ES2710601T3

ES2710601T3 - Inhibición del potencial tumorigénico de células madre tumorales por LIF

Info

Publication number: ES2710601T3
Application number: ES16171392T
Authority: ES
Inventors: Angelo Luigi Vescovi; Brent Allan Reynolds
Original assignee: STEMGEN SpA
Current assignee: STEMGEN SpA
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2026-07-19
Also published as: CA2790675C; EP3117833B1; JP2015057452A; US20100167999A1; DK1904093T3; US20160228511A1; JP5189977B2; CA2790675A1; NZ565172A; DK3117833T3; EP1904093B1; HRP20181379T1; KR101311061B1; WO2007010394A3; CA2615491A1; KR20120125990A; AU2006271308B2; WO2007010394A2; PL1904093T3; NZ598031A

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéutica de una preparación de proteína de factor inhibidor de la leucemia (LIF) para usar en un método de tratamiento de un tumor de glioblastoma multiforme (GBM), en donde el potencial tumorigénico de células madre neurales tumorales en el tumor GBM se inhibe irreversiblemente.

Description

DESCRIPCION

Inhibicion del potencial tumorigenico de celulas madre tumorales por LIF

Antecedentes de la invencion

Celulas madre neurales

Tradicionalmente se pensaba que las celulas madre estaban situadas solamente en aquellos tejidos en los que las celulas diferenciadas estaban mas expuestas a perdida y a una gran necesidad de reemplazo, tales como la piel (Huelsken et al, Cell 105: 533-45, 2001), epitelios intestinales (Potten et al., Development 110: 1001-20, 1990) y la sangre (Morrison et al., Annu Rev Cell Dev Biol 11: 35-71, 1995). De hecho, el ejemplo mas conocido de una celula madre adulta es la celula madre hematopoyetica (HSC hematopoyetic stem cell) que se encuentra en la medula osea y que en ultima instancia es responsable de la generacion de todos los tipos de celulas de la sangre a lo largo de la vida del animal (Morrison et al., supra.; Weissman, Cell 100: 157-68, 2000; Weissman, Science 287: 1442-6, 2000). Ya que se pensaba que el sistema nervioso central (SNC) adulto no presentaba una cantidad significativa de muerte neuronal, y no tiene capacidad de regeneracion, la existencia de celulas madre neurales parecfa tanto improbable como innecesaria. Sin embargo, en 1992, dos grupos independientes demostraron con exito la existencia de celulas precursoras dentro del SNC de los mairnferos adultos con la capacidad de dar origen a nuevas neuronas (Reynolds and Weiss, Science 255: 1707-10, 1992; Richards et al., Proc Natl Acad Sci U S A 89: 8591-5, 1992).

La fuente de las nuevas neuronas fue identificada como celulas madre que revisten interiormente la totalidad del neuroeje ventricular del sistema nervioso de los marnfferos adultos (Reynolds and Weiss, 1992). Lo mismo que las celulas madre encontradas en otros tejidos, se ha comprobado que las celulas madre del SNC (o celulas madre neurales (CMN)) demuestran la definicion in vitro de las caractensticas de las celulas madre (Hall et al., Development 106: 619-33, 1989; Potten et al, supra) en cuanto a proliferacion, amplia capacidad de autorrenovacion, generacion de una numerosa progenie, potencial de diferenciacion entre multiples cepas y la caractenstica in vivo de regenerar los tejidos despues de una lesion.

Uno de los papeles de una celula madre es el de dividir y dar origen a mas celulas precursoras dedicadas provistas de la capacidad de proliferar y de generar un gran numero de celulas no diferenciadas. En ultima instancia es la progenie de estos tipos de celulas precursoras dedicadas la que da origen a una progenie diferenciada. Por lo tanto, puede considerarse que las celulas madre son un reservorio relativamente quiescente de celulas no dedicadas con la capacidad de dividirse a lo largo de la vida del animal y, por lo tanto, con un amplio potencial de proliferacion, mientras que las celulas progenitoras son mas dedicadas y se dividen mas frecuentemente pero tienen un potencial de proliferacion mas limitado a lo largo del tiempo. Tanto durante su desarrollo como en su etapa adulta, la proliferacion de las celulas madre y de las celulas progenitoras apuntala la genesis celular.

Debido a la ausencia de cualquier firma morfologica, molecular o antigenica espedfica, las celulas madre se identifican en base a un criterio funcional. Por lo tanto, para estudiar la regulacion de las celulas madre in vitro, es necesario desarrollar una metodologfa para el cultivo de tejidos que induzca la division de las celulas madre. Existen pocos ensayos de este tipo; sin embargo, en el sistema nervioso, se utiliza comunmente una metodologfa de cultivo denominada NA (Neurosphere Assay, Ensayo de Neuroesfera) (Reynolds and Weiss, supra.) para identificar, propagar y enumerar NSCs in vitro. En pocas palabras, el NA implica la microdiseccion de tejido de SNC embrionario a adulto seguido por la disrupcion de los contactos de celula a celula y la generacion de una suspension celular individual. Las celulas se aplican (normalmente con una baja densidad) en material para cultivo de tejidos en un medio definido libre de suero en la presencia de por lo menos un factor de crecimiento en la presencia del por lo menos un factor de crecimiento promotor de la proliferacion (es decir, EGF (Epidermal Growth Factor, Factor de Crecimiento Epidermico), bFGF (basic Fibroblastic Growth Factor, factor de crecimiento fibroblastico basico), etc.). En estas condiciones, dentro de 2-5 empieza a dividirse un SNC multipotente que da origen a un cluster clonalmente derivado de celulas no diferenciadas que llevan la denominacion de “neuroesfera”. En la presencia continua del factor inductor de la proliferacion, las celulas presentes en la neuroesfera continuan dividiendose, dando como resultado un incremento en el numero de celulas de comprender la neuroesfera y, por lo tanto, el tamano de la neuroesfera. Las neuroesferas pueden recolectarse, disgregarse en forma de una suspension celular individual, y las celulas pueden ser aplicadas como recubrimiento en un cultivo para generar nuevas neuroesferas. El pasaje por el SNC de esta manera da como resultado un incremento aritmetico en celulas precursoras viables del SNC. El ensayo de NA permite aislar los NCSs y expandirlas en condiciones definidas de manera tal que es posible estudiar el comportamiento de las celulas madre putativas en diferentes condiciones experimentales. El NA ha llegado a ser el ensayo estandar para el aislamiento de SNC de m ai^eras y forma el nucleo de muchos ensayos utilizados para entender la biologfa celular y molecular de las celulas madre en el sistema nervioso.

El concepto de tumores que surgen de una pequena poblacion celular con caractensticas de celulas madre que contribuyen al crecimiento y propagacion del tumor no es nuevo en el campo de la biologfa del cancer. La idea fue propuesta a principios de los anos 70 y ha sido confirmada experimentalmente en estudios sobre AML (acute myelogenous leukaemia, leucemia mielogena aguda) donde unas celulas iniciadoras de tumores de baja frecuencia demostraron parecerse a celulas hematopoyeticas normales (HSCs). Estos estudios han sugerido que las celulas madre de leucemia eran los descendientes directos de HSC o el producto de una celula mas diferenciada que habfa adquirido rasgos de HSC. El descubrimiento de celulas madre fuera del sistema sangumeo dio origen a la posibilidad de que los canceres de residuos solidos tambien pueden contener celulas similares a celulas madre. La existencia y aislamiento de celulas similares a celulas madre, iniciadoras de tumores, presentes en tumores solidos, fueron demostrados inicialmente en tejido de cancer de mama humano, enfoque este que tambien ha sido aplicado a tumores del SNC.

Recientemente varios grupos han informado sobre la capacidad de celulas derivadas de tejido de glioma humano de generar celulas similares a neuroesferas en cultivo, confirmandose la presencia de NSCs dentro de tumores del SNC. Es interesante observar que en base al aislamiento, en basa a FACS (fluorescence activated cell sorting) de celulas de “poblaciones laterales”, que la cepa de celulas de glioma C6 bien establecida contiene una poblacion menor de celulas formadoras de neuroesferas que conservan un caracter maligno in vivo. Galli y colegas (Galli et al., Cancer Research (2004) 64: 7011-7021) informaron sobre el aislamiento, la propagacion y la transportacion en serie de celulas madre neurales de tumores (tNSCs) a partir de glioblastoma multiforme humano (GBM) que presenta propiedades funcionales casi identicas a las NSC derivadas del SNC embrionario y adulto. Estas GBM tNSCs son precursores positivos de la prominina, que presentan los hallazgos cnticos de las celulas madre neurales in vitro, pueden expandirse de una manera estable, y por medio de ciclos en serie de trasplantes y cultivos reproducen las caractensticas iniciales iniciadoras de tumores. En su conjunto, estos estudios respaldan fuertemente la hipotesis de que los tumores del SNC que contienen una poblacion de celulas madre pueden ser responsables del inicio y la malignidad de los tumores. Las tNSCs pueden seleccionarse de entre otras celulas GBM utilizando FACS en virtud de la expresion de las tNSCs de CD133 (Singh et al., Nature (2004) 432:396-401).

El GBM es el tumor cerebral adulto mas comun, con un tiempo de supervivencia medio de 9-12 meses. La gran mayona de los pacientes mueren a los dos anos a partir de la fecha del diagnostico. Esencialmente no hay cura, y la terapia de administracion se basa comunmente en una combinacion de cirugfa, radioterapia y quimioterapia. Los coeficientes de supervivencia han variado muy poco durante los ultimos 30 anos, lo que ha dado origen a una busqueda activa de nuevos tratamientos tales como terapia genetica, antiangiogenesis, inmunoterapia e inhibidores de transduccion de moleculas pequenas. El documento WO00/40264 describe una citotoxina quimerica que comprende una fraccion de union del receptor IL 13 para la inhibicion del crecimiento de tumores que tienen receptores espedficos IL 13, incluido el glioblastoma multiforme

LIF

El LIF (Leukemia inhibitory factor, factor inhibidor de la leucemia) es una glicoprotema citoquina polifuncional cuya produccion inducible puede tener lugar en muchos tejidos, tal vez en todos ellos. El LIF recibe a veces tambien la denominacion de CDF (Cholinergic Differentiation Factor, Factor de Diferenciacion Colinergico). El LIF actua sobre las celulas responsivas por el hecho de unirse a un receptor de membrana heterodimerico compuesto de LIFR (lowaffinity LIF-specific receptor, receptor espedfico de baja afinidad de LIF) y la cadena receptora de gp130 tambien utilizada como el receptor para interleuquina-6, oncostatina M, cardiotrofina-1, y factor neurotrofico ciliar. El LIF es esencial para la implantacion de los blastocistos y para el desarrollo normal de las neuronas receptoras del hipocampo y olfatorias. El LIF se utiliza ampliamente en biologfa experimental debido a su capacidad clave de inducir a las celulas madre embrionarias de conservar su totipotencialidad. El LIF tiene un amplio conjunto de acciones, inclusive el actuar como un estfmulo para la formacion de las plaquetas, proliferacion de algunas celulas hematopoyeticas, formacion de los huesos, transporte de los lfpidos adipodticos, produccion de hormona adrenocorticotropica, supervivencia y formacion neuronal, proliferacion celular de los musculos satelitales, la produccion en fase aguda por los hepatocitos (para una revision, ver: Metacalf, Stem Cells 2003; 21:5-14). Halfter et al. (Journal of Neuro Oncology 1998, 39:1-18) describen que LIF inhibe el crecimiento de lmeas celulares de glioma humano.

BMP

Las protemas morfogeneticas (BMPs) son miembros de la superfamilia TGF-h (Hoodless et al., Cell 85:489-500, 1996). Se conocen mas de 20 miembros que pueden ser subagrupados de acuerdo con la homologfa en su secuencia (Hoodless et al., supra, Wozney et al. J Cell Sci, Suppl 13:149-156,1990). Las BMPs desempenan papeles esenciales en el desarrollo embrionario. Por ejemplo, influyen sobre la gastrulacion, neurogenesis, apoptosis y hematopoyesis (ver: Nohe et al., Cellular Signalling 16, 291-299 (2004) para una revision). A continuacion, los receptores de BMP llevan la denominacion de BMPRs. Los BMPRs procedentes de humanos incluyen BMPR1a, BMPR1b, y BMPR2.

De acuerdo con la reciente descripcion, se ha descubierto ahora que el LIF y las BMPs regulan la supervivencia de celulas progenitoras y de celulas madre, su autorrenovacion, proliferacion y/o diferenciacion, y en particular pueden reducir el numero de celulas proliferantes en los tejidos cancerosos.

Compendio de la invencion

La presente invencion se define en las reivindicaciones 1 a 11 adjuntas.

En un aspecto, la descripcion proporciona metodos para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad o un trastorno caracterizados por proliferacion celular excesiva o mal regulada. Los metodos comprenden la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de un factor inhibidor de leucemia (LIF) y/o al menos una preparacion de protema morfogenetica osea (BMP) a un sujeto o tejido pensado para someterse a tal proliferacion celular excesiva o mal regulada.

En otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo para reducir el crecimiento de un tumor que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de un factor inhibidor de leucemia (LIF) y/o una preparacion de protema morfogenetica osea (BMP) a dicho tumor. Se incluye un metodo para reducir el crecimiento de un tumor en un paciente humano, incluyendo tumores cerebrales (por ejemplo, glioblastoma multiforme) por administracion de una preparacion de BMP-4 a un paciente humano.

En otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo de reduccion de la cantidad de celulas madre tumorales y/o celulas progenitoras tumorales en un tumor que comprende poner en contacto el tumor con una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP.

En otro aspecto, la descripcion proporciona preparaciones de LIF y preparaciones de BMP que son capaces de incrementar la senalizacion mediada por el receptor de LIF (LIFR) o la senalizacion mediada por el receptor de BMP (BMPR), respectivamente, en una celula madre tumoral o una celula progenitora tumoral.

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona agentes, de ahora en mas, mencionados como “activadores de la senalizacion de LFR ” y “activadores de la senalizacion del receptor de LIF” que son capaces de incrementar la senalizacion mediada por el receptor de LIF (LIFR) en una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral.

En otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo de reduccion del crecimiento de un tumor al incrementar la senalizacion mediada por LIFR o BMPR en dicho tumor. La senalizacion mediada por LIFR se puede activar, por ejemplo, usando una preparacion de LIF y/o un activador de senalizacion de LIFR; la senalizacion mediada por BMPR se puede activar, por ejemplo, usando una preparacion de BMP y/o un activador de la senalizacion de BMPR.

En otro aspecto, la descripcion proporciona metodos para la identificacion de activadores de la senalizacion de LIFR y activadores de senalizacion de BMPR.

En otro aspecto, la descripcion proporciona metodos para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad o un trastorno caracterizados por proliferacion celular excesiva o mal regulada. Los metodos implican la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de activador de senalizacion de LIFR y/o activador de senalizacion de BMPR a un sujeto o tejido pensado para someterse a tal proliferacion celular excesiva o mal regulada.

En otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo de reduccion de la cantidad de celulas madre tumorales y/o celulas progenitoras tumorales en un tumor que comprende poner en contacto el tumor con un activador de senalizacion de LIFR y/o un activador de senalizacion de BMPR.

En otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo para reducir el crecimiento de un tumor que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un activador de senalizacion de LIFR y/o un activador de senalizacion de BMPR a dicho tumor.

En otro aspecto, la descripcion proporciona metodos para reducir la probabilidad de que una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral se someta a division simetrica, que comprende poner en contacto la celula madre tumoral o celula progenitora tumoral con al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en una preparacion de LIF, una preparacion de BMP, un activador de senalizacion de BMPR y un activador de senalizacion de LIFR.

En otro aspecto, la descripcion proporciona metodos para reducir la frecuencia de las celulas madre neurales y la frecuencia de las celulas progenitoras neurales en celulas madre neurales pasadas en serie que comprenden poner en contacto las celulas madre neurales con una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP.

En otro aspecto, la descripcion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en una preparacion de LIF, una preparacion de BMP, un activador de senalizacion de BMPR y un activador de senalizacion de LIFR.

En un aspecto adicional, se describe el uso de la preparacion BMP o LIF en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un tumor, incluyendo el uso de una preparacion de un BMP-4 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de tumores cerebrales (por ejemplo, gioblastoma multiforme).

En otro aspecto, la descripcion proporciona metodos para el tratamiento de tumores que comprenden celulas madre tumorales, que comprenden poner en contacto las celulas madre tumorales con un agente que induce diferenciacion de las celulas madre tumorales. Los agentes de diferenciacion apropiados incluyen preparaciones de LIF, preparaciones de BMP, activadores de senalizacion de BMPR y activadores de la senalizacion de LIFR. Por ejemplo, un glioblastoma multiforme se puede tratar de acuerdo con los metodos de la descripcion por contacto de las celulas madre neurales tumorales en el tumor (o las remanentes en la cavidad de reseccion luego de citorreduccion quirurgica del tumor) con una preparacion de BMP-4 en una cantidad suficiente para inducir la diferenciacion de las celulas madre neurales tumorales.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1A muestra un grafico del numero total teorico de celulas al final de cada pasaje vs. el numero de pasajes para celulas madre neurales humanas. La Figura 1B muestra el log del numero total de celulas al final de cada pasaje vs. el numero de pasaje y una lmea de tendencia de mejor ajuste para el grafico log lineal.

La Figura 2A muestra un grafico del numero total teorico de celulas al final de cada pasaje vs. el numero de pasaje para celulas madre neurales humanas con y sin la adicion de LIF. La Figura 2B muestra el log del numero total de celulas al final de cada pasaje vs. el numero de pasaje y una lmea de tendencia de mejor ajuste para el grafico log lineal. La Figura 2C muestra graficamente la reduccion en la frecuencia de celulas madre y de celulas progenitoras en la presencia de LIF.

La Figura 3A ilustra una vista 20X de contraste de fase de una neuroesfera de celulas tumorales. La Figura 3B ilustra la cantidad teorica total de celulas en cada division para dos cepas de lmea de GBM diferentes.

La Figura 4A muestra un grafico de la cantidad total teorica de celulas al final de cada pasaje vs. el numero de pasaje para celulas tumorales de GBM pasadas en serie. La Figura 4B muestra el log del numero total de celulas al final de cada pasaje vs. el numero de pasaje y una lmea de tendencia de mejor ajuste para el grafico log lineal. La Figura 4C muestra graficamente la frecuencia de las celulas madre tumorales y de las celulas progenitoras tumorales.

El grafico principal de la Figura 5 muestra el porcentaje de celulas aplicadas (eje y) que forman colonias en los siguientes intervalos de tamanos de diametro en el NCFCA (Neural Colony Forming Cell Assay, Ensayo de Celulas Formadoras de Colonias Neurales) para celulas tumorales GBM pasadas en serie: 1500-2000 pm; 1000-1500 pm; 500- 1000 pm; y < 500 pm). El inserto en el rasgo principal de la Figura 5 muestra el porcentaje de celulas totales aplicadas (eje y) que forman colonias en las categonas de los diametros 1500-2000 pm y 1000-1500 pm, utilizandose un eje y con una escala diferente de la del grafico principal.

La Figura 6 muestra resultados de PCR en tiempo real en espedmenes de tumor humano primario y de cepas de celulas madre neurales de tumores humanos para BMPR1a, BMPR1b y BMPR2.

La Figura 7 ilustra el porcentaje de celulas madre y de celulas progenitoras tratadas con LIF o BMP-4.

La Figura 8 ilustra el porcentaje de celulas madre y de celulas progenitoras en cepas de celulas GBM tratadas con LIF, BMP-4 o LIF+BMP-4.

La Figura 9 ilustra el porcentaje de celulas madre y de celulas progenitoras en cepas de celulas GBM tratadas con BMP-2 durante el pasaje en serie o tratadas con b MP-2 transitoriamente para un pasaje (“pos BMP”).

La Figura 10 ilustra el GBM en ratones inmunodeficientes usados por el trasplante de celulas madre neurales tumorales procedentes de GBM humano (panel superior) y tambien ilustra que la formacion de GBM se reduce cuando las celulas madre neurales tumorales humanas son tratadas preliminarmente con BMP-4 o LIF antes del trasplante (panel inferior).

La Figura 11A ilustra niveles del transcripto para BMPR1A, BMPR1B, BMPR2 y BMP-4 para celulas de GBM agudamente disociadas y cultivadas. La Figura 1B-D ilustra la inmunorreactividad de BMPR1A, BMPR1B, y BMPR2 en celulas GBM recien aisladas. La Figura 11E-G ilustra la inmunorreactividad de BMPR1A, BMPR1B y BMPR2 en celulas GBM cultivadas. La Figura 1H-I ilustra la inmunorreactividad de fosfgSmad 1,5,8 en celulas GBM. La Figura 1K-P muestra analisis de transferencia Western de BMP-4, Smad1, phosphoSmad 1,5,8 y Smad 4 en celulas GBM.

La Figura 12A muestra mediciones de muerte celular, apoptosis, inmunorreactividad de Ki67 e inmunorreactividad de CD133 en cultivos de GBM en la presencia y ausencia de BMP-4. La Figura 12B muestra el mdice clonogenico de celulas GBM en la presencia y ausencia de BMP-4. La Figura 12C ilustra la propagacion de las celulas GBM en el Ensayo de Neuroesfera en presencia y ausencia de BMP-4.

La Figura 13A ilustra celulas GBM en la ausencia de BMP-4. La Figura 13B ilustra celulas GBM cultivadas con BMP-4. La Figura 13C (celulas GBM de control) y la Figura 13D (celulas GBM tratadas con BMP-4) muestran una inmunorreactividad de GFAP (IR); la Figura 13E (celulas GBM de control) y la Figura 13F (celulas GBM tratadas con BMP-4) muestran pIII-tubulina IR; la Figura 13G (celulas GBM de control) y la Figura 13H (celulas GBM tratadas con BMP-4s) muestran GalC IR. La Figura 13I-K muestra el analisis citofluorometrico de celulas GBM de control y celulas GBM tratadas con BMP-4 para GFAP IR, pIII-tubulina IR y GalC IR.

La Figura 14A muestra una masa tumoral en ratones que recibieron inyecciones de celulas GBM no tratadas. La Figura 14B muestra la ausencia de una masa tumoral comparable en ratones que recibieron inyecciones de celulas GBM tratadas con BMP-4. La Figura 14C muestra tumores en ratones tratados juntamente con perlas de control que carecen de BMP-4. La Figura 14D muestra la ausencia de tumores comparables en ratones tratados juntamente con perlas de BMP-4. La Figura 14E muestra tumores en ratones postratados con perlas de control. La Figura 14F muestra la ausencia de tumores comparables en ratones postratados con perlas de BMP-4. La Figura 14G muestra la morfologfa celular de tumores de GBM no tratados en ratones. La Figura 14H muestra la morfologfa celular de tumores de GBM tratado con BMP-4 en ratones. La Figura 14J muestra graficos de supervivencia para ratones que decidieron GBM tratados antes (panel izquierdo), simultaneamente (panel central) y posteriormente (panel derecho) de inyeccion de GBM con perlas de control o perlas de BMP-4.

La Figura 15 ilustra los efectos de varios BMPs sobre el crecimiento de las celulas GBM.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

Antes de describir la presente descripcion en detalle, se ha de entender que, a menos que se indique otra cosa, la descripcion objeto no se limita a componentes de formulacion, metodos de fabricacion, regfmenes posologicos espedficos, o similares, ya que ellos pueden variar. Tambien se ha de entender que la terminologfa usada en la presente es con fines de describir realizaciones particulares unicamente y no pretende ser limitativa.

Se debe observar que, cuando se usa en la memoria descriptiva objeto, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ la” incluyen aspectos plurales, a menos que el contexto claramente dictamine otra cosa. De este modo, por ejemplo, la referencia a “agente” incluye un agente simple, asf como dos o mas agentes; la referencia a una “celula madre” incluye una celula madre unica, asf como a dos o mas celulas madre; etc.

Como se usa en la presente memoria, una “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a aquella cantidad de un agente terapeutico suficiente para tratar o controlar una enfermedad o un trastorno caracterizados por proliferacion celular excesiva o mal regulada y, preferiblemente, la cantidad suficiente para destruir, modificar, controlar o remover tejido canceroso primario, regional o metastasico. Una cantidad terapeuticamente eficaz puede referirse a la cantidad de agente terapeutico suficiente para retardar o minimizar el inicio de la enfermedad o el trastorno caracterizados por proliferacion celular excesiva o mal regulada, por ejemplo, retardar o minimizar la difusion del cancer o el crecimiento de un tumor. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien se puede referir a la cantidad del agente terapeutico que proporciona un beneficio terapeutico en el tratamiento o el control de un tumor o de cancer. Ademas, una cantidad terapeuticamente eficaz con respecto a un agente terapeutico de la descripcion significa que aquella cantidad de agente terapeutico solo o en combinacion con otras terapias, que proporciona un beneficio terapeutico en el tratamiento o el control de una enfermedad celular hiperproliferativa o cancer. El termino puede comprender una cantidad que mejora la terapia en general, reduce o evita efectos no deseados o mejora la eficacia terapeutica o las sinergias con otro agente terapeutico.

Las expresiones “agente”, “compuesto”, “agente activo”, “compuesto activo”, “agente terapeutico”, “agente farmacologicamente activo”, “medicamento”, “activo” y “farmaco” se usan indistintamente en la presente para referirse a una sustancia que induce un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. Los terminos tambien comprenden ingredientes farmaceuticamente aceptables y farmacologicamente activos de aquellos agentes activos espedficamente mencionados en la presente, que incluyen, pero sin limitacion, sales, esteres, amidas, profarmacos, metabolitos activos, analogos, y similares. Cuando se usan las expresiones “agente”, “compuesto”, “agente activo”, “agente farmacologicamente activo”, “medicamento”, “activo” y “farmaco”, entonces se ha de entender que incluye el agente activo per se, asf como sales, esteres, amidas, profarmacos, metabolitos, analogos farmaceuticamente aceptables, farmacologicamente activos, etc. Los agentes de la presente descripcion pueden ser cualquier molecula proteinacea tal como peptidos, polipeptidos y protemas o moleculas no proteinaceas tales como moleculas de acido nucleico y moleculas organicas e inorganicas naturales o sinteticamente derivados pequenas a grandes. Los agentes pueden atravesar en general la barrera hematoencefalica o pueden ser apropiados para dirigir la administracion al SNC.

La referencia en la presente al “tratamiento” puede significar una reduccion en la gravedad de una enfermedad o condicion existentes. El termino “tratamiento” tambien se toma para abarcar un “tratamiento profilactico” para prevenir el inicio de una enfermedad o condicion. El termino “tratamiento” no implica necesariamente que un sujeto este tratado hasta la recuperacion total. De modo similar, “tratamiento profilactico” no significa necesariamente que el sujeto contraera eventualmente una enfermedad o condicion.

“Celula madre” como se usa en la presente memoria se refiere a una celula no diferenciada capaz de (a) proliferar, (b) autorrenovarse durante un penodo de tiempo extendido, (c) generar una gran cantidad de progenie y (d) dar origen a todos los tipos celulares del tejido del que se obtiene.

Como se usa en la presente memoria, una “celula madre tumoral” es una celula madre obtenida de un tumor. Una celula madre tumoral es capaz de (a) proliferar, (b) autorrenovarse durante un penodo de tiempo extendido, (c) generar una gran cantidad de progenie y (d) dar origen a todos los tipos celulares del tejido del que se obtiene. Una “celula madre neural tumoral”, tambien mencionada como una “tNSC”, se refiere a una celula madre tumoral obtenida de un tumor del SNC.

“Celula progenitora” como se usa en la presente memoria se refiere a una celula no diferenciada capaz de (a) proliferar, (b) autorrenovarse de modo limitado, (c) generar una cantidad limitada de progenie y (d) dar origen a al menos un tipo de progenie.

Como se usa en la presente memoria, una “celula progenitora tumoral” es una celula progenitora obtenida de un tumor. Una celula progenitora tumoral es capaz de (a) proliferar, (b) autorrenovarse de modo limitado, (c) generar una cantidad limitada de progenie y (d) dar origen a al menos un tipo celular hallado en el tumor del que se obtiene.

Preparaciones de LIF y preparaciones de BMP

Preferiblemente, el trastorno caracterizado por una excesiva proliferacion es un tumor benigno o un tumor maligno (cancer). Por ejemplo, el tumor puede ser un tumor cerebral que incluye, pero sin limitacion, neuroma acustico, adenoma, astrocitoma, astrocitoma pilocftico juvenil, glioma del tronco encefalico, cordoma, plexo coroide, craniofaringioma, ependimoma, ganglioglioma, ganglioglioneurocitoma, glioblastoma multiforme (GBM), glioma, linfoma, meduloblastoma, meningioma, oligodendroglioma, glioma del nervio optico, tumores de la pituitaria, tumores pineales o pineoblastoma. En realizaciones preferidas, el tumor cerebral es GBM.

En otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo para reducir el crecimiento de un tumor que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de un factor inhibidor de leucemia (LIF) y/o al menos una preparacion de protema morfogenetica osea (BMP) a dicho tumor. En algunas realizaciones, se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de BMP-4 a GBM en un paciente humano para reducir el crecimiento del GBM.

En otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo de reduccion de la cantidad de celulas madre tumorales y/o celulas progenitoras tumorales en un tumor que comprende poner en contacto el tumor con una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP. Sin quedar ligados por la teona o hipotesis, se cree que, cuando se administran a un tumor, las preparaciones de LIF y las preparaciones de BMP llevan a un aumento en la senalizacion mediada por LIFR o BMPR, que da como resultado la modulacion de una o mas de las siguientes propiedades de las celulas madre tumorales o celulas progenitoras tumorales tales como, pero sin limitacion, propiedades de supervivencia celular, autorrenovacion, division simetrica, proliferacion y/o diferenciacion. En particular y sin quedar limitados por la teona o hipotesis, se cree que un incremento en la senalizacion mediada por LIFR o BMPR da como resultado una reduccion en las propiedades de proliferacion de las celulas madre y progenitoras y en particular una reduccion en la probabilidad de division simetrica exhibida por las celulas madre o las celulas progenitoras proliferantes, reduciendo asf sus cantidades. Por consiguiente, en otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo para reducir la probabilidad de que una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral se someta a division simetrica, metodo que comprende poner en contacto la celula madre tumoral o celula progenitora tumoral con una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP.

En otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo de reduccion del el crecimiento de un tumor por aumento de la senalizacion mediada por LIFR o BMPR en dicho tumor. La senalizacion mediada por LIFR se puede activar, por ejemplo, usando una preparacion de LIF y/o un activador de senalizacion de LIFR (ver mas abajo); la senalizacion mediada por BMPR se puede activar, por ejemplo, usando una preparacion de BMP y/o un activador de senalizacion de BMPR (ver mas abajo).

Los actuales tratamientos destinados a erradicar las celulas tumorigenicas usando tratamientos convencionales se disenan para eliminar celulas de ciclo rapido. Por ejemplo, los agentes quimioterapeuticos tradicionales son mas eficaces contra celulas que se dividen. Como su contraparte no transformada, las tNSCs se ciclan con poca frecuencia y, asf, se escapen de los efectos toxicos del tratamiento y pueden reiniciar con facilidad la expansion tumoral despues del tratamiento. La longevidad intnnseca de las celulas madre adultas y su capacidad inherente de expresar la resistencia a los farmacos y los genes antiapoptoticos se puede hallar en su contraparte maligna, agravando la dificultad para desarrollar estrategias eficaces de tratamiento destinadas a erradicar las celulas madre tumorales. Los metodos y las composiciones revelados en la presente memoria superan esta dificultad al dirigirse a las celulas tNSC. Sin quedar ligados por la teona o hipotesis, se cree que los metodos y las composiciones descritos en la presente memoria tienen un efecto de prodiferenciacion sobre las tNSCs (como se evidencia por la regulacion hacia arriba de marcadores de diferenciacion neurales, en particular antfgenos astrogliales, como se muestra en los Ejemplos) y, de esta manera, reducen de modo permanente el pool de celulas madre sin afectar la viabilidad celular o producir apoptosis. Como resultado (como se muestra en los Ejemplos de abajo), incluso una exposicion transitoria a las composiciones de la descripcion (en particular, composiciones de BMP-4 para el tratamiento de GBM) inhibe de modo irreversible el potencial tumorigenico de las tNSCs.

La induccion de la diferenciacion de celulas tumorales, mas que intentar matarlas, es un enfoque totalmente nuevo para el tratamiento del cancer. De esta manera, en otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo de tratamiento de un tumor que comprende celulas madre tumorales, que comprende poner en contacto las celulas madre tumorales con un agente (como una preparacion de BMP) que induce su diferenciacion. En una de tales realizaciones, las celulas madre neurales tumorales en un tumor cerebral como glioblastoma multiforme, se ponen en contacto con BMP-4 para inducir su diferenciacion.

Las expresiones “preparacion de LIF” y “preparacion de BMP” incluyen el polipeptido de LIF o un polipeptido de BMP como se produce en la naturaleza, preferiblemente en seres humanos, con o sin ninguna modificacion postransduccional. Esto incluye, para LIF humano, el polipeptido codificado por el mARN que tiene el numero de acceso a GenBank NM_002309. Para BMPs humanos, esto incluye los polipeptidos de BMP codificados por los genes humanos: BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, GDF10 (BMP-3b), GDF11 (BMP11), GDF2 (BMP9), BMP10, BMP15 y por los mARNs que tienen los numeros de acceso a GenBank: NM_001719 (BMP7); NM_001201 (BMP3); NM_001200 (BMP2); NM_005448 (BMP15); NM_001720 (BMP8B); NM_014482 (BMP10); NM_006132 (BMP1-4); NM_006131 (BMP1-5); NM_006130 (BMP1-6J; NM_006129 (BMP1-3): NM_006128 (BMP1-2): NM_001718 (BMP6); NM_001199 (BMP1-1); NM_130851 (BMP4-3); NM_130850 (BMP4-2); NM_001202 (BMP4-l); NM_181809 (BMP8A); NM_021073 (BMp 5). Observar que el polipeptido BMP-4 tambien a veces se menciona como BMP-2B.

Las BMPs preferidas para usar en los metodos y las composiciones de la descripcion incluyen BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 y BMp-8b. En particular, la exposicion a BMP-4 se muestra en los Ejemplos de abajo para reforzar la maduracion de las celulas aisladas GBM humano mientras no afecten la viabilidad general y la apoptosis. Esto da como resultado la regulacion hacia arriba de marcadores neuronales y gliales y tambien da como resultado una mayor reduccion en la capacidad de proliferacion. La exposicion a BMP-4 —incluso transitoriamente— se muestra en los Ejemplos de abajo para reducir en gran medida el tamano de las poblaciones de tNSCs de GBM (celulas CD133+ de GBM) en cultivos de GBM, para reducir ampliamente el mdice clonogenico de celulas de GBM y reducir dramaticamente la cinetica de expansion de las tNSCs de GBM. Estos efectos son irreversibles y extinguen la capacidad de inicio de tumores in vivo de celulas de GBM humano.

La expresion “preparacion de LIF” o “preparacion de BMP” como se usa en la presente memoria tambien incluye fragmentos de polipeptidos de LIF o BMP o glicopolipeptidos que retienen al menos parcialmente la capacidad de atenuar una proliferacion celular excesiva en los ensayos y metodos de tratamiento de la descripcion, por ejemplo, que retienen entre el 1-100% de la actividad de LIF de longitud total o un BMP de longitud total en los ensayos o metodos de tratamiento de la descripcion. Estos fragmentos pueden tener mayor actividad respecto del LIF de longitud total o un BMP de longitud total en los ensayos o metodos de tratamiento de la descripcion. Estos fragmentos pueden tener una serie continua de residuos delecionados del termino amino o carboxi o ambos, en comparacion con la protema de longitud total. Los fragmentos se pueden caracterizar por dominios estructurales o funcionales, tales como fragmentos que comprenden helice alfa y regiones que forman la helice alfa, hoja beta y regiones que forma la hoja beta, vuelta y regiones que forman vueltas, espiral y regiones que forman espirales, regiones hidrofflicas, regiones hidrofobicas, regiones anfipaticas alfa, regiones anfipaticas beta, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie y regiones que se unen con sustrato. Los fragmentos se pueden producir por tecnicas de smtesis de peptidos o por escision de polipeptido de LIF o BMP de longitud total. Los fragmentos se pueden ligar en sus terminos N, terminos C o tanto su termino N como C con otras secuencias de polipeptidos, formando asf protemas de fusion.

La expresion “preparacion de LIF” o “preparacion de BMP” como se usa en la presente memoria tambien incluye un polipeptido o glicopolipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que es parcialmente homologa a la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de LIF o BMP o uno de sus fragmentos, como se revelo con anterioridad y que retiene al menos parcialmente la capacidad de atenuar una excesiva proliferacion celular en los ensayos y los metodos de tratamiento de la descripcion. Los homologos pueden ser un 50%, 70%, 80%, 80,6%, 83%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% identicos a LIF o BMP o fragmentos de ellos.

La expresion “preparacion de LIF” o “preparacion de BMP” tambien incluye variantes de polipeptido de longitud total de LIF o BMP y variantes de fragmentos de LIP o BMP. Estas variantes retienen al menos parcialmente la capacidad de atenuar la excesiva proliferacion celular en los ensayos y metodos de tratamiento de la descripcion. Las variantes pueden incluir deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas de acuerdo con las reglas generales conocidas en la tecnica de modo que tienen poco efecto sobre la actividad. Por ejemplo, se proporciona una grna referente a como preparar sustituciones de aminoacidos fenonormalmente silenciosos en Bowie et al., Science 247: 1306-1310 (1990). Por ejemplo, se pueden obtener variantes por mutagenesis dirigida a sitio o mutagenesis por exploracion de alanina (introduccion de mutaciones simples de alanina en cada residuo en la molecula) (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989). Las variantes tambien pueden tener sustituciones de aminoacidos que contienen, por ejemplo, uno o mas enlaces no peptfdicos (que reemplazan los enlaces peptfdicos) en la secuencia de protemas o peptidos. Las variantes tambien pueden tener sustituciones que incluyen residuos de aminoacidos distintos de los L-aminoacidos naturales, por ejemplo, D-aminoacidos o aminoacidos no naturales o sinteticos, por ejemplo, aminoacidos B o y. Las variantes tambien pueden incluir grupos reticulantes que imponen limitaciones conformacionales al polipeptido. Las variantes tambien pueden incluir glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, y similares. Las variantes tambien pueden incluir (i) sustituciones con uno o varios de los residuos de aminoacido no conservados, donde los residuos de aminoacido sustituidos pueden o no pueden estar codificados por el codigo genetico o (ii) sustitucion con uno o varios residuos de aminoacido con un grupo sustituyente o (iii) fusion del polipeptido maduro con otro compuesto, como un compuesto para incrementar la estabilidad y/o la solubilidad de la preparacion de LIF o la preparacion de BMP (por ejemplo, polietilenglicol) o dirigir la preparacion de LIF o la preparacion de BMP a un tipo celular espedfico (como una celula madre neural tumoral) o permitir que la preparacion de LIF o la preparacion de BMP atraviese la barrera hematoencefalica (BBB) y/o la barrera hematotumoral (BTB) o (iv) fusion del polipeptido con aminoacidos adicionales o peptidos adicionales o polipeptidos adicionales o (v) fusion con un agente citotoxico, por ejemplo, una toxina o compuesto radiactivo o (vi) fusion con un marcador que se puede usar con fines de imagenes, por ejemplo, un radiorrotulo.

Las preparaciones de LIF y las preparaciones de BMP de la descripcion se pueden obtener de cualquier manera apropiada, incluyen por aislamiento de polipeptidos naturales, por tecnicas recombinantes, por tecnicas de smtesis de polipeptidos o por una combinacion de estos metodos. Los metodos para preparar tales polipeptidos son bien conocidos en la tecnica. Las preparaciones de LIF o las preparaciones de BMP pueden estar en forma de una protema mas grande como una protema de fusion. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoacidos adicional que contenga secuencias secretoras o lfderes, prosecuencias, secuencias que ayudan a la purificacion, como residuos de histidina multiples o una secuencia adicional para estabilidad durante la produccion recombinante.

Las preparaciones de LIF y las preparaciones de BMP de la presente descripcion se proporcionan preferiblemente en una forma aislada y, con preferencia, estan sustancialmente purificadas. Una version producida en forma recombinante de una preparacion de LIF o una preparacion de BMP se puede purificar sustancialmente usando tecnicas descritas en la presente memoria o conocidas de otro modo en la tecnica, tales como, por ejemplo, por el metodo de una etapa descrito en Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (1988). Las preparaciones de LIF o de b Mp de la descripcion tambien se pueden purificar de fuentes naturales, sinteticas o recombinantes usando protocolos conocidos en la tecnica tales como, por ejemplo, anticuerpos de la descripcion contra LIF o BMP de longitud total.

En algunas realizaciones de la presente descripcion, una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP se pueden administrar a un sujeto directamente, de modo tal que las celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales endogenas se regulan in vivo. Por ejemplo, una preparacion de BMP-4 se puede administrar a un tumor cerebral como GBM, en un paciente humano. En realizaciones alternativas de la presente descripcion, las celulas madre tumorales y las celulas progenitoras tumorales se pueden poner en contacto con los agentes de la presente descripcion in vitro. Por ejemplo, un tumor aislado que comprende celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales se puede poner en contacto con los agentes de la descripcion in vitro.

Los metodos de administracion de las preparaciones de LIF y/o las preparaciones de BMP a un sujeto, incluyendo un tumor en un sujeto, junto con composiciones farmaceuticas que comprenden preparaciones de LIF y/o preparaciones de BMP, se proporcionan mas abajo en la seccion intitulada “Administracion y composiciones farmaceuticas”.

Activadores de senalizacion del receptor de LIF y activadores de la senalizacion del receptor de BMP

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona agentes, denominados en la presente memoria como “activadores de la senalizacion de LIFR” y “activadores de la senalizacion del receptor de LIF” que son capaces de incrementar la senalizacion mediada por el receptor de LIF (LIFR) en una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral. La descripcion tambien proporciona metodos para la identificacion de tales activadores de la senalizacion de LIFR y composiciones farmaceuticas que comprenden tales activadores de la senalizacion de LIFR. Los activadores de la senalizacion de LIFR de la presente descripcion pueden incrementar la senalizacion mediada por LIFR una celula madre o progenitora por activacion de LIFR directamente (por ejemplo, un agonista) o indirectamente, como por incremento de la expresion o la actividad de una molecula o compuesto secundarios (por ejemplo, por incremento de la expresion de LIF propiamente dicha o por incremento de la actividad o la expresion de un componente corriente debajo de la senalizacion mediada por LIFR, como JAK o STAT) en la celula madre tumoral o la celula progenitora tumoral que, a su vez, incrementa la senalizacion mediada por LIFR en una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona agentes, de ahora en mas mencionados como “activadores de senalizacion de BMPR” y “activadores de la senalizacion del receptor de BMP” que son capaces de incrementar la senalizacion mediada por el receptor de BMP (BMPR) en una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral. La descripcion tambien proporciona metodos para la identificacion de tales activadores de senalizacion de BMPR y composiciones farmaceuticas que comprenden tales activadores de senalizacion de BMPR. Los activadores de senalizacion de BMPR de la presente descripcion pueden incrementar la senalizacion mediada por BMPR en una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral por activacion de BMPR directamente (por ejemplo, un agonista) o indirectamente, como por incremento de la expresion o la actividad de una molecula o compuesto secundarios (por ejemplo, por incremento de la expresion de BMP propiamente dicha o por incremento de la expresion o actividad de un componente corriente debajo de la senalizacion mediada por BMPR) en la celula madre tumoral o celula progenitora tumoral que, a su vez, aumenta la senalizacion mediada por BMPR en una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral.

La referencia en la presente memoria a “LIFR” incluye la referencia a todas las formas de LIFR tales como homologos, paralogos, ortologos, derivados, fragmentos y equivalentes funcionales de LIFR. La referencia en la presente memoria a “BMPR” incluye la referencia a todas las formas de BMPR tales como homologos, paralogos, ortologos, derivados, fragmentos y equivalentes funcionales de BMPR.

En el contexto de la presente descripcion, un incremento en la senalizacion mediada por LIFR o BMPR se refiere a un incremento de uno a aproximadamente el 1000% del nivel normal de senalizacion mediada por LIFR o BMPR. Alternativamente, el activador de senalizacion de LIFR o BMPR puede regresar el nivel de senalizacion mediada por LIFR o BMPR a normal en casos en los que la senalizacion es inferior a lo normal.

Preferiblemente, el incremento de la senalizacion mediada por LIFR o BMPR resulta en la modulacion de una o mas propiedades de celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales tales como, pero sin limitacion, propiedades de supervivencia, autorrenovacion, proliferacion, division simetrica y/o diferenciacion. Con maxima preferencia, el incremento de la senalizacion mediada por LIFR o BMPR altera las propiedades de division de las celulas madre tumorales y las celulas progenitoras tumorales y en particular una reduccion en la probabilidad de division simetrica o reduccion en la frecuencia del ciclo celular exhibido por las celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales proliferantes, llevando asf a una reduccion de la cantidad de celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales.

Los activadores de senalizacion de LIFR y de BMPR de la descripcion pueden ser cualquier molecula proteinacea tales como peptidos, polipeptidos y protemas o pueden ser moleculas no proteinaceas. Los metodos para el aislamiento de activadores de senalizacion de LIFR y BMPR se proporcionan en la presente memoria.

En relacion con la presente descripcion, los mimeticos son un grupo particularmente util de activadores de senalizacion de LIFR y BMPR. El termino pretende referirse a una sustancia que tiene cierta similitud qmmica con la molecula que imita, tales como, por ejemplo, LIF, pero que agoniza (imita) su interaccion con un blanco, como, por ejemplo, un LlFR. Un mimetico de peptido es una clase de mimeticos y puede ser una molecula que contiene peptido que imita los elementos de la estructura secundaria de la protema (Johnson et al., Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York, 1993). El razonamiento subyacente detras del uso de mimeticos peptfdicos es que la estructura del peptido de las protemas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoacidos de modo tal que facilite las interacciones moleculares como aquellas de anticuerpo y antigeno, enzima y sustrato o protemas estructurales. Un mimetico peptfdico, por ende, se disena para permitir interacciones moleculares similares a la molecula natural.

El diseno de los mimeticos en un compuesto farmaceuticamente activo es un conocido enfoque para el desarrollo de productos farmaceuticos en base a un compuesto “de gma”. Esto puede ser deseable cuando el compuesto activo es diffcil o costoso para sintetizar o cuando es inapropiado para un metodo particular de administracion, por ejemplo, peptidos son agentes activos inapropiados para composiciones orales porque tienden a degradarse rapidamente por las proteasas en el canal alimentario. El diseno, la smtesis y el ensayo de los mimeticos se usa en general para evitar el control aleatorio de grandes cantidades de moleculas para una propiedad diana. Un mimetico de BMP-4, incluyendo un mimetico peptfdico, por ejemplo, se contempla espedficamente en la presente.

El objeto del diseno farmacologico racional consiste en producir analogos estructurales de polipeptidos de interes biologicamente activos o de pequenas moleculas con las que interactuan para elaborar farmacos que, por ejemplo, son formas mas activas o estables del polipeptido o que, por ejemplo, mejoran o interfieren con la funcion de un polipeptido in vivo (ver, por ejemplo, Hodgson, Bio/Technology 9:19-21, 1991). En un enfoque, uno determina primero la estructura tridimensional de una protema de interes por cristalograffa por rayos X, por modelaje por ordenador o mas normalmente, por una combinacion de enfoques. La informacion de utilidad respecto de la estructura de un polipeptido tambien se puede obtener por modelaje en base a la estructura de protemas homologas. Un ejemplo del diseno farmacologico racional es el desarrollo de inhibidores de HIV proteasa (Erickson et al., Science 249:527-533, 1990).

La capacidad de los activadores de senalizacion de LIFR y BMPR de la presente descripcion, ya sea proteinaceos o no proteinaceos, de interactuar con LIFR o BMPR y/o incrementar la senalizacion mediada por LIFR o BMPR (ya sea directa o indirectamente) en una celula madre o celula progenitora se puede evaluar por medio de una cantidad de metodos de control que seran bien conocidos por un experto en la tecnica. Ellos pueden incluir control de bibliotecas naturalmente producidas, bibliotecas qmmicamente producidas, asf como bibliotecas combinatorias, bibliotecas de visualizacion de fagos y bibliotecas a base de traduccion in vitro.

Los anticuerpos planteados contra LIFR y BMPR pueden ser particularmente utiles como agonistas que imitan la configuracion activa de LIF y BMP, respectivamente. Los anticuerpos apropiados incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespedficos, heteroconjugados, multiespedficos, humanos, humanizados o quimericos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresion de Fab, anticuerpos antiidiotfpicos (anti-id) y fragmentos de union a epftopos de cualquiera de los anteriores. El termino “anticuerpo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de union con antfgeno que se une inmunoespedficamente con un antfgeno. Las moleculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molecula de inmunoglobulina. Mas aun, el termino “anticuerpo” (Ab) o “anticuerpo monoclonal” (Mab) incluye moleculas intactas, asf como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que son capaces de unirse espedficamente con protema. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se limpian mas rapidamente de la circulacion del animal o la planta y pueden tener menos union con tejido no espedfico que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). Los metodos para producir agonistas de anticuerpos se describen, por ejemplo, en la publicacion PCT WO 96/40281; la patente de EE.UU. No. 5.811.097; Deng et al., Blood 92 (6): 1981-1988 (1998); Chen et al., Cancer Res. 58 (16): 3668-3678 (1998); Harrop et al., J. Immunol. 161 (4): 1786-1794 (1998); Zhu et al., Cancer Res.

58 (15): 3209-3214 (1998); Yoon et al., J. Immunol. 160 (7): 3170-3179 (1998); Prat et al., J. Cell. Sci. 111 (Pt2): 237-247 (1998); Pitard et al., J. Immunol. Methods 205 (2): 177-190 (1997); Liautard et al., Cytokine 9 (4): 233-241 (1997); Carlson et al., J. Biol. Chem. 272 (17): 11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron 14 (4): 755-762 (1995); Muller et al., Structure 6 (9): 1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8 (1): 14-20 (1996); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981).

Los ligandos de acido nucleico (tambien conocidos como “aptameros”) tambien pueden ser particularmente utiles como agonistas que imitan la configuracion activa de LIF y BMP, respectivamente. Por ejemplo, los aptameros se pueden seleccionar usando el metodo SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Tuerk and Gold, 1990, Science 249: 505-510. En el metodo SELEX, se produce una gran biblioteca de moleculas de acido nucleico (por ejemplo, 1015 diferentes moleculas) y/o se controlan con la molecula diana, en este caso, BMPR, LIFR o porciones de ellos. La molecula diana se deja incubar con la biblioteca de secuencias de nucleotidos durante un penodo de tiempo. Varios metodos se pueden usar luego para aislar ffsicamente las moleculas diana de aptamero de las moleculas no ligadas en la mezcla y las moleculas no ligadas se pueden descartar. Los aptameros con la maxima afinidad para la molecula diana se pueden purificar luego de la molecula diana y se pueden amplificar enzimaticamente para producir una nueva biblioteca de moleculas que esta sustancialmente enriquecida para aptameros que pueden unir la molecula diana. La biblioteca enriquecida se puede usar luego para iniciar un nuevo ciclo de seleccion, particion y amplificacion. Despues de 5-15 ciclos de este proceso de seleccion, particion y amplificacion, la biblioteca se reduce a una pequena cantidad de aptameros que se unen mtimamente con la molecula diana. Las moleculas individuales en la mezcla se pueden aislar luego, sus secuencias de nucleotidos se pueden determinar y sus propiedades con respecto a la afinidad de union y especificidad se pueden medir y comparar. Los aptameros aislados se pueden refinar luego para eliminar cualquier nucleotido que no contribuye con la union diana y/o la estructura del aptamero (es decir, aptameros truncados con su dominio de union central). Ver, por ejemplo, Jayasena, 1999, CHn. Chem. 45: 1628-1650 para una resena de la tecnologfa de los aptameros.

Esencialmente cualquier compuesto qmmico se puede emplear como un activador de la senalizacion de LIFR o BMPR candidatos. Las metodologfas de control de alto rendimiento se pretenden en particular para la deteccion de tales activadores candidatos. Estos metodos de control de alto rendimiento normalmente implican el suministro de bibliotecas combinatorias de productos qmmicos o peptidos que contienen una gran cantidad de compuestos terapeuticos potenciales (por ejemplo, compuestos ligandos o moduladores). Estas bibliotecas combinatorias de productos qmmicos o de ligandos se controlan luego en uno o mas ensayos para identificar aquellos miembros de la biblioteca (por ejemplo, especies qmmicas o subclases particulares) que muestran una actividad caractenstica deseada. Los compuestos asf identificados pueden servir como compuestos lfderes convencionales o se pueden usar en sf mismos como agentes terapeuticos potenciales o reales.

Una biblioteca de productos qmmicos combinatoria es una coleccion de diversos compuestos qmmicos generados ya sea por smtesis qmmica o smtesis biologica, por combinacion de una cantidad de bloques constructivos qmmicos (es decir, reactivos tales como aminoacidos). Como un ejemplo, se forma una biblioteca combinatoria lineal, por ejemplo, una biblioteca de polipeptidos o peptidos, por combinacion de un grupo de bloques constructivos qmmicos en cada forma posible para un largo de compuesto dado (es decir, la cantidad de aminoacidos en un compuesto polipeptfdico o peptfdico). Se pueden sintetizar millones de compuestos qmmicos por medio de tal mezcla combinatoria de bloques constructivos qmmicos.

La preparacion y el control de las bibliotecas de productos qmmicos combinatorias son bien conocidos para los expertos en la tecnica pertinente. Las bibliotecas combinatorias incluyen, sin limitacion, bibliotecas de peptidos (por ejemplo, patente de EE.UU. No. 5.010.175; Furka, 1991, Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493; y Houghton et al., 1991, Nature, 354: 84-88). Tambien se pueden usar otras qmmicas para generar bibliotecas de diversidad de productos qmmicos. Los ejemplos no limitativos de qmmicas de bibliotecas de diversidad de productos qmmicos incluyen, peptidos (publicacion PCT N.° WO 91/019735), peptidos codificados (publicacion PCT N.° WO 93/20242), biooligomeros aleatorios (publicacion PCT N.° WO 92/00091), benzodiazepinas (patente de EE.UU. No. 5.288.514), diversomeros tales como hidantomas, benzodiazepinas y dipeptidos (Hobbs et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6909-6913), polipeptidos vimlogos (Hagihara et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc., 114: 6568), peptidomimeticos no peptfdicos con estructura de glucosa (Hirschmann et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc., 114: 9217-9218), smtesis organica analoga de pequenas bibliotecas de compuestos (Chen et al., 1994, J. Amer. Chem. Soc., 116: 2661), oligocarbamatos (Cho et al., 1993, Science, 261: 1303), y/o peptidilfosfonatos (Campbell et al., 1994, J. Org. Chem., 59: 658), bibliotecas de acidos nucleicos (ver Ausubel, Berger and Sambrook, todos supra), bibliotecas de acidos nucleicos peptfdicos (patente de EE.UU. No. 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (por ejemplo, Vaughn et al., 1996, Nature Biotechnology, 14 (3): 309-314) y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (por ejemplo, Liang et al., 1996, Science, 274-1520-1522) y patente de EE.UU. No. 5.593.853), bibliotecas de moleculas organicas pequenas (por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, Jan. 18, 1993, pagina 33; y patente de EE.UU. No. 5.288.514; isoprenoides, patente de EE.UU. No. 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, patente de EE.UU. No. 5.549.974; pirrolidinas, patentes de EE.UU. Nos. 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, patente de EE.UU. No.

5.506.337; y similares).

Los dispositivos para la preparacion de bibliotecas combinatorias son asequibles en comercios (por ejemplo, 357 MPS, 390 m Ps , Advanced Chem Tech, Louisville Ky.; Symphony, Rainin, Woburn, Mass.; 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif.; 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). Ademas, una gran cantidad de bibliotecas combinatorias son asequibles en comercios (por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J.; Asinex, Moscu, Rusia; Tripos, Inc., St. Louis, Mo.; ChemStar, Ltd., Moscu, Rusia; 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa.; Martek Biosciences, Colombia, Md., y similares).

Los activadores de senalizacion de LIFR y BMPR candidatos se pueden controlar primero respecto de su capacidad de unirse con LIFR o BMPR o componentes corriente debajo de la via de senalizacion de LIFR o BMPR, usando un ensayo de union y aquellos candidates que se unen se pueden controlar luego en un ensayo funcional. Los ensayos de union apropiados incluyen el ensayo de desplazamiento termico a base de fluorescencia (3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 3DP, Exton, Pa.) como se describe en las patentes EE.UU. Nos. 6.020.141 y 6.036.920 de Pantoliano et al.; ver tambien J. Zimmerman, 2000, Gen. Eng. News, 20 (8)).

Un ejemplo de un metodo para el control funcional de activadores de senalizacion de LIFR y BMPR candidatos incluye las siguientes etapas:

(i) aislar una muestra de celulas madre tumorales y/o celulas progenitoras tumorales;

(ii) colocar alteuotas de las celulas madre tumorales y/o celulas progenitoras tumorales en receptaculos apropiados; y

(iii) exponer las alteuotas de celulas madre tumorales y/o celulas progenitoras tumorales a agentes candidatos durante un pertedo de tiempo particular y en condiciones particulares; y

(iv) controlar los cambios morfologicos, fisiologicos y geneticos de las celulas madre tumorales y/o celulas progenitoras tumorales.

Los cambios morfologicos, fisiologicos y geneticos incluyen el control de los estados de supervivencia, autorrenovacion, proliferacion y/o diferenciacion. Un ejemplo de un ensayo que se puede usar es el ensayo celular de formacion de colonias neurales (NCFCA) descrito en la publicacion de solicitud de patente de los Estados Unidos No.

2005/0112546. El NCFCA es capaz de distinguir celulas madre de celulas progenitoras, donde ambas tienen un potencial proliferativo y son capaces de formar esperas en cultivo en suspension (ensayo de neuroesferas) o colonias en el NCFCA. Brevemente, las celulas primarias o cultivadas obtenidas de un tumor se plaquean en una matriz de colageno 3-D libre de suero que contiene los mitogenos FGF2 y EGF. En estas condiciones de cultivo, solo las celulas madre y las celulas progenitoras con un potencial proliferativo dividen las colonias de forma bien definida cuyo tamano se puede medir despues de 1-4 semanas. Las diferencias en el tamano de la colonia se correlacionan positivamente con el potencial proliferativo de la celula fundadora y proporcionan una lectura de la frecuencia de las celulas madre y las celulas progenitoras. En estas condiciones, solo las colonias de mas de 2 mm de diametro se derivan de una celula madre, mientras que aquellas de menos de 2 mm de diametro se derivan de celulas progenitoras. Una lectura significativa y precisa de las celulas madre y las celulas progenitoras permite controlar los elementos geneticos y epigeneticos que alteran la frecuencia de estos dos tipos celulares.

Otro ejemplo de un ensayo para la supervivencia, la autorrenovacion, la proliferacion y/o la diferenciacion que se puede usar para controlar los receptores de LIFR y BMPR se lleva a cabo de la siguiente manera. En primer lugar, se plaquen celulas de un tumor desagregado de glioblastoma multiforme en medio libre de suero con contenido de mitogenos FGF2 (factor de crecimiento de fibroblastos 2) y EGF (factor de crecimiento epidermico) como se describe por Gritti et al., J. Neurosci. (1996) 16(3): 109-1100. Este sistema de cultivo selecciona las celulas diferenciantes/diferenciadas de los cultivos tumorales primarios, dejando solo las celulas madre tumorales libres para proliferar y expandirse exponencialmente, formando asf neuroesferas primarias. Las neuroesferas primarias se pueden disociar y plaquear otra vez en medio libre de suero a una densidad clonal en presencia de EGF y FGF2 en platas de microtitulacion. Los activadores de senalizacion de LIFR y BMPR candidatos se anaden a cada pocillo de la placa de microtitulacion y las placas se incuban durante un pertedo suficiente para permitir que las celulas no tratadas proliferen. Al final de la incubacion, las neuroesferas se disocian otra vez y el proceso se puede repetir durante una cantidad predeterminada de pasajes adicionales en presencia de los activadores de senalizacion de LIFR y BMPR candidatos. Al final de la cantidad de pasajes predeterminada, los pocillos de la placa de microtitulacion se pueden examinar usando un microscopio para la presencia de neuroesferas y la cantidad y el tamano de las neuroesferas se determinan, proporcionando una medida del efecto del activador de senalizacion de LIFR o BMPR candidato en celulas madre y progenitoras. Los algoritmos matematicos del Ejemplo 1 se pueden usar para determinar la cantidad de celulas madre y progenitoras al final de cada pasaje. La comparacion con celulas no tratadas que tambien se habfan pasado en serie permite la identificacion de activadores de senalizacion de LIFR y BMPR candidatos, por ejemplo, agentes que ateman las propiedades de proliferacion de las celulas madre y progenitoras. Los activadores de senalizacion de LIFR y BMPR candidatos se pueden ensayar luego en celulas diferenciadas o diferenciantes para determinar si el efecto de los agentes candidatos es espedfico de las celulas madre tumorales, mas que ser generalmente citotoxicos.

Los activadores de senalizacion de LIFR y de BMPR tambien pueden incluir moleculas de interferencia del ARN (ARNi), ribozimas u oligonucleotidos antisentido. Estas moleculas pueden reducir la expresion de inhibidores de la senalizacion de LIFR y BMPR y asf tienen el efecto de activar la senalizacion de LIFR y BMPR.

Los activadores de senalizacion de LIFR y de BMPR de la descripcion son de utilidad para incrementar la senalizacion mediada por LIFR o BMPR en una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral. Por consiguiente, la presente descripcion proporciona un metodo de incremento de la senalizacion mediada por LIFR o BMPR en una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral, metodo que comprende poner en contacto la celula madre tumoral o la celula progenitora tumoral con un activador de senalizacion de LIFR y/o BMPR durante un tiempo y en condiciones suficientes para incrementar la senalizacion mediada por LIFR o BMPR en la celula madre tumoral o la celula progenitora tumoral. Los activadores de senalizacion de LIFR y/o BMPR tambien se pueden usar en combinacion con una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP como se revela en la presente.

La descripcion tambien proporciona metodos para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad o un trastorno caracterizados por la proliferacion celular excesiva o mal regulada. Los metodos implican la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de LIFR y/o activador de senalizacion de BMPR a un sujeto o tejido pensado como sometido a tal proliferacion celular excesiva o mal regulada. Preferiblemente, el trastorno caracterizado por una excesiva proliferacion celular es un trastorno cerebral, mas preferiblemente, un tumor cerebral que incluye, pero sin limitacion, neuroma acustico, adenoma, astrocitoma, astrocitoma pilocftico juvenil, glioma del tronco encefalico, cordoma, plexo coroide, craniofaringioma, ependimoma, ganglioglioma, ganglioglioneurocitoma, glioblastoma multiforme (GBM), glioma, linfoma, meduloblastoma, meningioma, oligodendroglioma, glioma del nervio optico, un tumor de la pituitaria, un tumor pineal o pineoblastoma. Los activadores de senalizacion de LIFR y/o de BMPR tambien se pueden administrar en combinacion (ya sea al mismo tiempo o en tempos diferentes) con una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP como se revela en la presente.

En otro aspecto la descripcion proporciona un metodo para reducir el crecimiento de un tumor que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un activador de senalizacion de LIFR y/o un activador de senalizacion de BMPR a dicho tumor.

En otro aspecto, la descripcion proporciona un metodo de reduccion de la cantidad de celulas madre tumorales y/o celulas progenitoras tumorales en un tumor que comprende poner en contacto el tumor con un activador de senalizacion de LIFR y/o un activador de senalizacion de BMPR. Sin quedar ligados por la teona o hipotesis, se cree que cuando se administra a un tumor, los activadores de la senalizacion de LIFR y los activadores de senalizacion de BMPR llevan a un incremento de la senalizacion mediada por LIF o por BMP, que da como resultado la modulacion de cualquiera o mas de las siguientes propiedades de las celulas madre tumorales o celulas progenitoras tumorales tales como, pero sin limitacion, propiedades de supervivencia celular, autorrenovacion, division simetrica, proliferacion y/o diferenciacion. En particular, se cree que el incremento de la senalizacion mediada por LIFR o BMPR da como resultado una reduccion en las propiedades de proliferacion de las celulas madre y progenitoras y en particular una reduccion en la probabilidad de division simetrica exhibida por las celulas madre o celulas progenitoras proliferantes reduciendo asf sus cantidades. Por consiguiente, en otro aspecto, la descripcion proporciona metodos para reducir la probabilidad de que una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral se someta a division simetrica, metodo que comprende poner en contacto la celula madre tumoral o celula progenitora tumoral con un activador de senalizacion de BMPR y/o un activador de senalizacion de LIFR.

En algunas realizaciones de la presente descripcion, el activador de senalizacion de LIFR y/o de BMPR se puede administrar a un sujeto directamente de modo que las celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales endogenas se regulen in vivo. En realizaciones alternativas de la presente descripcion, las celulas madre tumorales y las celulas progenitoras tumorales se pueden poner en contacto con los agentes de la presente descripcion in vitro.

Los metodos para administrar los activadores de la senalizacion de LIFR y/o los activadores de senalizacion de BMPR a un sujeto, incluyendo a un tumor, junto con composiciones farmaceuticas que comprenden activadores de la senalizacion de LIFR y/o activadores de senalizacion de BMPR, se proporcionan mas abajo en la seccion intitulada “Administracion y composiciones farmaceuticas”

Administracion y composiciones farmaceuticas

Como se divulgo con anterioridad, las composiciones terapeuticamente eficaces de una preparacion de LIF y/o de una preparacion de BMP y/o de un activador de la senalizacion de LIFR y/o de un activador de la senalizacion de BMPR pueden administrarse, entre otros, a un sujeto o tejido para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno caracterizado por una proliferacion celular excesiva o mal regulada. Por ejemplo, en una realizacion se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de BMP-4 o de un mimetico de BMP-4 a un paciente humano que sufre de GBM. Ademas de los tumores y canceres descritos con anterioridad, otros canceres que pueden ser tratados o prevenidos de acuerdo con los metodos divulgados en la presente incluyen, sin limitacion, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Los ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon (inclusive cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de pulmon de celulas no pequenas, adenocarcinoma de pulmon, y carcinoma escamoso de pulmon), cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o de estomago (que incluye cancer gastrointestinal), cancer de pancreas, cancer de cerviz, cancer de ovario, cancer de hngado, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de glandulas salivares, cancer de rinon o renal, cancer de tngado, cancer de prostata, cancer de vulva, melanoma, cancer de tiroides, carcinoma hepatico y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello, como tambien linfoma de celulas B (que incluye linfoma de bajo grado/folicular no Hodgkin (NHL); NHL linfodtico pequeno (SL); NHL intermedio/NHL folicular; NHL intermedio de grado difuso; NHL inmunoblastico de elevado grado; NHL de celulas pequenas no escindidas de elevado grado; NHL de enfermedad masiva; linfoma de celulas del manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfodtica cronica (CLL, chronic lymphocytic leukemia); leucemia linfoblastica aguda (ALL; acute lymphoblastic leukemia), leucemia de celulas pilosas; leucemia mieloblastica cronica; y trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD, post-transplant lymphoproliferative disorder).

En una realizacion, se administra una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP y/o un activador de senalizacion de LIFR y/o un activador de senalizacion de BMPR a un sujeto en la forma de una composicion farmaceutica. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente descripcion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que son utiles para el tratamiento o prevencion de una enfermedad o trastorno caracterizados por una proliferacion celular excesiva o mal regulada. Las composiciones farmaceuticas de la descripcion comprenden por lo menos un agente seleccionado de entre el grupo consistente en una preparacion de LIF, una preparacion de BMP, un activador de la senalizacion de LIFR y/o un activador de la senalizacion de BMPR. Por ejemplo, en una realizacion una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de BMP-4 se proporciona para el tratamiento de GBM. En otra realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de BMP-2 para el tratamiento de GBM. En otra realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de BMP-5 para el tratamiento de GBM. En otra realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de BMP-6 para el tratamiento de GBM. En otra realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de BMP-7 para el tratamiento de GBM. En otra realizacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de BMP-8b para el tratamiento de GBM.

En otro aspecto, la descripcion divulga la utilizacion de una preparacion de LIF y/o de una preparacion de BMP y/o de un activador de la senalizacion de LIFR y/o de una activador de la senalizacion de BMPR en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad o trastorno caracterizados por una proliferacion celular excesiva o mal regulada. La invencion proporciona una preparacion de la protema LIF para el tratamiento de glioblastoma multiforme.

Las composiciones farmaceuticas de la descripcion pueden comprender un agente unico o pueden comprender cualquier combinacion de los agentes anteriormente mencionados, por ejemplo, una combinacion de LIF y BMP-4. Por otra parte, las composiciones farmaceuticas pueden comprender mas de un agente de una clase particular, por ejemplo, dos preparaciones LIF diferentes o dos activadores de senalizacion de BMPR diferentes, por ejemplo BMP-2 y BMP-4.

Las composiciones farmaceuticas comprenden preferiblemente por lo menos un portador farmaceuticamente aceptable. En tales composiciones farmaceuticas, una preparacion de LIF y/o un activador de la senalizacion de LIFR y/o un activador de la senalizacion de BMPR forma el “compuesto activo”. Como se utiliza en el presente, la expresion “portador farmaceuticamente aceptable” incluye solventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion, y similares, compatibles con una administracion farmaceutica. En las composiciones pueden incorporarse tambien compuestos suplementarios activos. Se formula una composicion farmaceutica de manera que sea compatible con su via de administracion prevista. Los ejemplos de via de administracion incluyen la via parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradermica, subcutanea, oral (por ejemplo, inhalacion), transdermica (topica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea, pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyecciones, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico; metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico y bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiaminacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clorhfdrico o hidroxido de sodio, La preparacion parenteral puede estar encerrada en ampollas jeringas descartables o en viales de multiples dosis hechos de vidrio o de material plastico.

Observese que en las realizaciones en las que un tejido o celula de los que se considera que experimentan una proliferacion celular excesiva o mal regulada es tratado con una preparacion de LIF y/o con una preparacion de BMP y/o con un activador de la senalizacion de LIFR y/o de un activador de BMPR in vitro, una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP y/o activador de la senalizacion de LIFR y/o activador de la senalizacion de BMPR puede estar o no en la forma de una composicion farmaceutica.

El termino “sujeto” utilizado en la presente se refiere a seres humanos y a primates no humanos (por ejemplo, gorilas, macacos, titf), animales de ganado (por ejemplo, ovejas, vacas, caballos, burros, cerdos), animales de compama (por ejemplo, perros, gatos), animales utilizados en ensayos de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, ratas, cobayos, hamsteres), animales salvajes cautivos (por ejemplo, zorros, venados) o cualesquiera otros organismos que puedan beneficiarse de los agentes de la presente descripcion. No hay ninguna limitacion acerca del tipo de animal que podna beneficiarse de los agentes descritos en la presente. El sujeto mas preferido de la presente descripcion es un ser humano. Un sujeto, independientemente de si se trata de un ser humano o de un organismo no humano, recibe la denominacion de paciente, Individuo, animal, huesped o receptor.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas esteriles (cuando sean solubles en agua) o de dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables. Para la administracion intravenosa, los portadores adecuados incluyen solucion fisiologica salina, agua bacteriostatica, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N. J.) o solucion salina tamponado con fosfato (PBS, phosphate buffered saline). En todos los casos, la composicion debe ser esteril y debena ser fluida en la medida que sea facil aplicarla mediante jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe conservarse contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol propilenglicol, y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de ellos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante la utilizacion de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano requerido para las partfculas en el caso de una dispersion y mediante la utilizacion de agentes tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianas y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio, en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede promoverse incluyendo en la composicion un agente que retarde la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados con anterioridad, de acuerdo con necesidad, seguido de esterilizacion filtrada. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un portador esteril que contiene un medio de dispersion basica y los otros ingredientes requeridos de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son el secado al vado y la liofilizacion que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada filtrada de el.

Las composiciones orales por lo general incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Para el proposito de la administracion oral terapeutica, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, tabletas o capsulas, por ejemplo, capsulas de gelatina. Las composiciones orales tambien se pueden preparar usando un portador lfquido para usar como enjuague bucal. Los agentes aglutinantes farmaceuticamente compatibles y/o los materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composicion. Los comprimidos, pfldoras, capsulas, tabletas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente disgregante tal como acido algmico, Primogel o almidon de mafz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un agente de deslizamiento tal como dioxido de silicio coloidal; un agente endulzante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para la administracion por inhalacion, los compuestos se administran en forma de un aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dioxido de carbono o un nebulizador.

La administracion sistemica tambien puede efectuarse por via transmucosal o transdermica. Para la administracion transmucosal o transdermica, se usan en la formulacion agentes penetrantes apropiados para la barrera por penetrar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, para administracion transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de acido fusfdico. La administracion transmucosal se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administracion transdermica, los compuestos activos se formulan en unguentos, pomadas, geles o cremas como se conoce generalmente en la tecnica. Los compuestos tambien se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retencion para administracion rectal.

En una realizacion, los compuestos activos se preparan con portadores que protegeran el compuesto contra su eliminacion rapida del cuerpo, tal como una formulacion de liberacion controlada, que incluye implantes y sistemas de administracion microencapsulados. Se pueden usar polfmeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhndridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Los metodos para la preparacion de tales formulaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Los materiales tambien se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomicas (que incluyen liposomas dirigidos a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales para antfgenos espedficos de celulas) tambien se pueden usar como portadores farmaceuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. No.

4.522.811.

Es ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitarias para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosificacion. La expresion “forma de dosis unitaria”, tal como se usa en la presente se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto por tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido.

La toxicidad y la eficacia terapeutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares o animales de experimentacion, por ejemplo, para determinar la LD⁵⁰(la dosis letal para el 50% de la poblacion) y la ED⁵⁰(la dosis terapeuticamente efectiva en el 50% de la poblacion). La relacion de dosis entre los efectos toxicos y los efectos terapeuticos es el mdice terapeutico y se puede expresar como la relacion LD⁵⁰/ED⁵⁰. Se prefieren los compuestos que exhiben elevados indices terapeuticos. Aunque pueden usarse compuestos que exhiben efectos secundarios toxicos, se debe tener cuidado en disenar un sistema de administracion que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado con el fin de minimizar el dano potencial a las celulas no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios efectuados en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificacion para uso en humanos. La dosificacion de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen el ED⁵⁰con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo en funcion de la forma de dosis empleada y de la via de administracion utilizada. Para cualquier compuesto usado en el metodo de la descripcion, la dosis terapeuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentracion de plasma circulante que incluye la IC⁵⁰(es decir, la concentracion del compuesto de prueba que logra una inhibicion semimaxima de los smtomas) segun se determina en cultivo celular. Tal informacion se puede usar para determinar con mayor precision las dosis utiles en seres humanos. Los niveles en el plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatograffa lfquida de alta resolucion.

Como se define en la presente, una “cantidad terapeuticamente eficaz de protema o polipeptido (es decir, una dosificacion efectiva)” puede variar de aproximadamente 0,001 a 30 mg/kg de peso corporal, con preferencia, de aproximadamente 0,01 a 25 mg/kg de peso corporal, con mayor preferencia, de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, e incluso mas preferiblemente alrededor de 1 a 10 mg/kg, de 2 a 9 mg/kg, de 3 a 8 mg/ kg, de 4 a 7 mg/jg o de 5 a 6 mg/kg de peso corporal . La protema o polipeptido se puede administrar una vez por semana durante aproximadamente 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2 y 8 semanas, mas preferiblemente entre aproximadamente 3 a 7 semanas, e incluso mas preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. El experto en la materia apreciara que determinados factores pueden influir en la dosificacion y en el tiempo requeridos para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo sin limitacion, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otros enfermedades presentes Ademas, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapeuticamente eficaz de una protema, polipeptido o anticuerpo puede incluir un unico tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos.

En realizaciones de la descripcion en las que se trata un trastorno proliferativo del cerebro, por ejemplo GBM, es preferible que la composicion farmaceutica y/o el metodo de administracion se adapten para superar la barrera hematoencefalica (BBB) y/o la barrera hematotumoral (BTB). Los metodos para administrar composiciones farmaceuticas a traves de la BBB son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, ver Misra et al, (2003) J Pharm Pharm Sci 6: 252-273. Los metodos adecuados incluyen sin limitacion metodos pata la administracion de farmacos cerebrales transcraneales tales como implantacion intracerebral, infusion intracerebroventricular (ICV) y/o difusion potenciada por conveccion (CED). La implantacion intracerebral puede realizarse usando, por ejemplo, perlas de polfmero (tales como perlas acnlicas de heparina) o laminas de polfmero (como polifeprosano 20) impregnadas con una preparacion de LIF y/o de una preparacion de BMP y/o activadores de senalizacion de LIFR y/o activadores de senalizacion de BMPR). Por ejemplo, la implantacion intracerebral puede llevarse a cabo inyectando estereotacticamente perlas acnlicas de heparina cargadas con BMP-4 en el tumor o en la cavidad de la reseccion.

Las composiciones farmaceuticas de la descripcion, por ejemplo, las composiciones farmaceuticas que comprenden las preparaciones BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 o BMP-8b (o combinaciones de las mismas), se pueden administrar a un tumor no reseccionado usando estos metodos; como alternativa, las composiciones farmaceuticas se pueden administrar a la cavidad de la reseccion despues de la reseccion del tumor. En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas se administran primero intratumoralmente, y luego se administran en forma posoperatoria despues de la reseccion del tumor.

En algunas realizaciones, una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP y/o un activador de senalizacion LIFR y/o activador de senalizacion BMPR esta asociada con una molecula que puede unirse a un epftopo exofacial en un componente del sistema de transporte mediado por receptor (RMT, receptor-mediated transport) de la barrera hematoencefalica (BBB). De esta forma, la preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP y/o un activador de senalizacion de LIFR y/o activador de senalizacion de BMPR, pueden transportarse a traves de la BBB usando el sistema de RMT endogeno. Por ejemplo, una preparacion de LIF o de BMP puede conjugarse con un anticuerpo monoclonal (tal como OX26) al receptor de transferrina (TfR) para permitir el transporte transmembrana del conjugado. Vease, por ejemplo, Pardridge, Neurorx 2 (1): 3-14 (2005). Las nanopartmulas tambien pueden inducirse a cruzar la BBB por conjugacion a, por ejemplo, OX26; dichas nanopartmulas tambien pueden conjugarse con una preparacion LIF y/o una preparacion de b Mp y/o un activador de senalizacion de LIFR y/o un activador de senalizacion de BMPR. Ver por ejemplo, Olivier et al., Pharm Res. (2002) 19 (8): 1137-43. Ademas, los liposomas conjugados a, por ejemplo, OX26 se pueden usar para administrar una preparacion de LIF encapsulada y/o una preparacion de BMP y/o un activador de senalizacion de LIFR y/o un activador de senalizacion de BMPR a traves de la BBB. Ver Huwyler y col., Proc Natl Acad Sci EE.UU. (1996) 93 (24): 14164-9. Ademas, los agentes y tratamientos que interrumpen el BBB y el BTB tambien pueden usarse para hacer pasar una preparacion de LIF y/o una preparacion de BMP y/o un activador de senalizacion LIFR o un activador de senalizacion BMPR a traves de BBB o BTB. Por ejemplo, la infusion intracarotidica del agente vasoactivo bradiquinina puede aumentar selectivamente la permeabilidad en los capilares de tumores cerebrales. Ver Matsukado et al., Brain Res. (1998) 792 (1): 10-5.

En una realizacion, las moleculas de acido nucleico que codifican las preparaciones de LIF y BMP, o los activadores de senalizacion de LIFR o BMPR de polipeptido y peptido, o para ribozimas, moleculas de ARNi y moleculas antisentido que son activadores de senalizacion LIFr o BMP, se insertan en vectores y se utilizados como vectores de terapia genetica. Los vectores de terapia genetica pueden administrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyeccion intravenosa, administracion local (ver la Patente de Estados Unidos No. 5.328.470) o mediante inyeccion estereotactica (ver, por ejemplo, Chen y otros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91: 3054 - 3057; Voges y otros (2003), Ann. Neurol., 54: 479 - 487). La preparacion farmaceutica del vector de terapia genetica puede incluir el vector de terapia genetica en un diluyente o encapsulante aceptable (tal como un liposoma que contiene el vector), o puede comprender una matriz de liberacion lenta en la que esta incrustado el portador de administracion de genes. Como alternativa, cuando el vector de suministro genetico completo puede producirse intacto a partir de celulas recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparacion farmaceutica puede incluir una o mas celulas que producen el sistema de suministro de genes. En una realizacion, las moleculas de acido nucleico que codifican las preparaciones de LIF y BMP, o para los activadores de senalizacion de LIFR o BMPR de polipeptido y peptido, se transfieren a celulas madre de cancer neural de mairnfero mediante vectores lentivirales, como se describe en Consiglio et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2004, 12 de octubre; 101 (41): 14835-14840.

En algunas realizaciones, se administra un unico compuesto activo de acuerdo con la descripcion, por ejemplo, una unica preparacion de LIF o una unica preparacion de BMP. En otras realizaciones, multiples compuestos activos se administran conjuntamente, por ejemplo, dos diferentes preparaciones de LIF; o una preparacion de LIF y una preparacion de BMP; o un activador de senalizacion de b Mp R y dos preparaciones de b Mp diferentes. Ademas, los compuestos activos de la descripcion se pueden coadministrar con otros productos farmaceuticos, tales como agentes quimioterapeuticos, sensibilizadores a la radiacion, agentes radioterapeuticos, y similares. Cualquier referencia en la presente a "coadministrado" significa una administracion simultanea en la misma formulacion o en dos formulaciones diferentes a traves de la misma ruta o por rutas diferentes o la administracion secuencial por la misma ruta o por rutas diferentes. La referencia en este documento a la administracion "secuencial" se refiere a un tiempo diferencia de segundos, minutos, horas o dfas entre la administracion de los dos tipos de agentes y/o composiciones farmaceuticas. La coadministracion de los agentes y/o composiciones farmaceuticas puede ocurrir en cualquier orden.

Los metodos de tratamiento y las composiciones farmaceuticas descritos en la presente pueden usarse junto con otros tratamientos, incluidos los tratamientos de quimioterapia (como carmustina, cisplatino, paclitaxol, temozolomida, PCV (procarbazina, lomustina y vincristina) e IL13-PE38QQR) con radioterapia (tal como anticuerpos radiomarcados o ligandos de acido nucleico radiomarcados), radioterapia y cirugfa (incluida reseccion tumoral / eliminacion quirurgica de la masa). Por ejemplo, las preparaciones de b Mp -4 pueden coadministrarse con agentes quimioterapeuticos despues de la cirugfa de reseccion tumoral y la radioterapia para el tratamiento de GBM. Estos tratamientos adicionales se pueden usar antes y/o durante y/o despues del tratamiento de acuerdo con los metodos descritos en la presente.

Ejemplos

La presente descripcion se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Cabe senalar que para los Ejemplos 19-23, los protocolos utilizados para obtener los resultados enumerados se proporcionan en los Ejemplos 24-29. Los ejemplos 4, 10, 11 y 13 son ejemplos de la presente invencion.

Ejemplo 1: Pasaje seriado de celulas madre neurales humanas fetales y analisis de la frecuencia de celulas madre y progenitoras sobre la base del modelado matematico

Se derivo un algoritmo para calcular el numero de celulas madre neurales y el numero de celulas progenitoras neurales presentes en cultivos de neuroesferas pasados en serie. A los efectos de este algoritmo, todas las celdas se dividen en tres categonas:

1. Las celulas madre se definen como: celulas indiferenciadas capaces de, (a) proliferacion, (b) autorrenovacion durante un penodo de tiempo extendido, (c) capaces de generar un gran numero de progenie, y (d) la capacidad de generar todos los tipos de celulas del tejido del que se obtiene,

2. Las celulas progenitoras se definen como: celulas indiferenciadas capaces de, (a) proliferacion, (b) capacidad de autorrenovacion limitada, (c) generacion de un numero limitado de progenie y (d) la capacidad de originar al menos un tipo de progenie; y 3

3. Las celulas diferenciadas se definen como una celula con capacidad de proliferacion limitada o nula y expresion de marcadores espedficos de linaje y propiedades funcionales maduras.

Los terminos "celulas madre" y NSC se pueden usar en forma indistinta en la presente.

De modo similar, los terminos "celula progenitora" y NPC tambien se puede usar de modo indistinto en la presente.

En la descripcion de este algoritmo, se han realizado una serie de suposiciones:

1. Una neuroesfera esta compuesta de celulas madre, celulas progenitoras y celulas diferenciadas.

2. Cada neuroesfera crece a partir de una celula madre unica o celula progenitora unica.

3. Una celula madre tiene una vida infinita y una celula progenitora tiene una vida finita. La vida finita se define como l pasajes.

4. Una celula madre siempre forma una neuroesfera y una celula progenitora formara una neuroesfera a menos que haya llegado al final de su ciclo de vida.

5. Cada neuroesfera tiene un total de celulas c que son de una de dos posibles composiciones. Las posibles composiciones son:

a. en cada neuroesfera derivada de una celula madre unica, la composicion es celulas madre c, celulas progenitoras p y el resto son celulas diferenciadas; y

b. en cada neuroesfera derivada de una celula progenitora unica, la composicion es celulas progenitoras p, el resto es celulas diferenciadas.

Se ha derivado un algoritmo que describe el numero total de celulas, Tn, en cada pasaje, n. Al comienzo del experimento, se disocia una neuroesfera derivada de celulas madre, es decir, hay celulas madre s, celulas progenitoras p y celulas diferenciadas c-s-p. Las celulas madre y progenitoras se dejan crecer en neuroesferas de las cuales el numero total es s+p y las celulas diferenciadas mueren. El numero total de celulas en el momento del primer pasaje Ti, esta dado por el producto del numero total de neuroesferas con el numero de celulas en cada neuroesfera:

La segunda igualdad de la ecuacion anterior es interesante porque s c representa el numero total de celulas en neuroesferas derivadas de celulas madre y p c representa el numero total de celulas en neuroesferas derivadas de celulas progenitoras.

Asumiendo que las celulas progenitoras vivan durante dos generaciones, en la actualidad estas neuroesferas estan disociadas. En el primer pasaje hay neuroesferas derivadas de celulas madre s, cada una de las cuales debe contener celulas madre s, celulas progenitoras p y celulas diferenciadas c-s-p . Tambien en el primer pasaje estan las neuroesferas derivadas de del progenitor p cada una de las cuales a su vez contiene celulas progenitoras p y celulas diferenciadas c-p. Estas celulas recien disociadas creceran en sus propias neuroesferas, excepto las celulas diferenciadas que mueren. El numero total de celulas en el momento del segundo pasaje, T², entonces esta dado por:

(2) 7i = sc + pc

(3) T2 = (^j+ p)sc (p)ps = s 2c spc p 2c

La primera columna en el lado derecho de la igualdad contiene los terminos que representan las neuroesferas derivadas de celulas madre. La segunda columna representa las neuroesferas derivadas del progenitor.

La segunda igualdad en la ecuacion T² representa el numero total de celulas en una forma expandida. Los terminos s2c denotan el numero total de celulas en la neuroesfera derivada de celulas madre que en la proxima generacion se convertiran en neuroesferas derivadas de celulas madre. El segundo termino, spc, representa el numero total de celulas en las neuroesferas derivadas de celulas madre que en la proxima generacion se convierten en neuroesferas derivadas de celulas progenitoras. El ultimo termino, p2c, representa las neuroesferas derivadas de celulas progenitoras que, de acuerdo con su vida, se convertiran en neuroesferas derivadas de celulas progenitoras o moriran.

Estas celulas ahora pasan y llevan a la tercera generacion. El numero total de celulas en esta generacion depende de la vida de las celulas progenitoras. Si la vida es solo de dos generaciones, entonces las celulas progenitoras derivadas del progenitor ahora moriran en lugar de crear una nueva neuroesfera. Bajo esta suposicion, el numero total de celulas en el momento del tercer pasaje, T³esta dado por:

(4) Tx = sc + pc

(5) T2 = s 2c spc p 2c

(6) T3 = (5 + p)s2c + {p)psc 0 = s 3c -l- s 2pc + p 2sc

De forma similar, se puede determinar el numero total de celulas en el momento del cuarto pasaje. La reescritura de estas ecuaciones produce:

En consecuencia, por induccion, se puede decir que en el nth pasaje el numero total de celulas estara dado por

Se debe repetir que esta ecuacion se basa en la suposicion de que la vida del progenitor es de dos generaciones.

Si la vida de las celulas progenitoras es superior a dos generaciones, el numero total de celulas en el momento del tercer pasaje, T³ esta dado por

Si la vida del progenitor es de tres generaciones, entonces el numero total de celulas en la cuarta generacion esta dado por:

Por lo tanto, con esta suposicion espedfica, por induccion, se puede decir que el numero total de celulas en el nth pasa esta dado por

En general, mediante un argumento similar se puede demostrar que si la vida de la celula progenitora es de l generaciones, entonces el numero total de celulas en el nth pasaje esta dado por

Existe una simplificacion bien conocida para la suma en la ecuacion anterior,

En consecuencia la expresion Tn simplifica:

Debido a que, para un tipo de celula, p, s, c y l son fijos, se puede reemplazar el termino entre corchetes por una constante, por lo tanto:

y

Esta ecuacion se puede representar en una forma lineal tomando el logaritmo de Ecuacion (25) para obtener

Examinando la ecuacion (27), la pendiente de esta lmea recta es log s y la interseccion y-es log B. Desde un punto de vista experimental, esto significa que si el log del numero total de celulas se grafica contra el numero de pasaje, entonces el numero de celulas madre en una neuroesfera se puede calcular mediante el examen de la pendiente del grafico y el numero de celulas progenitoras se puede calcular mediante el examen de la interseccion con el eje y. Al construir esta grafico, se debe tener cuidado de incluir solo los puntos de datos que estan en numeros de pasajes mayores que la vida de las celulas progenitoras. La vida de las celulas progenitoras se calcula al observar que para

1 ≥ n ,

, la relacion del numero total de celulas en el pasaje dado

, pero que para esta relacion no es constante.

En consecuencia: ^ n 1 donde n es el numero entero para el cual esta relacion no es igual a s. Esta tecnica se puede adaptar para manejar los datos ruidosos.

Es im p o s e desjacar qUe ,os primeros « pasajes,

...... no se hallan en la lmea recta. Esto se puede ver al examinar las ecuaciones (23) y (24).

De la ecuacion (27) se puede ver que el numero de celulas progenitoras en una neuroesfera, p no afecta la pendiente de la lmea. Si la pendiente cambia, esto debe significar que la cantidad de celulas madre cambia. Si la pendiente es 0, es decir, si la lmea es horizontal, entonces solo hay una celula madre en una neuroesfera y, por lo tanto, el numero total de celulas en cada pasaje no se expande.

Si las condiciones bajo las cuales crecen las neuroesferas cambian, por ejemplo, si el factor de crecimiento cambia de solo EGF a solo EGF FGF, entonces la pendiente de la lmea todavfa esta determinada unicamente por el numero de celulas madre en una neuroesfera. La prueba de esta afirmacion constituye el resto de esta seccion.

Se supone que las condiciones cambian despues del rth pasaje y el numero de celulas madre que se producen cambia a q, el numero de celulas progenitoras a w y la vida de las celulas progenitoras a m generaciones (por conveniencia asumiremos que m~l pero el caso donde m >l es similar). El numero total de celulas despues de los pasajes r l esta dado por:

Despues de r + m - 1 pasajes el numero total es

Y despues de r m pasajes el numero total es:

Por induccion, el numero total de celulas despues de r N pasajes entonces es:

donde:

Linealizacion,

Por lo tanto, como antes, se puede ver que despues del cambio de condiciones, la pendiente de esta lmea solo es afectada por el numero de celulas madre.

Sobre la base del algoritmo anterior, la frecuencia de celulas madre y celulas progenitoras se puede calcular a partir de las siguientes etapas:

1. pasar las celulas en forma seriada en el ensayo de la neuroesfera y graficar el numero total de celulas generadas en cada pasaje en funcion de multiplicar las celulas totales de la

2. linealizar la curva de crecimiento logantmico tomando el logaritmo de las celulas totales generadas en cada pasaje;

3. calcular la lmea de mejor ajuste y luego usar la formula para una lmea recta (y = mx b) para calcular la pendiente de la lmea y la interseccion en y, que a su vez revela el numero de celulas madre y el numero de celulas progenitoras usando las formulas anteriores.

Ejemplo 2: Pasaje seriado de celulas madre neurales humanas fetales y analisis de la frecuencia de celulas madre y progenitoras sobre la base del modelado matematico

El modelo matematico del Ejemplo 1 se aplico a las celulas madre neurales humanas fetales pasadas en serie. Las celulas madre neurales humanas fetales se pasaron en forma seriada usando tecnicas convencionales (es decir, las celulas se sembraron en una densidad clonal en cada pasaje usando una fraccion de las celulas del pasaje anterior, y usando el medio libre de suero suplementado con los mitogenos EGF y FGF2), como se describe en Vescovi et al. (1999) Exp. Neurol. 156: 71-83. Al final de cada pasaje, se determino el numero total de celulas mediante la disociacion de las celulas en una suspension celular unica y recuento de las celulas de suspension celular unica y recuento del numero de celulas viables y muertas por celulas de exclusion con azul de tripano. El numero teorico total de celulas al final de cada pasaje (que es una funcion del numero total de celulas contadas al final del pasaje y la fraccion del pasaje inmediatamente anterior que se sembro de nuevo para producir las celulas contadas) se grafico versus numero de pasaje (FIGURA 1A) para producir una curva de crecimiento. El log del numero total de celulas al final de cada pasaje tambien se grafico versus al numero de pasaje (FIGURA 1B). Se genero una lmea de tendencia de mejor ajuste para el grafico log lineal (FIGURA 1B) y se uso la formula para una lmea recta (y = mx b) para determinar la pendiente y la interseccion en y. La frecuencia de celulas madre y celulas progenitoras se calculo de acuerdo con las ecuaciones (26) y (27) en el Ejemplo 1 (con n = 1, l = n 1 = 2, c = 1000; estos valores tambien se usan en todos los siguientes ejemplos). Se calculo que la frecuencia de celulas madre era del 0,24% de la poblacion celular total, y se calculo que la frecuencia de celulas progenitoras era del 1,15% de la poblacion celular total.

Ejemplo 3: Analisis de la frecuencia de celulas madre y progenitoras de celulas madre neurales humanas fetales en el ensayo de celulas formadoras de colonia neurales

El ensayo de celulas formadoras de colonias neurales (NCFCA) se puede utilizar para determinar la frecuencia de celulas madre y progenitoras sobre la base de un analisis del tamano de la colonia neural. El NCFCA se describe en la publicacion de solicitud de la patente de Estados Unidos serie No. 2005/0112546, publicada el 26 de mayo de 2005. En resumen, el NCFCA se realiza mediante la suspension de celulas neurales en un medio semisolido, preferiblemente un medio semisolido a base de colageno o a base de metilcelulosa (IMDM, DMEM/F12, McKoys, Iscoves). El medio semisolido puede comprender el mismo medio adecuado usado para cultivar las celulas neurales (por ejemplo, Neurocult™ [StemCell Technologies, Inc.] medio libre de suero sin citoquinas mas Neurocult™ Proliferation Supplements mas EGF) al que se anade colageno o metilcelulosa. El medio esta preferiblemente libre de suero. Las celulas en el medio semisolido se siembran a una concentracion que permitira un numero suficiente de colonias para analisis estadfsticos de los datos (por ejemplo, 1.000-25.000 celulas, preferiblemente 2.500-7.500 por placa de cultivo de 35 mm). Las colonias que se forman surgen de una celula unica, ya sea una celula madre o una celula progenitora neural.

Las colonias se cultivan hasta el tamano adecuado y se pueden distinguir las diferencias entre tamanos de colonias (por ejemplo, aproximadamente 10-30 dfas), luego se cuentan las colonias y se estima el tamano de las colonias usando rejillas en una placa de clasificacion. Las colonias que se generaron a partir de una celula madre neural unica continuaran creciendo en tamano con el tiempo, mientras que las colonias generadas a partir de una celula progenitora neural tendran una capacidad limitada para crecer y por lo tanto no continuaran creciendo en tamano con el tiempo. El tamano de la colonia distinguira entre NSC de potencial proliferativo alto (HPP-NSC), NSC de potencial proliferativo bajo (LPP-NSC) y las celulas progenitoras neurales. Por lo tanto, el tamano de la colonia generada puede ser indicativo de si la colonia se genero a partir de una celula madre neural o una celula progenitora neural y ademas si NSC tiene un potencial proliferativo alto o bajo. En particular, las colonias mas grandes (en comparacion con las otras colonias en la placa) son indicativas de celulas madre neurales de alto potencial proliferativo, las colonias de tamano medio son indicativas de celulas progenitoras neurales de bajo potencial proliferativo, y las colonias mas pequenas son indicativas de celulas progenitoras neurales. El diametro real de las "colonias mas grandes" o "colonias mas pequenas" dependera de muchos factores, tales como cuanto tiempo se cultivan las colonias, etc. Por ejemplo, despues de cultivar 2.500 celulas/placa durante 14-28 dfas, las colonias se clasificaron en una de cuatro categonas basadas en el diametro: (1)> 2,0 mm, (2) 1-2 mm, (3) 0,5-1 mm y (4) <0,5 mm. Por lo tanto, asumiendo que las colonias se cultivan durante al menos 14 dfas, un diametro mayor de 2,0 mm es indicativo de una colonia generada a partir de una celula madre neural. Los tipos de celulas en el NCFCA tambien se pueden distinguir en funcion de las morfologfas que producen. Las colonias onduladas son producidas por celulas madre neurales, mientras que las colonias con una periferia lisa son producidas por celulas progenitoras neurales. Los kits para realizar el NCFCA estan disponibles comercialmente en StemCell Technologies, Inc.

La frecuencia de celulas madre y progenitoras para celulas madre neurales humanas fetales se calculo mediante la siembra de celulas en el NCFCA. La progenie de celulas madre neurales fetales del pasaje 12 se disocio en una suspension de celulas unicas y se sembro a una densidad de 2000 celulas/ml junto con 20 ng/ml de EGF y 10 ng/ml de bFGF. Las celulas se cultivaron en el medio semisolido durante 3 semanas despues de lo cual se calcularon la frecuencia y el tamano de las colonias. Menos del 2% del total de celulas sembradas formaron colonias que exhiben caractensticas de celulas madre. Por lo tanto, los resultados del Ejemplo 2 del metodo de analisis matematico son compatibles con los resultados del NCFCA.

Ejemplo 4: El factor inhibidor de leucemia (LIF) reduce la frecuencia de celulas madre y progenitoras en celulas madre neurales humanas fetales pasadas en serie

Las celulas madre neurales humanas fetales pasadas en serie se cultivaron en condiciones de proliferacion normal como en el Ejemplo 2 (que incluye los mitogenos FGF2 y EGF) con o sin la adicion de 20 ng/ml de LIF humano. Se generaron curvas de crecimiento para ambos grupos (FIGURA 2A), se convirtieron a una escala lineal tomando el log del numero teorico total de celulas generadas al final de cada pasaje (ver el Ejemplo 2) y se determinaron la pendiente y la interseccion sobre la base de la lmea de tendencia de mejor ajuste (FIGURA 2B). El analisis de la frecuencia de celulas madre y progenitoras de acuerdo con el metodo del Ejemplo 1 revelo una reduccion del 48% en la frecuencia de celulas madre y una reduccion del 18% en la frecuencia de celulas progenitoras en presencia de LIF (FIGURA 2C; el eje y representa el % del valor de control). Por lo tanto, LIF se puede usar para reducir la frecuencia de celulas madre neurales y celulas progenitoras neurales en celulas madre neurales humanas pasadas en serie.

Ejemplo 5: La protema morfogenetica osea 2 (BMP-2) reduce la frecuencia de celulas madre y progenitoras en celulas madre neurales humanas fetales pasadas en serie

Las celulas madre neurales humanas fetales pasadas en serie se cultivaron en condiciones de proliferacion normal (que incluye los mitogenos FGF2 y EGF) como en el Ejemplo 2 con o sin la adicion de 20 ng/ml de la protema BMP-2 humana. Se generaron curvas de crecimiento para ambos grupos, se convirtieron a una escala lineal tomando el log del numero teorico total de celulas generadas al final de cada pasaje y se determinaron la pendiente y la interseccion sobre la base de la lmea de tendencia de mejor ajuste. El analisis de la frecuencia de celulas madre y progenitoras de acuerdo con el metodo del Ejemplo 1 revelo una reduccion en ambos tipos celulares en presencia de BMP-2. Por lo tanto, la BMP se puede usar para reducir la frecuencia de celulas madre neurales y celulas progenitoras neurales en celulas madre neurales humanas pasadas en serie.

Ejemplo 6: Las celulas pasadas en serie derivadas del glioblastoma multiforme (GBM) exhiben rasgos clave de celulas madre

El GBM humano contiene celulas madre neurales tumorales (tNSC) que proliferan en condiciones adaptadas para permitir el crecimiento ex vivo de celulas madre neurales. Ver Galli et al. (2004) Cancer Research 64: 7011-7021. Las tNSC se pueden aislar a partir de muestras tumorales de acuerdo con el metodo de Galli et al (2004), supra, y Vescovi et al., Exp. Neurol. 156: 71-83 (1999). Brevemente, las tNSC se pueden aislar disociando primero las muestras tumorales mediante trituracion en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 que contiene 07 mg/ml de ovomucoide. Las celulas se recogen por centrifugacion y se resuspenden en medio NS-A qmmicamente definido libre de factor de crecimiento (Stem Cell Technologies, Vancouver, b C, Canada) que contiene glutamina 2 mM, glucosa 0,6%, putrescina 9,6 gm/ml, progesterona 6,3 ng/ml, selenito de sodio 5,2 ng/ml, insulina 0,025 mg/ml, transferrina 0.1 mg/ml. Las celulas viables se siembran en matraces de cultivo de tejidos de 25 cm2 a densidad (2.500-5.000 celulas/cm2) en el mismo medio NS-A definido qmmicamente mas EGF 20 ng/ml y FGF2 20 ng/ml. El medio se reemplaza con medio fresco cada 24-48 horas si es necesario. 5 a 20 dfas despues de la siembra, se pueden observar neuroesferas de celulas tumorales (ver la FIGURA 3A, que representa una vista de contraste de fase 20X) que se asemejan a las neuroesferas clasicas formadas in vitro por celulas madre neurales normales, como se describe en Reynolds and Weiss (1992) Science 255:1707-1710. Las neuroesferas de celulas tumorales se pueden disociar y volver a pasarse en serie en las mismas condiciones, con lo que las tNSC establecen nuevas neuroesferas de celulas tumorales. Las tNSC se autorrenuevan de forma estable y se expanden en cultivo (ver la FIGURA 3B que representa el numero total teorico de celulas en cada division para dos lmeas celulares GBM diferentes). Las tNSC son multipotenciales in vitro ya que su progenie produce neuronas, oligodendrocitos y astrocitos en condiciones de diferenciacion. Por ejemplo, se observo tincion de progenie diferenciada con un anticuerpo anti-beta-tubulina, un anticuerpo anti-protema acido-fibrilar glial (GFAP) (GFAP es un marcador de diferenciacion astroglial) y con un anticuerpo anti-galactocerebrosido (GalC) (GalC es un marcador para oligodendrocitos).

Cuando se trasplantan a los cerebros de ratones inmunodeficientes, los tNSC generan GBM con inmunorreactividad para marcadores espedficos de astroglial, al igual que en GBM humanos tfpicos. Cuando estos tumores se extirpan y las tNSC se cultivan de nuevo, las tNSC secundarias regeneran GBM cuando se trasplantan en el cerebro de ratones inmunodeficientes. Por lo tanto, las tNSC humanas son unipotenciales in vivo, multipotenciales in vitro, pueden actuar como celulas fundadoras de tumores hasta el nivel clonal, y pueden establecer tumores en ratones que se parecen mucho a las caractensticas clave de la enfermedad humana incluso despues del retrasplante en serie. Por lo tanto, las tNSC humanas parecen estar implicados en el crecimiento y la recurrencia de la GBM humana

Ejemplo 7: Uso del modelado matematico de celulas tumorales pasadas en serie para calcular la frecuencia de celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales.

Se determino la frecuencia de celulas madre y progenitoras para tres lmeas celulares GBM usando el metodo de analisis del Ejemplo 1. Las lmeas celulares se derivaron de los tumores de tres pacientes diferentes (tumores obtenidos del Institute Neurologico C. Besta y clasificados de acuerdo con los lineamientos de la Organizacion Mundial de la Salud). (OMS)). Las celulas tumorales se pasaron en serie usando los metodos del Ejemplo 6, y el numero total teorico de celulas generadas se grafico para cada pasaje para cada lmea celular (627, 913, 1022) (ver la FIGURA 4A). Se calculo el log del numero teorico total de celulas generadas al final de cada pasaje y, sobre la base de una lmea de tendencia de mejor ajuste, se calcularon la pendiente y la interseccion en y (ver la FIGURA 4B). La frecuencia del numero de celulas madre y progenitoras se calculo utilizando el metodo del Ejemplo 1. La frecuencia de celulas madre tumorales fue 0,44% de las celulas totales, y la frecuencia de celulas progenitoras tumorales fue 1,56% de las celulas totales (representada para cada una de las tres lmeas celulares de GBM en la FIGURA 4C).

Ejemplo 8: Calculo de la frecuencia de celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales de la progenie derivada de celulas madre tumorales de GBM en el ensayo de celulas formadoras de colonia neurales (NCFCA)

Las celulas de GBM del pasaje 15 se sembraron en el ensayo de celulas formadoras de colonias neurales (NCFCA) como se describe en el ejemplo 3. Los cultivos se alimentaron semanalmente con medios frescos y despues de 3 semanas se determino el diametro de la colonia. En este ensayo, solo las colonias mas grandes presentan caractensticas de celulas madre despues de la extraccion del medio semisolido y la subclonacion. Entre 0,25% a 0,65% del total de las celulas sembrada formaron colonias grandes. Se debe ver el grafico principal en la FIGURA 5 que muestra el % de celdas totales sembradas (eje y) que forman colonias en los siguientes rangos de tamano de diametro: 1.500-2.000 pm; 1.000-1.500 pm, 500-1.000 pm; y < 500 pm). El recuadro del grafico principal de la FIGURA 5 muestra el % de celdas totales sembradas (eje y) que forman colonias en las categonas de 1.500—2.000 pm y de 1.000-1.500 pm de diametro, utilizando una escala de eje y diferente a la del grafico principal. Por lo tanto, el NCFCA y el analisis matematico del Ejemplo 7 producen una frecuencia similar para las celulas madre tumorales en las lmeas celulares tumorales de GBM.

Ejemplo 9: Presencia de todas las formas de receptores de BMP en muestras tumorales primarias y tNSC.

La expresion de los tres receptores de BMP (BMPRIa, BMPRIb y BMPR2) se determino en OCR en tiempo real en:

1. Muestras de tumores cerebrales humanos primarios: astrocitoma anaplasico (AA 031217); glioblastoma (GBM050203, GBM 040114, GBM 040202, GBM 050207, GBM 050208); y neoplasia neuroepitelial disembrioblastica (NND 040115);

2. Celulas madre neurales fetales humanos normales (fNSCs); y

3. Lmeas de celulas madre neurales tumorales de glioblastoma humano (tNSC) (GBM 010627, GBM 020913, GBM 021022) preparadas de acuerdo con el metodo del Ejemplo 6.

Se uso el siguiente metodo. Primero, se aislo el ARN total de las fNSC, tNSC y de las muestras de tumores primarios usando el reactivo TRIzol (Life Technologies, Rockville, MD), y luego se transcribio de forma inversa usando Superscript Rnasa H-Transcriptasa Reversa (Life Technologies, Rockville, MD). Todos los ADNc usados como moldes se normalizaron previamente usando Gliceraldelddo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como un gen constitutivo y una lmea celular MCF-7 como control positivo. Las reacciones cuantitativas de PCR en tiempo real se corrieron luego por triplicado usando cebadores espedficos para cada receptor de BMP y usando el kit de reactivo principal QPRCR verde Brilliant® SYBR® (STRATAGENE, La Jolla, CA, USA). El colorante SYBR verde se une a cualquier producto de PCR, y por lotanto no requiere el uso de sondas espedficas de secuencia. Las mezclas maestras Brilliant SYBR verde contienen dUTP para usar con el protocolo de descontaminacion UNG. Las secuencias de cebador utilizadas son las siguientes:

Secuencias del cebador x PCR transcripta inversa (RT)

hBMPR-lA Fw: 5VAATGGAGTAACCTTAGCA CCA GAG-31

hBMPR-lA Rw: 5’-AGCTGAGTCCAGGAACCTGTAC-3’

hBMPR-lB Fw: 5’-GGTTGCCTGTGGTCACTTCTGG-31

hBMPR-lB Rw: 5!-TAGTCTGTGATTAGGTACAACTGG-3 ’

hBMPR-2 Fw: 5'-TCAGATATATGGCACCAGAAGTG-3'

Secuencias del cebador x PCR tiempo real

hBMPRla Fw: 5'-caggttcctggactcagctc-3'

hBMPRla Rw: 5 ’-ctttccttgggtgccataaa-3'

hBMPRlb Fw: 5'-aaagglcgclaLggggaagt-3'

hBMPRlb Rw: 5'-gcagcaatgaaacccaaaat-3'

hBMPR2 Fw: 5’-gctaaaatttggcagcaagc-3'

hBMPR2 Rw: 5'-cttgggccctatgtgtcact-3’

La emision fluorescente se registro en tiempo real (Detector de PCR en tiempo real de cuatro colores Cromo 4, MJ Research, BIO-RAD, USA). El perfil de expresion genica se completo usando el metodo Ct comparativo de cuantificacion relativa (Higuchi et al). Para cada gen, las cantidades relativas de ARN se normalizaron para dos controles endogenos, GAPDH y ARNr 18s. Cada replicado se normalizo y la cantidad relativa promedio (RQ) se informa para cada gen. Los niveles de cambio medios se calcularon junto con la desviacion estandar y los intervalos de confianza del 95% de los tres replicados.

La FIGURA 6 representa los resultados. Los resultados indican que diferentes tumores que tiene diferentes grados de agresividad tienen perfiles de expresion de BMPR caractensticos. Por lo tanto, el perfil de expresion de BMPR de un tumor se puede usar en un metodo de diagnostico para caracterizar el tumor y predecir la agresividad del tumor.

Ejemplo 10: El factor inhibidor de leucemia (LIF) y las BMP reducen la frecuencia de celulas madre en lineas celulares de GBM humanas pasadas en serie

Las celulas tumorales GBM obtenidas de tres pacientes diferentes se pasaron en serie en medio de control (que incluye los mitogenos EGF FGF2, ver el Ejemplo 6) con o sin LIF (20 ng/ml) o BMP-4 (20 ng/ml). El analisis de la frecuencia de celulas madre y progenitoras usando el metodo del Ejemplo 1 revelo una reduccion significativa en el numero de celulas madre tumorales mediante la adicion de LIF o BMP-4 (una significancia estadfstica de p <0,01), una reduccion significativa en el numero de celulas progenitoras tumorales mediante la adicion de BMP-4 (a significacion estadfstica de p <0,05) pero ningun cambio significativo en la frecuencia de la poblacion de celulas progenitoras tumorales mediante la adicion de LIF. Estos resultados indican que las moleculas de BMP reducen la proliferacion de celulas madre tumorales y progenitoras tumorales mientras que LIF reduce selectivamente el numero de celulas madre tumorales sin efecto sobre la poblacion progenitora tumoral. La Figura 7 representa graficamente los resultados (como % de valores de control no tratados). Estos resultados indican que tanto LIF como BMP son efectivos para reducir la proliferacion de tNSC, incluso en presencia de los mitogenos EGF y FGF2. Esto muestra que el tratamiento con LIF y/o BMP sera efectivo en el tratamiento de tumores cerebrales en seres humanos.

Ejemplo 11: Aplicacion de LIF y BMP-2 a celulas derivadas de GBM pasadas en serie reducen la frecuencia de celulas madre y progenitoras

Las celulas GBM pasadas en serie (ver el Ejemplo 6) en medio de control (que incluye los mitogenos EGF FGF2, ver el Ejemplo 6) se trataron con LIF, BMP-2 o una combinacion de BMP-2 LIF. Las celulas GBM control pasadas en serie no se trataron con ninguna protema. Las curvas de crecimiento se compararon usando el metodo del Ejemplo 1 para calcular la frecuencia de celulas madre y celulas progenitoras. Los datos revelan una mayor reduccion en la frecuencia de las celulas madre tumorales y de las celulas progenitoras tumorales cuando se usan LIF y BMP-2 juntos que cuando se usan solos. La Figura 8 representa graficamente los resultados (el eje y representa el % del valor de control no tratado). Estos resultados muestran que la coadministracion de LIF y BMP-2 es efectiva para reducir la proliferacion de las tNSC, incluso en presencia de los mitogenos EGF y FGF2, y que la coadministracion de LIF y BMP-2 sera efectiva en el tratamiento de tumores cerebrales en seres humanos.

Ejemplo 12: Tratamiento transitorio de celulas de GBM cultivadas con BMP-2 reduce permanentemente la frecuencia de celulas madre y progenitoras

Las celulas tumorales GBM obtenidas de tres pacientes diferentes se pasaron en serie en medio de control (que incluye EGF FGF2; ver el Ejemplo 6) con la adicion de BMP-2 (20 ng/ml) (indicada como "BMP" en la FIGURA 9) o una exposicion transitoria a BMP-2 (indicada como "post BMP" en la FIGURA 9) para un pasaje. El analisis de la frecuencia de las celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales usando el metodo del Ejemplo 1 revelo una reduccion significativa en el numero de celulas madre tumorales y de celulas progenitoras tumorales en ambos grupos BMP. Estos resultados indican que una exposicion transitoria a BMP-2 produce una reduccion permanente en la frecuencia de las celulas madre tumorales y de las celulas progenitoras tumorales, incluso en presencia de los mitogenos EGF y FGF2. Estos resultados indican que el tratamiento con BMP-2 tendra un efecto duradero sobre el crecimiento del tumor cerebral en seres humanos.

Ejemplo 13: Tumorigenicidad reducida de celulas GBM cultivadas despues del tratamiento previo con LIF y BMP

El trasplante de 100.000 celulas madre neurales tumorales de GBM humano en el cerebro (estriado ventrolateral) de ratones inmunodeficientes se realizo usando inyeccion estereotactica. Las celulas madre neurales tumorales establecieron GBM en los ratones. Estas lesiones de GBM se hicieron evidentes como areas hipernucleadas amplias distinguidas claramente por el tejido normal (ver la FIGURA 10, panel superior). Cuando las mismas celulas madre tumorales neurales tumorales se pretrataron con BMP-4 100 ng/mL o LIF 100 ng/mL durante 48 horas antes del trasplante, la formacion del tumor se reduce enormemente (aproximadamente en un 80%) y las areas hipernucleadas a menudo son diffciles de detectar (ver FIGURA 10, panel inferior). Estos resultados indican ademas que el tratamiento con BMP y/o LIF es efectivo en el tratamiento de tumores cerebrales humanos. Ver tambien el Ejemplo 22 para un Ejemplo adicional.

Ejemplo 14: Ensayo para la frecuencia de celulas madre tumorales en tejido de carcinoma de mama despues del tratamiento de LIF y BMP-2

Las muestras tumorales se obtienen de pacientes que consienten y se someten a biopsias para la reseccion tumoral y se digieren enzimaticamente en una solucion 1: 1 de colagenasa/hialuronidasa durante 1 hora a 37 °C, seguido de filtracion a traves de un filtro de40pm y siembra de celulas a una densidad clonal en mezcla de hormonas DMEM/F12 libre de suero (NeuroCult, Stem Cell Technologies) con los mitogenos EGF y FGF2 (20 ng/ml). Despues de 3-5 dfas, se observan grupos de celulas derivadas clonalmente que flotan en suspension. Estas celulas se recolectan, se disocian enzimaticamente y las celulas se vuelven a sembrar en medio de crecimiento fresco. Las celulas pasadas de esta manera cada 4-7 dfas muestran un aumento geometrico en el numero total de celulas generadas.

Las celulas madre derivadas de tumores mamarios pasadas en serie se exponen a LIF y/o BMP-2 y se compararon con cultivos de control. La frecuencia de celulas madre tumorales y progenitoras tumorales entre los grupos de tratamiento y control se analiza mediante la siembra de celulas de esferas mamarias disociadas en el ensayo de celulas formadoras de colonias neurales y analizando las curvas de crecimiento seriado con el modelo matematico del Ejemplo 1.

Ejemplo 15: Ensayo para la frecuencia de celulas madre tumorales en tejido de carcinoma prostatico despues del tratamiento con LIF y BMP-2

Las celulas de cancer de prostata se obtienen a partir de metastasis de ganglios linfaticos y se cultivan en la mezcla de hormonas DMEM/F12 (StemCell Technologies) con la adicion de suero 5% y los mitogenos de celulas madre EGF y FGF2. Los esferoides derivados clonalmente se pasan en forma seriada despues de la tripsinizacion y los datos de expansion de las celulas pasadas (no tratadas o tratadas con LIF y/o BMP-2) se usan para calcular la frecuencia de celulas madre tumorales y progenitoras tumorales usando el modelo matematico del Ejemplo 1.

Ejemplo 16: Ensayo para la frecuencia de celulas madre tumorales en tejido de melanoma despues del tratamiento con LIF y BMP-2

Las celulas de melanoma se obtienen de tumores resecados y las celulas madre se afslan segun los metodos utilizados para cultivar celulas madre multipotentes de piel de mairnfero (ver Toma et al, Nat Cell Biol. 2001 Sep;3(9):778-84). Brevemente, el tejido se corta en trozos pequenos (<2 mm), se lava con HEM y se digiere con tripsina 0,1 durante 30 minutos a 37 °C. Las muestras se lavan en PBS, se disocian mecanicamente en una suspension de celulas unica, se filtran a traves de un filtro de celulas de 40 pm y se siembran a una densidad de 50.000 celulas por ml en matraces de cultivo de tejidos Nunc T-80. El medio de cultivo es DMEM/F12 libre de suero con mezcla de hormonas (StemCell Technologies) con la adicion de los mitogenos de celulas madre EGF y FGF2. Despues de 7-10 divisiones, se identifican grupos de celulas derivadas clonalmente en cultivo. Estas melanosferas se recogen, se disocian en una suspension de celulas unicas y se vuelven a sembrar usando mitogenos de celulas madre de medio fresco. Los cultivos pasados de esta manera se tratan con LIF o BMP-2 y el numero total de celulas generadas a lo largo del tiempo se grafica en un escala logantmica. La frecuencia de celulas madre tumorales y progenitoras tumorales entre los grupos de tratamiento y control se analiza utilizando el modelo matematico del Ejemplo 1.

Ejemplo 17: Tratamiento de glioblastoma multiforme recurrente usando la administracion de LTF por administracion aumentada por conveccion (CED) despues de la reseccion tumoral

Se seleccionan pacientes con glioblastoma multiforme recurrente. Despues de la reseccion tumoral, se colocan de dos a tres cateteres en el parenquima cerebral que rodea la cavidad de reseccion usando una grna de imagen para evitar la entrada a los surcos o ventnculos. Se infunden setenta y dos ml de LIF humano a 1-pg/mL a traves de los cateteres durante 96 horas utilizando una bomba de jeringa.

Ejemplo 18: Tratamiento del glioblastoma multiforme recurrente usando la administracion de BMP-4 con perlas de polimero

Se seleccionan pacientes con glioblastoma multiforme recurrente. Despues de la reseccion del tumor, se implantan perlas poliacnlicas saturadas de BMP-4 (que liberan BMP-4 durante mas de una semana) en el sitio de reseccion.

Ejemplo 19: Expresion de BMPR en celulas de especimenes de GBM

La expresion de BMP y sus transcriptos de receptor (BMPR) y protemas en celulas derivadas de tejido GBM se evaluaron en la poblacion tNSC CD133+ derivada de tejido GBM (Singh, S. K. et al., Nature 432, 396-401 (2004)). Mientras que los datos in vitro a continuacion ilustran los datos obtenidos de celulas de un especimen de GBM representativo, se obtuvieron resultados equivalentes con cuatro muestras adicionales, que incluyen celulas clasificadas o no clasificadas CD133+, ya se aisladas completamente de GBM o despues de un breve cultivo con mitogenos (celulas cultivadas) (Galli et al, Cancer Res 64, 7011-21 (2004); Singh, S. K. et al., Nature 432, 396-401 (2004)). Se encontraron transcriptos para los tres subtipos BMPR (BMp R1A,-1B,-2) y BMP tanto en celulas GBM disociadas completamente y cultivadas. Ver la FIGURA 11A donde el carril 1 es un control negativo, el carril 2 es celulas GBM CD 133+ disociadas completamente, el carril 3 es celulas GBM CD 133+ cultivadas, y el carril 4 es celulas MCF7 como control positivo. Ademas, el receptor cognado y las protemas BMP-4 se encontraron en ambas poblaciones, en las fracciones CD133+ y CD133. Ver la FIGURA 11B-G que representa la inmunofluorescencia de las protemas indicadas en las celulas CD133+ GBM recientemente aisladas (FIGURA 11B-D) y cultivadas (FIGURA 11E-G).

Los BMPR fueron funcionales, ya que se observo la fosforilacion de Smad 1-5-8 despues de la adicion de concentraciones saturantes de b MP-4 (100 ng/ ml), uno de los ligandos mas efectivos, mientras que no se detecto activacion de la via p38 MAPK. Ver la FIGURA 11H-J, que muestra la fosforilacion y la translocacion nuclear de las protemas Smad activadas por receptor (antiphosphoSmad 1,5,8) en los tiempos indicados (en minutos) en celulas de GBM.

La FIGURA 11K-P muestra un analisis de transferencia de Western de las protemas indicadas. FIGURA 11K muestra la protema BMP-4 en celulas GBM CD133+ disociadas completamente (carril izquierdo) y cultivadas (carril derecho).

La FIGURA 11L muestra que los niveles de Smadl no se modificaron en las celulas cultivadas tratadas con BMP-4 (el carril izquierdo es control, el carril derecho se trata con BMP-4). La FIGURA 11M-N muestra una fosforilacion incrementada de Smad 1,5,8 en presencia de BMP-4 (controles de los carriles izquierdos, los carriles derechos se tratan con BMP-4) en celulas recien disociadas (FIGURA 11M) y cultivadas (FIGURA 11N). La FIGURA 11O-P muestra una expresion aumentada de Smad4 en celulas GBM cultivadas (FIGURA 11O) y disociadas completamente (FIGURA 11P) despues del tratamiento con BMP-4 (control en los carriles izquierdos, tratamiento con b MP-4 en los carriles derechos).

Este resultado tambien indica que el complejo Smad 1,5,8 tambien puede ser un blanco terapeutico util para el tratamiento de GBM. Por ejemplo, los agentes terapeuticos que aumentan la fosforilacion del complejo tendran el mismo efecto en tNSC que BMP-4. Los metodos de seleccion descriptos en otra parte en esta descripcion se pueden usar para obtener tales agentes terapeuticos.

Ejemplo 20: Estudio del efecto de la exposicion de BMP-4 en tNSC de GBM

Se estudio la naturaleza del efecto de BMP-4 en celulas aisladas de GBM. Diferente de otros sistemas celulares (Hallahan et al, Nat Med 9, 1033-8 (2003); Zuzarte-Luis & Hurle, Semin Cell Dev Biol 16, 261-9 (2005); Hruska et al, Circ Res 97, 105-14 (2005)), que incluyen meduloblastomas (Graham et al., Mol Cell Neurosci 8, 76-83 (1996)), BMP-4 no produjo muerte celular (medida por la exclusion de yoduro de propidio) o apoptosis (medida por el Ensayo TUNEL), pero redujo significativamente la proliferacion (medida por inmunofluorescencia Ki67) de celulas GBM en respuesta a mitogenos. La FIGURA 12A muestra graficamente los efectos de BMP-4 en cultivos de GBM (las columnas vadas son cultivos de control, las columnas negras son tratadas con BMP-4, media ± SE, n = 3; * p, 0,005; PI = yoduro de propidio).

Los efectos de otras BMP sobre la proliferacion tambien se analizaron. Vea la FIGURA 15 que muestra los efectos de otras BMP (100 ng/ml) en el crecimiento de las celulas GBM. BMP-2,-4,-5,-6,-7,-8b inhiben el crecimiento celular, mientras que BMP1,-3 y-3b parecen ser ineficaces, similares a TGFp1 y 2 y a TGFp1.2 (un polipeptido agonista de TGFpquimerico) (todos a 100 ng/ml), que tambien fueron ineficaces. * p <0,005 BMP versus control, media ± SE n = 3, prueba t de Student de dos colas; **p <0,001 BMP4 versus control, media ± SE n = 3, prueba t de Student de dos colas. Por lo tanto, BMP-2,-4,-5,-6,-7,-8b tambien seran utiles en los metodos y composiciones de la descripcion, particularmente para el tratamiento de GBM.

El efecto antiproliferativo de BMP-4 fue corroborado por el analisis del ciclo celular, que muestra un aumento significativo en el numero de celulas GBM en la fase G0/G1 y una disminucion en el porcentaje de celulas en la fase S en respuesta a BMP-4. A diferencia de BMP4, los TGFp hallados en las celulas Gb M (Kjellman et al., Int J Cancer 89, 251-8 (2000)), usando vfas de senalizacion que se superponen con las de las BMP (Canalis et al., Endocr Rev 2, 218-35 (2003);Golestaneh et al, Oncogene 24, 5722-30 (2005)) y que provoca efectos pro o antimicoticos (Jennings et al., J Neurooncol 36, 123-40 (1998)) no afectaron la proliferacion de celulas GBM, subyacente a la especificidad de las acciones de BMP4 descriptas en la presente.

Dos ensayos clasicos, uno que determina el mdice clonogenico, que mide el porcentaje de precursores neuronales formadores de clones (Gritti et al., J Neurosci 16, 1091-100 (1996); Reynolds et al., Dev Biol 175, 1-13 (1996)) y un segundo que proporciona una medicion de la expansion del tamano de la mezcla de NSC sobre la base de los datos de cinetica de crecimiento (Galli et al., Development 129, 1633-44 (2002); Reynolds et al., Nat Methods 2, 333-6 (2005))-confirmaron que el efecto citostatico de BMP-4 incidfa sobre la poblacion de tNSC en celulas GBM. Una exposicion de 48 horas a BMP-4 produjo una reduccion superior a 70% en el mdice clonogenico (% de clones formados en relacion con las celulas totales sembradas) en celulas GBM, in vitro (ver la FIGURA 12B que muestra graficamente el mdice clonogenico para control y las celulas GBM tratadas con BMP-4, tanto disociadas completamente como cultivadas, media ± SE, n = 3; * p <0,005). Ademas, la exposicion de las celulas GBM a BMP-4 poco despues del aislamiento del especimen de tumor primario anulo su capacidad de experimentar expansion en cultivo, mientras que la adicion de b MP4 a celulas GBM que ya se estaban expandiendo in vitro, disminuyo en gran medida su tasa de crecimiento. Ver la FIGURA 12C que representa graficamente la propagacion de celulas GBM in vitro usando el Ensayo de neuroesfera, que revela que las celulas del tejido de GBM disociadas completamente no se pueden subcultivar en serie en presencia de BMP-4 (lmea de puntos negra y triangulo negro lleno). La FIGURA 12C tambien muestra que despues de una breve expansion bajo las mismas condiciones (rombos) las celulas del mismo tejido disociadas completamente que se trataron con BMP-4 tambien mostraron una reduccion significativa en la pendiente de su curva de crecimiento (cuadrados). Se observo un efecto similar para las NSCs fetales humanas tratadas con BMP4 (ver FIGURA 12C, estrellas negras (control) versus drculos negros (BMP-4)), mientras que las lmeas de glioma humano U87 (que no portan BMPR) no fueron afectadas (ver la FIGURA 12C, triangulos abiertos, control versus cruces (BMP-4)).

El analisis citofluorimetrico mostro que el tratamiento con BMP4 dio como resultado un tamano de casi mitad de la poblacion de CD133+ (ver la FIGURa 12A), tanto en celulas GBM disociadas completamente como cultivadas. En conjunto, estos datos indican que BMP-4 se puede dirigir a la poblacion de tNSC en celulas GBM.

La exposicion de las celulas GBM a BMP-4 dio como resultado cambios morfologicos evidentes, in vitro. En relacion con las celulas cultivadas solo con mitogenos, las celulas que recibieron tambien BMP4 adoptaron una morfologfa mas diferenciada (plana, fase oscura, con procesos elaborados). Ver la FIGURA 13A que muestra las celdas de control y la FIGURA 13B que muestra las celulas despues de una exposicion de 48 horas a BMP-4. En consecuencia, se observo un aumento considerable en la expresion de marcadores astrogliales (inmunorreactividad GFAP [IR]), junto con un aumento menos intenso de la marcacion para marcadores neuronales (pIII-tubulina y MAP5) u oligodendrogliales (GalC). Ver la FIGURA 13C-H. Espedficamente, la FIGURA 13C (control) y la FIGURA 13D (BMP-4) muestran GFAP-IR; La FIGURA 13E (control) y la FIGURA 13F (BMP-4) muestran pIII-tubulina IR; La FIGURA 13G (control) y la FIGURA 13H (BMP-4) muestran GalC IR.

La cuantificacion del efecto de BMP4 mediante el recuento del numero de celulas que expresan marcadores de diferenciacion espedficos fue diffcil debido a la expresion aberrante de antigenos neuronales y gliales en cultivos de GBM que proliferan indiferenciados y dentro de la misma celula dos fenomenos que no se observan en las celulas madre neurales normales. Por lo tanto, el analisis citofluorimetrico se uso para medir la intensidad de senal de fluorescencia y descubrio que, en relacion con el control, los cultivos tratados con BMP-4 exhidan un aumento mayor que dos veces de GFAP-IR (ver FIGURA 13I) y un aumento consistente, aunque no significativo en la inmunorreactividad de pIII-tubulina (FIGURA 13J) y GalC (FIGURA 13K) (MEFF = moleculas de fluorescema equivalente; MEFE = moleculas de ficoeritrina equivalente).

Sin estar limitado por teona o hipotesis, se cree que los efectos actualmente descriptos de BMP-4 se producen ya sea a traves de una reduccion en el numero de divisiones simetricas que producen dos hijas identicas que son, ellas mismas tNSC, o una diferenciacion de una fraccion de los tNSC de modo que ya no sean capaces de retener las propiedades de las celulas madre. En conjunto, esto sugiere que BMP-4 puede anular la estimulacion mitogenica, imponer la adquisicion de un fenotipo mas maduro y menos tumorigenico por tNSC. Este efecto es inesperado porque b MP-4 ejerce un efecto anti-diferenciacion en las celulas ES humanas, lo que aumenta la mezcla de celulas madre y la tasa de expansion.

Ejemplo 21: BMP-4 inhibe el potencial tumorigenico de GBSCs y se puede suministrar in vivo

Las celulas CD133+ GBM tanto precisamente disociadas como cultivadas se expusieron a BMP-4 durante 48 horas en cultivo, antes de la inyeccion unilateral, intraestriatal (3 x 105 celulas viables) en ratones scid/bg inmunodeficientes. La formacion y la expansion del tumor se compararon con aquellas de los animales de control que recidan celulas G mantenidos en condiciones identicas, pero sin BMP-4.

Todos los animales que recibieron celulas de GBM no tratadas desarrollaron masas tumorales bien establecidas en el lado inyectado (ver la FIGURA 14A). Mostraban caractensticos rasgos de glioblastoma, incluyendo marcada atipia nuclear, expresion de elementos gliales aberrantes, extensa neovascularizacion y alta actividad mitotica (Galli et al. Cancer Res 64, 7011-21 (2004)) e invadieron los ventnculos lateral, tercero y cuarto. Por el contrario, las celulas tratadas con BMP4 no formaron tumores invasivos, pero pequenas lesiones delimitadas, que se confinaron al sitio de inyeccion, teman un bajo mdice mitotico y no mostraban una invasion ventricular (ver la FIGURA 14B). Entre tres y cuatro meses despues de la inyeccion, todos los animales de control murieron, mientras que virtualmente todos los ratones que recibieron celulas pretratadas con BMP-4 sobrevivieron (ver la FIGURA 14J que representa la supervivencia graficamente en paradigmas de pretratamiento (panel izquierdo), cotratamiento (panel central) y postratamiento (panel derecho) (ensayo de Logrank, p < 0,001, p < 0,001 y p < 0,005, respectivamente). Se observaron identicos resultados cuando se purifo la fraccion residual de CD 133+ de cultivos de GBM tratados con BMP-4 por FACS y su tumorigenicidad se comparo con aquella de una cantidad igual (1,5 x 105 celulas CD133+/animal) de celulas CD133+ purificadas de celulas GBM de control. Ademas, como se mostro previamente (Galli et al. Cancer Res 64, 7011-21 (2004); Singh et al., Nature 432, 396-401 (2004)), siempre era posible recultivar tNSCs CD133+ (frecuencia clonogencia promedio: 9,0 ± 1,3% [n = 2, 90 dfas despues del trasplante]) del cerebro de ratones que recidan celulas GBM de control precisamente disociadas. Cuando se retrasplantan en el cerebro de ratones scid/bg por via intracerebral, dan origen a grandes tumores secundarios. Por el contrario, nunca fue posible cuando los animales recidan celulas GBM pretratadas con BMP-4 en el trasplante primario, ni fuera posible establecer tumores secundarios por inyeccion directa de 3 x 105 celulas, que se disociaron en forma precisa de los tumores primarios de estos mismos ratones.

Tomados juntos, estos hallazgos demuestran que incluso la exposicion transitoria a BMP-4 agota la poblacion de GBM tNSC y produce una prominente reduccion de la capacidad de inicio de tumores in vivo de las celulas GBM. Ver tambien el Ejemplo 13.

Ejemplo 22: Suministro in vivo de BMP-4 evita el establecimiento y el crecimiento de tumores intercerebrales

El suministro in vivo de BMP-4 se evaluo luego como un tratamiento para prevenir el establecimiento y el crecimiento tumoral intercerebral. El trasplante de GBM fue acompanado por inyeccion de perlas poliacnlicas saturadas con portador (control) o BMP-4 (liberando BMP-4 durante 1 semana), en el sitio del injerto de las celulas, ya sea al mismo tiempo que las celulas (paradigma de cotratamiento) o diez dfas despues (paradigma de postratamiento). La reconstruccion serial histologica en ambos tratamientos revelo una reduccion significativa en la maxima extension de la masa tumoral en los animales tratados con BMP-4 versus los controles. Espedficamente, en todas las configuraciones experimentales, los animales que recidan las perlas de control desarrollaron grandes tumores malignos (FIGURA 14C (celulas GBM cultivadas, 4 semanas posinyeccion, paradigma de cotratamiento); FIGURA 14E (celulas GBM reden aisladas, 30 dfas despues de la inyeccion celular, paradigma de postratamiento) y murieron pronto (FIGURA 14J), mientras que los ratones implantados con perlas liberadoras de BMP4 mostraron pequenas lesiones confinadas (FIGURA 14D (celulas GBM cultivadas, 4 semanas posinyeccion, paradigma de cotratamiento); FIGURA 14F (celulas GBM recien aisladas, 30 dfas despues de la inyeccion celular, paradigma de postratamiento); y sobrevivieron significativamente mas tiempo (FIGURa 14J). Los tumores de control conternan elementos pleomorficos, altamente neoplasicos, con cromatina reactiva y celulas infiltrantes muy malignas (FIGURA 14G). Por el contrario, los animales tratados con BMP-4 mostraban lesiones que incorporaban pequenas lesiones neoplasicas, muchos elementos muy diferenciados y numerosos macrofagos (FIGURA 14H). El mdice mitotico era significativamente mayor en controles respecto a los animales tratados con BMP-4 (cotratamiento: control 3,8 ± 0,2 versus BMP-40,20 ±0,1; p < 0,01. Postratamiento: control 4,3 ± 0,3 versus BMP-40,7 ± 0,3; p < 0,05. Media ± SE, n = 4, prueba t de Student de dos colas). La inmunofluorescencia in vivo revelo la presencia de astrocitos y celulas positivas en nestina, pero no celulas oligodendrogliales o neuronales, tanto en tumores tratados con control y con BMP-4.

Estos resultados indican que el implante intracerebral de un dispositivo que libera o suministra de otro modo BMP-4 seran eficaces en el tratamiento de GBM en humanos.

Ejemplo 23: Estudios de anticuerpos de BMP-4 neutralizantes

El Ejemplo 19 muestra que BMP-4 endogena y otras BMPs se hallan en celulas GBM. De acuerdo con los hallazgos presentados en los ejemplos anteriores, los anticuerpos anti-BMP4 neutralizantes incrementan la proliferacion de fNSC. Esto sugiere que las BMPs endogenas pueden actuar fisiologicamente en celulas GBM in vivo, a pesar de que sus efectos son insuficientes para detener el crecimiento del tumor. El estudio de los mecanismos detras de este fenomeno, por ejemplo, la presencia posible de antagonistas de BMP endogenas en el tumor (Canalis et al., Endocr Rev 2, 218-35 (2003)), puede apuntar a estrategias alternativas para la cura de GBMs. Ademas, BMPs, sus receptores cognados y sus mecanismos de transduccion intracelular asociada, en particular la via Smad, emergen como un blanco promisorio para terapias dirigidas mas espedficamente a las celulas principalmente responsables del establecimiento y la expansion de GBM.

Ejemplo 24: Cultivo primario, propagacion de cultivo, clonacion y establecimiento de lmea celular

Se obtuvieron celulas GBM por procesamiento de muestras tumorales como se describe por Galli et al., Cancer Research (2004) 64: 7011-7021. Las celulas precisamente disociadas se clasificaron respecto de su inmunorreactividad por CD133 (ver mas abajo) y se plaquearon en matraces de cultivo tisular de 25 cm2 a una densidad final de 2500 celulas/cm2 en medio libre de suero NeuroCult® NS-A (Stem Cell Technologies). La propagacion del cultivo, ensayo clonogenico y analisis de la poblacion se llevaron a cabo usando las mismas condiciones descritas previamente por Galli et al., Development 129, 1633-44 (2002). Para el pretratamiento de celulas CD133+ GBM precisamente disociadas con BMP4, se plaquearon en el mismo medio carente de mitogenos (control) o con contenido de 100 ng/ml de BMP4 durante 48 horas antes del trasplante.

Ejemplo 25: Inmunocitoqmmica

2,5 x 104 celulas/cm2 de celulas GBM se plaquearon en cubreobjetos de vidrio recubiertos con Matrigel en presencia de FGF2/EGF y se trataron con BMP4 (100 ng/ml) durante 48 h. Las celulas luego se lavaron y se fijaron en 4% de paraformaldehndo (10 minutos). Se llevo a cabo una multiple inmunofluorescencia para antfgenos neurales (GFAP, Dako Corporation; Tuj1, Babco; Gale, Chemicon) como describen Galli et al., Cancer Research (2004) 64: 7011- 7021. La tincion con Ki67 (1:1000, NovoCastra, Newcastle, RU) detecto celulas proliferantes.

Despues de fijar en 4% de paraformaldehndo, la inmunotincion para BMPR-1A, -1B y -2 se llevo a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (1:50 R&D Systems). Cuando se terna para phospho-Smad 1 (1:100 Cell Signaling, Beverly, MA), las celulas se trataron con BMP-4 (100 ng/ml) en diferentes momentos (de 5 minutos a 2 horas). Los controles isotfpicos o negativos apropiados siempre se inclrnan en estos procedimientos. Las celulas apoptoticas se detectaron usando una modificacion a base de digoxigenina del metodo original TUNEL introducido por Gavrieli et al., J Cell Biol 119, 493-501 (1992) usando el ensayo TUNEL de fluorescema-dUTP (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein, Roche Applied Science). Brevemente, las celulas cultivadas en cubreobjetos de 12 mm se fijaron en 4% de paraformaldetndo durante 10 min a temperatura ambiente y luego se enjuagaron en PBS. Las celulas luego se permeabilizaron durante 2 min en hielo antes de rotular con 50 ul de mezcla de reaccion TUNEL y se incubaron a 37 °C durante 1 hora en una camara humidificada bajo cubreobjetos de parafilm. Despues de lavar con PBS, los cubreobjetos se montaron en Vectashield™ con contenido de DAPI y se examinaron con microscopio de fluorescencia. Para tincion con yoduro de propidio (PI), las celulas se fijaron en 4% de paraformaldehndo durante 10 min a temperatura ambiente, se enjuagaron en PBS y se incubaron con PI (1 ug/ml) durante 5 min a temperatura ambiente. Despues de lavar, los cubreobjetos se montaron en Vectashield™ con contenido de DAPI y se analizaron con microscopio de fluorescencia. La exclusion de PI mostro celulas viables. Para los ensayos en el Ejemplo 19, se ejecutaron muestras en seis replicaciones para cada condicion ensayada.

Ejemplo 26: PCR convencional y en tiempo real

El ARN total se aislo de celulas GBM cultivadas y precisamente disociadas usando reactivo TRIzol (Life Technologies, Rockville, MD) y se transcribieron inversamente usando Superscript RNAse H-Reverse Transcriptase (Life Technologies). Las cantidades de cADN usado como plantillas en las reacciones convencionales de PCR se normalizaron con referencia a la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Las lmeas celulares MCF-7 se usaron como controles positivos para BMPRs. Los productos de PCR se visualizaron por electroforesis en geles de agarosa (1%) tenidos con bromuro de etidio.

Se corrieron reacciones cuantitativas de RT-PCR por triplicado usando Brilliant® SYBR® Green QPCR Core Reagent Kit (Stratagene, La Jolla, CA). La tintura SYBR Green se une con cualquier producto de PCR y, por ello, no requiere del uso de sondas espedficas de secuencias. La emision fluorescente se registro en tiempo real (Chromo 4 Four-Color Real-Time PCR Detector, MJ Research, Bio-Rad). El perfilado de la expresion genica se completo usando el metodo comparativo de Ct de cuantificacion relativa. Las cantidades de ARN relativas normalizaron a dos controles endogenos, GAPDH y 18S ARN ribosomal (18S rARN).

Para la PCR convencional, se usaron los siguientes cebadores: BMP4, directo: 5'- cttcagtctggggaggag-3', inverso: 5'-gatgaggtgcccaggcac-3'; BMPR1A, directo: 5'-aatggagtaaccttagcaccagag-3', inverso: 5'-agctgagtccaggaacctgtac-3'; BMPR1B, directo: 5'-ggttgcctgtggtcacttctgg-3', inverso: 5'-tagtctgtgattaggtacaactgg-3', BMPR2, directo: 5'-tcagatatatggcaccagaagtg-3', inverso: 5'-gtggagaggctggtgacacttg-3'; GAPDH, directo: 5'-cggagtcaacggatttggtcgtat-3', inverso: 5'-agccttctccatggtggtgaagac-3'. Las condiciones de amplificacion de PCR consistfan en 35 ciclos con cebadores que se fusionaban a 56 °C.

Para la RT-PCR, se usaron los siguientes cebadores: BMPR1A, directo: 5'-caggttcctggactcagctc-3', inverso: 5'-ctttccttgggtgccataaa-3'; BMPR1B, directo: 5'-aaaggtcgctatggggaagt-3', inverso: 5'-gcagcaatgaaacccaaaat-3'; BMPR2, directo: 5'-gctaaaatttggcagcaagc-3', inverso: 5'-cttgggccctatgtgtcact-3'; GAPDH: se usaron los mismos cebadores que los descritos para la PCR convencional; 18S rARN, directo: 5'-agtccctgccctttgtacaca-3', inverso: 5'-gatccgagggcctcactaaac-3'. La especificidad de los cebadores se confirmo para cada corrida de PCR por analisis de la curva de disociacion (Opticon®2 y Chromo4™ Real-Time System Software, MJ Research). Las condiciones de amplificacion por RT-PCR consistfan en 40 ciclos con cebadores que se funden a 56 °C.

Ejemplo 27: Transferencia Western

Las protemas se cultivaron por lavado de celulas GBM cultivadas y precisamente disociadas en PBS fno y lisado con 500 |jl de 1X tampon de muestra (62,5 mM de Tris HCl, pH 6,8 a 25 °C; 2% p/v de SDS; 10% de glicerol; 50 mM de DTT; 0,01% p/v de azul de bromofenol). Las muestras se incubaron en hielo y se almacenaron a -20 °C. Las almuotas se hirvieron durante 5 minutos, se incubaron en hielo y se cargaron 20 jl/carril en gel de SDS-PAGE (10 cm x 10 cm). Las protemas se transfirieron luego a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en 5% de leche en polvo / 0,1% de Tween en TBS durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces con 15 ml de TBS/0,1% de Tween. Las transferencias se incubaron luego con anti-Smad 1-5-8 (1:1000; Cell Signaling), anti-fosfo Smad1-5-8 (1:1000; Cell Signaling), anti-Smad4 (1: 200; Santa Cruz), anti-BMP4 (1:400, Chemicon) en 5% de leche en polvo / 0,1% de Tween en TBS. Para todas las transferencias, las membranas se lavaron 3 veces con 15 ml de TBS / 0,1% de Tween y luego se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con rabano picante apropiado (1:1000, Amersham) en 5% de leche en polvo / 0,1% de Tween en TBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia (ECL; Amersham).

Ejemplo 28: Citometria de flujo

Para determinar el estado de fosforilacion de p38 y Smad 1-5-8, las preparaciones celulares se centrifugaron y se resuspendieron en 0,5 ml de PBS y 0,5 ml de 4% de paraformaldetndo durante 10 min a 37 °C. Las celulas GBM se permeabilizaron luego por adicion lenta de 100% de metanol helado a las celulas preenfriadas mientras se sometfa moderadamente a vortex, dando una concentracion final del 90% de metanol. Despues de la incubacion durante 30 min a 4 ° C y centrifugacion, las celulas se lavaron dos veces con 3 ml de 0,5% de albumina de suero bovino (BSA, Sigma) en PBS, se resuspendieron en 150 j l de PBS y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente. Despues de incubar, se expusieron a una dilucion 1:50 de anticuerpo policlonal de conejo anti-fosfo Smad 1-5-8 (Cell Signaling) o 1:50 de anticuerpo policlonal de conejo de fosfo-p38 MAP quinasa (Cell Signaling) durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Despues de extensos lavados, se añ uandaió dilucion 1:800 de anticuerpo rotulado con Ig FITC de cabra anti-conejo (BD, Pharmingen) y cada tubo se incubo durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Despues de dos lavados con 3 ml de 0,5% de BSA (Sigma) en celulas PBS se resuspendieron en 0,5 ml de PBS y se analizaron por citometna de flujo. Los controles de autofluorescencia y de isotipo se ejecutaron de modo rutinario para tos estos ensayos.

Para analisis del ciclo celular, se trato 1 millon de celulas GBM cultivadas y precisamente disociadas/muestra con BMP4 (100 ng/ml) durante el tiempo indicado. Las celulas GBM se resuspendieron luego en volumenes iguales de PBS helado y 100% de etanol y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Despues de centrifugar, el pellet celular se lavo 3 X con PBS y se centrifugo durante 5 minutos. Las celulas GBM se incubaron luego durante la noche en la oscuridad en 1 ml de ARNAsa con contenido de PBS (12,5 ug /ml; Sigma) y yoduro de propidio (3 ug/ml; Sigma) y se analizaron por citometna de flujo.

Para la cuantificacion de la expresion de CD133, se realizo una citometna de flujo de doble tincion, usando 7-amino actinomicina D (7AAD) para identificar celulas viables. Despues de lavar en PBS, las celulas GBM se resuspendieron en tampon de rotulacion 7AAD (0,1 M de tampon de fosfato-citrato con contenido de 0,15 M de NaCl, 5 mM de EDTA, 0,5% de BSA y 0,004% de saponina, pH 6,0) antes de anadir 7AAD en una concentracion final de 20 pM como se describe porToba et al., J Immunol Methods 182,193-207 (1995). Despues de la incubacion de 7AAD durante 5-7 min, las celulas GBM se incubaron con anticuerpo conjugado monoclonal CD133/1 (CD133)-PE (1:40, Miltenyi Biotec) durante 30 min a 4 °C y se lavaron con 1 ml de medio de cultivo. Las celulas se centrifugaron luego a 500 x g durante 5 min, se resuspendieron en 0,5 ml de medio de cultivo y se analizaron por citometna de flujo. El mismo analisis tambien se realizo usando otro anticuerpo conjugado monoclonal CD133/2 (293C3)-PE, para dar identicos resultados.

La clasificacion de las celulas GBM (MoFlo High Performance Cell Sorter, DakoCytomation) se llevo a cabo usando la misma dilucion de anticuerpos conjugados CD133/1 (CD133)-PE y CD133/2 (293C3)-PE. Como se describe por Singh et al. (Nature (2004) 432:396-401), las celulas clasificadas se analizaron respecto de la pureza por citometna de flujo con una maquina FACSCalibur (BD Biosciences) empleando los mismos anticuerpos. La pureza era de al menos el 87% para las fracciones tanto positiva como negativa de CD133.

Para la cuantificacion de protema acida fibrilar glial (GFAP), pIII-tubulina y galactocerebrosida C (GalC, tambien a veces mencionada como “GC”), se uso una mezcla de partfculas de calibracion en arcoms (8 picos), 3,0-3,4 um (BD Biosciences) para la calibracion y la intensidad de rotulacion celular se expreso como moleculas de ficoeritrina equivalente (MEPE) o moleculas de fluorescema equivalente (MEFL). Brevemente, para la tincion intracelular se permeabilizaron las celulas en solucion de 0,5 ml de Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) a temperatura ambiente durante 20 min. Las celulas se lavaron con 2 ml de BD Perm/Wash 1X (BD Biosciences) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Despues de centrifugar, se resuspendieron en 0,2 ml de solucion BD Perm/Wash 1X (BD Biosciences) que contema la mzcla apropiada de anticuerpo primario. Para los antfgenos de membrana, las celulas se resuspendieron en 0,2 ml de medio de cultivo y luego se incubaron durante 30 min a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: 1:400 anti-GFAP policlonal (Dako Corporation), anti-pIII-tubulina monoclonal (Babco) y anti-galC monoclonal (Chemicon). Las celulas luego se lavaron y se expusieron durante 30 min a 4 °C al anticuerpo secundario. En el caso de antfgenos intracelulares, era 1:800 anticuerpo rotulado con Ig FITC de cabra anticonejo o anticuerpo rotulado con IgG R-PE de cabra antirraton (BD, Pharmingen), mientras que para los antfgenos de membrana se usaron 1:1000 de IgM antirraton de cabra F(ab')2 conjugado con FITC o IgM antirraton de cabra conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch). Despues de un extenso lavado, las celulas se resuspendieron y se analizaron por citometna de flujo.

Para todos los ensayos anteriores, los analisis se llevaron a cabo por citometna de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences) usando software CellQuest (BD Biosciences). La fluorescencia de fondo se estimo sustituyendo los anticuerpos primarios espedficos con controles isotfpicos espedficos. La medicion de la autofluorescencia tambien se realizo por rutina para cada condicion ensayada.

Ejemplo 29: Evaluacion de la tumorigenicidad por inyeccion ortotopica e inmunohistoquimica

La tumorigenicidad se determino por trasplante ortotopico de celulas GBM ya sea crecidas en condiciones de control o con la ulterior adicion de 100 ng/ml de BMP-4 durante 48 horas. Antes del trasplante, las celulas se lavaron y se resuspendieron en PBS (108 celulas/ml). Tres microlitros se inyectaron estereotacticamente en el striatum derecho de ratones inmunodeficientes como se describio previamente en Galli et al., Cancer Research (2004) 64: 7011-7021. El suministro a base de polfmeros de BMP-4 se llevo a cabo usando perlas acnlicas de heparina cargadas con BMP-4 (100 perlas/animal; Sigma-Aldrich). Antes del trasplante, las perlas se incubaron durante 1 hora a 37 °C en PBS solo o con contenido de 0,65 pg/pl de BMP4 y se enjuagaron bien 2X3 veces con PBS antes de la implantacion. La tincion con hematoxilina y eosina y la inmunohistoqmmica se realizaron en secciones microtomales de 4 um de espesor incluidas en parafina, procesadas como se describio previamente por Galli et al., Cancer Res 64, 7011- 21 (2004).

Se realizo un grafico con pendiente descendente de la probabilidad acumulativa (eje y) de supervivencia durante penodos de tiempo (eje x) usando el software MedCalc (Mariakerke, Belgica). Se determinaron significativas diferencias en la supervivencia mediante el ensayo de Longrank.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeutica de una preparacion de protema de factor inhibidor de la leucemia (LIF) para usar en un metodo de tratamiento de un tumor de glioblastoma multiforme (GBM), en donde el potencial tumorigenico de celulas madre neurales tumorales en el tumor GBM se inhibe irreversiblemente.

2. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde la preparacion de LIF comprende el factor inhibidor de la leucemia (LIF) humano de longitud total o un fragmento del factor inhibidor de la leucemia (LIF) humano de longitud total que retiene una capacidad para atenuar la proliferacion celular excesiva.

3. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde el metodo de tratamiento comprende poner en contacto el tumor GMB con la composicion farmaceutica que comprende la preparacion de LIF.

4. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde la cantidad terapeutica reduce la probabilidad de una celula madre tumoral o celula progenitora tumoral sometida a division simetrica.

5. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde un aumento en la senalizacion mediada por LIFR

(a) da como resultado la modulacion de una o mas propiedades de celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales que incluyen las propiedades de supervivencia, autorrenovacion, proliferacion, division simetrica o diferenciacion; o

(b) da como resultado la alteracion de la probabilidad de division simetrica o reduccion de la frecuencia del ciclo celular exhibido por celulas madre tumorales proliferantes y celulas progenitoras tumorales, llevando a una reduccion de las cantidades de celulas madre tumorales y celulas progenitoras tumorales.

6. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde la composicion tiene un efecto de prodiferenciacion sobre las celulas madre neurales tumorales y, por lo tanto, reduce de forma permanente el pool de celulas madre neurales tumorales sin lograr la viabilidad celular o producir apoptosis.

7. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde el suministro de la preparacion de LIF es por implante intracerebral, infusion intracerebroventricular (ICV) y/o difusion mejorada por conveccion (CED).

8. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde la composicion farmaceutica esta asociada con perlas polimericas u obleas polimericas impregnadas con la preparacion de LIF.

9. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde la composicion comprende una cantidad terapeutica de una quimioterapia seleccionada del grupo que consiste en carmustina, cisplatino, paclitaxol, temozolomida, PCV (procarbazina, lomustina y vincristina) e IL13-PE38QQR.

10. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde la preparacion de LIF contiene una variante de LIF humano que retiene la capacidad de atenuar la proliferacion celular excesiva.

11. La composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 1, en donde la preparacion de factor inhibidor de la leucemia (LIF) comprende ademas BMP-2 humano.