JP4970948B2 - 癌幹細胞の同定、単離、および除去の方法 - Google Patents
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Description
白血病は、骨髄および血液における白血球の異常な増殖および発達が関与する造血器官の悪性疾患である。白血病は通常、関与する細胞の種類によって骨髄性またはリンパ性に分類される。これらの群内には慢性疾患および急性疾患が存在し、これらは持続時間および性質の点で異なる。白血病は年齢特異性を有する傾向があり、例えば急性リンパ性白血病は若年小児で好発するのに対し、急性骨髄性白血病は主に若年成人に見られる。
白血病幹細胞(LSC)を含む癌幹細胞が同定される。これらの細胞は、疾患の進行および化学療法剤に対する耐性に関与する。LSCは造血前駆細胞の表現型と類似した表現型を有し、この表現型は、白血病幹細胞が活性化β-カテニン経路を獲得している点で正常前駆細胞と異なる。結果として、LSCは、通常は造血幹細胞に限定されている増殖能および自己複製能を獲得する。CMLでは、疾患の進行に関与するLSCは、表現型が顆粒球/マクロファージ前駆細胞と類似している。
白血病および前白血病、特に慢性白血病、例えば慢性骨髄性白血病(CML);慢性骨髄単球性白血病などは、造血幹細胞および/または前駆細胞、特に、CMP(common myeloid progenitor);巨核球赤血球前駆細胞(MEP)、および骨髄単球系統(GMP)を含み得る骨髄系統に委任された前駆細胞の存在を解析することによって、病期分類される。病期分類は、予後診断および治療に有用である。
白血病幹細胞は、白血病の進行および薬剤耐性に関与し得る。本明細書において提供されるLSCは、造血前駆細胞の表現型と類似しているが、細胞が通常は造血幹細胞に限定されている増殖能および自己複製能を獲得している点で異なる表現型を有することが示される。
慢性白血病には、慢性骨髄性白血病(CML);慢性骨髄単球性白血病、および慢性リンパ性白血病が含まれる。CMLのクローン性骨髄増殖は初期造血細胞の悪性形質転換によって起こり、主に骨髄またそればかりでなく骨髄以外の部位における顆粒球の著しい過剰産生によって臨床的に特徴づけられる。腫瘍クローンは、RBC、巨核球、単球、ならびにさらにはいくらかのT細胞およびB細胞を含み得る。正常な幹細胞は保持され、CMLクローンの薬剤抑制後に出現し得る。大部分の患者において、CMLクローンは加速期および最終的な急性転化に進行する。
骨髄異形性症候群(MDS)は、一般に老齢患者に見られる一連の造血不全を示す(WHO分類を参照のこと)。発癌物質への曝露が関係している可能性がある。MDSは、赤血球、骨髄および巨核球型を含む造血細胞の異常な成熟を特徴とする。骨髄は正常であるかまたは過形成性であり、無効な造血により様々な血球減少が起こり、貧血が最もよく見られる。細胞産生障害のために、骨髄および血液において形態的細胞異常も伴う。時折、骨髄外の造血が起こり得り、肝腫大および脾腫大が生じる。骨髄線維症が時に診断時に存在し、またはMDSの過程で発症し得る。MDSクローンは不安定であり、AMLに進行する傾向がある。
患者試料中のLSCの存在は、白血病の段階の徴候となり得る。さらに、LSCの検出により、治療に対する応答をモニターすることができ、またこれは予後診断の補助となり得る。LSCの存在は、特定の白血病に関連する前駆細胞の表現型を有する細胞を定量化することによって決定し得る。例えば、CMLでは、GMP表現型を有する細胞の数を定量化することが有用である。
細胞染色による解析は、当技術分野において周知である簡便な方法を使用し得る。正確な計数を提供する方法には蛍光活性化セルソーターがあり、セルソーターは、マルチカラーチャネル、低角および鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、様々な程度の精巧さを有し得る。死細胞と結合する色素(例えば、ヨウ化プロピジウム)を用いることにより、細胞を死細胞に対して選択することができる。
細胞の混合集団またはLSCについて濃縮した集団を、β-カテニン経路の活性化に関して解析し得る。本明細書で「検出構築物」と称する、βカテニンによって制御される転写応答エレメントに機能的に連結された検出可能なマーカーをコードする配列を含む核酸構築物を細胞または細胞集団に導入する。核βカテニンの存在下では、検出可能なマーカーが発現され、細胞が幹細胞であることが示される。この局面において、本方法を用いて、試験細胞が幹細胞であるかどうかを判定することができる。関心対象の幹細胞を単離または濃縮するために、マーカーを発現する生細胞をソーティングすることも可能である。
上記に説明される特徴を有する細胞を濃縮する方法により、細胞の複合混合物から関心対象の細胞を分離することができる。組織から細胞を単離するため、分散または懸濁のために適切な溶液が用いられ得る。そのような溶液は一般に、一般に5〜25 mMである低濃度の許容可能な緩衝液と同時に、ウシ胎児血清および他の天然因子を都合よく添加した、例えば生理食塩水、PBS、ハンクス平衡塩類溶液等の平衡塩類溶液である。簡便な緩衝液には、HEPES、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が含まれる。
LSCはまた、癌幹細胞に活性を及ぼす因子および化学療法剤を検出するインビトロのアッセイ法およびスクリーニングに有用である。特に興味深いのは、ヒト細胞に活性を及ぼす薬剤のスクリーニングアッセイ法である。このためには、タンパク質結合に関する免疫測定法;細胞増殖、分化、および機能活性の決定;因子の産生などを含む、多種多様なアッセイ法を用いることができる。
実施例1
蛍光活性化セルソーティング(FACS)により、患者がイマチニブ耐性を発現する前の(CP;n=20、AP;n=24、BC;n=12)、発現する過程にある(CP=22、AP=11、BC=2)、および発現した後(AP=4、BC=1)の慢性期(CP)、加速期(AP)、および急性転化(BC)期CMLの骨髄および末梢血試料から、高度に精製された造血幹細胞(HSC)を見込みで単離した。
骨髄および末梢血試料
健常ボランティア(AllCells、カリフォルニア州、バークレー)および同種骨髄ドナー(スタンフォード大学医学部、Department of Bone Marow Transplantation、カリフォルニア州、スタンフォード)からインフォームドコンセントを得て新鮮な骨髄を採取した。また、サイトカイン(G-CSF)動員末梢血試料を同種ドナーからアフェレーシス後に採取した。スタンフォード大学メディカルセンターにおいて新たに診断された患者(CP;n=20、AP;n=24、BC;n=12)から、ならびに6〜16ヶ月間イマチニブ投与を受けた患者(CP=22、AP=11、BC=2)、およびイマチニブ耐性になった患者(AP=4、BC=1)であり、イマチニブ抵抗性患者のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤/イマチニブ研究に登録された患者からインフォームドコンセントを得て、慢性期(CP)、加速期(AP)、および急性転化(BC)期の骨髄および末梢血試料を採取した。
標準的な方法に従ってフィコール密度遠心分離後に単核画分を抽出し、新鮮な状態で、または液体窒素下にて90% FCSおよび10% DMSO中で予め凍結しておいた試料を急速に融解した後に解析した。FACS解析および選別を行う前に、造血幹細胞(HSC)を、CD2 RPA-2.10;CD11b、ICRF44;CD20、2H7;CD56、B159;GPA、GA-R2(Becton Dickinson-PharMingen、サンディエゴ)、CD3、S4.1;CD4、S3.5;CD7、CD7-6B7;CD8、3B5;CD10、5-1B4;CD14、TUK4;CD19、SJ25-C1(Caltag、カリフォルニア州、サンフランシスコ)を含む系統マーカー特異的フィコエリトリン(PE)-Cy5結合抗体、ならびにAPC結合抗CD34、84G12(Becton Dickinson-Pharmingen)、ビオチン化抗CD38、HIT2(Caltag)、FITC結合抗CD90、およびPE結合抗Flk2で染色した。ストレプトアビジン結合テキサスレッド(Gibco)を用いて、ビオチン化抗体を可視化した。CD34+CD38-CD90+系統陰性(lin-)染色に基づいてHSCを同定した。
BSA、グルタミン、2-メルカプトエタノール、抗生物質、ならびにIL-3(20 ng/ml)、IL-6(10 ng/ml)、IL-11(10 ng/ml)、幹細胞因子(SCF、10 ng/ml)、Flt3リガンド(FL、10 ng/ml)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF、50 ng/ml)、トロンボポエチン(TPO、50 ng/ml)、およびエリスロポエチン(Epo、4単位/ml)を含むヒトサイトカイン(R&D Systems)を添加したメチルセルロース培地(Methocult、Stem Cell Technologies、バンクーバー)を含む35 mmペトリ皿(Falcon)上に約100個の細胞を直接選別し、これを7% CO2インキュベーター中で37℃でインキュベートしてから14日後に、正常およびCMLの骨髄および末梢血試料による骨髄コロニー形成を評価した。連続した再プレーティング実験において、個々のコロニー(4〜17個/プレート)を採取し、IL-3、IL-6、IL-11、SCF、Flt3リガンド、GM-CSF、TPO、およびEPOを添加したメチルセルロース培地200μlに再度プレーティングし、上記のように14日後にコロニーをスコアリングした。
正常(n=5)骨髄試料またはCML(CP=2、AP=3、BC=4、イマチニブ後=2、イマチニブ耐性=2)の骨髄もしくは末梢血試料に由来するFACSで二重選別した前駆細胞集団のサイトスピンをShandon Cytospin Cnetrifuge(500 rpm)で調製するか、または前駆細胞集団をスライドガラス上に直接選別した。スライドをPBS中で室温にて5分間洗浄し、加湿した暗下チャンバー内でPBSに溶解した1:50抗ヒトCD45-FITC抗体(Anti-Hle-1;Becton Diskinson)と共に室温で1時間インキュベートし、その後暗下でPBSにより5分間洗浄した。次にスライドを4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、その後PBSおよび0.1% Tween-20中で暗下にて室温で5分間洗浄した。0.1% Tween-20およびPBSに溶解した5%ヤギ血清、1% BSA、1:100 Fcγ受容体を添加して室温で1時間インキュベートすることにより、非特異的抗体結合をブロッキングし、次いでスライドを、PBS中の2%ヤギ血清および1% BSAで希釈した非リン酸化β-カテニンに対する2.5μg/mlの抗体(Clone 8E4マウスモノクローナルIgG、Upstate)と共に、加湿した暗下チャンバー内で室温で1時間インキュベートした。次にスライドをPBSおよび0.1% Tween-20により暗下にて室温で15分間2回洗浄し、その後、抗体希釈緩衝液中で1:1000に希釈したAlexa 594結合ヤギ抗マウス抗体(Molecular Probes)と共に1時間インキュベートした。次いで細胞をPBSおよび0.1% Tween-20で15分間2回洗浄し、PBS中のHoechst 33342(Molecular Probes)の1:1000のPBS希釈物と共に10分間インキュベートし、PBSおよび0.1% Tween-20で5分間洗浄し、その後Prolong褐色防止剤(Molecular Probes)と共にカバーガラスを加えた。
高感度GFP(eGFP)遺伝子が3つのLEF-1/TCF結合モチーフおよび1つのTATAボックスを含むLEF-1/TCF応答プロモーターの下流にクローニングされたレンチウイルスLEF/TCFレポーターを作製した。次に、このカセットを自己不活性化レンチウイルス伝達ベクタープラスミドにクローニングした。伝達ベクターをVSV-GエンベロープコードプラスミドpMD.GおよびパッケージングプラスミドCMVΔR8.74と共に293T細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスを作製した。上清を回収し、超遠心により濃縮した。10%ウシ胎児血清、グルタミン、抗生物質(Pen-Strep)、ならびにIL-6(10 ng/ml)、Flt3リガンド(50 ng/ml)、幹細胞因子(SCF;50 ng/ml)、およびトロンボポエチン(TPO;10 ng/ml)を含むサイトカインを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)150μlを含む96ウェルプレート上に直接クローン選別した(200〜1000細胞/ウェル)造血幹細胞および前駆細胞集団を含む200マイクロリットルウェルに、LEF-TCF-IRES-GFPベクター(1/100)を1:100希釈で直接添加するか、またはベクターを添加しなかった。細胞を37℃、7% CO2インキュベーター中で7日間インキュベートし、次いで回収して洗浄し、ヨウ化プロピジウム中で再懸濁し、FACS解析(FACS Vantage)によりGFP発現について解析した。IL-3、IL-6、IL-11、Flt3リガンド、GM-CSF、SCF、TPO、およびEPOを添加したメチルセルロース培地(Stem Cell Technologies、バンクーバー)中で、正常およびCMLの単核細胞、HSC、およびGMPにLEF/TCF-IRES-GFPベクター(1/100)を形質導入するかまたはせず、上記のようにこれらの細胞を37℃、7% CO2インキュベーター中で14日間培養した。Zeiss倒立顕微鏡を用いてコロニー中のGFP発現を可視化し、SPOTソフトウェアを用いて撮影した。非形質導入コロニーを自家蛍光対照として使用した。
正常および造血幹細胞プロファイルの5色FACS解析から、イマチニブ療法前はCMLの骨髄および末梢血試料においてCD34+lin-細胞が拡大しているが、イマチニブ療法後にはCD34+Lin-前駆細胞が劇的に減少することが明らかになった。加速期への疾患の進行は、正常骨髄に対するCD34+CD38+Lin-前駆細胞プールの拡大(P=0.026)によって特徴づけられた。HSC区画はCML CPおよびAPでは有意に拡大していなかったが、イマチニブ耐性CML試料では増加していた。CML APはまた、CD34+CD38+細胞によるCD90の一貫した異常発現によって、慢性CMLまたは急性転化期CMLから識別され得た。CML急性転化は、CD34+CD38-前駆細胞(p=0.01)およびCD34+CD38+前駆細胞の両方の拡大によって表された。さらに、予後不良AMLにおいて変異しているかまたは過剰発現している場合が多いチロシンキナーゼ、Flk3/Flt3の表面発現は、進行期CMLのCD34+CD38-CD90+およびCD90-Lin-細胞で増加していた。
同様の実験をCMML患者の血液試料で行った。データから、CMML患者の造血幹細胞によるFlk2発現の増加が示される。
慢性骨髄性白血病(CML)の急性転化への進行は、自己複製する白血病幹細胞によって支持される。正常マウス造血幹細胞は、自己複製のためにWnt/β-カテニンシグナル伝達経路を使用する。本発明者らは、CMLにおける白血病幹細胞が自己複製のためにβ-カテニン経路を使用するかどうかを調べた。
骨髄および末梢血試料
前記の健常ボランティア(All Cells、カリフォルニア州、バークレー;n=11)から、またはスタンフォード大学およびUCLA IRB規制に従った書面によるインフォームドコンセントが得られた慢性期(n=20)、加速期(n=26)、および急性転化(n=13)にあるCML患者から、骨髄およびG-CSF動員末梢血を得た。イマチニブによる治療を受ける前の患者、6〜15ヶ月間イマチニブ投与を受けた患者(慢性期;n=22、加速期;n=11、急性転化;n=2)、およびイマチニブ耐性患者(加速期;n=5、急性転化;n=1)から細胞を採取した。慢性期の患者はインターフェロンα投与を受け、進行疾患の患者はイマチニブに加えてしばしば細胞縮小剤による治療を受けた(表1)。
BM=骨髄;PB=末梢血;CP=慢性期;AP=加速期;BC=急性転化;Ph+=フィラデルフィア染色体陽性;CHR=血液学的完全寛解;FTI=ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤;alloBMT=同種骨髄移植;IFN-α=インターフェロンα;ara-C=シトシンアラビノシド
造血幹細胞(HSC;CD34+CD38-CD90(Thy1)+Lin-細胞)、ならびに骨髄系共通前駆細胞(CMP;CD34+CD38+IL-3Rα+CD45RA-)、顆粒球/マクロファージ前駆細胞(GMP;CD34+CD38+IL-3Rα+CD45RA+)、および巨核球/赤血球前駆細胞(MEP;CD34+CD38+IL-3Rα-CD45RA-)を含む骨髄前駆細胞を、上記したように正常およびCMLの単核細胞からFACSにより単離した。
コロニー形成細胞(CFC)アッセイ法は、上記の通り行った。再プレーティング実験では、14日目に個々のコロニーを採取し、96ウェルプレートに再度プレーティングし、14日後にスコアリングした。いくつかの実験では、LEF/TCF-GFPレポーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター-β-カテニン-IRES-GFP、またはPGK-アキシン-IRES-GFPを含むレンチウイルス構築物をCFCアッセイ法に添加した(LEFはリンパ球エンハンサー因子であり、TCFはT細胞因子であり、GFPは緑色蛍光タンパク質であり、IRESはウイルスRNA中の内部リボソーム侵入部位である)。
40〜300個の正常またはCML造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、または巨核球/赤血球前駆細胞(慢性期、n=4;加速期、n=7;急性転化、n=3;イマチニブ後、n=4;イマチニブ耐性、n=5)からのRNA単離、ならびにBCR-ABL、β-カテニン、LEF-1、およびHPRT発現に関する定量的逆転写-PCRは上記の通り行った。
FACS分離した造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、および巨核球/赤血球前駆細胞を0.8%パラホルムアルデヒドで固定し、0.3%サポニンで透過性にした。細胞をβ-カテニンに対するフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合抗体(Transduction Laboratories)またはIgG1アイソタイプ対照-FITC抗体で一晩染色し、洗浄して、FACSにより解析した。
正常(n=6)またはCMLの造血幹細胞または顆粒球/マクロファージ前駆細胞をスライドガラス上にFACS選別し、抗ヒトCD45-FITC抗体で染色し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、その後1/200希釈した(2.5μg/ml)活性化β-カテニンに対するマウスモノクローナル抗体(Clone 8E4;Upstate、ニューヨーク州、レークプラシッド)で染色し、上記のようにalexa 594結合ヤギ抗マウス抗体で検出した。Hoechst 33342(Molecular Probes)を核染色として使用した。Volocity(商標)ソフトウェアを利用し、二重光子Zeiss LSM510共焦点蛍光顕微鏡により、100x倍率で共焦点像を得た。
レンチウイルスLEF/TCFレポーター(図6)を使用し、ヒトサイトカインIL-6(10 ng/ml)、Flt3リガンド(50 ng/ml)、スチール因子(SLF;50 ng/ml)、およびトロンボポエチン(10 ng/ml)に置き換えるが本質的には上記の通りに、選別した正常およびCMLの造血幹細胞および骨髄前駆細胞集団におけるLEF/TCF媒介性転写のβ-カテニン活性化についてアッセイした。
個々のコロニーをmyelocult培地(H5100、Stem Cell Technologies)50マイクロリットル中に採取して穏やかにボルテックスし、上記の通りに幹細胞因子(SCF、10 ng/ml)、Flt3リガンド(FL、10 ng/ml)、IL-3(20 ng/ml)、IL-6(10 ng/ml)、IL-11(10 ng/ml)、トロンボポエチン(TPO、50 ng/ml)、およびエリスロポエチン(EPO、4単位/ml)を含むヒトサイトカインを添加したメチルセルロース(150マイクロリットル)で、上記のLEF/TCF-GFP、ホスホグリセリン酸キナーゼ-β-カテニン-IRES-GFP、ホスホグリセリン酸キナーゼ-アキシン-IRES-GFP、またはホスホグリセリン酸キナーゼ-IRES-GFP対照ベクターを含むレンチウイルスベクターを加えてまたは加えずに再懸濁し、加湿した37℃、5% CO2インキュベーター中、96ウェルプレート(Falcon)で14日間培養した。14日目にコロニーをスコアリングし、Zeiss倒立蛍光顕微鏡を用いてGFP蛍光を解析し、SPOTソフトウェアを用いて40X倍率で顕微鏡写真を得た。
40〜300個の正常またはCML造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、または巨核球/赤血球前駆細胞からRNAを単離した。BCR-ABL Taqman定量的RT-PCR反応は、以前に記載されているP210 BCR-ABL特異的プライマーおよびP210 BCR-ABLプローブを用いて行った49。β-カテニン、LEF-1、およびHPRT(対照として)の定量的RT-PCRアッセイ法は、RNeasy Miniキット(Qiagen)を用いて単離し、オリゴ(dT)プライマーおよびSuperscript(商標)II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて42℃で50分間逆転写した全RNAにおいて、SYBR Green core PCR試薬(Applied Biosystems)および配列特異的プライマー(以下を参照)を用いて、以下を含む特異的プライマーにより行った。
増幅は、ABI Prism 7700 Sequence Detector System(Applied Biosystems)を用いて、最初の変性(95℃で10分)後の2段階PCR(95℃で15秒および60℃で60秒)50サイクルにより行った。内因性対照としてのHPRT mRNAの増幅を使用して、試料全域にわたり反応を標準化した。異なる試料における相対標的遺伝子発現を比較するため、正常(NL)骨髄試料の1つを参照とし、平均試料値を参照値の割合として表した。
正常(n=5)またはCML(慢性期;n=2、加速期;n=3、急性転化;n=4、イマチニブ後;n=2、イマチニブ耐性;n=2)の造血幹細胞または顆粒球/マクロファージ前駆細胞を、スライドグラス上にFACS選別した。スライドをPBS中で5分間洗浄し、抗ヒトCD45-FITC抗体(Anti-Hle-1;BD)で1時間染色し、PBSで洗浄して、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、さらにPBS/0.1% Tween-20(PBS-T)中で5分間洗浄した。PBS-TおよびPBSに溶解した5%ヤギ血清、1% BSA、1:100 Fcγ受容体で非特異的抗体結合をブロッキングし、次いで上記の通りに核β-カテニンに対するマウスモノクローナル抗体で1時間染色した。次にスライドをPBS-Tで洗浄し、Alexa 594結合ヤギ抗マウス抗体で染色し、洗浄して、Hoechst 33342(Molecular Probes)と共に10分間インキュベートし、PBS-Tでリンスし、Prolong褐色防止剤(Molecular Probes)およびカバーガラスを被せた。二重光子Zeiss LSM 510共焦点蛍光顕微鏡により、100x倍率で共焦点像を得た。β-カテニン-Alexa594について、励起スペクトルおよび発光スペクトルはそれぞれ543 nmおよび565〜615 nmであった。Hoechst 33342を可視化するには、776 nm励起波長、ビームスプリッタ、および435〜485 nmのバンドパスを用いる二重光子レーザーシステムを使用し、一方CD45 FITCを可視化するための励起波長は488 nmであった。Volocity(商標)ソフトウェアを用いて、共焦点像の三次元レンダリングを作製した。
CMLにおける造血幹細胞および前駆細胞
FACS解析から、CMLの加速期および急性転化期の骨髄では、正常骨髄と比較してCD34+系統陰性(Lin-)細胞が拡大していることが明らかになった(図6A)。CD34+Lin-幹細胞および前駆細胞プールのうち、造血幹細胞区画(CD34+CD38-CD90+Lin-)は疾患の進行に伴って拡大していなかった(図1A)。しかし、個々の骨髄前駆細胞集団(CD34+CD38+Lin-)の評価から、正常骨髄と比較して、慢性期CMLでは巨核球/赤血球前駆細胞が増加しており(p<0.001)、加速期CMLでは骨髄系共通前駆細胞が増加しており(P=0.04)、急性転化した患者の骨髄では顆粒球/マクロファージ前駆細胞が増加している(P=0.02)ことが判明した(図1B)。イマチニブに反応する患者では、正常骨髄と比較してCD34+ Lin-細胞の数が有意に減少し(P=0.027)、また個々の骨髄前駆細胞の割合も正常に戻っているが、イマチニブ耐性CMLの試料では顆粒球/マクロファージ前駆細胞の数が増加していた(図6AおよびC)。
FACS解析から、細胞内の全β-カテニンレベルは、CMLのどの病期においても正常造血幹細胞とCML造血幹細胞とに有意な相違がないことが明らかになった(慢性期ではP=0.36、加速期ではP=0.30、および急性転化ではP=0.33)。対照的に、加速期(P=0.009)または急性転化(P=0.04)の患者の骨髄前駆細胞では、正常ドナーの骨髄前駆細胞と比較してβ-カテニンレベルが上昇していた(図2A)。このレベルは、イマチニブ投与を受けそれに反応した患者では正常であった(図2B)。活性化(非リン酸化)β-カテニンは核に移動する(図7)。非リン酸化β-カテニンに対するモノクローナル抗体を用いた共焦点蛍光顕微鏡法により、核β-カテニンの染色強度は正常、加速期、および急性転化の造血幹細胞において同様であることが示された。しかし、急性転化を起こした患者(図3B)またはイマチニブ耐性患者の顆粒球/マクロファージ前駆細胞では、正常骨髄のそのような前駆細胞と比較して(図3C)、活性化β-カテニンが著しく増加したいた。これと一致して、核β-カテニンによる転写活性化を測定するために使用したLEF/TCF-GFPレポーターアッセイ法から、正常、慢性期、および急性転化の造血幹細胞では同様のレベルのβ-カテニン/LEF-TCF媒介性転写が活性化されているが、急性転化を起こした患者の顆粒球/マクロファージ前駆細胞ではその活性化レベルが増加していることが判明した(図3D)。さらに、LEF/TCF-GFPレポーターを形質導入した急性転化CD34+Lin-細胞に由来するコロニーは、正常対応物と比較して高いレベルのβ-カテニン/LEF/TCF媒介性転写を有した(図8)。正常な顆粒球/マクロファージ前駆細胞はβ-カテニンまたはその転写活性化補充因子、LEF-1をほとんど発現しないが、急性転化およびイマチニブ耐性CMLではそのような前駆細胞において両遺伝子の転写物が増加しており(図9)、それがβ-カテニンの核蓄積に寄与している可能性が高い。
本発明者らは、CMLにおける顆粒球/マクロファージ前駆細胞が、β-カテニン活性化の結果として造血幹細胞の高増殖能および自己複製能を獲得するかどうかを調べた。レンチウイルスβ-カテニンを形質導入した加速期CMLのCD34+Lin-細胞は正常コロニーよりも大きなコロニーを形成したが、β-カテニンアンタゴニスト、アキシンを細胞に形質導入するとコロニーサイズは減少した(図4A、図10、および図11)。図11に示すように、細胞を他のwnt阻害剤を用いて試験した場合にも効果が認められる。
様々な前駆細胞サブセットの長期白血病能を追跡するため、ヒトCML急性転化、イマチニブ耐性患者から前駆細胞を単離し、細胞選別および形質導入手順は上記の通りに行った。細胞に、マーカーとしてルシフェラーゼ-GFPを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。以下のように細胞をRAG2-/- γc -/-マウスに移植した。15 x 103個細胞のHSC;104個細胞のCMP;90 x 103個の全CD34+38+。蛍光カメラにより、生存マウス宿主において標識細胞の数を評価した。
Claims (5)
- 白血病幹細胞(LSC)の組成物を濃縮する方法であって、該方法が、
Thy-1、IL-7Rα(CD127)、および系統パネルを特異的に認識する試薬とLSCを含むと疑われる骨髄性白血病試料を混合するステップと、
Thy-1-、IL-7Rα(CD127)-、および系統パネル-である細胞を選択するステップと、
を含む方法。 - 前記試料が白血病患者の血液試料であり、任意に、該白血病患者が慢性骨髄性白血病患者である、請求項1記載の方法。
- 白血病状態の段階を決定する方法であって、該方法が、
Thy-1、IL-7Rα(CD127)、および系統パネルを特異的に認識する試薬とLSCを含むと疑われる試料を混合し、
Thy-1-、IL-7Rα(CD127)-、および系統パネル-である細胞として白血病幹細胞の存在を決定する、
方法により白血病幹細胞の存在を検出するステップを含み、
ここで、該白血病幹細胞の存在が前記白血病状態の段階を示す、方法。 - 前記白血病状態がMDSまたは骨髄性白血病であり、任意に、該骨髄性白血病がCMLまたはCMMLである、請求項3記載の方法。
- 請求項1または2記載の方法に用いるためのキットであって、Thy-1、IL-7Rα(CD127)、および系統パネルを特異的に認識する染色試薬の組合せを含むキット。
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