JP2005528115A - 幹細胞および癌幹細胞を同定および単離する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
癌の基礎研究は、癌を引き起こす遺伝子変化の同定に重点的に取り組んできた。これにより、腫瘍形成および悪性転換に関与する分子経路および生化学的経路の理解において、大きな進展がもたらされた。しかし、細胞生物学の理解は遅れている。特定の変異がモデル細胞の増殖および生存に及ぼす影響は周知であると考えられるが、このような変異が、特定の癌に関与する実際の細胞にどのような影響を及ぼすのかは未知である。
幹細胞および癌幹細胞を同定するための方法および組成物を提供する。関心対象の細胞を検出するため、βカテニンによって制御される転写応答エレメントに機能的に連結された検出可能なマーカーをコードする配列を含む核酸構築物を細胞または細胞集団に導入する。活性のある核βカテニンの存在下では、検出可能なマーカーが発現され、細胞が幹細胞であることが示される。この局面において、本方法を用いて、試験細胞、特に正常または非形質転換細胞が幹細胞であるかどうかを判定することができる。本発明のいくつかの態様において、検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)およびその誘導体である。関心対象の幹細胞を単離または濃縮するために、GFPを発現する生細胞をソーティングすることができる。この局面において、本方法を用いて既知の幹細胞を濃縮することおよび今まで未知の幹細胞を選択することができる。
βカテニンによって制御される転写応答エレメントに機能的に連結された検出可能なマーカーをコードする核酸構築物を導入することによる、幹細胞および癌幹細胞を同定するための方法および組成物を提供する。マーカーの発現は細胞におけるβカテニンの活性化を示し、細胞が幹細胞であることを示す。本方法を用いて、細胞が幹細胞であるかどうかを試験すること;ならびに細胞の混合集団において幹細胞を単離および同定することができる。
本明細書に示すデータにより、βカテニンが血液腫瘍と関連していることが実証される。不適切なβカテニン活性、すなわち核移行、変異、過剰発現等の検出は、造血過剰増殖疾患の検出および特徴づけの診断アッセイに使用され、またβカテニンは治療薬剤の標的として使用される。関心対象の過剰増殖状態には、1つもしくは複数の造血細胞系統または結合組織成分の異常な増殖によって特徴づけられる疾患の一群である骨髄増殖性疾患が含まれる。骨髄増殖性疾患には、真性多血症、骨髄線維症、慢性骨髄性(骨髄球性)白血病、および原発性血小板血症が含まれる。急性白血病、特に赤白血病、および発作性夜間血色素尿症を含める血液学者もいる。各疾患は、主な特性または増殖の部位に従って同定される。骨髄増殖性疾患は、急性白血病の転帰をとる場合がある。
本発明の1つの態様においては、本明細書で「検出構築物」と称する、βカテニンによって制御される転写応答エレメントに機能的に連結された検出可能なマーカーをコードする配列を含む核酸構築物を細胞または細胞集団に導入する。核βカテニンの存在下では、検出可能なマーカーが発現され、細胞が幹細胞であることが示される。この局面において、本方法を用いて、試験細胞が幹細胞であるかどうかを判定することができる。関心対象の幹細胞を単離または濃縮するために、マーカーを発現する生細胞をソーティングすることも可能である。この局面において、本方法を用いて既知の幹細胞を濃縮することおよび今まで未知の幹細胞を選択することができる。
実施例1
白血病マウスから骨髄系前駆細胞および造血幹細胞(HSC)を濃縮した集団のソーティングおよび移植
5カラーフローサイトメトリー解析(FACS Vantage)を用いて、白血病マウス骨髄前駆細胞集団を解析およびソーティングし、対照マウスのものと比較した。簡潔に説明すると、大腿骨から骨髄を採取し、25ゲージ針を通すことにより単一細胞懸濁液を作製し、細胞を洗浄した後、CD3、4、8、B220、IL-7受容体、Thy 1.1、Mac-1、Gr-1、およびTer119からなるビオチン化系譜抗体混合物と30分間インキュベートし、その後洗浄してダイナビーズを添加して30分間置いた。次に、Dynal磁気粒子コンセントレータを用いてLin+細胞を除去した。抗CD-34 FITC、c-kit APC、Sca-1テキサスレッド、およびFcγRIII PEで前駆細胞を30分間染色し、その後アビジンCy5 PEで30分間染色し、最後にヨウ化プロピジウムを添加した。同等数(5000/マウス)のGMP(c-kit+ sca- lineage- FcγRIII+ CD34+)およびHSC(c-kit+、Sca1+、lineage-)細胞を致死未満の照射(380ラド)をした、麻酔した免疫不全(RAG2-/- FcγR-/- またはnu/nu)マウスに眼窩後から移植した。図2に示すように、1°、2°、および3°白血病マウスにおけるHSCおよびGMPの拡大を記載した。
6〜10週齡の非白血病Faslpr/lpr-MRP8-Bcl2マウスの大腿骨および頚骨から骨髄を採取した。塩化アンモニウムを用いて赤血球を溶解し、残った細胞をビオチン化抗c-kit抗体およびアビジン複結合磁気ビーズで標識した。次に、Miltenyi MACS磁気精製システムを用いて、c-kit陽性画分を濃縮した。次いでc-kit+画分を、βメルカプトエタノール、グルタミン酸、および50 ng/ml幹細胞因子を含むX-Vivo15培地中の組織培養に供した。細胞の半分がPGK-βカテニン-IRES-GFPレンチウイルスベクターを受け取り、細胞の半分がPGK-IRES-GFPレンチウイルスベクターを受け取った。細胞を一晩インキュベートし、翌日、致死未満の照射(380ラド)をしたRag-/- FcγR-/-レシピエントに静脈内注射した。マウス8匹にβカテニン形質導入細胞を注射し、マウス8匹に対照ベクター形質導入細胞を注射した。移植してから7〜10週間以内に、βカテニン形質導入細胞を受け取ったマウス8匹のうち6匹が白血病になった。対照ベクター形質導入細胞を受け取ったマウスは、どれも発病しなかった(20週間後にも生存していた)。白血病マウスの細胞を連続的に移植したところ、三次の移植の時点でレシピエントの著しい割合に白血病が生じた(表1)。
所望の配列を保有する遺伝子伝達ベクターをウイルス粒子にパッケージングし、適切なパッケージング分子を発現するプラスミドと共にトランスフェクションして293T細胞の上清に分泌させた。これらの実験で用いた2つのベクターは、βカテニン-IRES-GFPまたは対照としてのIRES-GFPのみの発現を駆動するヒトホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターを含んだ。第3のベクターは、GFPの発現を駆動するLEF/TCF応答プロモーターを含んだ。LEF/TCF応答エレメントは、以下の配列(配列番号:13)
を有する。結合部位(1、2、および3)を下線で示し、TATAボックスも同様に示す。
正常対白血病細胞によるβカテニン発現の解析
正常もしくはCMLの末梢血または骨髄からフィコール濃縮した単核集団、およびCML急性転化細胞株K562を、抗βカテニンAlexa-594(赤)結合抗体で染色し、かつ核の可視化のためにヘキスト(Hoechst)(青)で対比染色し、次にデュアルフォトZeiss LSM共焦点蛍光顕微鏡により、βカテニンの細胞質対核局在について解析した。正常細胞と比較して、K562およびCML単核細胞では、細胞質および核の両方のβカテニン発現が高かった。
HSCおよび前駆細胞集団を染色し、以前に記載されたように(Manzら PNAS (2002) 99巻;11872-11877)、FACS Vantageを用いて解析およびソーティングした。造血幹細胞および前駆細胞集団を、(10%ウシ胎児血清、グルタミン、抗生物質(Pen-Step)、ならびに、IL-6(10 ng/ml)、Flt3リガンド(50 ng/ml)、幹細胞因子(SCF;50 ng/ml)、およびトロンボポエチン(TPO;10 ng/ml)を含むサイトカインを添加した)イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)150μlを含む96ウェルプレートに直接クローンソーティングした(200細胞/ウェル〜1000細胞/ウェル)。LEF/TCF-IRES-GFPベクター(1/100)をウェルに添加しまたはベクターを添加せず、細胞を37℃、7% CO2インキュベーター中で7日間〜10日間インキュベートし、その後倒立蛍光顕微鏡を用いてGFP発現を定量的に解析し、FACS解析(FACS Vantage)によりGFP発現を定量的に解析した。データを図7に示す。
インビボのHSCは通常、LEF/TCFエレメントを介してシグナル伝達する
インビボのHSCがWnt/Fzd/βカテニン経路に関連したシグナルを利用するか否かを判定した。ソーティングしたKTLS HSCに、不安定化GFP発現を駆動するLEF-1-TCFレポーター(TOP-dGFP) を有するベクター、またはLEF/TCF結合部位に変異を有する対照レポーター構築物(FOP-dGFP)感染させ、致死的に照射したマウスに移植した。次に照射したレシピエントマウスの群にHSCを移植し、14週間後にレシピエントの骨髄を調べて、ドナーHSCがレポーター活性を示すかどうかを判定した。示した代表的な例では、レシピエントマウスのHSCはGFPに対して陰性であったのに対し、TOP-dGFPで感染したドナー由来のHSCは細胞の29%においてGFPを発現することが認められた。さらに、対照FOP-dGFPレポーターを形質導入したHSCは2.5%しかGFPを発現せず、このことから、KTLS HSCがGFPを発現するには、機能的なLEF-TCF結合部位が特異的に必要であることが実証された。
活性化βカテニンを発現するHSCが、どちらも以前にインビトロおよびインビボアッセイにおいてHSC増殖および自己複製に関与していた遺伝子である、HoxB4およびNotch1をアップレギュレートするかどうかを試験した。βカテニンまたは対照ベクターを感染させたHSCに対してリアルタイムPCR解析を用いて、HoxB4が平均して3.5倍、Notch1が2.5倍アップレギュレートされたことを見出した。一方、GAPDH発現はβカテニン発現の結果差次的に制御されず、これを対照として用いた。これらのデータから初めて、HSC自己複製の制御因子としてこれまでに同定された遺伝子が、分子階層に関連し、おそらく分子階層において作用することが示される。
マウス
C57Bl/Ka Ly5.1、Thy1.1、C57Bl/Ka Ly5.2、Thy1.1マウス、およびAKR/JマウスをSPF施設で飼育し、6週〜10週齡で使用した。動物飼育施設において酸性水でマウスを飼育および維持した。
Domenら (2000) J Exp Med 191:253-64に記載されるように、抗体を用いてマウス骨髄からHSCをソーティングした。すべての細胞ソーティングおよびFACS解析は、スタンフォード共有FACS施設およびデューク癌センターFACS施設においてFACS Vantage(Becton Dickinson)により実施した。c-kit、Sca-1の発現、低レベルのThy1.1、および低レベルから陰性レベルの系譜マーカー(Lin)に基づき、細胞をソーティングおよび再解析した。
レトロウイルスで形質導入したHSCを培養物から回収し、ヘキスト培地中で、ヘキスト3342(Molecular Probes)を用いて37℃で45分間染色した。次に細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより解析して、GFP+細胞の細胞周期特性を決定した。
gag-polおよびVSVG構築物と共にMSCV構築物を用いて293T細胞を3回トランスフェクションすることにより、ウイルスを産生させた。ウイルス上清を3日間回収し、50,000gで超遠心することにより100倍濃縮した。ウイルス感染には、10,000個のHSCを96ウェルプレートのウェルにソーティングし、SLF(30 ng/ml)(R&D systems)の存在下で一晩培養した。12時間後、濃縮したレトロウイルス上清を細胞に1:1比で添加した。次に細胞を32℃で12時間インキュベートし、37℃で36時間インキュベートし、インビトロ用およびインビボアッセイ用にGFP+細胞をソーティングした。用いたレンチウイルスは、以下のレンチウイルスレポーターアッセイにおいて記載するように産生させた。
新鮮に精製したまたはウイルスにより形質導入したHSCを、単一細胞沈着ユニットおよびクローンサイクル・ソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry systems)を用いて、Terasakiプレートのウェル当たり1個〜20個細胞でプレーティングした。5×10-5M 2-メルカプトエタノールおよび示した増殖因子を添加した無血清培地(X-vivo 15、BioWhittaker)を含むウェルに、細胞をソーティングした。所定の間隔で各ウェル内の細胞数を計数することにより、増殖をモニタリングした。長期培養については、形質導入したHSCをSLF(1 ng/ml)の非存在下または存在下で96ウェルプレートにプレーティングし、所定の間隔で細胞計数することにより生じた細胞の数をモニタリングした。長期培養物については、10,000個の形質導入HSCをSLF(1 ng/ml)の非存在下または存在下で96ウェルプレートにプレーティングし、所定の間隔で細胞計数することにより生じた細胞の数をモニタリングした。
ウイルスにより形質導入したHSCをインビトロで培養し、200kV X線機器を用いて9.5 Gyで照射した4匹〜6匹のレシピエントマウスの群に、300,000個のレスキュー宿主全骨髄またはSca-1欠乏細胞と共に、眼窩後から注射した。照射後、宿主マウスに抗生物質水(1.1 g/L硫酸ネオマイシンおよび106 U/L硫酸ポリミキシンB)を与えた。移植したマウスから定期的に採血し、ドナー細胞によって寄与された造血区画の割合を測定した。ドナーおよび宿主細胞は、CD45(Ly5)の対立遺伝子発現またはBCl2導入遺伝子の発現により識別した。
ベクターの産生
EGFPまたはd2-EGFP遺伝子(不安定化、半減期2時間;Clontech)を、3つのLEF/TCF結合モチーフおよび1つのTATAボックスを含む、LEF/TCF応答プロモーター(Korinekら (1997) Science 275:1784-1787)の下流にクローニングした。次に、このカセットを自己不活性化レンチウイルスベクタープラスミド(Follenziら (2000) Nat Genet 25:217-22)にクローニングした。以前に記載されているように、ベクター保存液を調製し濃縮した。簡潔に説明すると、293T細胞に、伝達ベクタープラスミド、VSV-GエンベロープコードプラスミドpMD.GおよびパッケージングプラスミドCMVΔR8.74をトランスフェクションした。上清を回収して超遠心し、ベクターのペレットを少量のPBS/0.1% BSA中に懸濁した。類似の構築物をトランスフェクションし、それにコードされる遺伝子が非分裂HSCにおいて発現されることが示されている(Uchidaら (1998) Proc Natl Acad Sci 95:11939-44)。
以前に公表された方法により、HZ/Ly5.2/Thy1.1マウスから、二重ソーティングしたKTLS HSCを精製した。グルタミン酸、メルカプトエタノール、pen/strep、および、10 ng/ml IL-11、10 ng/ml TPO、50 ng/ml SCF、50 ng/ml Flt-3Lからなるサイトカイン混合物を含むX-Vivo15中で、細胞をインキュベートした。細胞を37℃、7% CO2で6時間〜一晩インキュベートし、致死的に照射したコンジェニックレシピエント(BAまたはB6/Ka)に移植した。致死的に照射したマウスはそれぞれ、レシピエント系統の3×105個の骨髄単核細胞と共に、500個の形質導入HSCを受け取った。14週間を超える期間が過ぎた後(14週間〜24週間の範囲)、マウスを解析した。解析するには、骨髄を採取し、AutoMACSを用いてc-kit+細胞を濃縮した。次にKit+画分を、Cy5-PE結合系譜混合物(CD3、CD4、B220、Gr-1、Mac-1、Ter119)、PE結合Ly5.2、APC結合c-kit、およびTR結合Sca-1で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。
BAマウスからKTLS HSCを精製し、培地中に(上記のようにIL-11、TPO、SCF、およびFlt-3Lを添加したIMDM/10% FBS)直接二重ソーティングした。ウェル当たり500細胞〜1000細胞で、細胞を96ウェルプレートに分注した。OT-GFPベクターを1:100希釈で適切なウェルに添加した。Wnt3aを、CTD, Inc.のランダムメチル化βシクロデキストリンの存在下で、1:1000希釈で適切なウェルに添加した。Wnt3aを受け取らないウェルは、代わりに1:1000 CHAPSを受け取った。5日後に細胞を回収し、PIで染色して非生細胞を排除し、GFP発現について解析した。
75,000個の野生型HSCを、βカテニン-IRES-GFPまたは対照IRES-GFPレンチウイルスと共に培養した。培養してから2日後、GFP発現に基づいて感染細胞を単離した。Trizol(登録商標)(Invitrogen)を用いてRNAを調製し、改変Eberwine合成を用いてリニア増幅した。SuperScript(商標)II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて、各500 ngの増幅RNAを第一鎖に変換し、リアルタイムPCRにより差次的遺伝子発現を解析した。cDNAをFastStart Master SYBR Greenポリメラーゼ混合物(Roche)、ならびにGAPDH用
、HoxB4用
、およびNotch1用
のプライマーと混合した。LightCycler(登録商標) (Roche)を用いてリアルタイムPCRを行い、LightCycler(登録商標)ソフトウェアを用いてリアルタイムデータを解析した。
Claims (11)
- βカテニンによって制御される転写応答エレメントに機能的に連結された検出可能なマーカーをコードする配列を含む核酸構築物を、細胞または細胞集団に導入する段階;および
検出可能なマーカーの発現の存在を検出する段階
を含む、幹細胞を同定する方法であって、該マーカーの発現により細胞が幹細胞であることが示される方法。 - マーカーが蛍光産生タンパク質である、請求項1記載の方法。
- βカテニンによって制御される転写応答エレメントがLEF-1/TCF結合配列である、請求項2記載の方法。
- 検出可能なマーカーを発現する細胞を選択する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
- 細胞が生細胞である、請求項4記載の方法。
- 細胞集団が腫瘍細胞集団である、請求項5記載の方法。
- 細胞集団が正常細胞の複合集団である、請求項5記載の方法。
- 細胞内の異常なβカテニンの存在を判定する段階を含む、造血過剰増殖疾患を診断するまたは特徴づける方法。
- 核酸構築物を幹細胞または造血前駆細胞に導入して、トランスジェニック造血幹細胞を産生する段階を含む、哺乳動物造血細胞の寿命を延ばす方法であって、
発現すると哺乳動物造血細胞の寿命を延ばすおよび/または数を増やす、βカテニン配列由来のオープンリーディングフレームを、該核酸構築物が含む方法。 - 腫瘍阻害用の候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
該薬剤を請求項9記載の細胞と混合する段階;および
該薬剤の該細胞に及ぼす効果を判定する段階
を含む方法。 - 腫瘍が造血器腫瘍である、請求項10記載の方法。
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