JP5065885B2 - 前立腺幹細胞 - Google Patents

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Description

本発明は、前立腺幹細胞、典型的には前立腺癌幹細胞の単離方法、該方法によって単離される幹細胞及び癌幹細胞、並びにその使用に関する。
前立腺は、男性生殖器官の主要な副器官であり、男性において腫瘍性疾患が最もよく見られる部位である。前立腺の主な２つの病変は、（ｉ）良性前立腺過形成（これは、年齢とともに一般的にみられる非悪性状態である）及び（ｉｉ）癌腫（これは、欧州諸国の男性で、肺癌に次いで２番目によく見られる死因であり、西欧の高齢化社会では有病率が増加している）である。症状としては、精液又は尿中の血液、背下部、腰又は大腿上部の頻繁な痛み又は凝りが挙げられる。前立腺腫瘍は原発性（すなわち、起源が前立腺にある）又は続発性（すなわち、癌性細胞が循環系によって他の組織に移動又は侵入できる能力により他の器官内に形成された腫瘍）である場合がある。
前立腺癌は、比較的害がない場合があるか、又は極めて攻撃性である場合がある。一部の前立腺腫瘍は、低速成長を示し、臨床症状をほとんど引き起こさない。攻撃性の前立腺腫瘍は、急速にリンパ節及び他の器官（特に骨）に広がる。前立腺癌の成長は、テストステロン等の男性ホルモンの供給をブロックすることにより阻害され得ることが知られている。しかしながら、前立腺癌は最終的には発症し、男性ホルモンに非依存性となる(すなわち、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞となる)。これらの細胞は、攻撃性の悪性前立腺癌と関連している。雄の哺乳動物はすべて前立腺を有するが、ヒト及びイヌだけが自然発生的に前立腺癌を発症することが知られている。
転移性前立腺癌は、主に骨に移動し、副腎及び精巣によるアンドロゲン産生をブロックすることによってアンドロゲン産生を低下させることにより処置される。この処置は、転移性病変がアンドロゲン非依存性となり制御不能に成長するため、短期間でのみ有効である。アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞の存在は、この処置計画がもはや有効ではなく、該疾患の進行を制御するためのさらなる介入が必要であることを意味する。同様の応答が化学療法処置及び放射線療法処置に見られる。その結果、転移性前立腺癌は、依然として、現行の処置ストラテジーでは治癒不可能な疾患である。したがって、引き続き、前立腺癌の新規な処置を提供するための新規な治療用標的を同定する必要がある。
癌性状態の有効な処置の基本的な課題は、腫瘍の成長を持続させる能力を有する腫瘍内の細胞集団の特定である。腫瘍がクローン性であり、したがって単一の細胞に由来することを示す証拠がある。しかしながら、腫瘍細胞成長の維持に関与する細胞型を特定し、特性付けした研究はほとんどない。一部では、これらのいわゆる「癌幹細胞」の研究がなされている。
国際公開第０３／０５０５０２号パンフレットには、ヒト乳癌細胞を免疫不全マウス内で増殖させた異種移植片モデルの使用により、乳癌幹細胞を選択的に富化する方法が開示されている。国際公開第０３／１０２２１５号パンフレットには、幹細胞内で活発に発現するようになったβカテニンによって調節されるレポーター遺伝子の特異的発現により幹細胞及び癌幹細胞を単離することが記載されている。米国特許出願公開第２００３１１９０８０号明細書には、固形腫瘍からの腫瘍幹細胞の単離方法が記載されている。国際公開第０１／４０３０９号パンフレットには、前立腺幹細胞抗原とされるもの(alleged)（前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）という）に対する抗体が記載されており、これは、米国特許第５，８５６，１３６号明細書、国際公開第９９／１４３２８号明細書及び国際公開第９８／５１８０５号明細書にも記載されている。
本発明者らはＣＤ１３３を同定したが、これは、初期の造血幹細胞及び成長中の上皮により発現され、前立腺上皮のさらなる幹細胞マーカーとなる。ＣＤ１３３細胞は、α２β１ ｈｉ集団（Ｉ型コラーゲンの受容体）に限定的であり、基底層内（多くの場合、芽状領域又は分岐点の基底部）に位置する（図１Ａ）。α２β１ ｈｉ／ＣＤ１３３＋細胞は、上皮の幹細胞の２つの重要な属性を示す。すなわち、これらは、高いインビトロ増殖可能性を有し（図１Ｂ）、免疫不全の雄ヌードマウスにおいて前立腺様腺房を再構成し得る（図１Ｃ）。
前立腺腫瘍幹細胞は、直接、一連の患者試料のリンパ節及び前立腺から、以下のマーカー：ヒト上皮抗原（ＨＥＡ）、ＣＤ４４（これは、前立腺内の基底細胞により発現される、Liu他、１９９７）、α２β１ ｈｉ及びＣＤ１３３を用いて単離した。形態学的には、当該細胞は、線維芽様（形質転換細胞に典型的なビメンチンを高レベルで発現する）から上皮まで(or)の範囲にわたり、前立腺上皮の分化と関連する前駆体を産生し得る（図２Ａ）。浸潤アッセイ（Ｍａｔｒｉｇｅｌコートフィルターを用いる）により、これらの細胞がＰＣ３Ｍ（ＰＣ３細胞の高度に転移性の亜株）と(than)同様のＭａｔｒｉｇｅｌ侵入能力を有することが測定された（図２Ｂ）。
本発明者らは、Ｉ型コラーゲンへの差次的(differential)接着及び培養幹細胞の成長を利用して前立腺幹細胞の可能性がある細胞集団を選択する、前立腺幹細胞又は前立腺癌幹細胞を選択的に富化する方法を記載する。
本発明の一態様によれば、ＣＤ１３３抗原を発現する前立腺細胞の選択的富化を含む、前立腺幹細胞の単離方法が提供される。好ましくは、当該幹細胞はまた、高レベルのα２β１インテグリンを発現する。
本発明の好ましい方法では、上記選択的富化が、以下の工程：
ｉ） 前立腺組織由来の前立腺細胞を含む細胞調製物を提供する工程、
ｉｉ） 上記前立腺細胞の培養状態での維持及び前立腺細胞のコラーゲン系マトリックスへの結合を可能にする細胞培養条件を提供する工程、
ｉｉｉ） ＣＤ１３３抗原を発現する結合細胞を選択する工程
を含む。
本発明の好ましい方法では、本方法は、以下のさらなる工程：
ｉ） ＣＤ１３３抗原を発現する細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）及び白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む培養培地中で培養する工程、及び
ｉｉ） 選択した（ｉ）の細胞を血清無含有培地中で継代培養する工程
を含む。
本発明の別の方法では、上記マトリックスは非コラーゲン系ペプチドマトリックスである。かかる非コラーゲン系ペプチドマトリックスの一例は、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）である。
本発明のさらに好ましい方法では、上記選択した細胞は上皮抗原、好ましくはヒト上 皮抗原を発現する。
本発明のまたさらに好ましい方法では、上記選択した細胞はＣＤ４４抗原を発現する。
本発明のなおもさらに好ましい方法では、上記選択した細胞は、テロメラーゼを発現しない。
本発明の好ましい方法では、上記前立腺由来組織は癌性前立腺細胞を含む。
本発明のさらに好ましい方法では、上記癌性前立腺細胞は、悪性前立腺由来組織に由来するものである。
本発明の好ましい方法では、上記癌性前立腺細胞は、原発性又は転移性リンパ節部位に由来するものである。
本発明のさらに好ましい方法では、上記コラーゲン系マトリックスはＩ型コラーゲンを含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法によって得ることができる前立腺幹細胞が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、上記細胞は前立腺癌幹細胞である。
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記幹細胞はクローン化された細胞である。
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１３３抗原を発現する前立腺幹細胞の実質的に純粋な培養物が提供される。好ましくは、上記細胞は前立腺癌幹細胞である。
本発明の好ましい実施形態では、上記細胞は、高レベルのα２β１インテグリンを発現する。
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記細胞はヒト上皮抗原を発現する。好ましくは、上記細胞はＣＤ４４抗原を発現する。
本発明のまたさらに好ましい実施形態では、上記細胞は、ＣＤ１３３抗原、高レベルのα２β１インテグリン、ヒト上皮抗原及びＣＤ４４抗原を発現する。
前立腺幹細胞／前立腺癌幹細胞は、典型的には、或る特定の表現型特質を特徴とする。例えば、幹細胞としての潜在能力がある細胞は、培養時に未分化の状態で分裂し、多数回の継代培養が可能であり、前立腺組織で見られるすべての細胞型を形成することができ、また、前立腺幹細胞及び／又は分化した前立腺細胞の遺伝子マーカーを発現する。これらの特質は、単に、前立腺幹細胞の例示を意図するものであって、限定を意図するものではない。
本発明のさらなる態様によれば、ワクチン組成物における使用のための、本発明による方法によって得ることができる前立腺幹細胞調製物が提供される。
本発明による方法によって選択される前立腺幹細胞は、正常前立腺幹細胞及び癌性前立腺幹細胞でも発現される遺伝子の選択に関して有用性を有することは明白であろう。発現されるこれらの配列に対して生成される抗体は、前立腺癌に対する素因を有する人、又は原発性前立腺癌若しくは原発性癌からの転移の結果としての続発性前立腺癌のいずれかに苦しむ人を処置するために予防的又は治療的に使用され得るワクチンの開発のための潜在的標的を提示するため、有用である。生成する抗体はまた、前立腺癌の診断に関して有用性を有する。
本発明の好ましい実施形態では、上記前立腺幹細胞は癌性前立腺幹細胞である。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による前立腺幹細胞を含むワクチン組成物が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、上記組成物はアジュバント及び／又は担体を含む。
アジュバントは、免疫細胞の活性をモジュレートすることにより、抗原に対する特異的免疫応答を増大させる物質又は手順である。アジュバントの例としては、一例にすぎないが、フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、リポソームが挙げられる。担体は、第２の分子に結合したとき、後者に対する免疫応答を増大させる免疫原性分子である。一部の抗原は、本来は免疫原性ではないが、外来タンパク質分子（例えば、スカシガイヘモシアニン又は破傷風トキソイド等）と会合すると、抗体応答を生じる能力を有し得る。かかる抗原は、Ｂ細胞エピトープを含有するがＴ細胞エピトープは含有しない。かかるコンジュゲートのタンパク質部分（「担体」タンパク質）は、ヘルパーＴ細胞を刺激するＴ細胞エピトープを提供し、これが抗原特異的Ｂ細胞を刺激して形質細胞に分化させ、抗原に対する抗体を産生させる。ヘルパーＴ細胞もまた、他の免疫細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）を刺激することができ、担体は、細胞媒介性免疫及び抗体の生成において同様の役割を果たすことができる。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による前立腺幹細胞調製物の有効量を投与することを含む、動物の免疫処置方法が提供される。
本発明の好ましい方法では、上記細胞調製物は、本発明による癌性前立腺幹細胞を含む。
本発明の好ましい方法では、上記動物はヒトである。
本発明の別の好ましい方法では、上記動物は齧歯類、好ましくはラット、マウス又は(of)ハムスターである。
本発明のさらに好ましい方法では、上記動物はウサギ、ヤギ又はヒツジである。
本発明のまたさらに好ましい方法では、上記動物はイヌである。
好ましい投与経路は、皮内、皮下、筋肉内、経口又は鼻腔内である。しかしながら、免疫処置方法は、或る特定の投与様式に限定されない。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法によって得ることができる抗体が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、上記抗体は治療用抗体である。
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記抗体は診断用抗体である。好ましくは、当該診断用抗体に標識又はタグを設ける。
本発明の好ましい実施形態では、上記抗体はモノクローナル抗体又はその結合性断片である。好ましくは、上記抗体はヒト化抗体又はキメラ抗体である。
キメラ抗体は、組換え方法によって、抗体の可変領域がヒト抗体の不変又は定常領域とともに含まれるように作製される。
ヒト化抗体は、組換え方法によって、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト抗体の定常（Ｃ）領域と可変（Ｖ）領域由来のフレームワーク領域との両方と組み合わせるように作製される。キメラ抗体は、マウス又はラットの抗体のＶ領域の全部をヒト抗体Ｃ領域と組み合わせた組換え抗体である。ヒト化抗体は、齧歯類抗体のＶ領域由来の相補性決定領域を、ヒト抗体のＶ領域由来のフレームワーク領域と融合させた組換えハイブリッド抗体である。また、ヒト抗体由来のＣ領域も使用される。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端ドメイン内の領域であり、ここにＶ領域の多様性の大部分が限定される。これらの領域は、抗体分子の表面にループを形成する。これらのループは、抗体及び抗原間の結合表面を提供する。
非ヒト動物由来の抗体は、外来抗体に対する免疫応答及び循環系からの除去を誘発する。キメラ抗体及びヒト化抗体はともに、ヒト被験体に注射された場合、低減された抗原性を有するが、それは、組換えハイブリッド抗体内に存在する齧歯類（すなわち、外来）抗体の量が低減されているとともに、ヒト抗体領域が免疫応答を惹起しないためである。これにより、より弱い免疫応答及び抗体のクリアランスの減少がもたらされる。このことは、治療用抗体をヒト疾患の処置において使用する場合、明らかに望ましい。ヒト化抗体は、より少ない「外来」抗体領域を有するように設計され、したがって、キメラ抗体よりも免疫原性が低いと考えられる。
また、単一の可変領域、いわゆる単鎖抗体可変領域断片（ｓｃＦｖ）を創製することも可能である。或る特定のモノクローナル抗体のハイブリドーマが存在する場合、ｓｃＦｖを、当該ハイブリドーマからＲＴ ＰＣＲによって抽出したｍＲＮＡから単離することは、当業者の知識の範囲内に充分含まれる。あるいは又はジディスプレイスクリーニングを行なって、ｓｃＦｖを発現するクローンを同定することができる。あるいはまた、上記断片は、「ドメイン抗体断片」である。ドメイン抗体は、抗体の最も小さい結合部（およそ１３ｋＤａ）である。この技術の例は、米国特許第６，２４８，５１６号明細書、米国特許第６，２９１，１５８号明細書、米国特許第６，１２７，１９７号明細書及び欧州特許０３６８６８４号明細書（これらはすべて、参照されて、その全体を本明細書の一部となる）に開示されている。
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記抗体はオプソニン抗体である。
食作用は、マクロファージ及び多型性白血球によって媒介され、微生物、障害細胞又は死細胞、細胞残屑、不溶性粒子及び活性化された凝固因子の取込み及び消化を伴う。オプソニンは、上記異物の食作用を助長する因子である。したがって、オプソニン抗体は、同じ機能を提供する抗体である。オプソニンの例は、抗体のＦｃ部分又は補体(compliment)Ｃ３である。免疫処置によって生成され、且つ抗原との免疫複合体の形態である抗体は、補体が抗原又はその近接微環境内の分子上に固定化することによりオプソニン作用をもたらし得る。
本発明のさらなる態様によれば、医薬としての使用のための本発明による抗体が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による抗体を含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法によって得ることができるＴリンパ球が提供される。
好ましくは、上記Ｔリンパ球はＴヘルパーリンパ球である。
免疫系は、一部は、特異的抗原を認識することができるリンパ球で構成される。Ｂリンパ球は、ネイティブなコンホメーション状態の抗原を、表面免疫グロブリン受容体を介して認識し、Ｔリンパ球は、抗原提示細胞の表面上の主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）又はヒトにおけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）として知られる自己分子ともにペプチドとして提示されるタンパク質抗原を認識する。抗原提示細胞は種々の形態で存在し、「古典的」抗原提示細胞（マクロファージ及び樹状細胞が例示される）と、「非古典的」抗原提示細胞（Ｂリンパ球が挙げられる）とに区別され得る。Ｔリンパ球は、さらに、「細胞傷害性Ｔリンパ球」（これは、例えばウイルスに感染した標的細胞を死滅させることができる）と、「Ｔヘルパー」リンパ球とに細分され得る。Ｔヘルパーリンパ球は調節的機能を有し、Ｂリンパ球が特異的抗体を産生するのを「補助」する能力、又はマクロファージが癌細胞を死滅させるのを補助する能力を有する。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ） 本発明に記載の少なくとも１つの前立腺幹細胞を含む調製物を提供する工程、
ｉｉ） 核酸を上記細胞調製物から抽出する工程、
ｉｉｉ） 上記抽出された核酸を核酸アレイと接触させる工程、及び
ｉｖ） 該核酸の該核酸アレイ上の結合パートナーへの結合を示すシグナルを検出する工程
を含む、前立腺幹細胞に関連した遺伝子の同定方法が提供される。
好ましくは、上記方法は、以下のさらなる工程：
ｉ） 上記核酸の上記結合パートナーへの結合によって生成されるシグナル（１つ又は複数）を照合する工程、
ｉｉ） 照合されたシグナル（１つ又は複数）をデータ解析可能な形態に変換する工程、及び
任意選択で、
ｉｉｉ） 解析されたデータの出力を提供する工程
を含む。
本発明の好ましい方法では、上記調製物が癌性前立腺幹細胞を含む。
本発明のさらに好ましい方法では、上記方法は、正常前立腺幹細胞及び癌性前立腺幹細胞間での生じたアレイシグナルの比較を含む。
本発明の代替的な好ましい方法では、上記方法は、第１の癌性前立腺幹細胞試料及び第２の異なる癌性前立腺幹細胞試料間での生じたアレイシグナルの比較を含む。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ） 本発明に記載の少なくとも１つの前立腺幹細胞を含む調製物を提供する工程、
ｉｉ） 核酸を上記細胞調製物から抽出する工程、
ｉｉｉ） 上記抽出された核酸に含まれるリボ核酸からｃＤＮＡを調製する工程、及び
ｉｖ） （ｉｉｉ）で形成したｃＤＮＡをベクター内にライゲートする工程
を含む、前立腺特異的遺伝子発現産物を含むライブラリーの作製方法が提供される。
本発明の好ましい方法では、上記ベクターがファージ系ベクターである。
本発明者らのＰＣＴ出願である国際公開第０３／０１４３３４号パンフレットにおいて、本発明者らは、前立腺上皮細胞が、インビボで見られる前立腺腺房と非常によく似た前立腺様腺房を形成するのを可能にする培養方式(regime)を提供するインビトロ細胞培養法を開発した。この方法は、血清と、ホルモンと、上記上皮細胞が接着、増殖、分化し、前立腺様腺房を形成するのを可能にする適当な細胞マトリックス支持体との組合せに依存する。この系は、インビボ状態を反映する３Ｄ構造がもたらされるように、クローン化された正常な前立腺上皮細胞並びにクローン化された癌性前立腺細胞、原発性前立腺上皮細胞及び原発性癌性前立腺細胞の成長を補助し得る。この系は、前立腺細胞の分化及び前立腺細胞の形質転換の研究にとって非常に貴重である。これは、前立腺癌細胞の増殖及び転移の抑制に有効な薬剤の同定における使用のため、また、前立腺細胞の分化及び形質転換の新規なマーカーを同定するためのツールを提供する。本発明者らは、本明細書において、本発明による方法によって選択される前立腺幹細胞が、国際公開第０３／０１４３３４号パンフレット（これは、参照されてその全体を本明細書の一部とする）に記載したような前立腺様腺房を形成し得ること、より具体的には、前立腺様腺房の形成のための培養条件を開示する。
本発明の一態様によれば、
ｉ） ａ） 本発明に記載の前立腺幹細胞、
ｂ） （ａ）の上記細胞が接着して増殖し得る細胞培養物支持マトリックス、
ｃ） 血清、間質画分並びに或る比率でのホルモンとしてエストロゲン及びジヒドロテストステロン又はその機能的誘導体を加えた細胞培養培地
を含む細胞培養容器を提供する工程、及び
ｉｉ） 上記容器内での上記前立腺由来細胞の成長及び分化を促進する条件を提供する工程
を含む、前立腺様腺房の形成のためのインビトロ方法が提供される。
本発明の好ましい方法では、血清は、約０．５％〜４％（ｖ／ｖ）の間で提供される。好ましくは、上記血清は、約１％〜３％（ｖ／ｖ）の間で提供される。最も好ましくは、上記血清は、約２％（ｖ／ｖ）で提供される。
本発明のさらに好ましい方法では、エストロゲンは、約１０ｎｇ／ｍｌで提供され、ジヒドロテストステロンは約１０−７Ｍで提供される。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ） 血清、間質画分並びに或る比率でのエストロゲン及びジヒドロテストステロン又はその機能的誘導体を加えた細胞培養培地中で形成させた本発明による前立腺幹細胞から形成された前立腺様腺房、細胞培養物支持マトリックス、及び前立腺腺房の成長を支持する細胞培養培地を含む細胞培養容器を提供する工程、及び
ｉｉ） 好ましくは活性化された内皮細胞を上記細胞培養容器に添加する工程であって、内皮細胞が増殖及び／又は移動して、血管細管を上記腺房内又はその周辺に形成する、添加する工程
を含む、血管新生した前立腺腺房の形成のためのインビトロ方法が提供される。
本発明の一態様によれば、
ｉ） ａ） 前立腺幹細胞及び活性化された内皮細胞、
ｂ） （ａ）の上記細胞が接着して増殖し得る細胞培養物支持マトリックス、
ｃ） 血清、間質画分並びに或る比率でのホルモンとしてエストロゲン及びジヒドロテストステロン又はその機能的誘導体を加えた細胞培養培地
を含む細胞培養容器を提供する工程、及び
ｉｉ） 前立腺腺房を形成させるための上記容器内での上記前立腺幹細胞の成長及び分化、並びに上記活性化された内皮細胞からの血管細管の形成による該腺房の血管新生を促進させる条件を提供する工程
を含む、血管新生した前立腺様腺房の形成のためのインビトロ方法が提供される。
本発明の好ましい方法では、上記前立腺上皮細胞及び内皮細胞がヒト起源のものである。
「容器」は、上記の細胞培養物を収容するのに適した任意の手段と定義する。典型的には、かかる容器の例は、ペトリ皿、細胞培養ボトル又はフラスコ、マルチウェル培養皿である。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法によって得ることができる前立腺様腺房が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、上記前立腺様腺房は、遺伝子操作された前立腺細胞を含む。
遺伝子操作は、１つの遺伝子又は複数の遺伝子を、後に腺房が形成され得る幹細胞内に導入するために行ない得る。例えば、限定的ではないが、プロドラッグ活性化遺伝子を、前立腺細胞内にトランスフェクトし、細胞傷害剤としてのプロドラッグの有効性をモニターし得る。プロドラッグ活性化遺伝子とは、その発現が非治療性化合物を治療性化合物に変換することができるタンパク質の産生をもたらす遺伝子のことを指し、これにより、細胞は外的因子による死滅を被りやすくなるか、又は細胞内に毒性状態が引き起こされる。
プロドラッグ活性化遺伝子の一例は、シトシンデアミナーゼ遺伝子である。シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシンを、強力な抗腫瘍剤である５−フルオロウラシルに変換する。腫瘍細胞の溶解は、腫瘍の限局的な位置で５ＦＣを５ＦＵに変換できるシトシンデアミナーゼの限局的バースト(burst)をもたらし、その結果、周囲の多くの腫瘍細胞が死滅する。これにより、これらの細胞をベクターに感染させる必要がなくなり、多数の腫瘍細胞の死滅がもたらされる（いわゆる「巻き添え(bystander)効果」）。プロドラッグ活性化遺伝子の別の例は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）（米国特許第５，６３１，２３６号明細書及び米国特許第５，６０１，８１８号明細書を参照）であり、この場合、ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビルの投与により選択的死滅を被りやすい。これは、本発明による細胞と組合せて使用され得る組換え方法の例示を意図しているにすぎない。他の例としては、腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、ｐ５３）のトランスフェクションが挙げられ得る。腫瘍サプレッサー遺伝子という用語は、標的細胞内での発現が、癌の表現型の抑制及び／又はアポトーシスの誘導を可能にするヌクレオチド配列を指す。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ） 培養条件及び本発明に記載の少なくとも１つの癌性腺房を提供する工程、
ｉｉ） 少なくとも１種類の被験薬剤を添加する工程、及び
ｉｉｉ） 上記薬剤の抗増殖活性を、癌性腺房を含む細胞に関してモニターする工程
を含む、癌性前立腺細胞の増殖を阻害できる薬剤の同定方法が提供される。
本発明のまたさらなる態様によれば、
ｉ） 培養条件及び本発明に記載の少なくとも１つの癌性腺房を提供する工程、
ｉｉ） 少なくとも１種類の被験薬剤を添加する工程、及び
ｉｉｉ） 癌性腺房を含む細胞の運動性をモニターする工程
を含む、癌性前立腺細胞の運動性を阻害できる薬剤の同定方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ） 本発明に記載の前立腺幹細胞を含む調製物を提供する工程、及び
ｉｉ） 発現が前立腺細胞の分化と関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を測定する工程
を含む、前立腺細胞分化のマーカーの同定方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ） 本発明に記載の前立腺幹細胞を含む調製物を提供する工程、及び
ｉｉ） 発現が前立腺細胞の形質転換と関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を測定する工程
を含む、前立腺細胞の形質転換のマーカーの同定方法が提供される。
細胞分化マーカー及び／又は前立腺細胞の形質転換のマーカーの同定に使用される方法としては、免疫原性に基づく手法(例えば、細胞を、免疫原複合体として使用し、上記のような細胞表面マーカーに対する抗血清を生成させる等)、核酸に基づく手法(例えば、正常腺房及び形質転換腺房由来のｃＤＮＡを用いるディファレンシャルスクリーニング)が挙げられる。また、腫瘍細胞はいくつかの腫瘍細胞特異的抗原を産生し、そのいくつかは、腫瘍細胞表面に提示されることが長年にわたって知られている。これらは、一般的に、腫瘍拒絶抗原と呼ばれ、腫瘍拒絶抗原前駆体と称するより大きなポリペプチドに由来するものである。腫瘍拒絶抗原はＨＬＡを介して免疫系に提示される。免疫系は、これらの分子を外来と認識し、自然に選別し、これらの抗原を発現する細胞を破壊する。形質転換細胞が検出を逃れ、確立されると、腫瘍が発生する。ワクチンは、主な腫瘍拒絶抗原に基づいて開発されており、腫瘍の確立に対して事前に形成された防御を個体に提供する。本発明による方法は、腫瘍拒絶抗原及び前駆体を同定するための手段を提供し、これは、患者自身の免疫系を刺激して前立腺腫瘍の確立を抑止するためのワクチン開発に関して有用性を有する。
本発明の好ましい方法では、上記遺伝子は癌遺伝子である。
好ましくは、上記癌遺伝子が、図３に示す核酸配列を含む核酸分子、又は上記核酸にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、転写因子のリプレッサー活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子にコードされる。
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補的な核酸分子が、互いに或る量の水素結合を行なう場合に起こる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸の周囲環境条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、並びに用いる核酸分子の組成及び長さに従って異なり得る。或る特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook他、Molecular Cloning： A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001）、及びTijssen，Laboratory Tequniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes 第Ｉ部、第２章（Elsevier，New York，1993）に説明されている。Ｔｍは、核酸分子の所与の鎖の５０％がその相補鎖にハイブリダイズする温度である。以下は、例示的な一組のハイブリダイゼーション条件であるが、これらに限定されない。
非常に高ストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズするのを可能にする）
ハイブリダイゼーション： ５×ＳＳＣで６５℃にて１６時間
洗浄２回： 各々、２×ＳＳＣで室温（ＲＴ）にて１５分間
洗浄２回： 各々、０．５×ＳＳＣで６５℃にて２０分間
高ストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズするのを可能にする）
ハイブリダイゼーション： ５×〜６×ＳＳＣで６５℃〜７０℃にて１６〜２０時間
洗浄２回： 各々、２×ＳＳＣでＲＴにて５〜２０分間
洗浄２回： 各々、１×ＳＳＣで５５℃〜７０℃にて３０分間
低ストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズするのを可能にする）
ハイブリダイゼーション： ６×ＳＳＣでＲＴ〜５５℃にて１６〜２０時間
少なくとも２回洗浄： 各々、２×〜３×ＳＳＣでＲＴ〜５５℃にて２０〜３０分間
本発明の好ましい方法では、上記核酸は、図４に示すアミノ酸配列、又は少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって修飾された変異アミノ配列で表され、且つ転写因子のリプレッサー活性を有するポリペプチドをコードする。
変異ポリペプチドは、１つ又はそれ以上の置換、付加、欠失、切頭(truncation)（これらは、いずれかの組合せで存在してもよい）によりアミノ酸配列が異なり得る。中でも、好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換により参照ポリペプチドと異なるものである。かかる置換は、所与のアミノ酸を、同様の特徴を有する別のアミノ酸と置き換えるものである。以下の非限定的なアミノ酸の列挙：ａ）アラニン、セリン及びトレオニン、ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸、ｃ）アスパラギン及びグルタミン、ｄ）アルギニン及びリシン、ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン並びにｆ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプシンは、保存的置き換え（類似）とみなされる。
加えて、本発明は、本明細書に開示したポリペプチド配列、又はその断片及び機能的に同等なポリペプチドと少なくとも７５％同一性を有するポリペプチド配列を特色とする。一実施形態では、該ポリペプチドは、本明細書に示したアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一性、より好ましくは少なくとも９０％同一性、なおより好ましくは少なくとも９５％同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％同一性、及び最も好ましくは少なくとも９９％同一性を有する。
本発明のさらなる態様によれば、前立腺癌に対する被験体の免疫処置における使用のためのワクチン組成物の製造のための、図４に示すアミノ酸配列、又は少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって修飾された変異アミノ配列で表されるポリペプチドを含む組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、前立腺癌に対する被験体の免疫処置における使用のためのワクチン組成物の製造のための、図３に示す核酸配列を含む核酸分子、又は核酸にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子を含む組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、前立腺癌の処置における使用のための医薬の製造のための、図４に示すアミノ酸配列で表されるポリペプチドに特異的反応性である抗体が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、上記抗体がモノクローナル抗体、又はその活性な結合性断片である。好ましくは、上記抗体は、本明細書に記載のようなヒト化抗体又はキメラ抗体である。
本発明の好ましい実施形態では、上記抗体断片が単鎖抗体可変領域断片又はドメイン抗体である。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ） 前立腺細胞を含む単離試料を提供する工程、及び
ｉｉ） 図３に示す核酸配列を含む核酸分子、又は核酸にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子の発現を検出する工程
を含む、被験体を前立腺癌又は前立腺癌に対する素因についてスクリーニングする方法が提供される。
本発明の好ましい方法では、上記方法によりｍＲＮＡの発現が検出される。好ましくは、上記方法はポリメラーゼ連鎖反応法である。
本発明の代替的な方法では、上記方法により、上記核酸分子にコードされるポリペプチドが検出される。好ましくは、上記ポリペプチドは、本発明による抗体によって検出される。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ） 前立腺幹細胞の調製物を提供する工程、
ｉｉ） 上記細胞を非ヒト動物被験体内に移植する工程、及び
ｉｉｉ） 移植された細胞の分化及び成長をモニターする工程
を含む、前立腺腺房の形成の解析のための非ヒト動物モデルが提供される。
本発明の好ましい方法では、上記動物が、マウス、ラット、モルモット、イヌ、非ヒト霊長類から成る群より選択される。
本発明の好ましい方法では、上記動物はマウスであり、好ましくは免疫不全マウスである。好ましくは、上記マウスはＳＣＩＤマウス又は胸腺欠損ヌードマウスである。
本発明の好ましい方法では、上記細胞は皮下に移植される。
本発明の代替的な好ましい方法では、上記細胞は、同所的に前立腺組織内又はその周辺に移植される。
次に、本発明の実施形態を、単に例示の目的で、図面を参照しながら記載する。
材料及び方法
単離した腫瘍幹細胞の遺伝子型
散発性前立腺癌と関連するマイクロサテライトマーカー（８ｐ １０ｑ １６ｐ、図３）の組合せを用い、単離したＨＥＡ＋／ＣＤ４４＋／α２β１ ｈｉ／ＣＤ１３３＋細胞が、同じ患者由来の血中リンパ球ＤＮＡと比べ、前立腺腫瘍に特徴的なヘテロ接合性パターンの減損を示すか否かを判定することができる。この解析は、３ＭＭ紙及び蛍光標識したＰＣＲプライマーを用いた培養物のマイクロサンプリングにて行なう（MacIntosh他、１９９８）。これにより、正常細胞と癌細胞とを区別することができ、幹細胞が確かに形質転換事象の標的であるかを判定することができる。
推定癌幹細胞の増殖、分化及び悪性の可能性
性質が異なる腫瘍細胞集団を単離し、その増殖、分化及び悪性の可能性をインビトロ及びインビボで判定する。下記の集団（ＨＥＡ＋／ＣＤ４４−（管腔細胞）、ＨＥＡ＋／ＣＤ４４＋（基底細胞）、ＨＥＡ＋／ＣＤ４４＋／α２β１ ｌｏｗ／ＣＤ１３３−（移行(transit)細胞）、ＨＥＡ＋／ＣＤ４４＋／α２β１ ｈｉ／ＣＤ１３３＋（幹細胞）を単離し、未分類腫瘍集団と比較する。
コロニー形成効率（ＣＦＥ）：足場非依存的及び足場依存的成長
性質が異なる集団（上記）の癌細胞の形質転換能（足場非依存性）を、当該細胞の軟質寒天中でのコロニー形成能によって測定する。個々のコロニーを、２１日後に、倒立顕微鏡を用いて計測する。ＣＦＥとコロニーの大きさの比較を行なう。
再構成基底膜マトリックスのゲル中での形態形成
本発明者らは、腫瘍幹細胞及びその前駆体が再構成基底膜（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ）中で腺の形態形成が行われる可能性を調べた。本発明者らにより、正常基底細胞が、コラーゲン系マトリックス（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ）中で間質とともに、アンドロゲンの存在下で培養すると腺の形態形成が行われ得ることが示された。構造及び表現型がインビボ腺房と類似した球状形態が生成され、多くの場合、分岐した腺胞管様である（Lang他、２００１）。対照的に、癌細胞は、多くの場合、紡錘形状の細胞の大きな集塊を形成するが、明白な器質化(organization)は見られない。それにもかかわらず、この構造体は、多くの場合、或る程度の分化を示す細胞を含有し、元の腫瘍との比較が可能である。
浸潤アッセイ
これらの幹細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ中を移動する能力を、改良ボイデン・チャンバ(Boyden-chamber)法（Albini他、１９８７）によって測定する。移動速度は、ＥＧＦＰで標識した細胞を用い、経時的共焦点顕微鏡検査により評価する。本発明者らにより、低レベルのＥＧＦＰを発現する前立腺上皮が生成された。作製したｐＬＮＣＸ−ＥＧＦＰ（２）系組換えレトロウイルスを用いて細胞集団を感染させ、Ｇ４１８耐性コロニーを運動性アッセイに用いる。低レベルのＧＦＰ発現を用いて浸潤及び運動性をリアルタイムで追跡する。
インビボ腫瘍形成
腫瘍幹細胞は、正常幹細胞を規定する重要な基準を有するはずである。移植後、これらは、増殖、分化及び自己蘇生(self-renew)するはずである。異なる表現型の腫瘍のインビボでのコロニー形成能力を調べるため、幹細胞、移行細胞、基底細胞、管腔細胞及び未分類細胞の移植片を６〜８週齢の雄の免疫不全(immunocomprimised)マウスの前立腺内に導入する。マウスを、移植時に、徐放性テストステロンペレットの皮下移植によってホルモン処置する。各集団について、成功裡に生着し、且つ腫瘍増殖を開始する細胞の数を、移植する細胞の数を変えることにより測定する。性質が異なる集団の自己蘇生能力は、二次レシピエント内に連続移植することにより調べる。
癌細胞と正常幹細胞間の遺伝子発現プロフィールの比較
発現プロフィールを、癌含有組織試料及び非癌組織試料から単離した幹細胞から得る。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイプラットフォームを用い、各試料について遺伝子発現の絶対レベルをアッセイする。これを行なうため、全ＲＮＡを精製α２β１ ＋＋細胞から抽出する。細胞収率が低いため、アレイへのハイブリダイゼーションのために充分な標的を提供する線形増幅工程を用いることが必要である。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの少量試料標識プロトコルでは、１００ｎｇ（約１０４細胞）で効を奏する(work well)が、１〜１０ｎｇという少量の全ＲＮＡも使用可能であることが示された。これまで、本発明者らは、この技術（Ｈｕ−Ｕ１３３Ａ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）を、本発明者らによって最近単離された前立腺癌リンパ節転移細胞株に由来するものである選択した細胞集団（α２β１ ＋＋を含む）から抽出された、増幅した全ＲＮＡのプロフィールを調べるために使用している。
各試料は別々の個体に由来するものであり、したがって、遺伝子発現の相当な程度のばらつき(癌試料と非癌試料間及び同じ類型の内での試料間の両方)は、内在する個体間の遺伝子異質性によるものである。その結果、各類型の試料において「生物学的」複製を含めることが必要であり、本発明者らは、典型的には、各場合で６〜１０の試料（すなわち、合計２０までの試料）を用いる。
バッチ比較解析を用いて各癌試料の実験を非癌試料の各々と比較し、比較結果を３種類の異なる統計学的アルゴリズム（マンホイットニー検定、ノンパラメトリックウィルコクスンの順位検定及び自己組織化マップクラスタリング解析に基づく）に供し、差次的発現を検出する。さらにまた、本発明他は、標準とは異なる挙動を示す遺伝子の群を探すためにクラスター解析を適用する。
図１は、ＣＤ１３３の前立腺上皮の幹細胞マーカーとしての確認である。１Ａ：核染色ＤＡＰＩ（青）及びＰＥに直接コンジュゲートした抗ＣＤ１３３（赤）で標識した前立腺腺房のパラフィン切片。１Ｂ：表現型α２β１ ｈｉ／ＣＤ１３３＋を有する基底細胞は、α２β１ ｌｏｗ／ＣＤ１３３−よりも高いコロニー形成効率（ＣＦＥ）を有する。（ＣＦＥ）は、選択した細胞の数あたりの形成されたコロニーの数×１００％として計算した。ＣＦＥは、対照ＣＦＥに対する比として示す。結果は、４回の実験の平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。１Ｃ．（Ａ）ヘマトキシリン及びエオシン、（Ｂ）３４βＥ１２、（Ｃ）抗Ｋ１８、（Ｄ）抗ＰＡＰ、（Ｅ）抗アンドロゲン受容体で染色したα２β１ ｈｉ／ＣＤ１３３＋基底細胞の移植により形成された前立腺腺房の異種移植片。バーは４０μｍ。 図２は、前立腺のリンパ節転移（ＬＮＭＰ）由来の腫瘍「幹」細胞の特性付けである。２Ａ．α２β１／ＣＤ１３３に基づいて選択した腫瘍細胞は培養中に分化する。２Ｂ．ＰＣ３Ｍ及び不死化前立腺上皮細胞株であるＰＮＴ１ａと比較したＬＮＭＰの浸潤アッセイ活性。 図３は、癌原遺伝子ＢＭＩの核酸配列である。 図４は、癌原遺伝子ＢＭＩのアミノ酸配列である。

Claims (6)

  1. 以下の工程：
    ｉ） 前立腺組織由来の前立腺癌幹細胞を含む細胞調製物を提供する工程、
    ｉｉ） 該前立腺癌幹細胞の培養状態での維持及び該前立腺癌幹細胞のコラーゲン系マトリックスへの結合を可能にする細胞培養条件を提供する工程、
    ｉｉｉ） ＣＤ１３３抗原、ＣＤ４４抗原、ヒト上皮抗原（ＨＥＡ）、および高レベルのα２β１インテグリンを発現する前記結合された細胞を選択する工程
    を含む、ＣＤ１３３抗原、ＣＤ４４抗原、ＨＥＡ、および高レベルのα２β１インテグリンを発現する前立腺癌幹細胞の選択的富化を含む、前立腺癌幹細胞の単離方法。
  2. 以下のさらなる工程：
    ｉ） ＣＤ１３３抗原、ＣＤ４４抗原、ＨＥＡ、および高レベルのα２β１インテグリンを発現する前立腺癌幹細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）及び白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む培養培地中で培養する工程、及び
    ｉｉ） （ｉ）の前立腺癌幹細胞を血清無含有培地中で継代培養する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記前立腺癌幹細胞が原発性で転移性の前立腺腫瘍に由来するものである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記コラーゲン系マトリックスがＩ型コラーゲンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 高いインビトロ増殖能を有し、α２β１インテグリンｌｏｗ／ＣＤ１３３−前立腺細胞よりも高いコロニー形成効率を有し、かつ、免疫不全非ヒト動物モデルにおいて癌性前立腺様腺房を形成することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる前立腺癌幹細胞。
  6. 高いインビトロ増殖能を有し、α２β１インテグリンｌｏｗ／ＣＤ１３３−前立腺細胞よりも高いコロニー形成効率を有し、かつ、免疫不全非ヒト動物モデルにおいて癌性前立腺様腺房を形成することができる、ＣＤ１３３抗原、ＣＤ４４抗原、ＨＥＡ、および高レベルのα２β１インテグリンを発現する前立腺癌幹細胞の細胞培養物。
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