KR20230130299A - 인간 피부 혈관육종 세포주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 피부 혈관육종(cutaneous angiosarcoma; CAS) 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 두피에서 얻은 인간 혈관육종 표본에서 확립한 2개의 인간 피부 혈관육종 세포주 KU-CAS3 및 KU-CAS5 및 이의 용도에 대한 것이다. 본 발명의 KU-CAS3 및 KU-CAS5 세포주를 누드마우스에 피하주사하고, 누드마우스에서 생성된 종양을 16주에 채취하여 조직학적 검사를 시행한 결과, 생성된 조직은 CD31, p53 양성이었으며, 혈관육종임을 확인하였다. 또한, 짧은 탠덤 반복 분석(Short Tandem Repeat analysis)를 시행하여 환자로부터 채취한 조직, 세포주, 실험동물에서 생성된 조직의 유전적 동일성을 확인하였다. 본 발명에 따른 인간 피부 혈관육종 세포주는 혈관육종의 병리 과정을 규명하기 위한 재료로서 사용될 수 있으며, 혈관육종 환자의 치료에 효과가 있는 화학항암요법 혹은 면역항암요법을 개발하기 위한 재료로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

인간 피부 혈관육종 세포주 및 이의 용도{human cutaneous angiosarcoma cell lines and uses thereof}
본 발명은 인간 피부 혈관육종(cutaneous angiosarcoma; CAS) 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 두피에서 얻은 인간 혈관육종 표본에서 확립한 2개의 인간 피부 혈관육종 세포주 KU-CAS3 및 KU-CAS5 및 이의 용도에 관한 것이다.
피부 혈관육종(cutaneous angiosarcoma; CAS)은 드물게 발생하는 악성종양이지만 예후가 극히 불량하여 수술적으로 절제를 시행하여도 전신 전이가 일어나 조기에 사망하게 된다. 조기 전이 경향이 있는 공격적인 과정을 따르지만 이 질병의 특성이 완전히 이해되지 않았으며, 이 질병에 대한 표준 치료 프로토콜이 확립되지 않았다. 이것은 주로 낮은 발생률에 기인할 수 있는데, 이러한 낮은 발생률의 경우, 대규모 무작위 대조 임상 시험은 거의 채택되지 않으며, 신뢰할 수 있는 실험 배경이 그 단점을 보완할 수 있다. CAS의 생물학적 특성을 조사하려면 확립된 CAS 세포주가 필요하다.
현재까지 3개의 인간 CAS 세포주(ISO-HAS, AS-M 및 HAMON)가 보고되었다. 첫 번째 세포주 ISO-HAS는 쥐-표현형 혈관육종 세포주(ISOS-1)로부터 조건 배지를 사용하여 두피에 발생하는 혈관육종(hemangiosarcoma 또는 angiosarcoma)으로부터 분리되었다. 다른 세포주 AS-M은 두피 혈관육종에서 분리되었지만, 누드 마우스에서 종양 발생 가능성을 보이지 않았다. 인간 혈관육종 단일 클론(HAMON) 세포주는 시험관 내 및 생체 내 실험 모델로 확립되었다. 그러나 인간 CAS 세포주는 여전히 많은 연구자들이 구하기 어려운 실정이다.
중국공개특허 CN 001904037 (2007.01.31 공개)
본 발명은 CD31에서 대해 양성이고, CD34 및 CD45에 대해 음성이며, 아드레날린 수용체 베타 2(adrenergic receptor beta 2; ADRβ2), VEGF1 및 VEGF2 수용체를 과발현하는 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 악성 피부혈관 육종 치료제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 CD31에서 대해 양성이고, CD34 및 CD45에 대해 음성이며, 아드레날린 수용체 베타 2(adrenergic receptor beta 2; ADRβ2), VEGF1 및 VEGF2 수용체를 과발현하는 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 피부혈관 육종 환자의 두피로부터 0.3 내지 1.5 g의 피부혈관 육종 조직을 분리하는 단계; 상기 분리된 피부혈관 육종 조직을 콜라게나제(collagenase)로 처리하는 단계; 상기 처리된 조직을 원심분리하여 세포 펠렛을 배지에 배양하는 단계; 및 상기 배양한 세포로부터 CD31 내피세포를 분리하는 단계를 포함하는, 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주에 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 약물 후보 물질을 접촉한 세포주에서 피부혈관 육종 세포의 증식능 또는 전이능을 측정하는 단계; 및 대조군과 비교하여 피부혈관 육종 세포의 증식능 또는 전이능이 억제된 약물 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 악성 피부혈관 육종 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 피부 혈관육종(cutaneous angiosarcoma; CAS) 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 두피에서 얻은 인간 혈관육종 표본에서 확립한 2개의 인간 피부 혈관육종 세포주 KU-CAS3 및 KU-CAS5 및 이의 용도에 대한 것이다. 본 발명의 KU-CAS3 및 KU-CAS5 세포주를 누드마우스에 피하주사하고, 누드마우스에서 생성된 종양을 16주에 채취하여 조직학적 검사를 시행한 결과, 생성된 조직은 CD31, p53 양성이었으며, 혈관육종임을 확인하였다. 또한, 짧은 탠덤 반복 분석(Short Tandem Repeat analysis)를 시행하여 환자로부터 채취한 조직, 세포주, 실험동물에서 생성된 조직의 유전적 동일성을 확인하였다. 본 발명에 따른 인간 피부 혈관육종 세포주는 혈관육종의 병리 과정을 규명하기 위한 재료로서 사용될 수 있으며, 혈관육종 환자의 치료에 효과가 있는 화학항암요법 혹은 면역항암요법을 개발하기 위한 재료로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1A는 100 계대 컨플루언스(confluence)에서의 피부 혈관육종 세포 형태를 나타낸다. 왼쪽: KU-CAS3, 오른쪽: KU-CAS5 (배율: ×40). 도 1B는 2개의 피부 혈관육종 세포주의 유세포 분석 결과를 나타낸다. 왼쪽부터 CD31, CD34, CD45 및 아드레날린성 β2 수용체. 도 1C는 관 형성 분석 결과를 나타낸다. Scale bar = 1000 μm. 도 1D는 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein; LDL) 흡수 분석 결과를 나타낸다. 왼쪽: HUVECs, 중간: KU-CAS3, 오른쪽: KU-CAS5. Scale bar = 200 μm.
도 2A는 HUVECs 및 2개의 피부 혈관육종 세포주의 면역형광분석 결과를 나타낸다. Scale bar = 100 μm. 도 2B는 KU-CAS 및 HUVECs에서 아드레날린성 수용체 및 VEGF 수용체의 상대적 유전자 발현 결과를 나타낸다.
도 3A는 2 × 106의 암세포를 피하 주입 후 16주 차에 누드마우스 등에서의 신생물 성장 결과를 나타낸다. 왼쪽: KU-CAS3 (passage 16), 중간: KU-CAS5 (passage 13), 오른쪽: 성작 곡선(KU-CAS3 및 KU-CAS5-유도 신생물의 최종 부피는 각각 220.4 ± 184.0 mm3 및 487.1 ± 282.6 mm3). 도 3B는 각 신생물 유도 후 성장 곡선을 나타낸다. 위: KU-CAS3, 아래: KU-CAS5. 도 3C는 1차 종양(환자 3) 및 KU-CAS3 유도된 종양의 조직학적 특성을 비교한 결과이다. ×400. Scale bar = 100 μm. 도 3D는 누드마우스로부터 채취한 신생물(KU-CAS5) 및 1차 종양(환자 5)의 조직학적 특성을 비교한 결과이다. ×200. Scale bar = 200 μm.
본 발명은 CD31에서 대해 양성이고, CD34 및 CD45에 대해 음성이며, 아드레날린 수용체 베타 2(adrenergic receptor beta 2; ADRβ2), VEGF1 및 VEGF2 수용체를 과발현하는 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주을 제공한다.
바람직하게는, 상기 세포주는 KCLRF-BP-00518로 기탁된 KU-CAS3 세포주 또는 KCLRF-BP-00519로 기탁된 KU-CAS5 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 KU-CAS3 세포주의 배가시간(Doubling time)은 34시간이고, 상기 KU-CAS5 세포주의 배가시간(Doubling time)은 29시간일 수 있다.
또한, 본 발명은 피부혈관 육종 환자의 두피로부터 0.3 내지 1.5 g의 피부혈관 육종 조직을 분리하는 단계; 상기 분리된 피부혈관 육종 조직을 콜라게나제(collagenase)로 처리하는 단계; 상기 처리된 조직을 원심분리하여 세포 펠렛을 배지에 배양하는 단계; 및 상기 배양한 세포로부터 CD31 내피세포를 분리하는 단계를 포함하는, 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주는 CD31에서 대해 양성이고, CD34 및 CD45에 대해 음성이며, ADRβ2, VEGF1 및 VEGF2 수용체를 과발현할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주에 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 약물 후보 물질을 접촉한 세포주에서 피부혈관 육종 세포의 증식능 또는 전이능을 측정하는 단계; 및 대조군과 비교하여 피부혈관 육종 세포의 증식능 또는 전이능이 억제된 약물 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 악성 피부혈관 육종 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 “피부혈관 육종(cutaneous angiosarcoma; CAS) 치료제”란 피부혈관 육종 세포를 파괴하는 기작을 갖는 약물 또는 화학제제를 말하며, 대부분의 암 치료제는 세포에 다발성 손상을 일으키고, 세포를 더 이상 복제되지 않도록 하는 작용을 하며, 암의 전이, 이동성을 억제하는 역할을 할 수 있다. 상기 피부혈관 육종 치료제는 내성세포주 또는 일반세포주에 투여시 전이능 또는 증식능을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 “전이능” 또는 “전이성”이란 암 세포의 전이 능력을 의미할 수 있으며, 상기 전이(metastasis)란 원발 부위로부터 다른 조직으로 악성 종양이 퍼져나가는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 용어 “대조군”이란 약물 후보 물질을 접촉시키지 않은 상태의 세포주를 의미할 수 있다.
상기 약물 후보 물질이란 피부혈관 육종 질환에 대한 치료효과가 있는 것으로 예상되어, 치료 효과를 측정하기 위한 실험대상으로 사용될 수 있는 모든 물질을 의미하며, 실험동물에 적용할 수 있고 치료 효과를 측정할 수 있으면 천연물질 또는 그로부터 얻어진 것이든, 인공적으로 합성된 것이든 제한되지 않고, 그 종류도 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 환자
본 발명은 헬싱키 선언을 완전히 준수하여 수행되었으며, 고려대학교 의료원 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았다(IRB No. 2017AS0138, 2017AN0375).
혈관육종 조직은 헬싱키 선언에 따라, 서면 동의를 받은 5명의 한국인 환자로부터 얻었다. 3명의 환자로부터 얻은 조직은 불멸화 세포주로 발달하지 못하였고, 2명의 환자로부터 얻은 2개의 혈관육종 세포주(KU-CAS3 및 KU-CAS5)가 확립되었다(표 1). 환자 3에게는 두피의 1차 CAS에 대해 넓은 절제와 전외측 대퇴 유리 피판술(free anterolateral thigh flap coverage)을 시행했다. 상기 환자는 수술 후 방사선 치료(평균 누적 방사선량 6240 센티그레이[centigray; cGy])를 받았지만 호흡 부전으로 사망했다. 환자 5에게는 넓은 절제술 및 광배근 유리 피판술(free latissimus dorsi flap coverage)을 시행했다. 수술 후 환자는 파클리탁셀로 화학 요법을 시작했지만 첫 번째 주기가 완료되기 전에 사망했다. 두 환자 모두에서 이하선으로의 전이가 발견되었다.
[표 1]
2. 분리 및 배양
CAS 조직은 절제 수술 후 수술 표본에서 얻었다. 세포 배양을 위해 얻은 조직의 무게는 0.3~1.5g 범위이다.
CAS 조직을 인산완충식염수(PBS)로 세척하고 가위를 사용하여 2mm 미만의 작은 조각으로 잘랐다. 그런 다음 조직을 0.25% 콜라게나제 유형 I(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 함유하는 PBS로 37℃에서 1~2시간 동안 부드럽게 교반하면서 처리했다. 소화된 조직을 300g에서 10분 동안 원심분리하고, 세포 분획을 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, NY, USA)을 함유하는 PBS로 세척하였다. 샘플을 300g에서 5분 동안 다시 원심분리하였다. 상층액을 버리고 펠렛을 보충 혼합물(ECGM-SM; Promocell)이 포함된 내피 세포 성장 배지 MV(Promocell, Heidelberg, Germany)에 재현탁한 후, 70μm 나일론 메쉬 필터를 통해 여과하였다. 여과된 세포 분획은 분리 절차 전에 5% CO2 조건의 37℃에서 최소 24시간 동안 반응시켰다.
CAS 세포는 제조업체의 지침에 따라 CD31 내피 세포 분리 키트(Dynabeads; Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA)를 사용하여 특이적으로 선별되었다. 분리된 세포는 서브컨플루언시(subconfluency)(약 80-90%)에서 유지되었고 연속적으로 계대되었다. 세포를 0.2% 젤라틴(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)으로 미리 코팅된 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 다이나비드(Dynabead) 분리 절차는 오염된 세포를 제거하기 위해 2주 간격으로 세 번 반복되었다. 배지는 3~4일마다 교체하였다. 위상차 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포 형태를 모니터링하였다.
세포 배가 시간은 지수 성장기(exponential-growth phase)로부터 계산되었다. KU-CAS3 및 KU-CAS5 세포주가 있는 세포(1 × 105)를 배양 접시에서 배양하였다. 그 후, 세포를 트립신 처리하고 원심분리하였다. 배지의 펠릿을 재현탁하고, 세포 계수기(Countess II, Invitrogen; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 세포를 계수하였다. 24시간마다 중복 플레이트를 계수하였다. 결과는 로그 선형 척도로 표시되었다. 집단 배증 기간은 곡선의 지수기를 따라 세포 수를 식별하고 해당 숫자가 두 배가 될 때까지 곡선을 추적한 뒤, 둘 사이의 시간을 계산하여 결정할 수 있다.
gr = ln(Nt / N0) / t,
배가 시간 = ln(2) /gr,
여기서 gr은 성장률, Nt는 시간 t에서의 세포 수, N0는 시간 0에서의 세포 수, t는 시간(h)이다.
3. 유세포 분석
유세포 분석은 아드레날린 수용체 베타 2(adrenergic receptor beta 2; ADRβ2), 두 개의 내피 세포 마커(CD31 및 CD34) 및 음성 마커(CD45)에 대해 수행되었다. 여러 계대에서 각각의 마커에 대해 분석을 5회 반복하였다.
혈관육종 세포를 젤라틴 코팅된 배양 플레이트에서 밤새 성장시켰다. 배양 접시에 TrypLE Express(Gibco, NY, USA) 용액을 첨가하여 배양 플레이트에서 세포를 분리하였다. 샘플을 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시켰다. 2 × 105 개의 세포를 포함하는 분주물(Aliquots)을 형광 결합된 항-CD31, 항-CD34 및 항-CD45 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 형광 결합 항체는 BD Bioscience(San Jose, USA)의 제품이다. ADRβ2 분석을 위해 세포를 1차 항-ADRβ2(1:100)(Abcam, Cambridge, UK)와 함께 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 2차 염소 항-토끼 결합 항체(Alexa 568; Invitrogen, Carlsbad, CA)와 함께 반응시켰다. 세포를 300g에서 5분간 원심분리하여 침전시킨 후 PBS로 세척하였다. 네 개의 표면 항원을 CellQuest Pro 소프트웨어와 함께 유세포 분석 시스템(FACSCalibur; BD Bioscience, San Jose, CA)을 사용하여 분석하였다.
4. 관 형성 분석
관 형성 분석은 내피 세포 관 형성 분석(Endothelial Cell Tube Formation Assay)(Corning, New York, NY)을 사용하여 수행되었다. 마트리젤(Matrigel)(10 mg/ml)을 해동하고 미리 냉각된 24웰 배양 플레이트에 부었다. 그 후, 플레이트가 고형화될 때까지 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 세포 현탁액(300 ㎕의 성장 배지에 8×104 세포)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 5%의 CO2 대기에서 18시간 동안 배양하였다. 배지를 버리고 플레이트를 PBS로 세척하였다. PBS 중 칼세인(Calcein) AM 2.4μg을 첨가한 후 30분 동안 배양하여 세포를 표지하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고 EVOS 이미징 시스템(Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA)을 사용하여 형광 현미경 검사를 수행하였다. 관 형성은 24시간 동안 평가되었다. 또한 관 형성 분석은 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC; Lonza, Basel, Swiss)를 양성 대조군으로 사용하여 수행되었다. 각 시점에서 ImageJ 혈관형성분석기(Angiogenesis Analyzer for ImageJ)를 사용하여 관의 수를 계산하였다.
5. 저밀도 지단백질 흡수 분석
저밀도 지단백질(low-density lipoprotein; LDL)의 흡수는 LDL Uptake Cell-Based Assay Kit(Abnova, Taipei, Taiwan)를 사용하여 분석하였다. 혈관육종 세포(4 × 104 cells/cm2)를 젤라틴으로 코팅된 96-웰 배양 플레이트(SPL, Pocheon-si, Korea)에서 컨플루언스(confluence)가 90%가 될 때까지 성장시켰다. 배양 배지를 100μl/웰의 LDL-DyLight 550 작업 용액(보충물이 없는 배양 배지에서 0.01%)으로 교체하였다. 다음으로, 추가로 세포를 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 반응 용액을 PBS로 교체하였다. LDL의 흡수 정도는 형광 현미경을 사용하여 확인하였다. LDL 수용체의 면역형광 염색 또한 제조사의 지침에 따라 수행되었다. LDL 흡수 분석은 배양된 HUVEC를 양성 대조군으로 사용하여 동일하게 수행되었다.
6. 면역형광 분석
세포(4 × 104 cells/cm2)를 젤라틴 코팅된 배양 슬라이드에서 밤새 성장시키고, 4% 파라포름알데히드의 PBS에 실온에서 15분 동안 고정시켰다. 투과를 위해 고정된 세포를 0.25%의 트리톤 X-100(Sigma-Aldrich)을 함유하는 PBS와 함께 10분 동안 반응시켰다. 세포를 5%의 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich)을 함유하는 PBS로 구성된 차단 완충액에서 차단한 다음, 1:400 항-폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor; vWF) 1차 항체(Abcam, Cambridge, UK), 1:500 항-CD31(Cell signaling, Danvers, MA), 1:100 항-Claudin-5(Invitrogen) 및 1:400 항-ADRβ2(Abcam, Cambridge, UK)으로 밤새도록 반응시켰다.
슬라이드를 PBS로 3회 세척하고 이차 당나귀 항-마우스 접합 항체(DyLight 488; Bethyl Laboratories, Montgomery, AL), 염소 항-마우스 IgG 교차 흡수 이차 항체(Alexa Fluor 488; Invitrogen) 및 염소 항-토끼 접합 항체(Alexa 568; Invitrogen)와 함께 반응시켰다. 다음으로, 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고, 핵을 DAPI(Sigma-Aldrich)로 15분 동안 염색하였다. PBS로 최종 세척한 후 슬라이드를 장착하였다. 형광 현미경 검사는 EVOS 이미징 시스템을 사용하여 수행되었으며, 복수의 이미지가 촬영되었다. 배양된 HUVEC를 양성 대조군으로 사용하여 면역형광 분석을 동일하게 수행하였다.
7. 실시간 PCR
총 세포 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)으로 추출되었다. cDNA는 SperScript III First-strand Synthesis SuperMix Kit(Invitrogen)를 사용하여 합성되었다. 실시간 PCR은 LightCyclerTM 96 System(Roche diagnostics)의 제조사 지침에 따라 FastStart Essential DNA Green Master 키트(Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 수행되었다. PCR 프라이머 서열 및 증폭된 단편의 크기는 표 2에 기재하였다. β-액틴은 내인성 대조군으로 사용되었다. PCR 반응은 효소 활성화에 필요한 95℃에서 10분 동안 수행한 다음, 45회의 증폭 주기(95℃에서 10초: 변성, 59℃, 57℃ 및 55℃에서 10초: 결합, 72℃에서 12-15초: 확장)로 수행하였다. 발현 수준은 β-액틴 발현 수준에 대해 표준화하였다.
[표 2]
8. 종양 발생 분석
TrypLE Express를 사용하여 배양 플레이트로부터 혈관육종 세포를 분리하고 세척한 뒤 PBS에 재현탁하였다. 암세포 현탁액(100μl PBS 중 2×106 세포)을 누드 마우스(BALB/c-nude; 나라바이오텍, 서울, 한국)의 등 측면에 피하 주사하였다. KU-CAS3 계대 16 및 KU-CAS5 계대 13 세포를 주입하였다. 신생물의 부피를 일주일에 한 번 기록하였다. 피하 주사 후 17주 차에 CO2 안락사를 사용하여 동물을 희생시키고, 조직학적 평가를 위해 신생물을 채취하였다. 채취한 조직을 10% 포르말린에 고정하고 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin)으로 염색하였다. 인간 CD31 및 p53 면역조직화학염색도 수행되었다. 병리학자가 조직학적 진단을 내렸다. 동물 사용 절차는 고려대학교 의과대학 실험동물연구센터의 IACUC(Institutional Animal Care & Use Committee)의 승인을 받았다(프로토콜 번호 KOREA-2019-0030).
9. 짧은 탠덤 반복 분석(Short tandem repeat analysis)
인간 및 마우스 피부 혈관육종 조직의 게놈 DNA를 QIAamp® Fast DNA Tissue Kit(Cat No. 510414, Qiagen, Hiden, Germany)를 사용하여 추출하였다. KU-CAS3 및 KU-CAS5 세포의 게놈 DNA는 Blood & Cell culture Mini Kit(Cat No. 13323, Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 얻어진 DNA를 nano drop2000(Thermo)으로 정량하였다. 정제된 게놈 DNA는 Cosmo Genetech(Seoul, South Korea)에서 STR 분석을 수행하였다. STR 프로파일링 워크플로는 다음과 같다(KU-CAS 세포주의 STR 인증을 보여주는 지원 정보).
1. 다중 PCR(Multiplex PCR)(PowerPlex 18D 시스템)
a. 17 STR 유전자좌
b. 1 성별 마커
2. 모세관 전기영동(3130xl Genetic Analyzer)에 의한 DNA 단편의 크기 분리
3. 크기 분석 및 대립 유전자 할당(GeneMapper 소프트웨어 5)
< 실시예 1> 세포주 확립
KU-CAS3 및 KU-CAS5 세포는 최대 100 계대 동안 연속 배양되었고, 다각형 모양을 유지했으며, 이는 컨플루언스(confluence) 상태에서 접촉을 억제하는 자갈 형태로 바뀌었다(도 1A). 계대 초기에는 오염 세포가 빠르게 성장하였고, 섬유아세포 유사 세포가 우세하였다. 그러나 Dynabeads CD31 분리 절차는 오염 세포를 감소시켰고, 세 번의 반복 절차 후에도 균일한 세포 형태를 유지하였다. 세포는 변성 없이 최적의 성장을 위해 내피 세포 성장 배지 MV와 보충 혼합물(ECGM-SM)을 필요로 하였다. 계산된 세포 배증 시간은 KU-CAS3의 경우 34시간, KUCAS5의 경우 29시간으로 나타났다.
< 실시예 2> 내피세포 특성
KU-CAS3와 KU-CAS5 모두 CD31에 대해 양성이었고(> 95%), CD34 및 CD45에 대해 음성이었다. KU-CAS3와 KU-CAS5 세포는 다른 비율로 아드레날린성 β2 수용체에 대해 양성이었다: KU-CAS3의 경우 88%, KU-CAS5의 경우 71%. 양성 백분율은 서로 다른 계대에서 5회의 반복 측정의 평균이었다(도 1B).
두 개의 세포주는 마트리젤(Matrigel)에서 관과 같은 구조를 만들 수 있으며, 이는 혈관 내피 세포의 뛰어난 특성이다(도 1C). 미성숙한 관형 구조는 4-6시간 후에 형성되기 시작했고, 성숙한 관형 구조는 12-24시간 후에 관찰되었다. 면역형광법을 통해 KU-CAS3 및 KUCAS5 세포의 LDL 수용체 발현을 확인하였다. LDL 흡수 패턴은 1차 내피 세포 및 HUVEC의 패턴과 유사했다(도 1D).
면역형광 염색 결과, KU-CAS3와 KU-CAS5 세포의 막 및 세포질에서 CD31, vWF, 클라우딘(Claudin)-5 발현을 보여주었으며, HUVEC에 대해서도 유사한 패턴이 관찰되었다(도 2A). KU-CAS 세포주의 자세한 특성은 표 3에 나타냈다.
[표 3]
< 실시예 3> 유전자 발현
두 세포주는 상대적으로 높은 수준의 아드레날린성 β2 수용체와 VEGF1 및 VEGF2 수용체를 발현하였다. 아드레날린성 α1B, α2A, β1 및 β3 수용체의 발현이 두 세포주에서 검출되었다(도 2B).
< 실시예 4> 누드 마우스의 종양 발생
성장하는 신생물은 2주차 내지 4주차 사이에 피하의 어두운 구진으로 확인되었고(도 3A), 이들은 14주 후에 빠르게 성장하였다. 신생물은 KU-CAS3를 접종한 마우스 11마리 중 7마리(63.6%), KU-CAS5를 접종한 마우스 9마리 중 7마리(77.8%)에서 유도되었다. KUCAS5 세포의 성장률은 KU-CAS3 세포의 성장률보다 높았다(도 3A 및 도 3B). 16주차에 마우스를 안락사시키고 병리학적 검사를 위해 신생물을 채취하였다. KU-CAS3 및 KU-CAS-5 세포의 주입 후 채취된 신생물은 두 명의 병리학자에 의해 CAS로 진단되었다. 인간 CD31 특이적 염색도 양성 결과를 나타냈다. 조직병리학적 결과는 원발성 CAS 및 KU-CAS 유발 신생물로 확인되었다(도 3C 및 도3D). 연구된 16주 기간 동안 마우스 중 어느 한 마리도 혈관육종으로 사망하지 않았다. 원위 장기에서는 전이가 검출되지 않았다.
< 실시예 5> 짧은 탠덤 반복 프로파일링
KU-CAS 세포주는 STR 프로파일이 세포주와 인간 혈관육종 조직 사이에 100% 일치를 나타내었기 때문에 동일한 것으로 간주되었다. 또한, STR 프로파일은 세포주와 KU-CAS 주입 마우스에서 생성된 종양 사이의 100% 일치를 보여주었다. 따라서 세포주와 마우스 종양은 인간 CAS 세포 및 종양으로 확인되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00518 20220125 한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00519 20220125

Claims (6)

  1. CD31에서 대해 양성이고, CD34 및 CD45에 대해 음성이며, 아드레날린 수용체 베타 2(adrenergic receptor beta 2; ADRβ2), VEGF1 및 VEGF2 수용체를 과발현하는 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 KCLRF-BP-00518로 기탁된 KU-CAS3 세포주 또는 KCLRF-BP-00519로 기탁된 KU-CAS5 세포주인 것을 특징으로 하는 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 KU-CAS3 세포주의 배가시간(Doubling time)은 34시간이고, 상기 KU-CAS5 세포주의 배가시간(Doubling time)은 29시간인 것을 특징으로 하는 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주.
  4. 피부혈관 육종 환자의 두피로부터 0.3 내지 1.5 g의 피부혈관 육종 조직을 분리하는 단계;
    상기 분리된 피부혈관 육종 조직을 콜라게나제(collagenase)로 처리하는 단계;
    상기 처리된 조직을 원심분리하여 세포 펠렛을 배지에 배양하는 단계; 및
    상기 배양한 세포로부터 CD31 내피세포를 분리하는 단계를 포함하는, 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주는 CD31에서 대해 양성이고, CD34 및 CD45에 대해 음성이며, ADRβ2, VEGF1 및 VEGF2 수용체를 과발현하는 것을 특징으로 하는 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주 제조방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 유래 악성 피부혈관 육종 세포주에 약물 후보 물질을 접촉시키는 단계;
    상기 약물 후보 물질을 접촉한 세포주에서 피부혈관 육종 세포의 증식능 또는 전이능을 측정하는 단계; 및
    대조군과 비교하여 피부혈관 육종 세포의 증식능 또는 전이능이 억제된 약물 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 악성 피부혈관 육종 치료제 스크리닝 방법.
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