和结蛋白，p16基因失活，不表达p16蛋白。

所述新的肉瘤细胞系的病理类型为软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤或成骨肉瘤；或者是以上肉瘤成分的组合。

所述的软骨肉瘤为含有纤维肉瘤和软骨肉瘤两种成分的去分化软骨肉瘤。

所述的肉瘤细胞系具有胞浆中含有脂滴的超微结构特征。

本发明的另一目是提供以上所述的新的肉瘤细胞系在抗肉瘤药物的筛选中的应用。

本发明的独特之处在于发现了一种新的建立肉瘤细胞系的方法，将哺乳动物(包括人类)的胚胎肌肉细胞进行原代培养和传代培养，体外培养2-7个月后，细胞恶性转化为肉瘤细胞系。采用这种方法能够容易建立永生化的肉瘤细胞系，比传统的肉瘤细胞系建立方法简单，省时、省力，而且能建立一种国内外首次建立的含有纤维肉瘤和软骨肉瘤两种成分的去分化软骨肉瘤。所建立的新的肉瘤细胞系对于肉瘤的研究和抗肉瘤药物的筛选有广泛的应用前景。

附图说明

图1是显微镜下(×10)肌肉组织中细胞贴壁移行的示意图；

图2是显微镜下(×10)培养皿中出现的增殖旺盛的细胞克隆，核分裂相多见，此时的细胞已经恶性转化的示意图；

图3是相差显微镜下(p32，×10)的体外长期培养的细胞形态示意图；

图4是电子显微镜(×2500)检查MS0812细胞骨架成分和细胞的微观结构示意图；

图5是显微镜下(p80，×10)免疫细胞化学染色，波形蛋白表达示意图；

图6是显微镜下(p107，×10)PCNA阳性，表达部位在细胞核的示意图；

图7是显微镜下(p100，×100)MS0812细胞系的染色体分析，典型的中期分裂相的示意图；

图8是MS0812骨分化相关基因的表达的示意图；

图9是裸鼠皮下肿瘤形成，移植后2个月的示意图；

图10是肿瘤组织浸润裸鼠皮下组织的示意图；

图11是显微境下(10×)肿瘤组织沿肌间隙浸润裸鼠肌肉组织的示意图；

图12是显微境下(20×)肿瘤组织编织成束状，单个细胞呈成纤维细胞形态的示意图；

图13是显微境下(40×)肿瘤组织中核大深染，可见核分裂相的示意图；

图14是显微境下(10×)皮下移植两个月肿瘤组织中有岛状的软骨样细胞形成，呈灶性分布的示意图；

图15是显微境下(20×)形成的软骨结构有一定的异型性，类似软骨肉瘤的病理表现的示意图；

图16是显微境下(20×)有的肿瘤组织中含有的软骨肉瘤组织较多，此图中的绝大部分细胞未软骨肉瘤细胞的示意图；

图17是阿立新蓝染色将软骨肉瘤细胞染成蓝色的示意图；

图18是甲苯胺蓝将软骨肉瘤细胞染成紫红色的示意图；

图19是免疫组织化学染色可见软骨肉瘤细胞S100阳性表达，而纤维肉瘤细胞S100阴性的示意图；

图20是MS0504裸鼠皮下移植形成的肿瘤的病理特征为纤维肉瘤的示意图。

具体实施方式

将哺乳动物(包括人类)的胚胎肌肉组织进行培养，胚胎的胎龄从孕期7周一直到出生；培养的方法为贴壁培养，可以应用组织块直接培养，也可以将肌肉组织酶消化后培养，消化的酶类包括胶原酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、透明脂酸酶、脱氧核糖核酸酶，或者乙二胺四乙酸二钠(EDTA)等；培养基中一般含有血清的成分，如牛血清、马血清、兔血清或者鸡胚提取物，培养基的基本成分为DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)，用于培养的基础培养基包括以下多种，但不仅限于以下描述的内容：DMEM、ADC-1、RPMI1640、BGJ、HAMF10、F12、DCCM1、IMEM-20、M199、MEME、CMRL1415、CMRL1969、CMRL1066、NCTC135、MB75261、MAB8713、DM145、MCDB202、MCDB401、MDBC153，最常用的是DMEM培养基和DMEM/F12(1∶1)，培养基中最优为含有10％的胎牛血清(GIBCO/BRL)，该血清的浓度也可以波动在很宽的范围，最低可以在1％左右，最高可达50％以上。也可以将胎牛血清改为其它动物血清，如大鼠、羊、兔等的血清。培养基中可加入L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、两性霉素或氟康唑等抗细菌和真菌的药物，也可以不加以上成分。组织块培养在培养皿或培养瓶中，一般在原代培养12小时后就能发现贴壁的细胞，贴壁细胞的成分含有成肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和其它的基质细胞，依据胎龄的不同各种细胞成分有一定的差别。

对于培养的细胞的鉴定主要是基于细胞的表面分子和细胞内的蛋白和基因的表达，这些方法包括(1)用免疫细胞化学的方法检测细胞内蛋白和表面分子的表达，具体可用流式细胞仪，也可以用间接免疫荧光的方法直接在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察蛋白的表达。(2)在mRNA水平检测相应基因的表达，可用原位杂交的方法，或RT-PCR技术对基因的表达进行鉴定，也可以用Northern杂交的方法和基因芯片技术对cDNA检测。(3)在蛋白水平可用Western杂交的方法鉴定，对蛋白表达的多少可以进行定量分析。

原代培养细胞贴壁后能够继续增殖，当细胞趋于融合时进行传代培养，一般细胞在体外培养时间超过3个月，细胞会逐渐衰老，最后死亡。但有部分细胞能够渡过衰老期和危机期，细胞发生转化而获得不死性。能够恶性转化为肉瘤细胞，在裸鼠体内移植能够形成肉瘤组织。细胞发生恶性转化最常见的时间是体外培养2个月至7个月后，或传代培养5-15代的时候。来源的肉瘤细胞系可能来源于干细胞的随机突变。细胞转化的标志是增殖速度明显加快，癌基因表达和抑癌基因的失活。

在体外长期培养条件下，人类胚胎肌肉组织的细胞发生恶性转化的机率很高，大约50％的人类胚胎肌肉长期培养会发生细胞的恶性转化。恶性转化的细胞为肌肉细胞来源。其特征是表达波形蛋白和结蛋白，p16基因失活，不表达p16蛋白。裸鼠皮下移植都能够形成肉瘤组织，常见的病理类型为软骨肉瘤和纤维肉瘤。

实施例1：一种具有软骨肉瘤特性的细胞系的建立

一、方法

1建系过程

流产胚胎，7-13周龄，组织的获取得到病人或家属的同意。无菌条件下取大腿肌肉组织进行培养。无菌条件下切取胚胎大腿肌肉组织，浸泡于含有双抗(青霉素100μ/ml、链霉素100μg/ml)及两性霉素B(2μg/ml)的生理盐水中，用含有双抗及两性霉素B的无菌生理盐水及DMEM培养液各冲洗3遍，剪成0.5-1mm³小组织块，接种一个24孔培养板中。将小组织块贴附于培养板底部，加入少量含DMEM/10％血清的培养液，将培养板放入37℃、含5％CO₂及一定湿度的CO₂培养箱中培养，10小时后加入足量的培养基，使肌肉组织块浸泡于培养液中。第二天少量补液，每天观察细胞生长情况。以后每2天更换培养基，培养第1-7天，可见贴壁组织块周围有细胞爬出，随着培养时间延长，贴壁的细胞不断增多，细胞集落明显增大，培养第20天，将24孔培养板中的细胞0.25％胰酶-0.02％EDTA(乙二胺四乙酸二钠)消化细胞5分钟，收集细胞，离心1000rpm，5分钟，用培养液重悬细胞，移入培养瓶中持续培养。细胞生长至融合时，将其消化、离心、传代培养，细胞重新贴壁生长；细胞以后连续传代，以后每1-2天传代1次。

2.细胞系的维持、冻存与复苏

取对数生长期细胞，0.25％胰酶-0.02％EDTA消化细胞5min，收集细胞，离心1000rpm，5min，用培养液重悬细胞，1瓶细胞分种2～3瓶，同时冻存适量细胞，冻存液为培养液，含有10％-20％二甲基亚砜，放入液氮罐中或超低温冰箱中永久保存。细胞复苏时，将盛有细胞的冷冻管从液氮或超低温冰箱中取出，37℃水浴，使细胞融化、离心、弃上清，将预温至37℃、含有10％血清的培养液加入离心管中重悬细胞，置于37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养。

3.形态学观察将细胞接种于放有盖玻片的小平皿中，长成单层，经PBS洗涤后，用4％多聚甲醛固定，做常规HE染色及免疫组化染色。免疫细胞化学检查波形蛋白、PCNA、p16等在细胞中的表达。

4.染色体分析取对数生长期细胞，加入终浓度为0.04μg/ml的秋水仙素，5％CO₂、37℃孵育2h，吸出培养液，用0.25％胰酶消化细胞，离心1500rpm，8min，弃上清，加入0.075M KCl，37℃水浴20min，离心弃上清，加入新鲜配制的固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)，室温固定10min，离心后弃上清，重复固定一次，滴片，室温干燥，进行Gemsa染色，进行核型分析。

5.裸鼠成瘤实验

BALB/C nu/nu裸鼠，雌雄兼具，7-11周龄，购自中山大学实验动物中心。饲养条件：恒温26±1℃，恒湿50％～70％；饮水、饲料、垫料及笼具均经高压灭菌，并在无菌操作下定期更换。取对数生长期细胞制备成细胞悬液接种裸鼠，接种量1×10⁶细胞/只或2×10⁶细胞/只，其中皮下细胞接种裸鼠，雌雄兼具。观察成瘤率、肿瘤潜伏期。皮下接种的裸鼠在当肿瘤接种1-4个月，照相后处死。取出肿块作病理组织学检查。所有裸鼠对全身重要脏器进行病理学检查，注意有无局部淋巴结及全身转移。

二、结果

1.形态学观察胎儿骨骼来源的细胞原代培养2-5天，可见组织块周围有成纤维样细胞生长，细胞呈梭形，中有圆形或椭圆形核；细胞大小形态均匀一致(图1)。10-15d(天)后细胞融合成片，原代培养的细胞70％-80％为成肌细胞，表达结蛋白，但不表达肌球蛋白。培养超过2周，在培养板中可见肌管结构形成，肌管为多核细胞结构，表达成熟肌细胞的标志物肌球蛋白。细胞融合面积达80％予传代，传至4-5代左右大部分细胞停止增殖，相继衰老死亡(体外培养约2个月)。也有少部分细胞在体外培养3个月左右细胞的形态发生变化，增殖速度明显加快，细胞呈单层贴壁生长，无明显接触抑制，核分裂相多见(图2)。细胞能够在体外长期传代培养，目前已经培养两年，细胞已经获得不死性，细胞系命名为MS0812。在相差显微镜下，细胞为成纤维细胞形态，梭形，可重叠生长(图3)。细胞可以冻存和复苏。

透射电镜下可见：细胞大小均匀，呈圆形，表面可见微绒毛结构，核呈圆形或不规则形状，细胞核明显增大，多为单核，偶见2个核细胞，可见核分裂相，核膜可有内陷或外凸，核的形态不规则，核异染质增多，凝集成块状或聚集在核膜下，核仁增大，数目增多，形状和位置不规则(图4)。细胞浆中典型的特征是可见较多脂滴结构(图4)。

2.免疫细胞化学染色MS0812细胞波形蛋白(图5)、PCNA(图6)等阳性表达；p16、CD31、CD34、HLA-DR等在细胞中的无表达。

3.核型分析分析分离中期细胞，细胞染色体数目波动在55～158之间，众数为71～84条染色体占总数的75％，染色体可见双着丝粒、环状染色体、易位等结构异常(图7)。

4.基因芯片分析

基因芯片(SuperArray Bioscience Corporation)检测骨分化有关的基因的表达，初步的结果证明MS0812表达软骨分化相关基因如碱性磷酸酶、2型胶原、9型胶原、10型胶原、纤维粘连蛋白(Fibronectin)金属基质蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9和骨形态发生蛋白1(BMP1)、BMP4、BMP8、RUNX2(CBFA1)等，而不表达骨分化的基因1型胶原(附图8)。

5.裸鼠皮下移植

裸鼠移植成瘤细胞系皮下接种裸鼠(8-12周)，成瘤率为100％，肿瘤形成潜伏期为14～40天(平均20天)(图9)；当皮下移植瘤直径达1cm时，将细胞接种裸鼠处死，取下肿瘤。从大体形态上观察，表面有丰富的血管，切面白色，质脆。病理组织学证实，细胞接种裸鼠后形成的肿瘤为类似平滑肌肉瘤，瘤细胞排列成束状，纵横交织，也可呈旋涡状(附图10，12，13)。肿瘤浸润至周围的脂肪、皮肤、肌肉和神经组织；对肌肉组织的侵袭主要沿着肌间隙进行，反应了肿瘤的低度恶性(图11)。高度分化，可见病理性核分裂。皮下移植瘤未见全身重要脏器及局部淋巴结转移。我们对1个月内的皮下移植瘤标本进行检查，未发现肿瘤组织中含有软骨结构；在肿瘤生长超过2个月的肿瘤标本中，在大部分的肿瘤组织中发现了软骨样结构(图14)，软骨样结构与软骨肉瘤的病理表现基本一致，软骨细胞具有异型性(图14，15)；软骨样细胞大部分呈集落样灶性分布，细胞个数最多可达数百。也有散在的单个软骨细胞。组织化学检查发现：软骨岛细胞甲苯胺蓝染色(图16)和阿利新蓝(Alcian)特染阳性(图17)；免疫细胞化学证明软骨岛的细胞S100阳性表达(图18)。肿瘤组织中偶尔可发现病理性骨组织。

这种细胞系裸鼠皮下移植形成的肿瘤的病理表现符合去分化软骨肉瘤，它为软骨肉瘤的特殊类型，肿瘤内含有2种明确区分的成分；一种为高分化的软骨肿瘤，可以是内生性软骨瘤或低级别软骨肉瘤，另一种为高级别非软骨肉瘤(本细胞系的成分为纤维肉瘤)。这两种成分分界清楚，组织学上表现突然转化。肿瘤内高度间变形非软骨性肉瘤成分是来自原先存在的高分化软骨成分还是来自完全不同的非软骨形细胞克隆是长期争论的问题，最近细胞遗传学研究结果倾向于认为肿瘤内分化与“去分化”2种成分可能起源于一种共同的原始间叶细胞。因此用去分化这个名称反映肿瘤内间变性非软骨成分可能并不恰当，但“去分化”概念已广泛应用于文献，目前仍沿用这一名称。

实施例2：一个具有纤维肉瘤特性的细胞系的建立

采用与实施例1相同的方法，对人类胚胎肌肉来源的细胞进行培养，培养时间超过3-4个月，细胞恶性转化获得了永生化肌肉来源的细胞系，体外培养超过100代，细胞仍维持原来的增殖速度，获得不死性，此细胞系命名为MS0504。目前体外连续培养12个月，细胞的增殖速度没有减慢，每隔一天传代1次，细胞倍增时间约为26-28小时，细胞的体外生长状态为类似成纤维细胞。染色体分析证明为多倍体；透射电镜下可见细胞表面微绒毛结构，胞质内可见较多脂滴样结构，线粒体、高尔基体、粗面内质网均可见，还可见较多糖原颗粒，个别细胞可见较多髓样小体样结构，未见肌丝横纹结构。细胞在软琼脂中没有克隆形成能力；细胞表达波形蛋白和结蛋白(desmin)，但不表达肌球蛋白；少数细胞(5％左右)表达α平滑肌肌动蛋白(alpha-SMA)。裸鼠皮下移植能够形成肿瘤组织，肿瘤组织的成分为纤维肉瘤的细胞结构，细胞分化程度高，但有异型性(图20)。在肿瘤组织中无软骨肉瘤样的岛状结构。

实施例3：肉瘤细胞系用于抗癌药物的筛选

不同的癌细胞对不同的化疗药物具有不同的敏感性，因此采用癌细胞体外培养方法，既可研究某种药物对不同癌细胞的敏感性，为药物抗癌敏感谱提供依据，同时又可采用某种癌细胞开展对不同药物，不同剂量的敏感性研究，以筛选出对该肿瘤最敏感的化疗药物和使用剂量，供人体治疗时参考。

研究的药物可以为多种，但不仅限于列出的几种：阿霉素(ADM)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、鬼臼噻吩甙(VM-26)、长春新碱(VCR)、环己亚硝脲(CCNU)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺氯氨铂(CDDP)、氨甲喋呤(MTX)、异搏定、红霉素、潘生丁、P-gp单克隆抗体、复方丹参等。

MS0812细胞种植在96孔培养板中，鬼臼乙叉苷(VP16)(Alexis Biochemicals，SanDiego，CA；0-1000ug/ml)或doxorubicin(Sigma；0-30ug/ml)37℃处理48小时。细胞存活率用细胞计数试剂盒-8(Dojindo Molecular Technologies，Inc.)，按试剂盒说明书进行。药物的抑制效果(％对照)的计算应用公式：无药物处理的吸光度—药物处理的吸光度/无药物处理的吸光度。EC50定义为药物处理组细胞存活率为无药物处理对照组50％的该药的药物浓度。实验重复3次。

肉瘤细胞系可以用于抗癌药物的筛选，证明恶性转化的成肌细胞与他们来源的母体细胞具有不同的性质，选择了两种抗癌药物VP16和doxorubicin来比较恶性转化的细胞和他们来源的母体细胞(p1)对治疗的反应。在鬼臼乙叉苷(VP16)处理后48小时，P1(第一代细胞)和P63(63代细胞)的抑制50％的细胞活性(与未处理的对照相比)的药物浓度分别是185.54±21.20ug/ml和1.07±0.07ug/ml(mean±SD)，在P1和P63代细胞VP16抑制曲线是显著分离的，研究证明VP16的药物浓度在很宽的范围内都是安全的，对正常的细胞(p1)没有引起严重的毒副作用，而其对肿瘤细胞(p63)的治疗作用是明显的。

与此形成对比，doxorubicin对P1和P63的抑制曲线非常接近，doxorubicin对P1和P63的平均EC50分别是0.49±0.18ug/ml和0.16±0.05ug/ml，显示其毒副作用非常明显，毒性曲线和治疗曲线没有明显分离。这些发现提示doxorubicin对病人可能有严重的副作用，如心肌损害和骨髓抑制。综合以上的研究，这个细胞系统是一种独特的细胞模型，可用于对敏感药物筛选以确定敏感药物的类型和剂量，而对正常的细胞没有严重的副作用。

Claims (10)

1.一种新的肉瘤细胞系的建立方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)将哺乳动物的胚胎肌肉细胞进行原代培养，用组织块培养法或酶消化培养法；

(2)细胞生长至融合时进行传代培养；

(3)在体外培养2-7个月后，培养物中出现增殖旺盛的克隆，细胞获得不死性，恶性转化为肿瘤细胞，即得到新的肉瘤细胞系。

2.根据权利要求1所述的新的肉瘤细胞系的建立方法，其特征是，还包括以下步骤：

(4)恶性转化后经过4～30次传代后，应用克隆培养法获得单克隆的细胞株；

(5)采用免疫细胞化学的方法或分子生物学方法对肿瘤细胞进行鉴定；

(6)将获得不死性的细胞裸鼠皮下移植，证明其致瘤性。

3.根据权利要求1或2所述的新的肉瘤细胞系的建立方法，其特征是，所述的胚胎肌肉细胞来源于人类的胎龄从孕期7周到出生的胚胎组织。

4.根据权利要求1或2所述的新的肉瘤细胞系的建立方法，其特征是，步骤(3)为：在体外培养3-5个月后，培养物中出现增殖旺盛的克隆，细胞获得不死性，恶性转化为肿瘤细胞，即得到新的肉瘤细胞系。

5.根据权利要求1所述的新的肉瘤细胞系的建立方法，其特征是，所述培养基中含有血清的成分。

6.一种由权利要求1-5任一所述方法得到的新的肉瘤细胞系，其特征是，它具有以下特征：该肉瘤细胞系表达波形蛋白和结蛋白，p16基因失活，不表达p16蛋白。

7.根据权利要求6所述的新的肉瘤细胞系，其特征是，所述新的肉瘤细胞系的病理类型为软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤或成骨肉瘤；或者是以上肉瘤成分的组合。

8.根据权利要求7所述的新的肉瘤细胞系，其特征是，所述软骨肉瘤为含有纤维肉瘤和软骨肉瘤两种成分的去分化软骨肉瘤。

9.根据权利要求7所述的新的肉瘤细胞系，其特征是，所述的肉瘤细胞系具有胞浆中含有脂滴的超微结构特征。

10.如权利要求6-9任一所述的新的肉瘤细胞系在抗肉瘤药物的筛选中的应用。

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