CN113597315A

CN113597315A - 用于治疗和预防神经胶质瘤的药剂、脑肿瘤恶性程度标志物、脑肿瘤预后标志物、确定脑肿瘤恶性程度和预后的方法以及抑制肿瘤增殖的抗体

Info

Publication number: CN113597315A
Application number: CN201980092527.2A
Authority: CN
Inventors: 宫园浩平; 田边谅; 森川真大; C-H·赫尔丁; B·维斯特马克; 玉田耕治
Original assignee: University of Tokyo NUC; Yamaguchi University NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC; Yamaguchi University NUC
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-11-02
Also published as: EP3936149A4; EP3936149A1; WO2020138503A1; JPWO2020138503A1; US20220105122A1; JP7457331B2

Abstract

本发明的目的是提供用于治疗或预防神经胶质瘤的新型药剂，提供脑肿瘤恶性程度标志物和脑肿瘤预后标志物，以及提供用于确定脑肿瘤恶性程度的方法以及确定脑肿瘤患者预后的方法。根据本发明，提供的是包括HVEM抑制剂作为有效成分的用于治疗和预防神经胶质瘤的药剂；脑肿瘤恶性程度标志物和脑肿瘤预后标志物，各自包含HVEM蛋白或HVEM基因；以及用于确定脑肿瘤恶性程度的方法和用于确定脑肿瘤患者预后的方法，各自包括测量受试者生物样本中的HVEM表达量的步骤。

Description

用于治疗和预防神经胶质瘤的药剂、脑肿瘤恶性程度标志物、脑肿瘤预后标志物、确定脑肿瘤恶性程度和预后的方法以及抑制肿瘤增殖的抗体

相关申请的交叉引用

本申请享有在先日本专利申请第2018-248465号(提交于：2018年12月28日)的优先权权益，其全部公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于治疗或预防神经胶质瘤的药剂。本发明还涉及脑肿瘤恶性程度标志物和脑肿瘤预后标志物，以及一种用于确定脑肿瘤恶性程度的方法和一种用于确定脑肿瘤预后的方法。本发明还涉及抑制肿瘤生长的抗体。

背景技术

日本原发性脑肿瘤的发生频率估计为约每年20,000人(2010年的患病率为每100,000人有130.8人)，且已知神经胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、神经鞘瘤和颅咽管瘤被称为所谓的五种主要脑肿瘤。脑肿瘤一般通过外科肿瘤切除术治疗，但在恶性脑肿瘤的情况下，进行多学科治疗，其中抗癌药物、放射治疗等进一步与这种外科肿瘤切除术相结合。治疗效果取决于第一次手术能切除多少肿瘤，据报道，在恶性肿瘤的情况下，除非整个肿瘤的95％至98％或更多被切除，否则生命预后与只切除一半肿瘤时没有太大区别。此外，据称在脑肿瘤中，恶性脑肿瘤发展为恶性程度更高的脑肿瘤的概率很高。

多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，下文有时称为“GBM”)是成人中最常见和最恶性形式的恶性脑肿瘤。尽管手术、放射治疗和化学治疗取得了进步，但胶质母细胞瘤患者的预后仍然很差，中位生存时间少于15个月。根据癌症基因组图谱(TheCancerGenome Atlas，TCGA)数据集鉴定的基因组畸变，胶质母细胞瘤被分类为原神经、神经、经典和间充质亚型。胶质母细胞瘤细胞的高度增殖特性是由于几种信号通路的变化，包括致癌基因和抑瘤基因。

骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，以下简称“BMP”)是TGF-β超家族成员，据报道包括BMP-2、BMP-4和BMP-7的BMP亚家族成员可诱导分化、细胞周期停滞和胶质母细胞瘤细胞凋亡。迄今为止，在胶质母细胞瘤中鉴定的BMP靶标基因含有大量的细胞内信号分子(非专利文献1)。

参考文献列表

非专利文献

非专利文献1：Savary K et al.,Oncogene,32:5409-5420(2013)

发明内容

在这样的技术背景下，本发明人发现BMP-4诱导胶质母细胞瘤起始细胞(GIC)的生长停滞和分化，此外，特定胶质母细胞瘤细胞中的HVEM表达被BMP-4抑制。本发明人还发现HVEM表达在成人脑肿瘤中的多形性胶质母细胞瘤中优先增加，并且HVEM在GBM的四种亚型中的间充质亚型中表达最高。本发明人还发现，间充质亚型细胞培养物中HVEM表达的抑制导致减少的细胞增殖和神经球形成，并且将具有抑制的HVEM表达的间充质亚型细胞颅内注射到小鼠中降低了致瘤性并延长了小鼠的存活时间。本发明人还发现HVEM的过表达增强了胶质母细胞瘤细胞的增殖和细胞培养中的神经球形成，并且颅内注射细胞缩短了小鼠的存活时间。此外，本发明人已经发现，向颅内和原位移植有表达HVEM的鼠神经胶质瘤GL261细胞的小鼠腹膜内施用抗小鼠HVEM抗体降低致瘤性并延长小鼠的存活时间。本发明人还发现，在GBM中，未被报道作为HVEM的配体的APRIL的表达高，而已知的HVEM配体的表达低。本发明人还发现，间充质亚型细胞培养物中APRIL表达的抑制减弱了细胞增殖和神经球形成。本发明人还发现APRIL通过共培养表达HVEM的细胞和表达APRIL的细胞将信号转导至HVEM。此外，本发明人已经发现在羊驼中制备的抗人HVEM抗体抑制间充质亚型细胞的增殖。本发明基于这样的发现。

本发明的一个目的是提供一种用于治疗或预防神经胶质瘤的新药剂。本发明的另一个目的是提供一种脑肿瘤恶性程度标志物和一种脑肿瘤预后标志物。本发明的又一个目的是提供一种用于确定脑肿瘤恶性程度的方法和一种用于确定脑肿瘤患者预后的方法。本发明的又一个目的是提供一种抑制肿瘤生长的新型抗体。

根据本发明，提供以下发明。

[1]一种用于治疗或预防神经胶质瘤的药剂，其包含HVEM抑制剂作为有效成分。

[2]根据[1]所述的药剂，其中所述神经胶质瘤是少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤中的任一种。

[3]根据[2]所述的药剂，其中所述多形性胶质母细胞瘤属于原神经亚型、神经亚型、经典亚型和间充质亚型中的任一种。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的药剂，其中所述HVEM抑制剂是针对HVEM的抗体或核酸。

[5]根据[4]所述的药剂，其中针对HVEM的抗体是抑制HVEM与配体之间的结合的抗体。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的药剂，其中所述神经胶质瘤是HVEM表达依赖性神经胶质瘤或HVEM配体依赖性神经胶质瘤。

[7]根据[5]或[6]所述的药剂，其中所述配体是APRIL。

[8]根据[1]至[7]中任一项所述的药剂，其用于施用于受试者，该受试者的HVEM表达量超过健康受试者中的HVEM表达量或正常组织样本中的HVEM表达量。

[9]一种脑肿瘤恶性程度标志物或脑肿瘤预后标志物，每个由HVEM蛋白或HVEM基因组成。

[10]一种用于确定脑肿瘤恶性程度的方法，所述方法包括测量受试者生物样本中HVEM表达量的步骤。

[11]根据[10]所述的方法，其中如果所述受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本中或正常组织样本中的HVEM表达量，则表明所述生物样本含有高度恶性的肿瘤细胞群。

[12]根据[10]所述的方法，其中如果所述受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本中或正常组织样本中的HVEM表达量，则表明所述受试者患有高度恶性脑瘤。

[13]一种用于确定脑肿瘤患者的预后的方法，所述方法包括测量受试者生物样本中HVEM表达量的步骤。

[14]根据[13]所述的方法，其中如果所述受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本中或正常组织样本中的HVEM表达量，则表明所述受试者的预后差。

[15]一种免疫球蛋白单一可变结构域，其以小于80nM的EC50值与HVEM结合，并抑制肿瘤生长。

[16]根据[15]所述的免疫球蛋白单一可变结构域，其包含互补决定区1至3(CDR1、CDR2和CDR3)，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)：

(i)CDRl包含由SEQ ID NO：36表示的氨基酸序列，CDR2包含由SEQ ID NO：37表示的氨基酸序列，且CDR3包含由SEQ ID NO：38表示的氨基酸序列；

(ii)CDRl包含由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列，CDR2包含由SEQ ID NO：40表示的氨基酸序列，且CDR3包含由SEQ ID NO：41表示的氨基酸序列；

(iii)CDRl包含由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列，CDR2包含由SEQ ID NO：43表示的氨基酸序列，且CDR3包含由SEQ ID NO：44表示的氨基酸序列；

(iv)CDRl包含由SEQ ID NO：45表示的氨基酸序列，CDR2包含由SEQ ID NO：46表示的氨基酸序列，且CDR3包含由SEQ ID NO：47表示的氨基酸序列；

(v)CDRl包含由SEQ ID NO：48表示的氨基酸序列，CDR2包含由SEQ ID NO：49表示的氨基酸序列，且CDR3包含由SEQ ID NO：50表示的氨基酸序列；

(vi)CDRl包含由SEQ ID NO：51表示的氨基酸序列，CDR2包含由SEQ ID NO：52表示的氨基酸序列，且CDR3包含由SEQ ID NO：53表示的氨基酸序列；或

(vii)CDRl包含由SEQ ID NO：54表示的氨基酸序列，CDR2包含由SEQ ID NO：55表示的氨基酸序列，且CDR3包含由SEQ ID NO：56表示的氨基酸序列。

[17]根据[16]所述的免疫球蛋白单一可变结构域，其包含框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如下(viii)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)或(xiv)；

(viii)FR1包含由SEQ ID NO：57表示的氨基酸序列，FR2包含由SEQ ID NO：58表示的氨基酸序列，FR3包含由SEQ ID NO：59表示的氨基酸序列，且FR4包含由SEQ ID NO：60表示的氨基酸序列；

(ix)FR1包含由SEQ ID NO：61表示的氨基酸序列，FR2包含由SEQ ID NO：62表示的氨基酸序列，FR3包含由SEQ ID NO：63表示的氨基酸序列，且FR4包含由SEQ ID NO：64表示的氨基酸序列；

(x)FR1包含由SEQ ID NO：65表示的氨基酸序列，FR2包含由SEQ ID NO：66表示的氨基酸序列，FR3包含由SEQ ID NO：67表示的氨基酸序列，且FR4包含由SEQ ID NO：68表示的氨基酸序列；

(xi)FR1包含由SEQ ID NO：69表示的氨基酸序列，FR2包含由SEQ ID NO：70表示的氨基酸序列，FR3包含由SEQ ID NO：71表示的氨基酸序列，且FR4包含由SEQ ID NO：72表示的氨基酸序列；

(xii)FR1包含由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列，FR2包含由SEQ ID NO：74表示的氨基酸序列，FR3包含由SEQ ID NO：75表示的氨基酸序列，且FR4包含由SEQ ID NO：76表示的氨基酸序列；

(xiii)FR1包含由SEQ ID NO：77表示的氨基酸序列，FR2包含由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列，FR3包含由SEQ ID NO：79表示的氨基酸序列，且FR4包含由SEQ ID NO：80表示的氨基酸序列；或

(xiv)FR1包含由SEQ ID NO：81表示的氨基酸序列，FR2包含由SEQ ID NO：82表示的氨基酸序列，FR3包含由SEQ ID NO：83表示的氨基酸序列，且FR4包含由SEQ ID NO：84表示的氨基酸序列。

[18]根据[15]所述的免疫球蛋白单一可变结构域，其包含以下多肽(xv)、(xvi)或(xvii)：

(xv)具有SEQ ID NO：29至35中任一个的氨基酸序列的多肽；

(xvi)包含与SEQ ID NO：29至35中任一个的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列且具有HVEM结合能力和肿瘤生长抑制能力的多肽；或

(xvii)包含其中一个或多个氨基酸被删除、替换、插入和/或添加到SEQ ID NO：29至35中任一个的氨基酸序列中且具有HVEM结合能力和肿瘤生长抑制能力的氨基酸序列的多肽。

[19]一种抗体或免疫球蛋白单一可变结构域多聚体，其各自包含根据[15]至[18]中任一项所述的免疫球蛋白单一可变结构域。

[20]一种多核苷酸，其编码根据[15]至[18]中任一项所述的免疫球蛋白单一可变结构域或根据[19]所述的抗体或多聚体。

[21]一种药物组合物，其包含根据[15]至[18]中任一项所述的免疫球蛋白单一可变结构域或根据[19]所述的抗体或多聚体。

[22]根据[21]所述的药物组合物，其用于治疗或预防神经胶质瘤。

[23]一种用于降低发展成神经胶质瘤的风险的药剂和用于降低发展成神经胶质瘤的风险的组合物，各自包含HVEM抑制剂作为有效成分。

[24]一种用于改善脑肿瘤治疗中的预后的药剂和用于改善脑肿瘤治疗中的预后的组合物，各自包含HVEM抑制剂作为有效成分。

[25]一种用于治疗或预防神经胶质瘤的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的HVEM抑制剂的步骤。

[26]一种用于治疗神经胶质瘤的方法，包括以下步骤：进行[10]至[12]中任一项所述的脑肿瘤恶性的判定方法；和向确定患有或极有可能患有高度恶性脑瘤的受试者(或确定患有或极有可能患有神经胶质瘤的受试者)施用有效量的抗癌剂(尤其是HVEM抑制剂)。

在本说明书中，根据上述[1]、上述[23]和上述[24]所述的药剂有时被称为“本发明的药剂”，以及根据上述[1]、上述[23]和上述[24]所述的组合物有时被称为“本发明的组合物”。

根据本发明，可以提供用于治疗或预防被认为是脑肿瘤中相对频繁发生的且难以治愈的疾病的神经胶质瘤的新药剂，以及用于确定脑肿瘤恶性的手段和脑肿瘤患者的预后。在脑肿瘤中，神经胶质瘤(尤其是多形性胶质母细胞瘤)是恶性程度最高、预后最差的恶性肿瘤之一，且手术、放射疗法或化学疗法均未取得足够的治疗效果。因此，本发明的优势在于它可以为包括神经胶质瘤的恶性脑肿瘤提供一种新的治疗策略。

附图说明

图1a为显示实施例1中BMP信号传导对GBM细胞的抑制作用的图表。在存在或不存在30ng/mL的重组人BMP-4的情况下测量GBM细胞(U3024MG、U3031MG和U3054MG)的生长曲线。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；用于细胞增殖测定的双尾未配对Student’s t检验)。

图1b为显示实施例1中BMP信号传导对GBM细胞的抑制作用的图表。在存在或不存在30ng/mL的重组人BMP-4的情况下测量GBM细胞(U3024MG、U3031MG和U3054MG)的球形成。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；球形成测定的双向方差分析)。

图2为显示实施例2中用BMP-4处理的GBM细胞中HVEM的定量RT-PCR分析的图表。

图3a为显示实施例3中HVEM的表达水平在恶性脑肿瘤中升高的图表。TCGA数据集中的正常脑和脑肿瘤组织中HVEM的表达水平(**P<0.01，***P<0.001；带Bonferroni校正的双尾Kruskal-Wallis检验)。

图3b是显示实施例3中HVEM的表达水平在恶性脑肿瘤中升高并与脑肿瘤患者预后相关的图表。TCGA数据集中脑肿瘤患者的Kaplan-Meier图。低恶性神经胶质瘤包括少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤和星形细胞瘤。根据HVEM表达水平将患者平均分为两组。

图3c和3d是显示实施例3中HVEM的表达水平在恶性脑肿瘤中升高并与脑肿瘤患者预后相关的图表。TCGA数据集中的GBM亚型中HVEM的表达水平(**P<0.01，***P<0.001；带Bonferroni校正的双尾Kruskal-Wallis检验)。(d)通过定量RT-PCR确定人神经干细胞(hNSC)和人GBM细胞四种亚型中HVEM的表达水平。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复)。根据Affymetrix GeneChip人外显子1.0ST阵列(Xie Y et al.,EBioMedicine,2：1351:-63 2015)。

图4a是显示在实施例4中的间充质亚型细胞(U3024MG、U3031MG和U3054MG)中慢病毒介导的shRNA敲低HVEM时HVEM的定量RT-PCR分析的图表。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复)。

图4b是显示在实施例4中，HVEM的阻断抑制细胞培养物中的间充质亚型细胞增殖的图表。表达HVEM shRNA或对照shRNA的间充质亚型细胞的生长曲线。数据表示为平均值±SD(对于细胞增殖测定，n＝4生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；用于细胞增殖测定的带Bonferroni校正的双尾未配对Student’s t检验)。

图4c是显示在实施例4中，HVEM的阻断抑制细胞培养物中的间充质亚型细胞的神经球形成的图表。表达HVEM shRNA或对照shRNA的间充质亚型细胞的球形成。数据表示为平均值±SD(球形成测定n＝3个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；用于球形成测定的带Bonferroni校正的双向方差分析)。

图4d为显示实施例4中抗人HVEM抗体对间充质亚型细胞增殖的影响的图表。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复；**P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；双尾未配对Student’s或韦尔奇t检验)。

图5a是显示在实施例5中，HVEM的沉默减弱间充质亚型细胞的体内致瘤活性的图表。通过体内生物发光成像系统在小鼠头骨中表达shRNA和萤火虫荧光素酶的间充质亚型细胞的图像。移植后15周观察由原位移植到小鼠头部的表达萤火虫荧光素酶的GBM细胞组成的肿瘤的发光强度。对于U3031 MG细胞，实验中各使用8只小鼠。小鼠头部以黑色显示的区域是由GBM细胞组成的肿瘤，其中心的白色区域是发射强度(每秒计数；cps)(约8,000至38,000cps)比外围部分高的部分。

图5a也是显示在实施例5中，HVEM的沉默减弱间充质亚型细胞的体内致瘤活性的图表。通过体内生物发光成像系统在小鼠头骨中表达shRNA和萤火虫荧光素酶的间充质亚型细胞的图像。移植后15周观察由原位移植到小鼠头部的表达萤火虫荧光素酶的GBM细胞组成的肿瘤的发光强度。对于U3054MG细胞，实验中各使用四只小鼠。小鼠头部以黑色显示的区域是由GBM细胞组成的肿瘤，其中心的白色区域是发射强度(每秒计数；cps)(约800至3,800cps)比外周部分高的部分。

图5b是显示在实施例5中，HVEM的沉默减弱间充质亚型细胞的体内致瘤活性的图表。具有衍生自表达shRNA的间充质亚型细胞的肿瘤的小鼠的生存曲线(U3031MG每组n＝8，U3054MG每组n＝4；*P<0.05，***P<0.001；带有Bonferroni校正的双尾对数秩检验)。

图6a为显示实施例6中异位HVEM促进非间充质亚型细胞增殖的图表。表达HVEM或EGFP(对照)的非间充质亚型细胞的生长曲线。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；双尾未配对Student’s t检验)。

图6b为显示实施例6中异位HVEM促进非间充质亚型细胞神经球形成的图表。表达HVEM或EGFP(对照)的非间充质亚型细胞的球形成。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；双尾未配对Student’s t检验)。

图7a是显示异位HVEM增强实施例6中非间充质亚型细胞的体内致瘤活性的图表。通过体内生物发光成像系统的表达EGFP或HVEM的非间充质亚型细胞(U3047MG)在小鼠颅骨中增殖的图像。移植后7周观察由原位移植到小鼠头部的表达萤火虫荧光素酶的非间充质亚型细胞和EGFP或HVEM组成的肿瘤的发光强度。实验中各使用六只小鼠。小鼠头部以黑色显示IDE区域是由GBM细胞组成的肿瘤，其内部中白色区域是发光强度高于外周部分的发光强度的部分(约10,000至40,000cps)，以及在其中心以黑色进一步发现的区域是具有进一步更高发光强度(约40,000cps或更高)的部分。

图7b显示了实施例6中具有衍生自表达EGFP或HVEM的非间充质亚型细胞(U3047MG)的肿瘤的小鼠的存活曲线(n＝6只小鼠/组；***P<0.001；双尾对数秩检验)。

图8a和8b是显示实施例7中鼠神经胶质瘤细胞的体内进展需要的VEM的图表。(a)HVEM在鼠神经胶质瘤GL261细胞株中的表达水平。Gl261细胞在含胎牛血清的分化培养基或无血清干细胞培养基中培养。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复；***P<0.001；双尾未配对Student’s t检验)。(b)C57BL/6J小鼠脑中表达HVEM或对照shRNA的GL261细胞的颅内增殖。EGFP和shRNA同时被慢病毒转导到GL261细胞中。对小鼠脑组织进行苏木精和伊红(H&E)染色或EGFP的生物发光成像。

图8c是显示实施例7中鼠神经胶质瘤细胞的体内进展需要的HVEM的图表。上图显示了小鼠神经胶质瘤细胞GL261颅内原位移植后25天的脑组织苏木精和伊红染色。下图显示了抗HVEM抗体施用组和对照组中具有GL261衍生肿瘤的C57BL/6J小鼠的存活曲线(每组n＝6只小鼠；**P<0.01；双尾对数秩检验)。GL261细胞颅内注射后5天，每5天将抗小鼠HVEM抗体或同种型对照抗体腹膜内注射到小鼠内。

图9a和9b是显示实施例8中脑肿瘤中HVEM配体的表达的图表。(a)TCGA数据集中正常脑组织和脑肿瘤中HVEM配体和APRIL的表达水平(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns：不显著(P>0.05)；双尾Kruskal-Wallis检验)。(b)通过夹心ELISA测量的来自HGCC资源的hNSC和GBM细胞中LTA、LIGHT和APRIL的表达水平。

图10a、b和c是显示实施例9中shRNA对APRIL敲低的影响的图表。(a)显示在间充质亚型细胞(U3054MG)中慢病毒介导的shRNA敲低APRIL时APRIL的定量RT-PCR分析的图表。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复)。(b)显示APRIL的阻断抑制细胞培养物中的间充质亚型细胞增殖的图表。表达APRIL shRNA或对照shRNA的间充质亚型细胞的生长曲线。数据表示为平均值±SD(对于细胞增殖测定n＝3个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；双尾未配对Student’s t检验)。(c)显示APRIL的阻断抑制细胞培养物中的间充质亚型细胞的神经球形成的图表。表达APRIL shRNA或对照shRNA的间充质亚型细胞的球形成。数据表示为平均值±SD(对于球形成测定n＝3个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；双尾未配对Student’s t检验)。

图10d和e是显示实施例9中APRIL抑制的影响的图表。(d)显示抗人APRIL抗体对间充质亚型细胞增殖的影响的图表。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；双尾未配对Student’s t检验)。(e)显示抗人APRIL抗体对非间充质亚型细胞增殖的影响的图表。数据表示为平均值±SD(n＝3个生物学重复)。

图10f是显示实施例9中间充质亚型细胞中APRIL受体的表达的图表。(a)TCGA数据集中正常脑组织和脑肿瘤中APRIL(BCMA和TACI)和HVEM已知受体的表达水平(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns：不显著(P>0.05)；双尾Kruskal-Wallis检验)。

图11为显示实施例10中APRIL转导HVEM信号的图表。(a)表达HVEM的HEK293T细胞与表达可溶性配体(APRIL、LIGHT或SALM5)的HEK293T细胞共培养。数据显示为表达HVEM或对照载体的HEK293T细胞中NF-κB相对活性的平均值±SD。(b)表达HVEM或对照载体的HEK293T细胞由APRIL或SALM5-Fc嵌合体刺激。数据显示为NF-κB相对活性的平均值±SD。

图12是显示实施例11中基因组编辑对HVEM基因敲除(KO)的影响的图表。(a)显示人HVEM基因敲除在细胞培养物中抑制间充质亚型细胞增殖的图表。数据表示为平均值±SD(对于细胞增殖测定n＝4个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；带有Bonferroni校正的双尾未配对Student’s t检验)。(b)显示人HVEM基因敲除在细胞培养物中抑制间充质亚型细胞神经球形成的图表。数据表示为平均值±SD(对于细胞增殖测定n＝3个生物学重复；**P<0.01，***P<0.001；带有Bonferroni校正的双向方差分析)。(c)显示小鼠HVEM基因(Tnfrsf14)敲除在细胞培养物中抑制细胞增殖的图表。数据表示为平均值±SD(n＝3；*P<0.01，**P<0.01，***P<0.001；带有Bonferroni校正的双尾未配对Student’s t检验)。

图13是显示实施例12中使用人HVEM蛋白为抗原的羊驼衍生的VHH抗体的可变区的氨基酸序列的图表。CDR代表互补决定区，FR代表框架区。

图14为显示实施例12中抗人HVEM抗体对间充质亚型细胞增殖的影响的图表。数据表示为平均值±SD(n＝2个生物学重复)。

具体实施方式

用于治疗或预防神经胶质瘤的药剂

本发明的药剂和组合物各自包含HVEM抑制剂作为有效成分。如本文所用，“HVEM”是疱疹病毒进入介体(Herpes Virus mediator)的缩写，是指属于TNF/NGF受体超家族的I型跨膜蛋白。HVEM也称为TNFRSF14(tumor necrosis factor(TNF)receptor superfamilymember 14，肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员14)、CD270、LIGHTR或ATAR。即，本发明中的“HVEM”与“HVEM/TNFRSF14”同义。

HVEM在多种组织和细胞上表达，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突细胞、造血细胞和非造血细胞(实质细胞)(Pasero C et al.,CurrOpinPharmacol.,12:478-4852012))。已知多种配体与HVEM结合，包括TNF相关细胞因子，例如LIGHT和LTα，以及非TNF相关细胞因子，例如BTLA、CD160和SALM5。

本发明中，人HVEM基因基于HGNC:11912公开的碱基序列，小鼠HVEM基因基于MGI:2675303公开的碱基序列。此外，在本发明中，人HVEM蛋白基于GenBank登录号NP_003811.2中公布的氨基酸序列，而小鼠HVEM蛋白基于GenBank登录号NP_849262.1中公布的氨基酸序列。此外，在本发明中，人HVEM的mRNA基于GenBank登录号NM_003820.3，小鼠HVEM的mRNA基于GenBank登录号NM_178931.2。

在本发明中，HVEM抑制剂以包括抑制HVEM表达的物质和抑制HVEM功能的物质的含义使用。抑制HVEM表达的物质的实例包括针对HVEM的核酸(例如，靶向HVEM的核酸，例如反义核酸、siRNA、shRNA、微小RNA、gRNA和核酶)。抑制HVEM功能的物质，除了与HVEM相互作用以抑制功能的物质以外，还可以是例如抑制HVEM与配体的结合的物质，其实例包括抗体和适体。

APRIL被指定为HVEM的配体。由于通过HVEM从APRIL的信号转导被证实促进肿瘤(特别是高度恶性的脑肿瘤，例如神经胶质瘤)的形成，如下面的实施例所示，因此抑制HVEM和APRIL之间的结合的物质可用于有效地抑制肿瘤的形成。如本文所用，“APRIL”是“增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand)”的缩写，也称为TNFSF13(肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员13)。即，本发明中的“APRIL”与“APRIL/TNFSF13”同义。

反义核酸是与靶序列互补的核酸。反义核酸可以抑制靶标基因的表达，例如通过三链形成抑制转录起始、通过与RNA聚合酶局部形成开环结构的位点的杂交形成抑制转录、通过与正在合成的RNA的杂交形成抑制转录、通过在内含子和外显子之间的连接点的杂交形成抑制剪接、通过与剪接体形成位点的杂交形成抑制剪接、通过与mRNA的杂交形成抑制从细胞核迁移到细胞质、通过具有加帽位点和聚(A)添加位点的杂交形成抑制剪接、通过具有翻译起始因子结合位点的杂交形成抑制翻译起始、通过在起始密码子附近具有核糖体结合位点的杂交形成抑制翻译、通过与mRNA的翻译区或多核糖体结合位点的杂交形成抑制肽链延长、通过与核酸-蛋白质相互作用位点的杂交形成抑制基因表达等。

抗HVEM的反义核酸是指例如与选自上述HVEM基因序列、编码上述HVEM氨基酸序列的碱基序列和上述HVEM的mRNA序列的某些碱基序列互补的单链核酸。核酸可以是天然存在的核酸或人工核酸，并且可以基于DNA或RNA。反义核酸的长度通常为约15个碱基至约mRNA的全长，优选约15个碱基至约30个碱基。反义核酸的互补性不一定必须是100％，并且可以使得反义核酸可以在体内与编码HVEM的DNA或RNA互补结合。

siRNA(小干扰RNA)是人工合成的低分子量双链RNA，其用于通过RNA干扰(mRNA的降解)进行基因沉默，其以包括siRNA表达载体的含义使用，siRNA表达载体可以提供体内双链RNA。引入到细胞中的siRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。该复合物结合并切割具有与siRNA互补的序列的mRNA，从而使得可以序列特异性地抑制基因表达。siRNA可以通过使用DNA/RNA自动合成仪合成有义链和反义链寡核苷酸中的每一个，并在适当的退火缓冲液中在90至95℃下约1分钟使寡核苷酸变性，然后在30至70℃下将变性的寡核苷酸退火约1至8小时来制备。siRNA的长度优选为19至27个碱基对，更优选为21至25个碱基对，或21至23个碱基对。

可以根据其碱基序列设计针对HVEM的siRNA，以引起从HVEM基因转录的mRNA的降解(RNA干扰)。抑制HVEM表达的siRNA的实例包括靶向上述HVEM的mRNA序列的siRNA。

shRNA(短发夹RNA)是人工合成的发夹型RNA序列，用于通过RNA干扰(mRNA降解)进行基因沉默。shRNA可以通过载体导入细胞并通过U6启动子或H1启动子表达，或者可以通过使用DNA/RNA自动合成仪合成具有shRNA序列的寡核苷酸并通过与siRNA相同的方法使寡核苷酸自我退火来制备。引入细胞中的siRNA的发夹结构被切割成siRNA，其与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。该复合物结合并切割具有与siRNA互补的序列的mRNA，从而使得可以序列特异性地抑制基因表达。

可以根据其碱基序列设计针对HVEM的shRNA，以引起从HVEM基因转录的mRNA的降解(RNA干扰)。抑制HVEM表达的shRNA的实例包括靶向上述HVEM的mRNA序列的shRNA。

miRNA(微小RNA)是基因组编码的功能性核酸，经过多步生产过程，最终成为约20个碱基的微小RNA。miRNA被归类为功能性ncRNA(非编码RNA：不翻译成蛋白质的RNA的总称)，在生命现象中起着调节其他基因表达的重要作用。在本发明中，通过载体将具有特定碱基序列的miRNA导入细胞中，将细胞施用于活体，可以抑制HVEM基因的表达。

gRNA(引导RNA)是一种用于基因组编辑技术的RNA分子。在基因组编辑技术中，gRNA特异性识别靶序列，引导Cas9蛋白与靶序列结合，实现基因敲除和敲入。在本发明中，通过将靶向HVEM基因的gRNA施用于活体，可以在体内抑制HVEM基因的表达。gRNA以包括sgRNA(单一引导RNA)的含义使用。在基因组编辑技术中设计gRNA的方法是众所周知的，可以通过参考，例如，Benchmarking CRISPR on-target sgRNA design,Yan et al.,BriefBioinform,15Feb 2017进行适当设计。

核酶是具有催化活性的RNA。虽然一些核酶具有多种活性，但对作为切割RNA的酶的核酶的研究使得设计用于RNA位点特异性切割的目的的核酶成为可能。核酶的大小可以为400个或更多的核苷酸，例如RNase P中包含的I组内含子型或M1RNA，或者可以是具有约40个核苷酸的大小的核酶，其称为锤头型或发夹型。

适体包括核酸适体和肽适体。本发明所用的核酸适体和肽适体可以通过体外分子进化法获得，即在体外形成文库分子与靶分子的复合物，然后基于亲和力筛选它们，其通常以SELEX法(通过指数富集的配体系统进化)或mRNA展示方法为代表。

反义核酸、siRNA、shRNA、miRNA、核酶和核酸适体可包括各种化学修饰以提高稳定性和活性。例如，为了防止水解酶如核酸酶的降解，它们的磷酸残基可以被化学修饰的磷酸残基替换，如硫代磷酸酯(PS)、甲基膦酸酯和连二硫代磷酸酯。或者，它们的至少一部分可由核酸类似物如肽核酸(PNA)组成。

抗HVEM的抗体是指与HVEM特异性结合并在结合后抑制HVEM功能的抗体。在本发明中，任何单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、骆驼抗体、抗体片段(例如，Fab、Fv、Fab'、F(ab’)₂和ScFv)等可以用作抗体，并且这些抗体可以根据本领域技术人员已知的技术制备。可用的抗HVEM抗体包括本发明的免疫球蛋白单可变结构域、本发明的抗体和本发明的免疫球蛋白单可变结构域多聚体，这将在后面描述。

可以根据用于制造抗体或抗血清的已知方法，通过使用HVEM蛋白或其一部分作为抗原来制造针对HVEM的抗体。HVEM蛋白或其一部分可以通过已知的蛋白表达方法和纯化方法制备。HVEM蛋白质的实例包括但不限于由上述HVEM的序列信息定义的人HVEM。衍生自各种生物体的HVEM蛋白可用作免疫原。可用于本发明的抗HVEM的抗体也可通过噬菌体展示方法制备(参见，例如，FEBS Letter,441:20-24(1998))。

本发明的药剂和组合物旨在用于治疗或预防神经胶质瘤。如本文所用，“神经胶质瘤”是从脑实质神经外胚层组织发展而来的肿瘤的总称，占原发性颅内肿瘤的30％至40％，是最常见的脑肿瘤。神经胶质瘤的实例包括少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。“多形性胶质母细胞瘤”，也称为胶质母细胞瘤或间变性神经胶质瘤，是一种主要由衍生自星状细胞的未分化细胞组成的神经胶质瘤。多形性胶质母细胞瘤表现出明显的核多形性，并发现坏死和血管内皮生长。多形性胶质母细胞瘤生长迅速，浸润广泛，并且通常在成人大脑中形成。据报道，多形性胶质母细胞瘤分为四种亚型：原神经型、神经型、经典型和间充质型(Verhaak RG et al.,Cancer Cell,17:98-110(2010))。如下文实施例中所示，HVEM在间充质亚型的多形性胶质母细胞瘤中高度表达，因此本发明的药剂和组合物可优选用于降低发展成神经胶质瘤的风险，如下文所述(尤其是间充质亚型的多形性胶质母细胞瘤)，除了多形性胶质母细胞瘤(尤其是间充质亚型的多形性胶质母细胞瘤)的治疗和预防之外。

如以下实施例中所预防的，可以通过抑制多形性胶质母细胞瘤细胞中的HVEM表达和HVEM的功能来抑制多形性胶质母细胞瘤细胞的增殖和神经球形成。此外，观察到经由HVEM来自APRIL的信号转导促进高度恶性脑肿瘤(如神经胶质瘤)的形成。因此，作为本发明的有效成分的HVEM抑制剂，可以施用给HVEM表达量超过健康受试者的HVEM表达量或正常组织样本，特别是其中HVEM在大脑中高度表达的脑肿瘤患者的HVEM表达量的受试者(例如脑肿瘤患者)。此外，用于本发明的治疗和预防的靶标可以是HVEM表达依赖性神经胶质瘤或HVEM配体依赖性神经胶质瘤。受试者是否高度表达HVEM，神经胶质瘤是否为HVEM依赖性，以及神经胶质瘤是否为HVEM配体依赖性，可以例如，对于在对脑肿瘤患者上进行的脑部手术期间切除的脑组织进行评估，并且其细节可根据将在下面描述的本发明的测定方法和将在实施例中描述的程序进行确定。

本发明的药剂和组合物也可以施用给有患神经胶质瘤(尤其是多形性胶质母细胞瘤)风险的受试者，从而降低形成神经胶质瘤的风险。如本文所用，“处于形成神经胶质瘤风险的受试者”是指没有注意到神经胶质瘤的症状或未被诊断为患有神经胶质瘤但有在未来发展为神经胶质瘤的危险的受试者。受试者的实例包括尚未被诊断为患有神经胶质瘤的脑肿瘤患者和已接受脑肿瘤组织切除术的脑肿瘤患者。另外，“降低形成神经胶质瘤的风险”是指降低形成神经胶质瘤的概率，并且通过降低形成神经胶质瘤的概率可以改善恶性脑肿瘤的预后。

即，根据本发明的另一方面，提供了用于降低形成神经胶质瘤的风险的药剂和用于降低形成神经胶质瘤的风险的组合物，各自包含HVEM抑制剂作为有效成分，并且还提供了用于改善恶性脑肿瘤治疗中的预后的药剂和用于改善脑肿瘤治疗中的预后的组合物，各自包含HVEM抑制剂作为有效成分。

本发明的药剂和组合物可以作为药物产品或药物组合物提供。本发明的药物产品和药物组合物各自包含HVEM抑制剂和药学上可接受的载体。本发明的药物产品和药物组合物还包括用于基因疗法的药物产品和药物组合物。此类药物产品和药物组合物包含靶向HVEM的核酸，例如反义核酸、siRNA、shRNA、微小RNA、gRNA或核酶作为有效成分。

本发明的药物产品和药物组合物可以包含除HVEM抑制剂之外的有效成分，或者可以与除HVEM抑制剂之外的有效成分或包含该有效成分的药物产品或药物组合物组合使用。除HVEM抑制剂之外的有效成分的实例包括抗癌剂(尤其是用于治疗恶性脑肿瘤的抗癌剂)。

当将作为本发明的有效成分的HVEM抑制剂施用给受试者时，施用途径不受特别限制，只要可获得治疗或预防神经胶质瘤(尤其是多形性胶质母细胞瘤)的效果，但是优选肠胃外施用(例如，静脉内施用、局部施用(包括使用导管的局部施用)、皮下施用或腹腔施用)。

作为用于肠胃外施用的制剂，可以根据具体的施用形式选择合适的剂型，其实例包括注射剂和栓剂。这些制剂可以使用药学上可接受的载体通过本领域常用的技术(例如，日本药典，第15版，关于制剂的一般规定，中描述的已知方法)来制备。药学上可接受的载体包括赋形剂、粘结剂、稀释剂、添加剂、香料、缓冲剂、增稠剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂和防腐剂。

本发明中HVEM抑制剂的剂量可以根据有效成分的种类、施用HVEM抑制剂的受试者的性别、年龄和体重、症状、剂型、施用途径等来确定。在本发明中，当施用HVEM抑制剂用于治疗或预防神经胶质瘤(尤其是多形性胶质母细胞瘤)的目的时，可以确定成人的HVEM抑制剂的单剂量，例如在0.0001mg至1000mg/kg体重的范围内，但不限于此。成人的HVEM抑制剂的每日剂量可以根据有效成分的种类、施用HVEM抑制剂的受试者的性别、年龄和体重、症状、剂型、施用途径等来确定。例如，有效成分的剂量可以每天一次或分成2至4份施用。本发明的药剂和组合物不仅可以施用于有此需要的人，还可以施用于非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊和猴子)。

脑肿瘤恶性程度标志物和脑肿瘤预后标志物

如将在以下实施例中描述的，显示HVEM的高表达与脑肿瘤相关，尤其是属于间充质亚型的多形性胶质母细胞瘤，并且HVEM的高表达与胶质母细胞瘤患者的不良预后相关。也证实了HVEM的过表达促进了多形性胶质母细胞瘤细胞的增殖、神经球形成和体内肿瘤生长。因此，根据本发明，提供了由HVEM蛋白或HVEM基因组成的脑肿瘤恶性程度标志物和由HVEM蛋白或HVEM基因组成的脑肿瘤预后标志物。本发明的脑肿瘤恶性程度标志物可用于判断脑肿瘤患者的脑肿瘤恶性程度，也可用于判断神经胶质瘤(尤其是多形性胶质母细胞瘤)。本发明的脑肿瘤预后标志物可用于预测或估计脑肿瘤患者治疗中脑肿瘤患者的预后。因此，本发明的这些标志物可用作确定脑肿瘤治疗策略的指标。

为了在人类患者的诊断中使用本发明的标志物，HVEM蛋白或HVEM基因优选衍生自人类。进一步地，在本发明的标志物中，HVEM基因可以是由HVEM基因的基因组序列组成的DNA，也可以是HVEM基因的mRNA或HVEM基因的mRNA逆转录得到的cDNA。本发明的标志物可以根据本发明的脑肿瘤恶性程度判断方法和本发明脑肿瘤患者预后判断方法实施。

确定脑肿瘤恶性程度和预后的方法

根据本发明的另一方面，提供了一种确定脑肿瘤恶性程度的方法，该方法包括测量受试者(尤其是脑肿瘤患者)的生物样本中HVEM表达量的步骤。

在本发明中，“生物样本”是指从活体分离的样本，其实例包括在脑外科手术期间切除的脑组织。

在本发明的恶性程度判断方法中，首先进行步骤(A)：测量被检测的受试者的生物体样本中的HVEM表达量。HVEM表达量可以通过公知的方法在体外测量。

例如，可以基于HVEM蛋白的表达量来测量生物样本中的HVEM表达量。在这种情况下，HVEM蛋白的表达量可以通过使用HVEM蛋白的特异性结合物质的已知检测手段来测量，并且可以通过例如ELISA、Western印迹、免疫组织化学染色等来测量。HVEM蛋白的特异性结合物质的实例包括抗体，并且可以使用针对本发明的药剂和组合物以及本发明的抗体描述的那些。

还可以基于HVEM基因的表达量来测量生物样本中的HVEM表达量。此时，HVEM基因的表达量可以通过诸如RT-PCR、定量RT-PCR、DNA微阵列分析、Northern印迹等公知的方法测量。HVEM基因的表达量的测量中使用的探针和引物组可以参照后述的实施例基于上述HVEM基因的序列信息来制备。

在本发明的恶性程度的判断方法中，还可以进一步进行基于步骤(A)中测量的HVEM表达量来判断生物样本中所含肿瘤细胞恶性程度的步骤。本步骤中，当受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本或正常组织样本(优选具有显著差异)中的HVEM表达量时，表明生物样本包含高度恶性的肿瘤细胞群(例如，神经胶质瘤细胞，尤其是多形性胶质母细胞瘤细胞)。即，本发明的恶性程度判断方法还可以包括步骤(B1)，当受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本或正常组织样本(优选具有显著差异)中的HVEM表达量时，确定生物样本含有高度恶性的肿瘤细胞群。

在本发明的恶性程度判断方法中，还可以进行基于步骤(A)中测量的HVEM表达量来判断采集生物样本的受试者的脑肿瘤恶性程度的步骤。在该步骤中，如果受试者生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本或正常组织样本(优选地具有显著差异)中的HVEM表达量，则表明受试者患有高度恶性的脑肿瘤(例如，神经胶质瘤，尤其是多形性胶质母细胞瘤)。即，本发明的恶性程度判断方法还可以包括步骤(B2)，当受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本或正常组织样本(优选具有显著差异)中的HVEM表达量时，确定受试者患有高度恶性的脑肿瘤。

在本发明中，健康受试者的生物样本或正常组织样本(截断值)中的HVEM表达量可以是通过测量从多个健康受试者初步采集的生物样本中或者在从多个受试者(包括脑肿瘤患者)初步采集的正常组织中的HVEM表达量计算的平均值，或者可以是根据以下等式(1)计算的值。

截断值＝(健康受试者生物样本或正常组织样本中的HVEM表达量的平均值)±k×(健康受试者生物样本或正常组织样本中的HVEM表达量的标准偏差)...等式(1)

其中k为0至3的常数，优选k＝1至3，且特别地可为2。

根据本发明的恶性程度判断方法，可以在待测生物样本中检测出高度恶性的肿瘤细胞群，例如神经胶质瘤细胞。根据本发明的恶性程度判断方法，可以在受试者中检测到高度恶性的脑组织，例如神经胶质瘤。因此，本发明的恶性程度判断方法是有用的，在于该方法为判定脑肿瘤的治疗策略提供了材料。即，本发明的恶性程度判断方法可以辅助用于神经胶质瘤(尤其是多形性胶质母细胞瘤)的诊断和/或鉴别，最终由医生结合其他发现判断受试者是否患有神经胶质瘤。

根据本发明的另一方面，提供了一种确定脑肿瘤患者的的预后方法，该方法包括测量受试者(尤其是脑肿瘤患者)的生物样本中HVEM表达量的步骤。

在本发明的预后的判断方法中，首先进行步骤(C)：测量被检测的受试者的生物体样本中的HVEM表达量。HVEM表达量可以与本发明的恶性程度的判断方法相同的方式测量。

在本发明的预后的判断方法中，还可以进行基于步骤(C)中测量的HVEM表达量来判断采集生物样本的受试者的预后的步骤。在该步骤中，如果受试者生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本或正常组织样本(优选地具有显著差异)中的HVEM表达量，则表明受试者具有不良预后。即，本发明的恶性程度判断方法还可以包括步骤(D)，当受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本或正常组织样本(优选具有显著差异)中的HVEM表达量时，确定受试者具有不良预后。健康受试者的生物样本或正常组织样本(截断值)中的HVEM表达量可以是通过测量从多个健康受试者初步采集的生物样本中或者在从多个受试者(包括脑肿瘤患者)初步采集的正常组织中的HVEM表达量计算的平均值，或者可以是根据上述等式(1)计算的值。另外，在本发明的恶性程度判断方法中，不良预后是指规定时间段内的存活率较低，且存在很高的发展高度恶性的脑肿瘤(例如，神经胶质瘤，特别是，多形性胶质母细胞瘤)的概率。

本发明的预后判断方法可用于预测或估计脑肿瘤治疗中脑肿瘤患者的预后。因此，本发明的预后判断方法是有用的，在于该方法为判定脑肿瘤的治疗策略提供了材料。即，本发明的预后判断方法可以辅助用于神经胶质瘤(尤其是多形性胶质母细胞瘤)的诊断和/或鉴别，最终由医生结合其他发现判断受试者的预后是不良还是良好。

单一可变结构域和抗体

根据本发明，提供了特异性结合HVEM并抑制肿瘤生长(尤其是恶性肿瘤细胞增殖)的免疫球蛋白单一可变结构域。本发明的单一可变结构域可以小于80nM的EC50值结合HVEM。

本发明的单一可变结构域可能特征在于互补决定区1至3(CDR1、CDR2和CDR3)，并且CDR1、CDR2和CDR3可以通过选自上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)的CDR1、CDR2和CDR3的组合来鉴定。

本发明的单一可变结构域还可以框架区1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)为特征，且FR1、FR2、FR3和FR4可以通过选自上述(viii)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)和(xiv)的FR1、FR2、FR3和FR4的组合来鉴定。本发明的单一可变结构域可由互补决定区1至3和框架区1至4鉴定，并且在这种情况下，本发明的单一可变结构域可由从N端侧按此顺序连接的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4组成。

当本发明的单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3为上述组合(i)时，上述组合(viii)可以选择为FR1、FR2、FR3和FR4的组合。当本发明的单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3为上述组合(ii)时，上述组合(ix)可以选择为FR1、FR2、FR3和FR4的组合。当本发明的单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3为上述组合(iii)时，上述组合(x)可以选择为FR1、FR2、FR3和FR4的组合。当本发明的单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3为上述组合(iv)时，上述组合(xi)可以选择为FR1、FR2、FR3和FR4的组合。当本发明的单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3为上述组合(v)时，上述组合(xii)可以选择为FR1、FR2、FR3和FR4的组合。当本发明的单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3为上述组合(vi)时，上述组合(xiii)可以选择为FR1、FR2、FR3和FR4的组合。当本发明的单一可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3为上述组合(vii)时，上述组合(xiv)可以选择为FR1、FR2、FR3和FR4的组合。

本发明的单一可变结构域也可以通过实施例中测序的单一可变结构域(上述多肽(xv))来鉴定，但是，在本发明中，除此之外，与上述多肽(xv)基本上相同的多肽也包括在本发明的单一可变结构域中。

与本发明的单一可变结构域基本上相同的多肽的实例是人源化单一可变结构域。将单一可变结构域人源化的方法是已知的。例如，可以通过将天然存在的单一可变结构域的氨基酸序列的框架区序列与一个或多个密切相关的人单一可变结构域的氨基酸序列的相应框架序列进行比较以确认潜在有用的人源化替换，然后将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化替换引入本发明的单一可变结构域的氨基酸序列中来获得人源化单一可变结构域。可以对由此获得的人源化单一可变结构域进行对靶标的亲和力、稳定性和其他期望特性的确认测试，以确定合适的人源化单一可变结构域的氨基酸序列。

与本发明的单一可变结构域基本上相同的多肽可由选自上述(xvi)和(xvii)的多肽代表。

在上述(xvi)中，“同一性”以包括“同源性”的含义使用。如本文所用，“同一性”是例如，当要比较的序列适当比对时的同一性程度，并且是指序列之间准确的氨基酸匹配的出现率(％)。例如，对于同一性，考虑序列中是否存在缺口和氨基酸的特性(Wilbur,Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:726-730(1983))。比对可以例如通过使用任意算法，特别是BLAST(基本局部比对搜索工具)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Peasron et al.,Methods in Enzymology 183:63-69(1990))，Smith-Waterman(Meth.Enzym.,164,765(1988))进行并且可以使用其他等同源性搜索软件。此外，可以使用例如，上述已知的同源性搜索程序来计算同一性，并且例如可以使用国家生物技术信息中心(NCBI)的同源性算法BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的默认参数来计算。

上述(xvi)中的同一性可以是80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大、或99％或更大。

上述(xvii)中，“氨基酸序列中删除、替换、插入和/或添加一个或多个氨基酸”是指通过诸如位点诱变的已知方法产生的多个氨基酸或已通过删除、替换、插入和/或添加修饰的许多天然存在的氨基酸。通过替换等修饰的氨基酸的数目例如为1至20、1至15、1至10、1至5、1至4、1至3、1至2或1。例如，在氨基酸序列中，修饰可以连续或不连续发生。

在上述(xvii)中插入氨基酸的实例包括插入到氨基酸序列中。此外，在(xvii)中添加氨基酸可以是例如，添加到氨基酸序列的N-末端或C-末端，或添加到N-末端和C-末端两者。

上述(xvii)中的氨基酸替换是指构成氨基酸序列的氨基酸残基被另一种类型的氨基酸残基替换。上述(xvii)中的氨基酸替换可以是例如保守替换。“保守替换”是指用另一种/其他氨基酸和/或氨基酸衍生物(多种)替换一个或多个氨基酸，以基本上不改变蛋白质的功能。在保守替换中，待替换的氨基酸和替换后的氨基酸优选地在例如性质和/或功能上相似。具体地，它们优选在化学性质如疏水性和亲水性、极性和电荷的指标、或物理性质如二级结构方面相似。因此，具有相似特性和/或功能的氨基酸或氨基酸衍生物是本领域已知的。非极性氨基酸(疏水性氨基酸)的实例包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸。极性氨基酸(中性氨基酸)的实例包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。带正电的氨基酸(碱性氨基酸)的实例包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸，带负电的氨基酸(酸性氨基酸)的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。

上述(xvii)中优选的氨基酸修饰例如是，1个氨基酸替换、2个氨基酸替换、3个氨基酸替换、4个氨基酸替换、5个氨基酸替换、6个氨基酸替换或7个氨基酸替换，并且其中替换是保守替换的修饰是更优选的。上述(xvii)中优选的氨基酸修饰是例如，发生在框架区1至4中的修饰，仅发生在框架区1至4中的修饰是更优选的。上述(xvii)中优选的氨基酸修饰例如是，1个氨基酸替换、2个氨基酸替换、3个氨基酸替换、4个氨基酸替换、5个氨基酸替换、6个氨基酸替换、或7个氨基酸的修饰，并且出现在框架区1至4中。作为1个氨基酸替换、2个氨基酸替换、3个氨基酸替换、4个氨基酸替换、5个氨基酸替换、6个氨基酸替换、或7个氨基酸并且仅在框架区1至4中出现的修饰是更优选的。

根据本发明的另一方面，提供了抗体和免疫球蛋白单一可变结构域多聚体，各自包含本发明的免疫球蛋白单一可变结构域。这样的抗体包括仅由作为可变区的两条重链组成的所谓的重链抗体(或VHH抗体)。此外，多聚体包括复合物，其中本发明的多个单一可变结构域直接或通过接头彼此结合，以及一种或多种任选组分(例如，生理活性肽和稳定物质)，而不是本发明的单一可变结构域可以进一步连接到这样的复合物。

本发明的单一可变结构域、抗体和多聚体可以例如通过在宿主中表达编码它们的多核苷酸并回收表达产物来制造。因此，根据本发明的另一方面，提供了编码本发明的单一可变结构域、抗体或多聚体的多核苷酸，以及通过引入本发明的多核苷酸或本发明的多核苷酸与其有效连接的载体获得的宿主细胞。“编码单一可变结构域等的多核苷酸”可以基于遗传密码(即，密码子)来鉴定，该遗传密码基于单一可变结构域等的氨基酸序列。在本发明中，“多核苷酸”包括DNA和RNA，并且还包括其修饰产物和人工核酸，但DNA是优选的。此外，DNA包括cDNA、基因组DNA和化学合成的DNA。

本发明的多核苷酸没有特别限制，只要它可以在要使用的宿主中表达并且由编码具有HVEM结合活性的单一可变结构域等的密码子组成。为了能够在要使用的宿主中表达多核苷酸或增加表达量，可以优化密码子。可以通过本领域常用的已知方法优化密码子。

本发明的单一可变结构域等可以在诸如细菌细胞、霉菌、动物细胞、植物细胞、杆状病毒/昆虫细胞或酵母细胞的各种宿主细胞中表达。用于表达本发明的单一可变结构域等的表达载体是已知的，并且可以使用适合于各种宿主细胞的载体。

当从培养的细菌细胞或培养细胞中提取宿主中表达的单一可变结构域等时，培养后，通过已知方法收集细菌细胞或培养细胞，悬浮在适当的缓冲剂中，用超声波、溶菌酶和/或冻融破坏，然后进行离心或过滤以获得可溶性提取物，并且可以使用已知的分离和纯化方法的适当组合从所获得的提取物中获得靶标单一可变结构域等。作为已知的分离和纯化方法，可以使用诸如盐析或溶剂沉淀的利用溶解性的方法；主要利用分子量差异的方法，例如透析、超滤、凝胶过滤或SDS-PAGE；利用电荷差异的方法，例如离子交换色谱法；利用特定亲和力的方法，例如亲和层析；利用疏水性差异的方法，例如反相高效液相色谱法；以及利用等电点差异的方法，例如等电点电泳。

本发明的单一可变结构域、抗体或多聚体具有HVEM结合活性并可抑制肿瘤生长。由于抑制HVEM表达的物质和抑制HVEM功能的物质可用于治疗或预防如上所述的神经胶质瘤，因此本发明的单一可变结构域、抗体或多聚体可用作药物组合物的有效成分，特别是可用作本发明的药剂和组合物(即，用于治疗和预防神经胶质瘤的药剂)的有效成分。

本发明的其他方面

根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗或预防神经胶质瘤的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的HVEM抑制剂的步骤。此外，根据本发明的另一方面，提供了一种用于降低发展神经胶质瘤的风险的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的HVEM抑制剂的步骤。此外，根据本发明的另一方面，提供了一种在恶性脑肿瘤的治疗中改善预后的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的HVEM抑制剂的步骤。本发明的方法可以根据关于本发明的药剂和组合物的描述进行。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗恶性肿瘤或神经胶质瘤的方法，包括：实施本发明的恶性程度测定方法；和向确定患有或极有可能患有高度恶性脑肿瘤(或确定患有或极有可能患有神经胶质瘤的受试者)的受试者施用有效量的抗癌剂(例如，旨在治疗恶性脑肿瘤的抗癌剂，优选HVEM抑制剂，尤其是抑制HVEM和APRIL之间结合的物质)。本发明的方法可以根据关于本发明恶性程度的测定方法的说明和关于本发明的药剂和组合物的说明进行。

根据本发明的另一方面，提供了HVEM抑制剂在制备用于治疗或预防神经胶质瘤的药剂或作为用于治疗或预防神经胶质瘤的药剂中的用途。此外，根据本发明的另一方面，提供了HVEM抑制剂在制备用于降低发展神经胶质瘤的风险的药剂或作为降低发展神经胶质瘤的风险的药剂中的用途。此外，根据本发明的另一方面，提供了HVEM抑制剂在制造用于改善恶性脑肿瘤治疗中的预后的药剂或作为改善恶性脑肿瘤治疗中的预后的药剂中的用途。本发明的用途可以根据关于本发明的药剂和组合物的描述进行。

根据本发明的另一方面，提供了一种HVEM抑制剂，作为用于治疗或预防神经胶质瘤的药剂，用于治疗或预防神经胶质瘤，或用于本发明的治疗或预防方法。此外，根据本发明的另一方面，提供了一种HVEM抑制剂，作为用于降低发展神经胶质瘤的风险的药剂、用于降低发展神经胶质瘤的风险、或用于本发明的风险降低方法。此外，根据本发明的另一方面，提供了一种HVEM抑制剂，作为用于改善恶性脑肿瘤治疗中的预后的药剂，或用于改善恶性脑肿瘤治疗中的预后，或用于本发明的预后改善方法。HVEM抑制剂可以根据关于本发明的药剂和组合物的描述进行。

本发明的方法和用途可以用于包括人在内的哺乳动物，并且旨在包括治疗用途和非治疗用途。如本文所用，“非治疗性”是指消除对人的操作、治疗或诊断活动(即，对人的医疗活动)，并且具体地指消除进行涉及医生的人或接受医生指示的人的操作、治疗或诊断的方法。

实施例

在下文中，将通过以下实施例更详细地描述本发明，但不限于此。

数据库

分子脑肿瘤数据存储库(REMBRANDT)和癌症基因组图谱(TCGA)提取自Betastasis项目(http://www.betastasis.com)、TCGA数据门户(https://tcga-data.nci.nih.gov)和NIH的基因组数据共享(https://api.gdc.cancer.gov)。

统计分析

统计分析(韦尔奇t检验、Student’s t检验、双向方差分析、Kruskal-Wallis检验和对数秩检验)由统计软件R(http://www.R-project.org)执行。

实施例1：BMP-4对GBM细胞株增殖和神经球形成的抑制作用

(1)人胶质母细胞瘤细胞培养条件

人类多形性胶质母细胞瘤细胞，即U3024MG、U3031MG和U3054MG细胞株，获自人类胶质母细胞瘤细胞培养资源(http://www.hgcc.se/#，本文有时简称为“HGCC”)，并维持在用于维持神经胶质瘤起始细胞(本文有时简称为“GIC”)特征的条件(Xie Y et al.,EBioMedicine,2:1351-63(2015))下。具体地，将细胞株培养在富含B-27补充剂(由ThermoFisher Scientific Inc.制造)、N-2补充剂(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)、20ng/mL表皮生长因子(EGF，由PeproTech,Inc.制造)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，由PeproTech,Inc.制造)的DMEM/F12(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)和Neurobasal培养基(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)中培养。

(2)BMP-4处理

向上述项目(1)中制备的细胞中加入30ng/mL的重组人BMP-4(由R&D Systems，Inc.制造)。另外，制备未添加BMP-4的组作为对照。

(3)体外细胞增殖测定

将上述项目(2)中制备的细胞培养7天，进行体外细胞增殖测定。根据制造商的说明使用细胞计数试剂盒-8(由NacalaiTesque,Inc.制造)。通过使用酶标仪(Model 680，由Bio-Rad Laboratories,Inc.制造)或Enspire(由PerkinElmer,Inc.制造)测量450nm和595nm下的吸光度来测量细胞数。

(4)球形成测定

将上述项目(2)中制备的细胞以1至100个细胞/孔的密度接种在超低粘附微孔板(由Corning Inc.制造)上，并培养7天。直径为20μm或更大的细胞簇被认为是球。在每种条件下都对没有球的孔进行计数。

(5)结果

结果如图1所示。在无血清条件和神经球形成下的细胞增殖测定中，发现BMP-4强烈抑制U3024MG和U3031MG细胞的增殖(Lenkiewicz M.et al.,CurrProtoc Stem CellBiol.,Chapter 3:Unit3.3(2009))。相比之下，BMP-4被证实不抑制U3054MG细胞的增殖或球形成。

实施例2：BMP-4靶标基因的搜索

(1)RNA序列分析

使用人胶质母细胞瘤细胞TGS-04进行RNA序列分析以鉴定BMP靶标基因(RajaE.et al.,Oncogene,36:4963-4974(2017))。RNA序列数据中受BMP-4刺激控制的基因的表达量基于它们的FPKM值(每百万个片段每千碱基外显子的片段)进行分析，以及FPKM值被BMP-4刺激抑制到1/2或更低的基因被提取。此外，从提取的基因中搜索编码跨膜蛋白的基因。结果，证实了在TGS-04细胞中HVEM的表达被BMP-4抑制到1/2或更少(数据未显示)。

(2)定量实时(RT)-PCR分析

使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen公司制造)从实施例1(2)中制备的GBM细胞(U3024MG细胞或U3031MG细胞)中提取总RNA，并分析人HVEM和人GAPDH的表达(用于相对表达量的标准化)。用于定量RT-PCR的引物在表1中示出。使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(由Takara Bio Inc.制造)合成互补DNA。使用FastStart通用SYBR Green MasterMix(由Roche制造)通过Step One Plus实时荧光定量PCR系统(由Applied Biosystems制造)量化基因表达水平。

[表1]

表1：用于定量RT-PCR的引物组

结果如图2所示。在U3024MG细胞和U3031MG细胞中，HVEM的表达被BMP-4强烈抑制。

实施例3：HVEM表达与GBM患者的不良预后之间的相关性

使用美国国立癌症研究所基因组数据共享(本文有时简称为“GDC”)TCGA脑肿瘤数据集分析以下表达式(1)至(4)。

(1)HVEM在GBM中的表达

为了研究HVEM在脑肿瘤中的功能，使用GDC TCGA数据集分析HVEM mRNA的表达水平。结果如图3a所示。与其在正常脑组织和低恶性胶质瘤组织如少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤和星形细胞瘤中的表达相比，在GBM中观察到显著增加的HVEM的表达。在正常脑和低恶性神经胶质瘤中的表达水平之间没有观察到显著差异。然而，与其在少突胶质细胞瘤和少突星形细胞瘤中的表达相比，在星形细胞瘤中观察到HVEM的显著增加的表达。

(2)脑肿瘤患者生存率及HVEM的表达

使用GDC TCGA数据集分析脑肿瘤患者的存活率。结果如图3b所示。与HVEM的高表达的患者相比，其肿瘤中HVEM低表达的GBM患者的生存时间显著延长，并且在低级别神经胶质瘤(LGG)、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤和星形细胞瘤的患者中也证实了类似的结果。

(3)HVEM在GBM亚型中的表达

分析了HVEM在GBM的四种亚型(前神经型、神经型、经典型和间充质型，基于Verhaak et al.,Cancer Cell,17:98-110(2010)的分类)中的表达。结果如图3c所示。在间充质亚型中观察到HVEM的最高表达，但在原神经亚型中观察到最低表达。

(4)HVEM在GBM亚型中的表达

HVEM在13种不同GBM细胞株(从HGCC资源(Xie Y et al.,EBioMedicine,2:1351-63(2015))和H9 hESC衍生的人类神经干细胞(hNSC，由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)中的表达通过定量RT-PCR进行分析。此外，hNSC在补充有StemPro神经补充剂(由ThermoFisher Scientific Inc.制造)、EGF(20ng/mL)和bFGF(20ng/mL)的敲除DMEM/F12(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)中培养。对于细胞，使用的引物是表1中所示的SEQID NO：1至4，按照实施例2(2)所述的方法进行RT-PCR。结果如图3d所示。在所有5个间充质亚型菌株中均观察到HVEM的高表达。相比之下，在原神经亚型、神经亚型和经典亚型中测试的2至3个菌株中，只有一个显示出增加的HVEM表达，并且证实间充质亚型中的HVEM表达水平普遍高于其他亚型。从这些结果，可以表明HVEM表达在特定人类脑肿瘤中增加，尤其是GBM的间充质亚型，并且HVEM的高表达与胶质母细胞瘤患者的不良预后相关。

实施例4：通过抑制HVEM抑制GBM细胞增殖和神经球形成

(1)shRNA对HVEM的抑制

编码表2中所示的短发夹RNA(shRNA)的DNA序列各自插入到pENTR4-H1或pENTR4-mU6载体中。pENTR4-H1和CS-RfA-CMV-PuroR载体之间或pENTR4-mU6和CS-RfA-CG之间的LR反应由LR Clonase(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)催化。使用Lipofectamine2000(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)将载体质粒pCAG-HIVgp和pCMV-VSV-G-Rev转导到HEK293FT细胞中。慢病毒颗粒用Lenti-X浓缩器(由Takara Bio Inc.制造)浓缩，然后用无血清缓冲剂重构。

[表2]

表2：shRNA序列

将各个制备的shRNA导入在实施例1(1)所述的条件下培养的间充质亚型细胞(U3024MG细胞、U3031MG细胞或U3054MG细胞)中。接着，通过定量RT-PCR分析导入了各个shRNA的GBM细胞(U3024MG细胞、U3031MG细胞或U3054MG细胞)中的HVEM表达。具体地，所用的引物是表1中所示的SEQ ID NO：1至4，按照实施例2(2)所述的方法进行RT-PCR。

(2)抗体对HVEM的抑制

使用抗人HVEM抗体(MAB356，由R&D Systems,Inc.制造)或小鼠IgG1抗体(MAB002，由R&D Systems,Inc.制造)作为对照，抑制HVEM在GBM细胞(U3024MG细胞、U3031MG细胞或U3054MG细胞)表面上的功能，用于研究GBM细胞的增殖。具体地，将10μg/mL的人HVEM抗体或小鼠IgG1同种型对照抗体加入到培养液中，并用抗人HVEM抗体或对照抗体处理GBM细胞。

(3)体外细胞增殖测定

对于上述项目(1)和(2)中制备的细胞，按照实施例1(3)所述的方法进行体外细胞增殖测定。

(4)球形成测定

对于上述第(1)项目中制备的细胞，根据实施例1(4)中所述的方法进行球形成测定。

(5)结果

结果如图4所示。shRNA对HVEM的敲低减弱了间充质亚型的所有三种细胞株的增殖(图4A和4b)。此外，间充质亚型细胞的球形成能力被HVEM表达的敲低强烈抑制(图4c)。还证实，在用抗人HVEM抗体处理的间充质亚型培养细胞中，细胞增殖显著减弱(图4d)。结果表明，U3054MG细胞中的细胞增殖和球形成不受BMP-4的抑制(参见图1)，但被HVEMshRNA抑制。从这些结果表明，HVEM在BMP-4以外的信号系统中也具有促进间充质亚型细胞的细胞增殖和球形成的作用。

实施例5：通过沉默HVEM抑制GBM细胞的体内肿瘤生长

(1)shRNA在GBM细胞中对HVEM的抑制

将萤火虫萤光素酶(Luc2，Promega公司制造，同样适用于下文)导入间充质亚型细胞(U3031MG细胞或U3054MG细胞)，以制备表达萤火虫萤光素酶的间充质亚型细胞，以与实施例4(1)中描述的相同方式，不同之处在于萤火虫荧光素酶Luc2被克隆到pENTR201载体(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)中，并且pENTR201-Luc2和CS-CMV-RfA载体之间的重组由LR Clonase(Thermo Fisher Scientific Inc.)催化。表2中所示的对照shRNA#1(SEQ ID NO：5)或HVEMshRNA#1或#2(SEQ ID NO：7或8)按照实施例4(1)中所述的方法导入间充质亚型细胞中，从而制备表达萤火虫荧光素酶和对照shRNA或HVEMshRNA的间充质亚型细胞。

(2)GBM细胞的颅内移植

通过将上述项目(1)中制备的GBM细胞的颅内原位移植到裸鼠中来研究HVEM的致瘤活性。具体地，将总共1×10⁵个存活细胞移植到BALB/c nu/nu的颅骨前囟的矢状缝右侧2mm处和颅骨表面下方3mm处。将萤火虫荧光素(由Promega Corporation制造)腹腔注射到小鼠体内后，用NightOWL LB981 NC100T(由Berthold Technologies制造)进行体内生物发光成像。根据东京大学动物伦理委员会的规定，对小鼠进行监测，直到它们的体重减轻20％或更多，或出现神经学症状，如轻偏瘫。

(3)结果

结果如图5所示。体内生物发光成像显示，用非靶向对照shRNA#1处理的U3031MG和U3054MG细胞在细胞移植后均形成肿瘤。相比之下，用HVEMshRNA#1或#2处理的细胞形成的肿瘤比对照细胞小，并且在细胞移植后15周，小鼠体内的生物发光信号降低或未检测到(图5a)。还证实，与具有表达对照shRNA的GBM细胞的小鼠相比，GBM细胞中HVEM表达的沉默延长了小鼠的存活时间(图5b)。

实施例6：通过HVEM过表达促进GBM细胞增殖、神经球形成和体内肿瘤生长

(1)HVEM的体外过表达

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或HVEM以与实施例4(1)所述相同的方式在实施例1(1)所述条件下培养的GBM非间充质亚型细胞(U3047MG、U3085MG和U3017MG细胞)中表达，不同之处在于将EGFP、HVEM或Luc2 cDNA克隆到pENTR201载体(由Thermo Fisher ScientificInc.制造)，且pENTR201和CSII-EF-RfA或CS-CMV-RfA载体之间的重组由LR Clonase(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)催化。

(2)体外细胞增殖测定

对于上述项目(1)中制备的细胞，按照实施例1(3)所述的方法进行体外细胞增殖测定。

(3)球形成测定

(4)HVEM的体内过表达

检测了在上述项目(1)中制备的过表达EGFP或HVEM的U3047MG细胞的体内致瘤活性。具体地，根据实施例5(2)所述的方法将U3047MG细胞原位移植到裸鼠头骨(BALB/c nu/nu)中，进行体内生物发光成像。

(5)结果

结果如图6和7所示。U3047MG、U3085MG和U3017MG细胞分别属于GBM细胞的原神经亚型、神经亚型和经典亚型，其HVEM表达水平低于间充质亚型细胞(参见图3d)。与引入EGFP的对照细胞相比，HVEM在这些细胞中的过表达增加了细胞增殖(图6a)。此外，HVEM的过表达增强了球形成能力(图6b)。这些发现证实了HVEM在维持胶质母细胞瘤细胞的干细胞样特性中的作用。此外，在图7中，各个小鼠之间的生物发光信号不同，但HVEM促进了体内肿瘤生长(图7a)，与对照小鼠相比，将移植了表达HVEM的U3047MG细胞的小鼠相比，具有短存活时间(图7b)。

实施例7：通过HVEM抑制抑制鼠神经胶质瘤细胞的致瘤性

(1)HVEM表达及血清

使用鼠神经胶质瘤细胞株GL261(由PerkinElmer,Inc.制造)分析HVEM的功能。将GL261细胞在添加有10％胎牛血清(含胎牛血清的分化培养基)或实施例1(1)所述的无血清干细胞培养基的DMEM(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)培养基中培养。根据实施例2(2)中描述的方法，使用表3中所示的引物进行定量RT-PCR。

[表3]

表3：用于定量RT-PCR的引物组

结果如图8a所示。当细胞在无血清培养基中增殖时检测到HVEM的表达，但在血清的存在下HVEM的表达降低。从这些结果可以确认GL261细胞在血清的存在下分化，且HVEM表达降低。

(2)HVEM的致瘤活性

根据实施例4(1)描述的方法将表4所示的具有编码HVEMshRNA#1或#2(SEQ ID NO：13或14)的DNA序列和EGFP序列的载体或对照shRNA#1(SEQ ID NO：5)导入GL261细胞中。通过将GL261细胞原位移植到C57BL/6J小鼠的颅骨中，检查了HVEM在抑制HVEM表达后GL261细胞中的致瘤活性。具体地，将总共1×10⁵个存活细胞移植到颅骨前囟的矢状缝右侧2mm处和颅骨表面下方3mm处。移植了胶质瘤细胞的小鼠用4％多聚甲醛经心灌注。小鼠脑组织用10-20％蔗糖冷冻保护，组织切片用苏木精和伊红染色。结果如图8b所示。用对照shRNA处理的GL261细胞在细胞移植后形成肿瘤(观察到EGFP信号)，而用HVEMshRNA处理的鼠神经胶质瘤细胞没有形成肿瘤(图8b)。从这些结果证实，通过抑制神经胶质瘤细胞中HVEM的表达可以抑制神经胶质瘤细胞的致瘤活性。

[表4]

表4：shRNA序列

(3)抗HVEM抗体增加存活概率

通过将表达萤火虫荧光素酶(RedFLuc)的GL261细胞(BW134246V，由PerkinElmer,Inc.制造)原位移植到C57BL/6J小鼠的颅骨中，使用抗HVEM抗体在体内研究HVEM的功能。具体地，根据上述项目(2)所述的方法将GL261细胞颅内移植5天后，基于体内生物发光成像，基于萤火虫荧光素酶的发光强度，将小鼠平均分为两组(抗小鼠HVEM抗体组和同种型对照IgG1组)。然后，在颅内移植GL261细胞后5天，腹腔注射7.5mg/kg的抗小鼠HVEM仓鼠单克隆IgG抗体(根据LBH1，Xu Yet al.，Blood,109:4097-4104(2007)制备的)或仓鼠同种型IgG抗体作为对照(I-140，由Leinco Technologies,Inc.制造)，每5天总共进行5次注射。结果如图8c所示。脑组织中的苏木精/伊红染色证实，在移植GL261细胞后25天，对照组中形成了肿瘤，但在施用抗小鼠HVEM抗体的组中，肿瘤形成得到抑制。对照抗体治疗组的所有小鼠均在35天内死亡，而抗小鼠HVEM抗体治疗组的所有小鼠均存活长于45天。从这些结果证实，抑制神经胶质瘤细胞中HVEM的功能可以抑制神经胶质瘤细胞的致瘤活性并且还可以延长存活时间。

实施例8 HVEM配体在GBM中的表达

(1)HVEM配体在GBM中的表达

为了研究HVEM配体在脑肿瘤中的功能，使用GDC TCGA数据集分析APRIL的mRNA和HVEM的已知配体(LIGHT、LTA、BTLA、CD160和SALM5)的表达水平。结果如图9a所示。与已知的HVEM配体相比，APRIL被观察到在正常脑组织和GBM中高度表达。

(2)HVEM配体在GBM亚型中的表达

通过夹心ELISA测量了13种不同GBM细胞株和H9 hESC衍生的人类神经干细胞(hNSC)的培养物上清液中APRIL和HVEM的已知配体(LTA和LIGHT)的量。具体地，细胞上清液中的人APRIL、LTA和LIGHT使用以下试剂通过免疫测定法定量：人APRIL/TNFSF13 DuoSetELISA(DY884B，R&D Systems,Inc.)、人淋巴毒素-α/TNF-βDuoSet ELISA(DY211,R&DSystems,Inc.)、人LIGHT/TNFSF14 QuantikineELISA试剂盒(DLIT00,R&D Systems,Inc.)和辅助试剂试剂盒2(DY008,R&D Systems,Inc.)。使用680型酶标仪(Bio-RadLaboratories,Inc.)或Enspire(PerkinElmer,Inc.)测量450nm和570nm处的吸光度。结果如图9b所示。培养上清液中LTA和LIGHT的浓度均不高于检测灵敏度。另一方面，已证实APRIL以50pg/mL或更高的浓度存在于人神经干细胞(hNSC)和所有13种类型的GBM中，并且APRIL在GBM中的表达量高于在正常脑组织中的表达量。

由这些结果可知，已知的HVEM配体均未在GBM中高表达，而未作为HVEM的配体报道的APRIL高表达。APRIL是TNF超家族的配体，且已知BCMA/TNFRSF17和TACI/TNFRSF13B是APRIL的受体。到目前为止，还没有报道APRIL与HVEM结合并转导信号。

实施例9：通过抑制APRIL抑制GBM细胞增殖和神经球形成

(1)shRNA对APRIL的抑制

根据实施例4(1)中描述的方法使用短发夹RNA(shRNA)抑制APRIL，不同之处在于使用编码表5所示shRNA的DNA序列、间充质亚型细胞(U3054MG细胞)和表6中所示的APRIL的引物(图10a)。

[表5]

表5：shRNA序列

[表6]

表6：用于定量RT-PCR的引物组

(2)抗体对APRIL的抑制

根据实施例4(2)的描述研究通过抑制APRIL在GBM细胞表面上的功能来增殖GBM细胞，不同之处在于使用针对人APRIL的抗体(抗人APRIL/TNFSF13、MAB5860，由R&D Systems,Inc.(同样适用于下文)(图10d)。除了使用10μg/mL的抗人APRIL和非间充质亚型GBM细胞(U3047MG)的抗体外，根据实施例4(2)(图10e)的描述研究通过抑制APRIL在非间充质亚型细胞表面上的功能的非间充质亚型细胞的增殖。

(3)体外细胞增殖测定

对于上述项目(1)和(2)中制备的细胞，按照实施例1(3)(图10b、图10d和图10e)所述的方法进行体外细胞增殖测定。

(4)球形成测定

对于上述第(1)项目中制备的细胞，根据实施例1(4)(图10c)中所述的方法进行球形成测定。

(5)APRIL受体在GBM中的表达

为了研究HVEM配体在脑肿瘤中的功能，使用GDC TCGA数据集分析正常脑组织和GBM中的mRNA、APRIL的HVEM和已知受体(BCMA/TNFRSF17和TACI/TNFRSF13B)的表达水平(图10f)。

(6)结果

结果如图10所示。

shRNA对HVEM的敲低减弱了间充质亚型的细胞株的增殖(图10b)。此外，间充质亚型细胞的球形成能力被APRIL表达的敲低强烈抑制(图10c)。还证实，在用抗人APRIL抗体处理的间充质亚型培养细胞中，细胞增殖显著减弱(图10d)。另一方面，在用抗人APRIL抗体(U3047MG)处理的非间充质亚型培养的细胞中，细胞增殖没有减弱(图10e)。由于U3047MG细胞是不表达HVEM但表达APRIL的细胞株，因此暗示HVEM在脑肿瘤细胞上的表达对于人APRIL抗体抑制细胞增殖是必要的。此外，由于已证实与HVEM相比，APRIL的两种受体(BCMA和TACI)在GBM中都以极低水平表达，因此表明APRIL不太可能与APRIL的已知受体结合，并且在GBM中起作用。这些结果表明HVEM的表达是APRIL在GBM中的细胞增殖能力和球形成能力所必需的。

APRIL作为HVEM配体的作用

(1)HVEM配体的鉴定

制备pCS-NF-κB-RE-minP-Luc2-CMV-hRluc，其中萤火虫荧光素酶基因(Luc2，Promega Corporation)被克隆到具有NF-κB响应元件的最小启动子下游且Renilla荧光素酶基因(hRluc，Promega Corporation)被克隆到CMV启动子的下游。使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific Inc.制造，同样适用于下文)将人源HVEM导入HEK293T细胞后，导入NF-κB反应性Luc2基因和持续表达的hRluc基因(表达HVEM的细胞)。另一方面，将人源LIGHT、APRIL和SALM5基因克隆到pENTR4-CMV载体中，pENTR4-CMV和CS-RfA-EF-PuroR之间的重组由LR Clonase(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)催化。接着，使用Lipofectamine2000在与上述不同的HEK293T细胞中分别表达LIGHT、APRIL和SALM5，制备表达可溶性配体的细胞(表达配体的细胞)。作为对照细胞，制备表达NF-κB报告基因但不表达HVEM或配体的细胞(空)。将表达HVEM的细胞和表达配体的细胞共培养，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega Corporation，同样适用于下文)评价表达HVEM的细胞中的NF-κB的活性。

(2)商业APRIL和SALM5的效果

用重组APRIL(PeproTech,Inc.)、重组人IgG1 Fc(对照-Fc,R&D Systems,Inc.)或重组SALM5-Fc(具有免疫球蛋白的Fc位点的嵌合蛋白质，R&D Systems,Inc.)刺激上述项目(1)中制备的表达HVEM的细胞，并使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒评估表达HVEM的细胞中的NF-κB的活性。

(3)结果

结果如图11所示。与作为HVEM配体的LIGHT和SALM5一样，还证实APRIL转导信号并激活表达HVEM的细胞中的NF-κB信号(图11a)。证实与SALM5-Fc一样，在10至30nM或更高的浓度下APRIL转导信号并激活表达HVEM的HEK293T细胞中的NF-κB信号(图11b)。这些结果表明，迄今为止尚未报道过作为HVEM配体的APRIL可充当HVEM的配体，就像已知的HVEM配体(LIGHT和SALM5)一样。证实APRIL以与SALM5相当的浓度起作用。

实施例11：使用HVEM基因的CRISPR/Cas9的敲除效果

(1)CRISPR/Cas9系统

制备编码表8所示的gRNA、靶向表7所示的DNA序列的LentiCRISPR v2载体，并使用Lipofectamine 2000将hCas9和每种gRNA导入间充质亚型细胞(U3054MG细胞)或鼠神经胶质瘤细胞株GL261(PerkinElmer,Inc.)。每个细胞通过有限稀释法进行克隆。通过免费软件(CHOP:http://chopchop.cbu.uib.no/)选择gRNA序列。

[表7]

表7：CRISPR/Cas9的靶标序列

下划线部分表示通过hCas9识别的PAM序列。由于理论上在人类基因组或小鼠基因组上不存在对照gRNA的靶标序列，因此显示了一般的PAM序列。

[表8]

表8：CRISPR/Cas9系统中使用的gRNA全长的碱基序列

(3)体外细胞增殖测定

对于上述项目(1)中制备的细胞，按照实施例1(3)所述的方法进行体外细胞增殖测定。根据实施例1(1)的描述在无血清干细胞培养基中培养GL261细胞。

(4)球形成测定

(5)结果

结果如图12所示。证实CRISPR/Cas9系统敲除HVEM基因强烈降低间充质亚型细胞株的增殖(图12a)。此外，间充质亚型细胞的球形成能力因HVEM基因的敲除而受到抑制(图4b)。此外，鼠神经胶质瘤细胞株GL261细胞是在无血清培养时表现出增加的HVEM表达的细胞(参见实施例7)，并且证实在这些细胞中也通过敲除小鼠HVEM基因来减弱细胞增殖(图12c)。

实施例12：使用羊驼制备HVEM抗体

(1)羊驼中抗体的制备

在羊驼皮肤下免疫表达人HVEM基因(GenBank登录号NM_003820.3或HGNC:11912)的HEK293T细胞以制备抗人HVEM羊驼VHH抗体。获得具有表9中所示的氨基酸序列的VHH抗体。互补决定区(CDR)根据Kabat分类进行鉴定。结果如图13所示。

[表9]

表9：抗人HVEM羊驼VHH抗体的氨基酸序列

(2)HVEM抗体与抗原的结合

使用上述项目(1)中制备的VHH抗体测量在表达HVEM的HEK293T细胞膜表面上的HVEM中是否检测到VHH抗体。具体地，将导入HVEM的HEK293T细胞和不表达HVEM的HEK293T细胞作为阴性对照分别以1×10⁴个细胞/孔接种，用4％多聚甲醛固定，然后与添加了6×His标签的VHH抗体反应。辣根过氧化物酶HRP标记的抗组氨酸标签抗体抗-His-tag mAb-HRP-DirecT(MBL)反应，并使用ELISA POD底物TMB试剂盒(NacalaiTesque,Inc.)测量HRP与底物的酶反应。对抗体浓度获得的效应量数据进行非线性回归，得到基于以下公式的S形曲线：

效应量＝背景+最大效应量/(1+10^(Hill系数×(logEC50-log(抗体浓度))))以确定50％效应浓度EC50。

结果，VHH#1至5的EC50值均小于80nM。VHH#6和VHH#7的克隆通过使用噬菌体展示方法的抗体筛选获得。

(3)VHH抗体的增殖抑制作用

间充质亚型细胞株(U3054MG细胞)用浓度为100至300nM的VHH(I)(VHH#3)和VHH(II)(VHH#2)处理，U3054MG细胞在以下条件下培养：37℃和5％CO₂持续7天。作为阴性对照，细胞株用PBS处理。使用细胞计数试剂SF(NacalaiTesque,Inc.)量化细胞增殖，以测量PBS处理组的细胞增殖。结果如图14所示。证实在VHH处理的细胞中增殖被抑制。

序列表

<110> 国立大学法人山口大学和国立大学法人东京大学

<120> 用于治疗和预防胶质母细胞瘤的药剂

<130> 191116PX

<150> JP2018-248465

<151> 2018-12-28

<160> 84

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gaaggtgaag gtcggagtc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gaagatggtg atgggatttc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

gtgtctgcag tgccaaatgt 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

ccacacacgg cgttctct 18

<210> 5

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扰码序列

<400> 5

gugguuuaca ugucgacuaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扰码序列

<400> 6

augguuuaca uguuguguga 20

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<400> 7

gugcagucca gguuaucgug u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<400> 8

gagcugacgg gcacagugug u 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 9

tgcagtggca aagtggagat t 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 10

tgccgttgaa tttgccgt 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 11

aatggaacct ctcccaggat 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 12

aggaagacac aaggcacca 19

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 小鼠

<400> 13

gcaacccagg uuaccaugug a 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 小鼠

<400> 14

gugagcauac aggcacagug u 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<400> 15

gagacucuau uccgauguau a 21

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<400> 16

ggcaagggcg aaacuuaacc u 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

tatagcgcag gtgtcttcca 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 18

acagtttcac aaaccccagg a 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照gRNA的靶序列

<220>

<221> misc_特征

<222> (21)..(21)

<223> n为a、c、g或t

<400> 19

gtattactga tattggtggg ngg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 20

agcagttccg gctcgcgcgc agg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 21

ccctccggac gtcaccacgg tgg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 22

tgcgctgcag caagttcaaa agg 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 23

gcggagtctg tgatccaggt agg 23

<210> 24

<211> 98

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照gRNA

<400> 24

gguauuacug auauuggugg gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60

ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcu 98

<210> 25

<211> 98

<212> RNA

<213> 智人

<400> 25

gagcaguucc ggcucgcgcg cguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60

ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcu 98

<210> 26

<211> 98

<212> RNA

<213> 智人

<400> 26

gcccuccgga cgucaccacg gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60

ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcu 98

<210> 27

<211> 98

<212> RNA

<213> 小鼠

<400> 27

gugcgcugca gcaaguucaa aguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60

ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcu 98

<210> 28

<211> 98

<212> RNA

<213> 小鼠

<400> 28

ggcggagucu gugauccagg uguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60

ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcu 98

<210> 29

<211> 115

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr His

20 25 30

Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala His Ile Ser Ser Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Asn Ala Arg Asp Trp Tyr Glu Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 117

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Leu Phe Asp Thr Tyr

20 25 30

Thr Met Ala Trp Tyr Arg Leu Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Asp Ile Ser Arg Thr Gly Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala His Tyr Arg Cys Lys

85 90 95

Val Arg Glu Pro Ala Thr Met Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 115

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Gly Ser Ile His

20 25 30

Arg Trp Asp Trp Tyr Arg Leu Cys Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Leu Asn Ser Glu Gly Gly Pro Thr Tyr Ala Asp Ser Val Glu

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys Ser

85 90 95

Ala Arg Thr Val Pro Phe Glu Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 118

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Glu Ser Met Leu Ser Pro Tyr

20 25 30

Ser Met Gly Trp Tyr Arg Leu Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ser Leu Gly Ser Gly Gly Arg Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys Asn

85 90 95

Ile Arg Glu Leu Leu Gly Arg Arg Tyr Glu Tyr Trp Ser Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 119

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

His Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Ser Ser Gly Arg Thr Ala Tyr Val Asp Ser Val Ala

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Thr Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Lys Gly Gly Trp Asp Gly Leu Pro Ser Ser Ser Ile Arg Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Ile Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Ala Phe Asp Arg Tyr

20 25 30

Thr Phe Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asp Ser Thr Ser Ala Val Ile Asp Tyr Glu Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Gly Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Thr

100 105 110

<210> 35

<211> 117

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Asp Lys Pro Thr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Asp Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Arg Met His Thr Gly Gly Leu Gly Thr Ala Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Ala Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Val Asn Asp Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Glu Ile Ser Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 36

Phe Ser Thr His Ala Met Ser

1 5

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 37

His Ile Ser Ser Thr Gly Gly Ser

1 5

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 38

Cys Asn Ala Arg Asp Trp Tyr Glu Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 39

Arg Leu Phe Asp Thr Tyr Thr Met Ala

1 5

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 40

Asp Ile Ser Arg Thr Gly Phe

1 5

<210> 41

<211> 13

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 41

Cys Lys Val Arg Glu Pro Ala Thr Met Tyr Glu Tyr Trp

1 5 10

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 42

Ser Ile Gly Ser Ile His Arg Trp Asp

1 5

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 43

Thr Leu Asn Ser Glu Gly Gly

1 5

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 44

Cys Ser Ala Arg Thr Val Pro Phe Glu Tyr Trp

1 5 10

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 45

Ser Met Leu Ser Pro Tyr Ser Met Gly

1 5

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 46

Ser Leu Gly Ser Gly Gly Arg

1 5

<210> 47

<211> 14

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 47

Cys Asn Ile Arg Glu Leu Leu Gly Arg Arg Tyr Glu Tyr Trp

1 5 10

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 48

Phe Thr Phe Ser Ser Ser His Met Thr

1 5

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 49

Leu Ile Asn Ser Ser Gly Arg

1 5

<210> 50

<211> 15

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 50

Cys Ser Lys Gly Gly Trp Asp Gly Leu Pro Ser Ser Ser Ile Arg

1 5 10 15

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 51

Leu Ala Phe Asp Arg Tyr Thr Phe Asn

1 5

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 52

Ser Ile Asp Ser Thr Ser Ala Val

1 5

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 53

Cys Gly Arg Gly Gly Tyr Tyr

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 54

Phe Thr Asp Lys Pro Thr Tyr Trp Ser

1 5

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 55

Met His Thr Gly Gly Leu Gly

1 5

<210> 56

<211> 12

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 56

Cys Asn Ala Glu Ile Ser Gly Gly Pro Asp Tyr Trp

1 5 10

<210> 57

<211> 28

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

20 25

<210> 58

<211> 14

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 58

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 59

<211> 38

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 59

Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Val Tyr Arg

35

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 60

Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 61

<211> 26

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly

20 25

<210> 62

<211> 14

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 62

Trp Tyr Arg Leu Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 63

<211> 38

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 63

Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp

20 25 30

Asp Thr Ala His Tyr Arg

35

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 64

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 65

<211> 26

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

<210> 66

<211> 14

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 66

Trp Tyr Arg Leu Cys Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 67

<211> 38

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 67

Pro Thr Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Val Tyr Arg

35

<210> 68

<211> 10

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 68

Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 69

<211> 26

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Glu

20 25

<210> 70

<211> 14

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 70

Trp Tyr Arg Leu Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 71

<211> 38

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 71

Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Val Tyr Arg

35

<210> 72

<211> 10

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 72

Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 73

<211> 26

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 73

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

<210> 74

<211> 14

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 74

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 75

<211> 38

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 75

Thr Ala Tyr Val Asp Ser Val Ala Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Asn Leu Lys Pro Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

35

<210> 76

<211> 10

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 76

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 77

<211> 26

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 77

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Ile Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly

20 25

<210> 78

<211> 14

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 78

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 79

<211> 38

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 79

Ile Asp Tyr Glu Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Val Tyr Phe

35

<210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 80

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Thr

1 5 10

<210> 81

<211> 26

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 81

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly

20 25

<210> 82

<211> 15

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 82

Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Asp Arg Glu Leu Val Ala Arg

1 5 10 15

<210> 83

<211> 38

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 83

Thr Ala Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Val

1 5 10 15

Asn Asp Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

35

<210> 84

<211> 10

<212> PRT

<213> 羊驼

<400> 84

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

Claims

1.一种用于治疗或预防神经胶质瘤的药剂，包含HVEM抑制剂作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的药剂，其中所述神经胶质瘤是少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤中的任一种。

3.根据权利要求2所述的药剂，其中所述多形性胶质母细胞瘤属于原神经亚型、神经亚型、经典亚型和间充质亚型中的任一种。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的药剂，其中所述HVEM抑制剂是针对HVEM的抗体或核酸。

5.根据权利要求4所述的药剂，其中所述针对HVEM的抗体是抑制HVEM与配体之间的结合的抗体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的药剂，其中所述神经胶质瘤是HVEM表达依赖性神经胶质瘤或HVEM配体依赖性神经胶质瘤。

7.根据权利要求5或6所述的药剂，其中所述配体是APRIL。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的药剂，其用于施用于其HVEM表达量超过健康受试者中的HVEM表达量或正常组织样本中的HVEM表达量的受试者。

9.一种脑肿瘤恶性程度标志物或脑肿瘤预后标志物，每个由HVEM蛋白或HVEM基因组成。

10.一种用于确定脑肿瘤恶性程度的方法，所述方法包括测量受试者生物样本中HVEM表达量的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中如果所述受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本中或正常组织样本中的HVEM表达量，则表明所述生物样本含有高度恶性的肿瘤细胞群。

12.根据权利要求10所述的方法，其中如果所述受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本中或正常组织样本中的HVEM表达量，则表明所述受试者患有高度恶性脑瘤。

13.一种用于确定脑肿瘤患者的预后的方法，所述方法包括测量受试者生物样本中HVEM表达量的步骤。

14.根据权利要求13所述的方法，其中如果所述受试者的生物样本中的HVEM表达量超过健康受试者的生物样本中或正常组织样本中的HVEM表达量，则表明所述受试者的预后差。

15.一种免疫球蛋白单一可变结构域，其以小于80nM的EC50值与HVEM结合，并抑制肿瘤生长。

16.根据权利要求15所述的免疫球蛋白单一可变结构域，其包含互补决定区1至3(CDR1、CDR2和CDR3)，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)：

17.根据权利要求16所述的免疫球蛋白单一可变结构域，其包含框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如下(viii)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)或(xiv)；

18.根据权利要求15所述的免疫球蛋白单一可变结构域，其包含以下多肽(xv)、(xvi)或(xvii)：

(xv)具有SEQ ID NO：29至35中任一个的氨基酸序列的多肽；

19.一种抗体或免疫球蛋白单一可变结构域多聚体，各自包含根据权利要求15至18中任一项所述的免疫球蛋白单一可变结构域。

20.一种多核苷酸，其编码根据权利要求15至18中任一项所述的免疫球蛋白单一可变结构域或根据权利要求19所述的抗体或多聚体。

21.一种药物组合物，其包含根据权利要求15至18中任一项所述的免疫球蛋白单一可变结构域或根据权利要求19所述的抗体或多聚体。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其用于治疗或预防神经胶质瘤。