WO2020138503A1 - 神経膠腫の治療および予防剤、脳腫瘍の悪性度のマーカーおよび脳腫瘍の予後マーカー、脳腫瘍の悪性度および予後の判定方法並びに腫瘍増殖を抑制する抗体 - Google Patents

神経膠腫の治療および予防剤、脳腫瘍の悪性度のマーカーおよび脳腫瘍の予後マーカー、脳腫瘍の悪性度および予後の判定方法並びに腫瘍増殖を抑制する抗体 Download PDF

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諒 田邉
真大 森川
ヘルディン、カール－ヘンリック
ヴェステルマルク、ベンクト
耕治 玉田
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic or preventive agent for glioma.
  • the present invention also relates to a marker for malignancy of brain tumor and a marker for prognosis of brain tumor, and a method of judging malignancy of brain tumor and a method of judging prognosis.
  • the present invention also relates to antibodies that suppress tumor growth.
  • the frequency of occurrence of primary brain tumors in Japan is estimated to be approximately 20,000 per year (prevalence in 2010 is 130.8 per 100,000 persons), and so-called five cerebral tumors are glioma and marrow.
  • Membranoma, pituitary adenoma, schwannoma and craniopharyngioma are known.
  • Resection of the tumor by surgery is generally used for the treatment of brain tumors, but in the case of malignant brain tumors, multidisciplinary treatment combined with an anticancer agent, radiation treatment, etc. is performed.
  • the therapeutic effect depends on how much the tumor can be removed in the first operation. In the case of malignant tumor, if 95 to 98% or more of all tumors are not removed, half of the tumor is removed and the survival prognosis is improved. It is reported that there is not much difference.
  • malignant brain tumors among brain tumors have a high probability of migrating to brain tumors of higher malignancy.
  • Glioblastoma multiforme (hereinafter sometimes referred to as “GBM”) is the most common and most malignant form of malignant brain tumor in adults. Despite advances in surgery, radiation and chemotherapy, glioblastoma patients still have a poor prognosis with median survival times of less than 15 months. Glioblastomas are classified into Proneural, Neural, Classical and Mesenchymal subtypes based on genomic abnormalities from The Cancer Genome Atlas (TCGA) dataset. The highly proliferative nature of glioblastoma cells is due to alterations in several signaling pathways, including oncogenes and tumor suppressor genes.
  • BMP Bone morphogenetic proteins
  • the present inventors have shown that, in addition to BMP-4 inducing the growth arrest and differentiation of glioblastoma stem cells (GIC), the expression of HVEM in specific glioblastoma cells causes BMP. It was found to be suppressed by -4. The present inventors also found that HVEM expression was preferentially increased in glioblastoma multiforme among human adult brain tumors, and that among the four subtypes of GBM, HVEM expression was highest in the Mesenchymal subtype. Found.
  • GAC glioblastoma stem cells
  • the present inventors also found that suppression of HVEM expression in Mesenchymal subtype cell culture attenuates cell proliferation and neurosphere formation, and when Mesenchymal subtype cells with suppressed HVEM expression were injected into the mouse skull, It was found that the tumorigenicity is reduced and the survival time of mice is prolonged. We have also found that overexpression of HVEM enhances glioblastoma cell proliferation and neurosphere formation in cell culture, and intracranial injection of the cells shortens mouse survival. The present inventors further demonstrated that intraperitoneal administration of anti-mouse HVEM antibody to mice in which HVEM-expressing mouse glioma GL261 cells were orthotopically transplanted resulted in decreased tumorigenicity and prolonged survival of mice.
  • the present inventors also found that in GBM, the expression of APRIL, which was not reported as a ligand for HVEM, was high, while the expression of a known ligand for HVEM was low.
  • the inventors have also found that suppressing APRIL expression in Mesenchymal subtype cell cultures attenuates cell proliferation and neurosphere formation.
  • the present inventors also found that APRIL transmits a signal to HVEM by co-culturing HVEM-expressing cells and APRIL-expressing cells.
  • an anti-human HVEM antibody produced by Alpaca suppresses the growth of Mesenchymal subtype cells.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention aims to provide a novel therapeutic or prophylactic agent for glioma.
  • the present invention also aims to provide markers of malignancy of brain tumors and prognostic markers of brain tumors.
  • Another object of the present invention is to provide a method for determining the malignancy of brain tumors and a method for determining the prognosis of brain tumor patients.
  • Still another object of the present invention is to provide a novel antibody that suppresses tumor growth.
  • a therapeutic or prophylactic agent for glioma which comprises an HVEM inhibitor as an active ingredient.
  • the glioma is any of oligodendroglioma, oligoastrocytoma, astrocytoma, and glioblastoma multiforme.
  • the glioblastoma multiforme belongs to any of Proneural subtype, Neural subtype, Classical subtype, and Mesenchymal subtype.
  • the HVEM inhibitor is an antibody or nucleic acid against HVEM.
  • the antibody against HVEM is an antibody that inhibits the binding between HVEM and a ligand.
  • a therapeutic or prophylactic agent according to any one of [1] to [7] above, which is to be administered to a subject whose HVEM expression level exceeds the HVEM expression level of a healthy subject or the HVEM expression level of a normal tissue sample.
  • a marker of malignancy of brain tumor or a prognosis marker of brain tumor which comprises HVEM protein or HVEM gene.
  • a method for determining the malignancy of a brain tumor which comprises the step of measuring the expression level of HVEM in a target biological sample.
  • Complementarity determining regions 1 to 3 (CDR1, CDR2 and CDR3), and the amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 are (i), (ii), (iii), (iv), ( v), (vi) or (vii) which is the immunoglobulin single variable domain according to the above [15]
  • CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, the amino acid represented by SEQ ID NO: 37 CDR2 containing the sequence and CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:38;
  • the immunoglobulin single variable domain includes a framework region (FR1, FR2, FR3 and FR4), and the amino acid sequences of FR1, FR2, FR3 and FR4 are (viii), (ix), (x ), (xi), (xii), (xiii) or (xiv), FR1 comprising the immunoglobulin variable domain (viii) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 57 according to the above [16], SEQ ID NO: 58 FR2 containing the amino acid sequence represented by, FR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:59 and FR4 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:60; (Ix) FR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 61, FR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62, FR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 63 and the amino acid represented by SEQ ID NO: 64 FR4 containing the sequence; (X
  • the immunoglobulin variable domain (xv) according to [15] above, which comprises the polypeptide of (xv), (xvi) or (xvii) below, having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 29 to 35.
  • (Xvi) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 29 to 35, and having HVEM binding ability and tumor growth inhibitory ability;
  • the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 29 to 35 which contains an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and/or added, and has HVEM binding ability and tumor growth inhibitory ability
  • [20] A polynucleotide encoding the immunoglobulin single variable domain according to any of [15] to [18] above or the antibody or multimer according to [19] above.
  • a pharmaceutical composition comprising the immunoglobulin single variable domain according to any of [15] to [18] above or the antibody or multimer according to [19] above.
  • a method for treating or preventing glioma which comprises the step of administering an effective amount of an HVEM inhibitor to a subject in need thereof.
  • a method for treating glioma which comprises the step of performing the method for determining the malignancy of a brain tumor according to any of [10] to [12] above, and whether the patient has a high-grade brain tumor.
  • a subject determined to be likely to be affected or a subject determined to be, or likely to be suffering from glioma
  • an effective amount of an anticancer agent in particular, a method of treatment comprising the step of administering an HVEM inhibitor.
  • the agents of the above [1], [23] and [24] are referred to as the "agent of the present invention", and the compositions of the above [1], [23] and [24] are In the specification, they may be referred to as “the composition of the present invention”.
  • a novel therapeutic or prophylactic agent for glioma which is a relatively high frequency of occurrence of brain tumors and which is difficult to cure, and a means for determining malignancy of brain tumors and prognosis of brain tumor patients are provided.
  • glioma especially glioblastoma multiforme
  • the present invention is advantageous in that it can provide a novel therapeutic strategy for malignant brain tumors including glioma.
  • FIG. 1 a is a diagram showing the inhibitory effect of BMP signaling in GBM cells in Example 1.
  • FIG. 1b is a diagram showing the inhibitory effect of BMP signaling in GBM cells in Example 1.
  • Sphere formation of GBM cells (U3024MG, U3031MG and U3054MG) was measured in the presence or absence of 30 ng/mL recombinant human BMP-4.
  • FIG. 2 shows HVEM quantitative RT-PCR analysis of GBM cells treated with BMP-4 in Example 2.
  • FIG. 3a is a diagram showing that the expression level of HVEM is elevated in malignant brain tumors in Example 3. Expression levels of HVEM in normal brain and brain tumor tissues in the TCGA dataset (**P ⁇ 0.01, ***P ⁇ 0.001; two-sided Kruskal-Wallis test with Bonferroni correction).
  • FIG. 3b is a diagram showing that the expression level of HVEM in Example 3 was elevated in malignant brain tumors and correlated with the prognosis of brain tumor patients.
  • FIG. 4c is a diagram showing that blocking of HVEM inhibits neurosphere formation of Mesenchymal subtype cells in cell culture in Example 4. Sphere formation of Mesenchymal subtype cells expressing HVEM shRNA or control shRNA.
  • Example 5a also shows that HVEM silencing in Example 5 attenuates the in vivo tumorigenic activity of Mesenchymal subtype cells. Images of Mesenchymal subtype cells expressing shRNA and firefly luciferase in the mouse skull by an in vivo bioluminescence imaging system. The luminescence intensity of the tumor composed of firefly luciferase-expressing GBM cells orthotopically transplanted to the mouse head was observed 15 weeks after the transplantation. For U3054 MG cells, 4 mice each were used in the experiment.
  • FIG. 5b shows that silencing of HVEM attenuates the in vivo tumorigenic activity of Mesenchymal subtype cells in Example 5.
  • FIG. 6b shows that ectopic HVEM promotes neurosphere formation in non-Mesenchymal subtype cells in Example 6. Sphere formation of non-Mesenchymal subtype cells expressing HVEM or EGFP (control).
  • Figure 7a shows that ectopic HVEM enhances in vivo tumorigenic activity of non-Mesenchymal subtype cells in Example 6. Images from an in vivo bioluminescence imaging system of non-Mesenchymal subtype cells (U3047MG) expressing EGFP or HVEM grown in the mouse skull. The luminescence intensity of a tumor consisting of non-Mesenchymal subtype cells expressing firefly luciferase and EGFP or HVEM orthotopically transplanted in the mouse head was observed 7 weeks after the transplantation.
  • Figures 8a and b show that HVEM is required for in vivo progression of mouse glioma cells in Example 7.
  • FIG. 1 Expression level of HVEM in mouse glioma GL261 cell line.
  • B Intracranial growth of GL261 cells expressing HVEM or control shRNA in the brain of C57BL/6J mice. EGFP and shRNA were co-transduced into GL261 cells with lentivirus. Mouse brain tissue was subjected to hematoxylin and eosin (H&E) staining or bioluminescence imaging of EGFP.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • mice 8c shows that HVEM is required for in vivo progression of mouse glioma cells in Example 7.
  • the upper figure shows hematoxylin-eosin stained brain tissue 25 days after intracranial orthotopic transplantation of mouse glioma cells GL261.
  • 9a and b are diagrams showing the expression of HVEM ligands in brain tumors in Example 8.
  • (A) Quantitative RT-PCR analysis of APRIL during lentivirus-mediated shRNA APRIL knockdown in Mesenchymal subtype cells (U3054MG). Data are shown as mean ⁇ SD (n 3 biological replicates).
  • FIG. 10d and e are diagrams showing the effect of APRIL inhibition in Example 9.
  • FIG. 10f is a diagram showing APRIL receptor expression in Mesenchymal subtype cells in Example 9.
  • FIG. 11 is a diagram showing that APRIL transmits a signal of HVEM in Example 10.
  • A HEK293T cells expressing HVEM were co-cultured with HEK293T cells expressing soluble ligands (APRIL, LIGHT or SALM5). Data are presented as mean ⁇ SD of NF- ⁇ B relative activity in HEK293T cells expressing HVEM or control vector.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of HVEM gene knockout (KO) by genome editing in Example 11.
  • B Human HVEM gene knockout inhibits neurosphere formation in Mesenchymal subtype cells in cell culture.
  • FIG. 13 is a diagram showing the amino acid sequence of the variable region of the alpaca-derived VHH antibody using human HVEM protein as an antigen in Example 12.
  • CDR represents the complementarity determining region, and FR represents the framework region.
  • HVEM is an abbreviation for Herpes Virus entry mediator and refers to a type I transmembrane protein belonging to the TNF/NGF receptor superfamily.
  • HVEM is also called TNFRSF14 (tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member 14), CD270, LIGHTTR or ATAR. That is, “HVEM” in the present invention is synonymous with “HVEM/TNFRSF14”.
  • HVEM is expressed on various tissues and cells including T cells, B cells, natural killer cells, dendritic cells, hematopoietic cells and non-hematopoietic cells (parenchymal cells) (Pasero C et al., Curr Opin Pharmacol. , 12: 478-485 (2012)).
  • Multiple ligands are known to bind to HVEM, including TNF-related cytokines such as LIGHT and LT ⁇ and non-TNF-related cytokines such as BTLA, CD160 and SALM5.
  • the human HVEM gene is based on the nucleotide sequence published in HGNC:11912
  • the mouse HVEM gene is based on the nucleotide sequence published in MGI:2675303.
  • the human HVEM protein is based on the amino acid sequence published in GenBank Accession No. NP_003811.2
  • the mouse HVEM protein is based on the amino acid sequence published in GenBank Accession No. NP_849262.1. ..
  • human HVEM mRNA is based on GenBank Accession No. NM_003820.3
  • mouse HVEM mRNA is based on GenBank Accession No. NM_178931.2.
  • HVEM inhibitor is used to include a substance that inhibits the expression of HVEM and a substance that inhibits the function of HVEM.
  • the substance that inhibits the expression of HVEM include nucleic acids for HVEM (eg, nucleic acids targeting HVEM such as antisense nucleic acid, siRNA, shRNA, microRNA, gRNA, and ribozyme).
  • the substance that inhibits the function of HVEM includes a substance that interacts with HVEM to inhibit the function, a substance that inhibits the binding between HVEM and a ligand, and the like, and examples thereof include an antibody and an aptamer.
  • APRIL is mentioned as a ligand of HVEM.
  • APRIL is an abbreviation for "a life-inducing ligand” and is also called TNFRSF13 (tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member 13). That is, “APRIL” in the present invention is synonymous with “APRIL/TNFRSF13”.
  • An antisense nucleic acid is a nucleic acid complementary to a target sequence.
  • the antisense nucleic acid inhibits transcription initiation by triplex formation, suppresses transcription by hybridizing with a site where an open loop structure is locally formed by RNA polymerase, inhibits transcription by hybridizing with RNA that is being synthesized, Inhibition of splicing by hybridization at the junction of intron and exon, suppression of splicing by hybridization with spliceosome formation site, suppression of translocation from nucleus to cytoplasm by hybridization with mRNA, capping site and poly(A) addition site
  • splicing suppression by hybridization with the translation initiation factor translation initiation suppression by hybridization with the translation initiation factor binding site, translation suppression by hybridization with the ribosome binding site near the initiation codon, by hybridization with the mRNA translation region or polysome binding site
  • the expression of the target gene can be suppressed by blocking the elongation of the peptide chain, suppressing the gene expression by
  • the antisense nucleic acid for HVEM is, for example, a single-stranded nucleic acid complementary to a part of the base sequence selected from the aforementioned HVEM gene sequence, the aforementioned HVEM amino acid sequence-encoding nucleotide sequence, and the aforementioned HVEM mRNA sequence.
  • the nucleic acid may be a naturally occurring nucleic acid or an artificial nucleic acid, and may be based on either DNA or RNA.
  • the length of the antisense nucleic acid is usually about 15 bases to about the same length as the entire length of mRNA, preferably about 15 to about 30 bases.
  • the complementarity of the antisense nucleic acid does not necessarily have to be 100%, and may be such that it can bind complementarily to the DNA or RNA encoding HVEM in vivo.
  • siRNA small interfering RNA
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • siRNA is obtained by synthesizing a sense strand and an antisense strand oligonucleotide with an automatic DNA/RNA synthesizer, and denaturing them in an appropriate annealing buffer at 90 to 95°C for about 1 minute, and then at 30 to 70°C. It can be prepared by annealing for about 1 to 8 hours.
  • the length of siRNA is preferably 19 to 27 base pairs, more preferably 21 to 25 base pairs or 21 to 23 base pairs.
  • SiRNA against HVEM can be designed based on its nucleotide sequence so as to cause degradation (RNA interference) of mRNA transcribed from the HVEM gene.
  • Examples of siRNA that inhibits the expression of HVEM include siRNA that uses the above-mentioned HVEM mRNA sequence as a target sequence.
  • ShRNA short hairpin RNA
  • shRNA is an artificially synthesized hairpin-type RNA sequence used for gene silencing by RNA interference (degradation of mRNA).
  • shRNA may be introduced into cells by a vector and expressed by U6 promoter or H1 promoter, or an oligonucleotide having an shRNA sequence may be synthesized by a DNA/RNA automatic synthesizer and self-annealed by the same method as siRNA. It may be prepared by The hairpin structure of shRNA introduced into cells is cleaved into siRNA and bound to RNA-induced silencing complex (RISC). This complex binds to and cleaves mRNA having a sequence complementary to siRNA, whereby sequence-specific gene expression can be suppressed.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • ShRNA for HVEM can be designed based on its nucleotide sequence so as to cause degradation (RNA interference) of mRNA transcribed from the HVEM gene.
  • shRNA that inhibits the expression of HVEM include shRNA whose target sequence is the above-mentioned HVEM mRNA sequence.
  • MiRNA is a functional nucleic acid that is encoded on the genome and undergoes a multistep generation process to finally become a microRNA of about 20 bases. miRNAs are classified into functional ncRNAs (non-coding RNAs, non-coding RNAs: a general term for RNAs that are not translated into proteins), and play an important role in the life phenomenon of regulating the expression of other genes. There is.
  • the expression of the HVEM gene can be suppressed by introducing miRNA having a specific nucleotide sequence into a cell by a vector and administering it to a living body.
  • GRNA guide RNA
  • gRNA specifically recognizes a target sequence, guides binding of Cas9 protein to the target sequence, and enables gene knockout or knockin.
  • the expression of HVEM gene can be suppressed in vivo by administering gRNA targeting HVEM gene in vivo.
  • gRNA is meant to include sgRNA (single guide RNA).
  • the design method of gRNA in the genome editing technology is widely known, and can be appropriately designed by referring to, for example, Benchmarking CRISPR on-target sgRNA design, Yan et.al., Brief Bioinform, 15 Feb 2017.
  • Ribozymes are RNAs that have catalytic activity. Although there are various ribozymes having various activities, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for the purpose of site-specific cleavage of RNA.
  • the ribozyme may have a size of 400 nucleotides or more such as group I intron type and M1RNA contained in RNaseP, and may have about 40 nucleotides called hammerhead type and hairpin type.
  • Aptamers include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • Nucleic acid aptamers and peptide aptamers used in the present invention are SELEX method (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), mRNA display (mRNA display) method, etc. It can be obtained by using an in vitro molecular evolution method in which after formation, selection is performed based on affinity.
  • the antisense nucleic acid, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme and nucleic acid aptamer may contain various chemical modifications in order to improve stability and activity.
  • the phosphate residue may be replaced with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, and the like.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate methylphosphonate
  • phosphorodithionate and the like.
  • at least a part may be composed of a nucleic acid analog such as a peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • the antibody against HVEM is an antibody that specifically binds to HVEM and that inhibits the function of HVEM by binding.
  • the antibody against HVEM the immunoglobulin single variable domain of the present invention described below, the antibody of the present invention and the immunoglobulin single variable domain multimer of the present invention can be used.
  • An antibody against HVEM can be produced according to a known antibody or antiserum production method using HVEM protein or a part thereof as an antigen.
  • the HVEM protein or a part thereof can be prepared by known protein expression methods and purification methods.
  • Examples of the HVEM protein include, but are not limited to, human HVEM and the like defined by the above-mentioned sequence information of HVEM.
  • HVEM proteins from various organisms may be used as the immunogen.
  • Antibodies against HVEM that can be used in the present invention can also be produced via the phage display method (see, for example, FEBS Letter, 441:20-24 (1998)).
  • glioma is a general term for tumors that arise from neuroectodermal tissue of brain parenchyma, and accounts for 30 to 40% of primary intracranial tumors, and is the most frequent brain tumor. .. Gliomas include oligodendroglioma, oligoastrocytoma, astrocytoma, and glioblastoma multiforme. “Glioblastoma multiforme” is also called glioblastoma or atypical glioma and is a glioma mainly composed of undifferentiated cells derived from stellate cells.
  • Glioblastoma multiforme nuclear polymorphism is prominent, and necrosis and vascular endothelial proliferation are observed.
  • Glioblastoma multiforme is fast-growing, extensively infiltrating, and often occurs in the adult cerebrum. It has been reported that glioblastoma multiforme is classified into four subtypes of Proneural, Neural, Classical, and Mesenchymal (Verhaak R G et al., Cancer Cell, 17: 98-110 (2010)).
  • HVEM is highly expressed in genoblastoma of the Mesenchymal subtype
  • the agents and compositions of the present invention have a glioblastoma multiforme (especially of the Mesenchymal subtype).
  • it can be preferably used for reducing the risk of developing glioma (particularly glioblastoma multiforme of the Mesenchymal subtype) as described below.
  • the HVEM inhibitor which is an active ingredient of the present invention, is used for a subject whose HVEM expression level exceeds the HVEM expression level of a healthy subject or the HVEM expression level of a normal tissue sample (for example, a brain tumor patient), particularly a brain tumor patient.
  • a HVEM inhibitor can be administered to a subject that highly expresses HVEM therein.
  • the subject to be treated and prevented according to the present invention may be HVEM expression-dependent glioma or HVEM ligand-dependent glioma. Whether the subject highly expresses HVEM, whether the glioma is HVEM-dependent, and whether the glioma is HVEM-ligand-dependent was performed, for example, on brain tumor patients.
  • the brain tissue excised at the time of brain surgery can be evaluated, and details can be determined according to the determination method of the present invention described below and the procedure described in the examples.
  • the agents and compositions of the present invention can also be administered to subjects at risk of developing glioma (especially glioblastoma multiforme), thereby reducing the risk of developing glioma.
  • a subject at risk of developing glioma is a subject who has no subjective symptoms of glioma, or has not been diagnosed with glioma, but who is at risk of developing glioma in the future. And a brain tumor patient who has not been diagnosed with glioma or a brain tumor patient who has undergone resection of brain tumor tissue.
  • “reducing the risk of developing glioma” means reducing the probability of developing glioma, and reducing the probability of developing glioma improves the prognosis of malignant brain tumors.
  • a composition for reducing the risk of developing glioma and a composition for reducing the risk of developing glioma which comprises an HVEM inhibitor as an active ingredient
  • a prognosis improving agent in the treatment of malignant brain tumor and a composition for a prognosis improving agent in the treatment of malignant brain tumor, which comprises an HVEM inhibitor as an active ingredient.
  • the agent and composition of the present invention can be provided as a medicine or a pharmaceutical composition.
  • the drug and the pharmaceutical composition of the present invention comprise an HVEM inhibitor and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical products and pharmaceutical compositions of the present invention also include pharmaceutical products and pharmaceutical compositions intended for gene therapy.
  • Such drugs and pharmaceutical compositions contain, as an active ingredient, nucleic acids targeting HVEM such as antisense nucleic acid, siRNA, shRNA, microRNA, gRNA, and ribozyme.
  • the drug and the pharmaceutical composition of the present invention may contain an active ingredient other than the HVEM inhibitor, or may be used in combination with an active ingredient other than the HVEM inhibitor or a drug or a pharmaceutical composition containing the same.
  • the active ingredient other than the HVEM inhibitor include anticancer agents (particularly, anticancer agents for treating malignant brain tumor).
  • the route of administration is not particularly limited as long as a therapeutic or prophylactic effect for glioma (particularly glioblastoma multiforme) can be obtained.
  • Parenteral administration eg, intravenous administration, local administration (including local administration using a catheter), subcutaneous administration, intraperitoneal administration) is preferable.
  • an appropriate dosage form can be selected according to a specific administration form, and examples thereof include injections and suppositories.
  • These preparations can be prepared using a pharmaceutically acceptable carrier by a method usually used in this field (for example, a known method described in the 15th Revised Japanese Pharmacopoeia General Rules for Preparation, etc.).
  • Pharmaceutically acceptable carriers include excipients, binders, diluents, additives, fragrances, buffers, thickeners, colorants, stabilizers, emulsifiers, dispersants, suspending agents, preservatives, etc. Are listed.
  • the dose of the HVEM inhibitor in the present invention can be determined depending on the type of active ingredient, sex of the subject, age and weight, symptoms, dosage form, administration route, and the like.
  • the dose per adult is, for example, 0.0001 mg to 1000 mg/kg body weight.
  • the range can be determined, but is not limited thereto.
  • the daily dose of an HVEM inhibitor for an adult can be determined depending on the type of active ingredient, sex of the subject, age and weight, symptoms, dosage form, administration route, and the like.
  • the active ingredient may be administered once a day or in 2 to 4 divided doses.
  • the agents and compositions of the present invention include not only humans in need thereof but also mammals other than humans (for example, mouse, rat, rabbit, dog, cat, cow, horse, pig, sheep, goat, monkey). Can also be administered to.
  • HVEM glioblastoma multiforme belonging to Mesenchymal subtype
  • HVEM prognostic marker of brain tumor
  • high expression of HVEM correlates with brain tumor, particularly glioblastoma multiforme belonging to Mesenchymal subtype, and high HVEM. Expression was shown to correlate with poor prognosis in glioblastoma patients. It was also confirmed that overexpression of HVEM promotes the growth of glioblastoma multiforme cells, neurosphere formation, and tumor growth in vivo, respectively. Therefore, according to the present invention, a marker of brain tumor malignancy consisting of HVEM protein or HVEM gene and a prognosis marker of brain tumor consisting of HVEM protein or HVEM gene are provided.
  • the marker for malignancy of brain tumor of the present invention can be used for determining the malignancy of brain tumor in a brain tumor patient, and can also be used for determining glioma (particularly glioblastoma multiforme).
  • the brain tumor prognosis marker of the present invention can be used for predicting or estimating the prognosis of a brain tumor patient in the treatment of brain tumor. Therefore, these markers of the present invention are useful as an index when determining a therapeutic strategy for brain tumors.
  • the HVEM protein or HVEM gene is preferably of human origin.
  • the HVEM gene may be DNA consisting of the genomic sequence of the HVEM gene, or may be mRNA of the HVEM gene or cDNA obtained by reverse transcribing the mRNA of the HVEM gene. ..
  • the marker of the present invention can be implemented according to the method of determining the malignancy of brain tumor of the present invention and the method of determining the prognosis of a brain tumor patient of the present invention described below.
  • a method for determining the malignancy of brain tumor which comprises the step of measuring the HVEM expression level in a biological sample of a subject (particularly a brain tumor patient). Provided.
  • the “biological sample” means a sample separated from a living body, and examples thereof include a brain tissue excised during brain surgery.
  • a step of measuring the expression level of HVEM in a biological sample of a test subject is carried out.
  • the HVEM expression level can be measured in vitro by a known method.
  • the expression level of HVEM in a biological sample can be measured based on the expression level of HVEM protein.
  • the expression level of the HVEM protein can be measured by a known detection means using a specific binding substance for the HVEM protein, for example, ELISA, Western blot, immunohistochemical staining and the like. it can.
  • An antibody is mentioned as a specific binding substance for the HVEM protein, and the agents and compositions of the present invention and those described for the antibody of the present invention can be used.
  • the expression level of HVEM in the biological sample can also be measured based on the expression level of the HVEM gene.
  • the expression level of the HVEM gene can be measured by a known method such as RT-PCR, quantitative RT-PCR, DNA microarray analysis and Northern blotting.
  • the probe and primer set used for measuring the expression level of the HVEM gene can be prepared based on the sequence information of the HVEM gene described above with reference to the examples described later.
  • a step of determining the degree of malignancy of tumor cells contained in a biological sample can be further carried out based on the HVEM expression level measured in the step (A). ..
  • the biological sample when the HVEM expression level in the biological sample of the subject exceeds the HVEM expression level in the biological sample of the healthy subject or in the normal tissue sample (preferably when it exceeds the significant amount), the biological sample Are shown to contain highly aggressive tumor cell populations (eg, glioma cells, especially glioblastoma multiforme cells).
  • the method for determining malignancy of the present invention is (B1) when the HVEM expression level in the target biological sample exceeds the HVEM expression level in the healthy target biological sample or the normal tissue sample (preferably If it exceeds by a significant difference), the biological sample may further comprise the step of determining that the biological sample contains a high-grade tumor cell population.
  • a step of determining malignancy of brain tumor in a subject from which a biological sample is collected can be further performed based on the HVEM expression level measured in the step (A). ..
  • the HVEM expression level in the biological sample of the subject exceeds the HVEM expression level in the biological sample of the healthy subject or in the normal tissue sample (preferably if it exceeds with significant difference)
  • the subject is malignant. It is shown to suffer from frequent brain tumors such as gliomas, especially glioblastoma multiforme.
  • the method for determining malignancy of the present invention is (B2) when the HVEM expression level in the target biological sample exceeds the HVEM expression level in the healthy target biological sample or the normal tissue sample (preferably The method may further comprise the step of determining that the subject suffers from a high-grade brain tumor (if significantly exceeded).
  • a tumor cell population with high malignancy such as glioma cells can be detected in a test biological sample.
  • a highly malignant brain tumor such as glioma can be detected in a subject. Therefore, the method for determining malignancy according to the present invention is useful in providing appropriate information for determining a treatment policy for brain tumor. That is, the method of determining malignancy of the present invention can be used as an auxiliary to the diagnosis and/or differentiation of glioma (particularly glioblastoma multiforme), and whether the subject has glioma. The judgment can be finally made by a doctor, possibly in combination with other findings.
  • a method for determining the prognosis of a brain tumor patient which comprises the step of measuring the HVEM expression level in a biological sample of a subject (particularly a brain tumor patient).
  • the step of measuring the HVEM expression level in the biological sample of the test subject is carried out.
  • the HVEM expression level can be measured in the same manner as the method for determining malignancy of the present invention.
  • the step of determining the prognosis of the subject from which the biological sample is collected can be further performed based on the HVEM expression level measured in the step (C). In this step, if the HVEM expression level in the biological sample of the subject exceeds the HVEM expression level in the biological sample of the healthy subject or in the normal tissue sample (preferably with a significant difference), the prognosis of the subject Is shown to be bad.
  • the method for determining malignancy of the present invention is (D) when the HVEM expression level in the target biological sample exceeds the HVEM expression level in the healthy target biological sample or the normal tissue sample (preferably The method may further include the step of determining that the prognosis of the subject is poor, if the results are significant.
  • the HVEM expression level (cutoff value) in a biological sample of a healthy subject or in a normal tissue sample is a biological sample previously collected from a plurality of healthy subjects, or a plurality of subjects (including a brain tumor patient) in advance.
  • the average value calculated by measuring the HVEM expression level in the normal tissue collected from can be used, or the value calculated by the above formula (1) can be used.
  • poor prognosis means that survival rate is lower within a predetermined period, brain tumor with high malignancy (for example, glioma, particularly glioblastoma multiforme). ) Is likely to develop.
  • the prognosis of a brain tumor patient can be predicted or estimated in the treatment of brain tumor. Therefore, the prognosis determination method of the present invention is useful in that it provides appropriate information for determining the treatment policy for brain tumors. That is, the prognosis determination method of the present invention can be used as an adjunct to the treatment of brain tumors (eg, glioma, particularly glioblastoma multiforme), and the determination of whether or not the subject has a poor prognosis depends on the case. Some can be combined with other findings and eventually done by a doctor.
  • brain tumors eg, glioma, particularly glioblastoma multiforme
  • an immunoglobulin single variable domain that specifically binds to HVEM and suppresses growth of tumor cells (especially growth of malignant tumor cells) is provided.
  • the single variable domain of the invention is capable of binding to HVEM with an EC50 value of less than 80 nM.
  • the single variable domain of the present invention can be characterized by complementarity determining regions 1 to 3 (CDR1, CDR2 and CDR3), and CDR1, CDR2 and CDR3 can be characterized by the aforementioned (i), (ii), (iii), ( iv), (v), (vi) and (vii) can be specified by the combination of CDR1, CDR2 and CDR3.
  • CDR1, CDR2 and CDR3 complementarity determining regions 1 to 3
  • CDR1, CDR2 and CDR3 can be characterized by the aforementioned (i), (ii), (iii), ( iv), (v), (vi) and (vii) can be specified by the combination of CDR1, CDR2 and CDR3.
  • the single variable domain of the invention can also be characterized by framework regions 1 to 4 (FR1, FR2, FR3 and FR4), wherein FR1, FR2, FR3 and FR4 are described above (viii), (ix), ( x), (xi), (xii), (xiii) and (xiv) can be specified by a combination of FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • the single variable domain of the present invention can be specified by the complementarity determining regions 1 to 3 and the framework regions 1 to 4, and in this case, the single variable domain of the present invention is FR1-CDR1- from the N-terminal side. FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 can be connected in this order.
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of the single variable domain of the present invention are the combination of (i) above, (viii) can be selected as the combination of FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • the combination of FR1, FR2, FR3 and FR4 can select the above (ix).
  • the combination of FR1, FR2, FR3 and FR4 can select the above (x).
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of the single variable domain of the present invention are the combination of (iv) above, the combination of FR1, FR2, FR3 and FR4 can select the above (xi).
  • the combination of FR1, FR2, FR3 and FR4 can select the above (xii).
  • the combination of FR1, FR2, FR3 and FR4 can select the above (xiii).
  • the combination of FR1, FR2, FR3 and FR4 can select the above (xiii).
  • the combination of FR1, FR2, FR3 and FR4 can select the above (xiv).
  • the single variable domain of the present invention can also be specified by the single variable domain sequenced in the Examples (polypeptide of (xv) above), but in the present invention, in addition to this, the above (xv) Polypeptides that are substantially identical to the polypeptides described above are also included in the single variable domain of the present invention.
  • polypeptides substantially identical to the single variable domain of the present invention include humanized single variable domains.
  • Methods for humanizing single variable domains are known, for example, the sequence of a framework region of a naturally occurring amino acid sequence of a single variable domain may be compared to one or more closely related amino acid sequences of a human single variable domain.
  • the potentially useful humanized substitutions were identified by comparison with the corresponding framework sequences of, and the potentially useful humanized substitution(s) thus determined were
  • a humanized single variable domain can be obtained by introducing it into the amino acid sequence of the single variable domain.
  • the humanized single variable domain thus obtained may be subjected to confirmatory tests for affinity to target, stability and other desired properties to determine the amino acid sequence of the appropriate humanized single variable domain. it can.
  • a polypeptide substantially identical to the single variable domain of the present invention can be represented by a polypeptide selected from the above (xvi) and (xvii).
  • identity is used to include “homology”.
  • identity is, for example, the degree of identity when the sequences to be compared are properly aligned (alignment), and means the appearance rate (%) of exact matches of amino acids between the sequences. ..
  • identity for example, the presence of a gap in the sequence and the nature of the amino acid are considered (Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983)).
  • the alignment can be performed by using an arbitrary algorithm, for example, specifically, BLAST (Basic local alignment search tool) (Altschul et al., J. Mol. Biol.
  • the identity in the above (xvi) can be 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • amino acid sequence in the amino acid sequence, one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and/or added means, for example, the degree of occurrence by a known method such as site mutagenesis. It means that, or a naturally occurring number of amino acids have been modified by deletion, substitution, insertion and/or addition.
  • the number of amino acids modified by the substitution or the like is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 or 2, or It is one.
  • the modification may occur, for example, continuously or discontinuously.
  • the insertion of the amino acid in the above (xvii) includes, for example, insertion inside the amino acid sequence. Further, the addition of the amino acid in the above (xvii) may be, for example, addition to the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence, or addition to both N-terminal and C-terminal.
  • the amino acid substitution in (xvii) above means that the amino acid residue constituting the amino acid sequence is replaced with another type of amino acid residue.
  • the amino acid substitution in (xvii) above may be, for example, a conservative substitution.
  • Constant substitution means the replacement of one or more amino acids with another amino acid and/or amino acid derivative so as not to substantially alter the function of the protein.
  • the amino acid to be substituted and the amino acid after substitution preferably have similar properties and/or functions, for example.
  • the indices of hydrophobicity and hydrophilicity, chemical properties such as polarity and charge, or physical properties such as secondary structure are similar.
  • amino acids or amino acid derivatives with similar properties and/or functions are known in the art.
  • non-polar amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • polar amino acids neutral amino acids
  • examples of polar amino acids (neutral amino acids) include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine and cysteine.
  • examples of the amino acid (basic amino) acid having a positive charge include arginine, histidine and lysine, and examples of the amino acid having a negative charge (acidic amino acid) include aspartic acid and glutamic acid.
  • Preferred amino acid modifications in the above (xvii) include one amino acid substitution, two amino acid substitution, three amino acid substitution, four amino acid substitution, five amino acid substitution, six amino acid substitution or seven amino acids, and more preferably the substitution is conservative. It is a substitution. Preferred amino acid modifications in (xvii) also include those in which the framework regions 1 to 4 are modified, and more preferred are those in which the framework regions 1 to 4 are modified. The preferable amino acid modification in the above (xvii) is also one amino acid substitution, two amino acid substitution, three amino acid substitution, four amino acid substitution, five amino acid substitution, six amino acid substitution or seven amino acids, and the modification is a framework.
  • the modification is one amino acid substitution, two amino acid substitutions, three amino acid substitutions, four amino acid substitutions, five amino acid substitutions, six amino acid substitutions or seven amino acids, and the alterations Occurs only in the framework regions 1 to 4.
  • an antibody and immunoglobulin single variable domain multimer comprising a single variable domain of the invention.
  • Such antibodies include so-called heavy chain antibodies (or VHH antibodies) composed of only two heavy chains as variable regions.
  • the multimer includes a complex in which a plurality of single variable domains of the present invention are bound to each other directly or via a linker, and such a complex includes 1 other than the single variable domain of the present invention.
  • One kind or two or more kinds of optional components for example, physiologically active peptide, stabilizing substance may be further linked.
  • the single variable domain, antibody and multimer of the present invention can be produced, for example, by expressing a polynucleotide encoding these in a host and recovering the expression product. Therefore, according to yet another aspect of the invention, a polynucleotide encoding a single variable domain, antibody or multimer of the invention, and a polynucleotide of the invention or a polynucleotide of the invention is operably linked.
  • a host cell into which the vector has been introduced is provided.
  • the “polynucleotide encoding a single variable domain or the like” can be specified based on the amino acid sequence of the single variable domain or the like based on the genetic code (ie, codon).
  • the "polynucleotide” includes DNA and RNA, and further includes modified forms thereof and artificial nucleic acids, and is preferably DNA.
  • DNA includes cDNA, genomic DNA, and chemically synthesized DNA.
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it can be expressed in the host to be used and is composed of codons encoding a single variable domain having HVEM binding activity. Codons may be optimized to allow expression or to increase the expression level. Codon optimization can be performed by a known method usually used in this field.
  • the single variable domain and the like of the present invention can be expressed in and using a variety of host cells, such as bacterial cells, molds, animal cells, plant cells, baculovirus/insect cells or yeast cells. .. Expression vectors for expressing the single variable domain and the like of the present invention are known, and a vector suitable for various host cells can be used.
  • bacterial cells or cultured cells When extracting a single variable domain or the like expressed in a host from cultured bacterial cells or cells, after culturing, the bacterial cells or cultured cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer solution, and After destroying the bacterial cells or cells by sonication, lysozyme and/or freeze-thawing, a soluble extract is obtained by centrifugation or filtration, and a known separation/purification method is appropriately combined from the obtained extract.
  • a single variable domain of interest can be obtained.
  • Known separation and purification methods include solubility-based methods such as salting-out and solvent precipitation methods, dialysis methods, ultrafiltration methods, gel filtration methods, SDS-PAGE and other methods that mainly utilize differences in molecular weight, and ions.
  • the single variable domain, antibody or multimer of the present invention has HVEM binding activity and can suppress tumor growth.
  • the substance that inhibits the expression of HVEM or the substance that inhibits the function of HVEM can be used for the treatment or prevention of glioma
  • the single variable domain, antibody or multimer of the present invention has a pharmaceutical composition. It can be used as an active ingredient of a product, and particularly as an active ingredient of the agents and compositions of the present invention (ie, therapeutic and prophylactic agents for glioma).
  • a method of treating or preventing glioma comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an HVEM inhibitor.
  • Another aspect of the present invention also provides a method for reducing the risk of developing glioma, comprising administering an effective amount of an HVEM inhibitor to a subject in need thereof.
  • a method for improving prognosis in the treatment of malignant brain tumor which comprises administering an effective amount of an HVEM inhibitor to a subject in need thereof.
  • the method of the present invention can be carried out as described for the agents and compositions of the present invention.
  • the method for determining malignancy of the present invention is carried out, and then an effective amount of an anti-cancer agent (for example, an anti-cancer agent for treating malignant brain tumor, preferably an HVEM inhibitor, particularly HVEM) is used.
  • an anti-cancer agent for example, an anti-cancer agent for treating malignant brain tumor, preferably an HVEM inhibitor, particularly HVEM
  • a subject or a glioma that is determined to have, or is likely to have, a high-grade brain tumor that has a substance that inhibits the binding to APRIL.
  • a method for treating malignant tumor or glioma is provided, which comprises administering to a subject determined to be likely to suffer from the disease.
  • the method of the present invention can be carried out according to the description of the method for determining malignancy of the present invention and the description of the agent and composition of the present invention.
  • an HVEM inhibitor for the manufacture of a therapeutic or prophylactic agent for glioma, or as a therapeutic or prophylactic agent for glioma.
  • an HVEM inhibitor for the production of an agent for reducing the risk of developing glioma, or as an agent for reducing the risk of developing glioma.
  • an HVEM inhibitor for producing a prognosis improving agent in the treatment of malignant brain tumor, or as a prognosis improving agent in the treatment of malignant brain tumor.
  • the use of the present invention can be carried out as described for the agents and compositions of the present invention.
  • an HVEM inhibitor as a therapeutic or prophylactic agent for glioma, for use in the treatment or prevention of glioma, or for use in the therapeutic or prophylactic method of the present invention.
  • HVEM is also used as an agent for reducing the risk of developing glioma, for use in reducing the risk of developing glioma, or for use in the method for reducing risk of the present invention.
  • An inhibitor is provided.
  • an HVEM inhibitor as a prognosis improving agent in the treatment of malignant brain tumor, for use in improving the prognosis in the treatment of malignant brain tumor, or for use in the prognosis improving method of the present invention.
  • the above HVEM inhibitors can be implemented as described for the agents and compositions of this invention.
  • non-therapeutic means not including an act of operating, treating or diagnosing a human (that is, a medical act for a human), specifically, a doctor or a doctor's instruction. It means that the person does not include a method of performing surgery, treatment or diagnosis on a human.
  • Example 1 Inhibitory effect of BMP-4 on proliferation and neurosphere formation of GBM cell line
  • Culture conditions of human glioblastoma cells Human glioblastoma multiforme cells, U3024MG, U3031MG and U3054MG cell lines were humanized.
  • Human glioblastoma cell culture http://www.hgcc.se/#, sometimes referred to herein simply as "HGCC” to obtain glioblastoma stem cells (glioma-initiating cells).
  • GAC Global System for a cell line
  • GAC glioblastoma cell culture
  • B-27 supplement (manufactured by Thermo Fisher Scientific), N-2 supplement (manufactured by Thermo Fisher Scientific), 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF, manufactured by PeproTech) ) And basic fibroblast growth factor-basic (bFGF, manufactured by PeproTech) and DMEM/F12 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and Neurobasal medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific). ).
  • RNA sequence analysis was performed to identify the BMP target gene using human glioblastoma cell TGS-04 (Raja E. et al., Oncogene. , 36: 4963-4974 (2017)).
  • the expression level of genes controlled by BMP-4 stimulation was analyzed based on the FPKM value (fragments per kilobase of exon per million fragments), and the FPKM value was suppressed to 1/2 or less by BMP-4 stimulation.
  • the genes that were extracted were extracted.
  • the primers used for the quantitative RT-PCR are shown in Table 1.
  • the complementary DNA was synthesized using PrimeScript II 1st strand cDNA synthesis kit (Takara Bio).
  • HVEM H9 hESC-derived human neural stem cells
  • Each prepared shRNA was introduced into the Mesenchymal subtype cells (U3024MG cells, U3031MG cells or U3054MG cells) cultured under the conditions described in Example 1(1). Then, HVEM expression in GBM cells (U3024MG cells, U3031MG cells or U3054MG cells) into which each shRNA was introduced was analyzed by quantitative RT-PCR. Specifically, RT-PCR was performed according to the method described in Example 2(2), using the SEQ ID NOS: 1 to 4 described in Table 1 as the primers.
  • HVEM Inhibition of HVEM by antibody GBM cells (U3024MG cells, U3031MG cells or U3054MG cells) using an antibody against human HVEM (MAB356, manufactured by R&D Systems) or a mouse IgG1 antibody (MAB002, manufactured by R&D Systems) as a control.
  • human HVEM MAB356, manufactured by R&D Systems
  • mouse IgG1 antibody MAB002, manufactured by R&D Systems
  • Example 5 Suppression of in vivo tumor growth of GBM cells by silencing of HVEM (1) Inhibition of HVEM by shRNA in GBM cells Firefly luciferase (Luc2, manufactured by Promega, the same applies hereinafter) was used as a pENTR201 vector (Thermo Fisher Scientific). Same as described in Example 4(1), except that the recombination between pENTR201-Luc2 and CS-CMV-RfA vector was catalyzed by LR clonase (Thermo Fisher Scientific).
  • the firefly luciferase Luc2 was introduced into Mesenchymal subtype cells (U3031 MG cells or U3054 MG cells) to prepare Mesenchymal subtype cells expressing firefly luciferase.
  • Mesenchymal subtype cells U3031 MG cells or U3054 MG cells
  • the control shRNA #1 SEQ ID NO: 5
  • HVEM shRNA #1 or #2 SEQ ID NO: 7 or 8
  • Mesenchymal subtype cells expressing firefly luciferase and control shRNA or HVEM shRNA were prepared.
  • Example 6 Promotion of cell proliferation, neurosphere formation and in vivo tumor growth of GBM cells by overexpression of HVEM
  • HVEM Overexpression of HVEM in vitro Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), HVEM or Luc2 cDNA is cloned into pENTR201 vector (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and recombination between pENTR201 and CSII-EF-RfA or CS-CMV-RfA vector is carried out by LR clonase (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • EGFP Green Fluorescent Protein
  • HVEM or Luc2 cDNA is cloned into pENTR201 vector (manufactured by Thermo Fisher Scientific)
  • CSII-EF-RfA or CS-CMV-RfA vector is carried out by LR clonase (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • GBM non-Mesenchymal subtype cells (U3047MG, U3085MG and U3017MG cells) in which EGFP or HVEM were cultured under the conditions described in Example 1(1), except that they were catalyzed by Example 4(1). Was expressed in.
  • Example 7 Inhibition of tumorigenicity of mouse glioma cells by HVEM inhibition (1) HVEM expression and serum HVEM function was analyzed using mouse glioma cell line GL261 (Perkin Elmer). DMEM (manufactured by Thermo Fisher Scientific) medium (differentiation medium containing fetal calf serum) supplemented with 10% fetal calf serum (manufactured by Thermo Fisher Scientific) of GL261 cells or serum-free according to Example 1(1) Cultured in stem cell medium. Quantitative RT-PCR was performed using the primers shown in Table 3 according to the method described in Example 2(2).
  • Example 4 Tumorigenic activity of HVEM
  • a vector having a DNA sequence and an EGFP sequence encoding HVEM shRNA #1 or #2 (SEQ ID NO: 13 or 14) or control shRNA #1 (SEQ ID NO: 5) shown in Table 4 was prepared as Example 4 It was introduced into GL261 cells according to the method described in (1).
  • the GL261 cells were intracranial orthotopically transplanted into C57BL/6J mice to examine the tumorigenic activity of HVEM in the GL261 cells after suppressing the expression of HVEM. Specifically, a total of 1 ⁇ 10 5 viable cells were transplanted at a position 2 mm to the right of the sagittal suture from the previous section of the skull and 3 mm below the surface of the skull.
  • mice transplanted with glioblastoma cells were transcardially perfused with 4% paraformaldehyde.
  • Mouse brain tissues were cryoprotected with 10-20% sucrose, and tissue sections were stained with hematoxylin and eosin.
  • the results were as shown in Figure 8b.
  • GL261 cells treated with control shRNA formed tumors after cell implantation (EGFP signal was observed), whereas mouse glioma cells treated with HVEM shRNA did not form tumors (FIG. 8b). From these results, it was confirmed that the tumorigenic activity of glioma cells can be suppressed by suppressing the expression of HVEM in glioma cells.
  • Hematoxylin-eosin staining in brain tissue confirmed that tumor formation was suppressed in the control group 25 days after GL261 cell transplantation, but tumor formation was suppressed in the group to which the anti-mouse HVEM antibody was administered. All mice in the control antibody treated group died within 35 days, while all mice in the anti-mouse HVEM antibody treated group survived longer than 45 days. From these results, it was confirmed that by inhibiting the function of HVEM in glioma cells, the tumorigenic activity of glioma cells could be suppressed, and the survival period could be extended.
  • Example 8 Expression of HVEM ligands in GBM (1) Expression of HVEM ligands in GBM To investigate the function of HVEM ligands in brain tumors, known ligands for APRIL and HVEM (LIGHT, LTA) were analyzed using the GDC TCGA dataset. , BTLA, CD160, SALM5) mRNA expression levels were analyzed. The results were as shown in Figure 9a. It was observed that APRIL was highly expressed in normal brain tissue and GBM as compared with the known ligand of HVEM.
  • beta DuoSet ELISA (DY211, R&D Systems), human LIGHT/TNFSF14 Quantine ELISA kit (DLIT00, R&D Systems), auxiliary reagent kit 2 (DY008, R&D Systems). Absorbance at 450 nm and 570 nm was measured with a Model 680 microplate reader (Bio-rad) or Enspire (Perkin Elmer). The results were as shown in Figure 9b. The concentrations of LTA and LIGHT in the culture supernatant were below the detection sensitivity. On the other hand, it was confirmed that APRIL was present at a concentration of 50 pg/mL or higher in normal brain tissue (hNSC) and all 13 types of GBM, and that the expression level in GBM was higher than that in normal brain tissue.
  • hNSC normal brain tissue
  • APRIL is a ligand of the TNF superfamily, and BCMA/TNFRSF17 and TACI/TNFRSF13B are known as APRIL receptors. It has not been previously reported that APRIL binds to HVEM and transmits a signal.
  • Example 9 Inhibition of GBM cell proliferation and neurosphere formation by inhibition of APRIL
  • Example 10 Action of APRIL as a HVEM ligand (1) Identification of HVEM ligand A firefly luciferase gene (Luc2, Promega) is located downstream of the minimal promoter having a NF- ⁇ B responsive element, and Renilla is located downstream of the CMV promoter. A luciferase gene (hRluc, Promega) was cloned into pCS-NF- ⁇ B-RE-minP-Luc2-CMV-hRluc, respectively.
  • Human-derived HVEM was introduced into HEK293T cells using Lipofectamine 2000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific, the same applies below), and then the NF- ⁇ B-responsive Luc2 gene and the hRluc gene constitutively expressed were introduced ( HVEM expressing cells).
  • human-derived LIGHT, APRIL, and SALM5 genes were cloned into a pENTR4-CMV vector, and recombination between pENTR4-CMV and CS-RfA-EF-PuroR was carried out by LR clonase (Thermo Fisher Scientific). Catalyzed.
  • LIGHT, APRIL, and SALM5 were respectively expressed in HEK293T cells different from those described above using Lipofectamine 2000 to prepare cells expressing soluble ligand (ligand-expressing cells).
  • ligand-expressing cells As a control cell, a cell expressing the NF- ⁇ B reporter gene, but expressing neither HVEM nor ligand was prepared (Empty).
  • HVEM-expressing cells and ligand-expressing cells were co-cultured, and the activity of NF- ⁇ B in the HVEM-expressing cells was evaluated using the Dual luciferase reporter assay kit (Promega, hereinafter the same).
  • Example 11 Knockout effect of HVEM gene using CRISPR/Cas9
  • CRISPR/Cas9 system Lentifectamine 2000 which is a lentiCRISPR v2 vector encoding the gRNAs shown in Table 8 targeting the DNA sequences shown in Table 7, was prepared.
  • HCas9 and each gRNA were introduced into Mesenchymal subtype cells (U3054MG cells) or mouse glioma cell line GL261 (Perkin Elmer). Each cell was cloned by the limiting dilution method.
  • the gRNA sequence was selected with free software (CHOP CHOP: http://chopchop.cbu.uib.no/).
  • Example 1 In vitro cell proliferation assay The cells prepared in (1) above were subjected to an in vitro cell proliferation assay according to the method described in Example 1(3).
  • the GL261 cells were cultured in a serum-free stem cell medium as described in Example 1(1).
  • Sphere formation assay The cells prepared in (1) above were subjected to a sphere formation assay according to the method described in Example 1 (4).
  • Example 12 Preparation of HVEM antibody using alpaca (1) Preparation of antibody in alpaca HEK293T cells expressing human HVEM gene (GenBank Accession No. NM_003820.3 or HGNC:11912) were immunized subcutaneously in the alpaca, and anti-human. HVEM Alpaca VHH antibody was generated. VHH antibodies having the amino acid sequences shown in Table 9 were obtained. Complementarity determining regions (CDRs) were identified according to Kabat's taxonomy. The result was as shown in FIG.
  • the anti-histidine tag antibody anti-His-tag mAb-HRP-DirecT (MBL) labeled with horseradish peroxidase HRP was reacted, and the enzyme reaction between HRP and the substrate was performed using ELISA POD Substrate TMB Kit (Nacalai Tesque). It was measured.
  • Non-linear regression was performed on the sigmoid curve based on the above to determine the 50% effective concentration EC50.
  • the EC50 of VHH#1 to 5 was all less than 80 nM.
  • the VHH#6 and VHH#7 clones were obtained by antibody screening using the phage display method.
  • VHH antibody Mesenchymal subtype cell line (U3054MG cells) was treated with VHH(I) (VHH#3) and VHH(II) (VHH#2) at a concentration of 100 to 300 nM.
  • U3054MG cells were cultured for 7 days under the conditions of 37° C. and 5% CO 2.
  • Cell growth was quantified using Cell Count Reagent SF (Nacalai Tesque) and the cell growth was measured for the PBS-treated group. The result was as shown in FIG. Proliferation was shown to be suppressed in cells treated with VHH.

Abstract

本発明は、神経膠腫に対する新規な治療または予防剤の提供と、脳腫瘍の悪性度のマーカーおよび脳腫瘍の予後マーカーの提供と、脳腫瘍の悪性度の判定方法および脳腫瘍患者の予後の判定方法の提供を目的とする。本発明によれば、ＨＶＥＭ阻害剤を有効成分として含んでなる、神経膠腫の治療および予防剤と、ＨＶＥＭタンパク質またはＨＶＥＭ遺伝子からなる、脳腫瘍の悪性度のマーカーおよび脳腫瘍の予後マーカーと、対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量を測定する工程を含んでなる、脳腫瘍の悪性度の判定方法および脳腫瘍患者の予後の判定方法が提供される。

Description

神経膠腫の治療および予防剤、脳腫瘍の悪性度のマーカーおよび脳腫瘍の予後マーカー、脳腫瘍の悪性度および予後の判定方法並びに腫瘍増殖を抑制する抗体 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国出願である特願２０１８－２４８４６５（出願日：２０１８年１２月２８日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、神経膠腫の治療または予防剤に関する。本発明はまた、脳腫瘍の悪性度のマーカーおよび脳腫瘍の予後マーカーと、脳腫瘍の悪性度の判定方法および予後の判定方法に関する。本発明はまた、腫瘍増殖を抑制する抗体にも関する。
　日本国内での原発性脳腫瘍の発生頻度は年間におおよそ２万人（平成２２年度の有病率は１０万人あたり１３０．８人）とされており、いわゆる５大脳腫瘍として神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫および頭蓋咽頭腫が知られている。脳腫瘍の治療は、手術による腫瘍の切除が一般的であるが、悪性脳腫瘍の場合は、さらに抗がん剤や放射線治療などを組み合わせた集学的治療が行われる。治療効果は、初めの手術で腫瘍をどれだけ切除し得たかにかかっており、悪性腫瘍の場合には全体の９５～９８％以上切除しなければ、半分の切除に終わった場合と生命予後にあまり差が無いことが報告されている。また、脳腫瘍のうち悪性脳腫瘍は、高い確率でより悪性度の高い脳腫瘍に移行するといわれている。
　多形性膠芽腫（Glioblastoma multiforme；以下「ＧＢＭ」ということがある）は、成人における悪性脳腫瘍の最も一般的かつ最も悪性の形態である。手術、放射線療法および化学療法の進歩にもかかわらず、膠芽腫患者の予後は依然として劣っており、生存期間中央値は１５ヶ月未満である。膠芽腫は、The Cancer Genome Atlas（TCGA）データセットによるゲノム異常に基づいて、Proneural、Neural、ClassicalおよびMesenchymalサブタイプに分類される。膠芽腫細胞の高度に増殖する性質は、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を含むいくつかのシグナル伝達経路の変化によるものである。
　骨形成因子（Bone morphogenetic proteins；以下「ＢＭＰ」という）は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのメンバーであり、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４およびＢＭＰ－７を含むＢＭＰサブファミリーのメンバーは、膠芽腫細胞の分化、細胞周期停止およびアポトーシスを誘導することが報告されている。これまでに、膠芽腫において同定されたＢＭＰ標的遺伝子には、細胞内シグナル分子が多く含まれていた（非特許文献１）。
Savary K et al., Oncogene, 32:5409-5420(2013)
　このような技術的背景のもと本発明者らは、ＢＭＰ－４が膠芽腫幹細胞（ＧＩＣ）の増殖停止および分化を誘導することに加え、特定の膠芽腫細胞においてＨＶＥＭの発現がＢＭＰ－４によって抑制されることを見出した。本発明者らはまた、ヒト成人脳腫瘍のうち多形性膠芽腫においてＨＶＥＭの発現が優先的に増加すること、ＧＢＭの４つのサブタイプのなかでMesenchymalサブタイプにおいてＨＶＥＭの発現が最も高いことを見出した。本発明者らはまた、Mesenchymalサブタイプ細胞培養においてＨＶＥＭ発現を抑制することにより細胞増殖およびニューロスフェア形成が減弱されること、ＨＶＥＭ発現を抑制したMesenchymalサブタイプ細胞をマウス頭蓋内へ注射した場合、腫瘍形成能が低下し、マウスの生存期間が延長することを見出した。本発明者らはまた、ＨＶＥＭの過剰発現は細胞培養における膠芽腫細胞の増殖およびニューロスフェア形成を増強し、該細胞の頭蓋内注射によりマウスの生存期間が短くなることを見出した。本発明者らはさらに、ＨＶＥＭを発現するマウス神経膠腫ＧＬ２６１細胞を頭蓋内に同所移植したマウスに抗マウスＨＶＥＭ抗体を腹腔内投与すると、腫瘍形成能が低下し、マウスの生存期間が延長することを見出した。本発明者らはまた、ＧＢＭにおいて、ＨＶＥＭのリガンドとしては報告のないＡＰＲＩＬの発現が高い一方、ＨＶＥＭの既知のリガンドの発現は低いことを見出した。本発明者らはまた、Mesenchymalサブタイプ細胞培養においてＡＰＲＩＬ発現を抑制することにより細胞増殖およびニューロスフェア形成が減弱されることを見出した。本発明者らはまた、ＨＶＥＭ発現細胞とＡＰＲＩＬ発現細胞を共培養することによりＡＰＲＩＬがＨＶＥＭへシグナルを伝達することを見出した。本発明者らはさらに、アルパカで作製した抗ヒトＨＶＥＭ抗体がMesenchymalサブタイプ細胞の増殖を抑制することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
　本発明は、神経膠腫に対する新規な治療または予防剤を提供することを目的とする。本発明はまた、脳腫瘍の悪性度のマーカーおよび脳腫瘍の予後マーカーを提供することを目的とする。本発明はさらに、脳腫瘍の悪性度の判定方法および脳腫瘍患者の予後の判定方法を提供することを目的とする。本発明はさらにまた、腫瘍増殖を抑制する新規な抗体を提供することを目的とする。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ＨＶＥＭ阻害剤を有効成分として含んでなる、神経膠腫の治療または予防剤。
［２］神経膠腫が、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、星細胞腫および多形性膠芽腫のいずれかである、上記［１］に記載の治療または予防剤。
［３］多形性膠芽腫が、Proneuralサブタイプ、Neuralサブタイプ、ClassicalサブタイプおよびMesenchymalサブタイプのいずれかに属する、上記［２］に記載の治療または予防剤。
［４］ＨＶＥＭ阻害剤が、ＨＶＥＭに対する抗体または核酸である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の治療または予防剤。
［５］ＨＶＥＭに対する抗体がＨＶＥＭとリガンドとの結合を阻害する抗体である、上記［４］に記載の治療または予防剤。
［６］神経膠腫がＨＶＥＭ発現依存性またはＨＶＥＭリガンド依存性である、上記［１］～［５］のいずれかに記載の治療または予防剤。
［７］リガンドがＡＰＲＩＬである、上記［５］または［６］に記載の治療または予防剤。
［８］ＨＶＥＭ発現量が健常な対象のＨＶＥＭ発現量または正常組織試料のＨＶＥＭ発現量を上回る対象に投与するための、上記［１］～［７］のいずれかに記載の治療または予防剤。
［９］ＨＶＥＭタンパク質またはＨＶＥＭ遺伝子からなる、脳腫瘍の悪性度のマーカーまたは脳腫瘍の予後マーカー。
［１０］対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量を測定する工程を含んでなる、脳腫瘍の悪性度の判定方法。
［１１］前記対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中の当該ＨＶＥＭ発現量を上回る場合に、該生体試料が悪性度の高い腫瘍細胞集団を含むことが示される、上記［１０］に記載の判定方法。
［１２］前記対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中の当該ＨＶＥＭ発現量を上回る場合に、対象が悪性度の高い脳腫瘍に罹患していることが示される、上記［１０］に記載の判定方法。
［１３］対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量を測定する工程を含んでなる、脳腫瘍患者の予後の判定方法。
［１４］前記対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中の当該ＨＶＥＭ発現量を上回る場合に、対象の予後が不良であることが示される、上記［１３］に記載の判定方法。
［１５］８０ｎＭ未満のＥＣ５０値でＨＶＥＭと結合し、かつ、腫瘍増殖を抑制する、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
［１６］相補性決定領域１～３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含み、かつ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が下記の（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）、（vi）または（vii）である、上記［１５］に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン
（ｉ）配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ii）配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（iii）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（iv）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（vi）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（vii）配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。
［１７］免疫グロブリン単一可変ドメインが、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列が下記（viii）、（ix）、（ｘ）、（xi）、（xii）、（xiii）または（xiv）である、上記［１６］に記載の免疫グロブリン可変ドメイン
（viii）配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
（ix）配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
（ｘ）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
（xi）配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
（xii）配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
（xiii）配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
（xiv）配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４。
［１８］下記（xv）、（xvi）または（xvii）のポリペプチドを含んでなる、上記［１５］に記載の免疫グロブリン可変ドメイン
（xv）配列番号２９～３５のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（xvi）配列番号２９～３５のいずれかのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＶＥＭ結合能および腫瘍増殖抑制能を有するポリペプチド；
（xvii）配列番号２９～３５のいずれかのアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＶＥＭ結合能および腫瘍増殖抑制能を有するポリペプチド。
［１９］上記［１５］～［１８］のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなる、抗体または免疫グロブリン単一可変ドメイン多量体。
［２０］上記［１５］～［１８］のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは上記［１９］に記載の抗体または多量体をコードするポリヌクレオチド。
［２１］上記［１５］～［１８］のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは上記［１９］に記載の抗体または多量体を含んでなる、医薬組成物。
［２２］神経膠腫の治療または予防に用いるための、上記［２１］に記載の医薬組成物。
［２３］ＨＶＥＭ阻害剤を有効成分として含んでなる、神経膠腫の発症リスクの低減剤および神経膠腫の発症リスクの低減用組成物。
［２４］ＨＶＥＭ阻害剤を有効成分として含んでなる、悪性脳腫瘍の治療における予後改善剤および悪性脳腫瘍の治療における予後改善剤用組成物。
［２５］有効量のＨＶＥＭ阻害剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含んでなる、神経膠腫の治療または予防方法。
［２６］神経膠腫の治療方法であって、上記［１０］～［１２］のいずれかに記載の脳腫瘍の悪性度の判定方法を実施する工程と、悪性度の高い脳腫瘍に罹患しているか、または罹患している可能性が高いと判定された対象（あるいは神経膠腫に羅患しているか、または羅患している可能性が高いと判定された対象）に、有効量の抗癌剤（特にＨＶＥＭ阻害剤）を投与する工程を含んでなる、治療方法。
　上記［１］、上記［２３］および上記［２４］の用剤を本明細書において「本発明の用剤」と、上記［１］、上記［２３］および上記［２４］の組成物を本明細書において「本発明の組成物」と、それぞれいうことがある。
　本発明によれば、脳腫瘍のなかでも比較的発生頻度が高く、治癒が困難な疾患とされる神経膠腫に対する新規な治療または予防剤と、脳腫瘍の悪性度および脳腫瘍患者の予後の判定手段を提供することができる。脳腫瘍のうち神経膠腫（特に多形性膠芽腫）は悪性度が高く、予後が最も悪い悪性腫瘍の一つであり、手術、放射線治療および化学療法により十分な治療効果が得られていないところ、本発明は神経膠腫を含む悪性脳腫瘍に対する新規な治療戦略を提供できる点で有利である。
図１ａは、例１における、ＧＢＭ細胞におけるＢＭＰシグナリングの阻害効果を示す図である。ＧＢＭ細胞（Ｕ３０２４ＭＧ、Ｕ３０３１ＭＧおよびＵ３０５４ＭＧ）の増殖曲線を、３０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＢＭＰ－４の存在下または非存在下で測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；細胞増殖アッセイのための両側unpairedスチューデントｔ検定）として示される。 図１ｂは、例１における、ＧＢＭ細胞におけるＢＭＰシグナリングの阻害効果を示す図である。ＧＢＭ細胞（Ｕ３０２４ＭＧ、Ｕ３０３１ＭＧおよびＵ３０５４ＭＧ）のスフェア形成を、３０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＢＭＰ－４の存在下または非存在下で測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；スフェア形成アッセイのための二元配置分散分析）として示される。 図２は、例２における、ＢＭＰ－４で処理したＧＢＭ細胞のＨＶＥＭの定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析を示す図である。 図３ａは、例３における、ＨＶＥＭの発現レベルが悪性脳腫瘍では上昇することを示す図である。ＴＣＧＡデータセットにおける正常脳および脳腫瘍組織におけるＨＶＥＭの発現レベル（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ボンフェローニ補正を伴う両側クラスカル・ウォリス検定）。 図３ｂは、例３における、ＨＶＥＭの発現レベルが悪性脳腫瘍では上昇し、脳腫瘍患者の予後と相関することを示す図である。ＴＣＧＡデータセットにおける脳腫瘍患者のカプランマイヤープロット。低悪性度神経膠腫には、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、および星細胞腫が含まれる。患者はＨＶＥＭ発現レベルに基づいて等しく２つのグループに分けられた。 図３ｃおよび図３ｄは、例３における、ＨＶＥＭの発現レベルが悪性脳腫瘍では上昇し、脳腫瘍患者の予後と相関することを示す図である。（ｃ）ＴＣＧＡデータセットにおけるＧＢＭサブタイプ間のＨＶＥＭの発現レベル（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ボンフェローニ補正を伴う両側クラスカル・ウォリス検定）。（ｄ）ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）およびヒトＧＢＭ細胞の４つのサブタイプにおけるＨＶＥＭの発現レベルを定量的ＲＴ－ＰＣＲによって決定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復）として示される。ＧＢＭ細胞は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　ＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｘｏｎ　１．０ＳＴアレイ（Xie Y et al., EBioMedicine, 2:1351-63(2015)）によって得られたデータに従って、４つのＧＢＭサブタイプに分類された。 図４ａは、例４における、Mesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０２４ＭＧ、Ｕ３０３１ＭＧおよびＵ３０５４ＭＧ）におけるレンチウイルス媒介ｓｈＲＮＡによるＨＶＥＭノックダウン時のＨＶＥＭの定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析を示す図である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復）として示される。 図４ｂは、例４における、ＨＶＥＭの遮断により細胞培養においてMesenchymalサブタイプ細胞の増殖が阻害されることを示す図である。ＨＶＥＭｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するMesenchymalサブタイプ細胞の増殖曲線。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４細胞増殖アッセイのための生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；細胞増殖アッセイについてボンフェローニ補正を伴う両側unpairedスチューデントｔ検定）として示された。 図４ｃは、例４における、ＨＶＥＭの遮断により細胞培養においてMesenchymalサブタイプ細胞のニューロスフェア形成が阻害されることを示す図である。ＨＶＥＭｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するMesenchymalサブタイプ細胞のスフェア形成。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３スフェア形成アッセイのための生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；スフェア形成アッセイについてボンフェローニ補正を伴う二元配置分散分析）として示された。 図４ｄは、例４における、抗ヒトＨＶＥＭ抗体がMesenchymalサブタイプ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側unpairedスチューデントまたはウェルチのｔ検定）として示される。 図５ａは、例５における、ＨＶＥＭのサイレンシングが、Mesenchymalサブタイプ細胞のイン・ビボ腫瘍形成活性を弱めることを示す図である。マウス頭蓋内のｓｈＲＮＡおよびホタルルシフェラーゼを発現するMesenchymalサブタイプ細胞のイン・ビボ生物発光イメージングシステムによる画像。マウス頭部に同所移植されたホタルルシフェラーゼ発現ＧＢＭ細胞からなる腫瘍の発光強度を移植から１５週間後に観察した。Ｕ３０３１ＭＧ細胞は各８匹のマウスを実験に用いた。マウス頭部において黒く示される領域がＧＢＭ細胞からなる腫瘍であり、その中心部の白い領域は発光強度（count per second；ｃｐｓ）が周辺部に比べて高い部分（約８０００～３８０００ｃｐｓ）である。 図５ａはまた、例５における、ＨＶＥＭのサイレンシングが、Mesenchymalサブタイプ細胞のイン・ビボ腫瘍形成活性を弱めることを示す図である。マウス頭蓋内のｓｈＲＮＡおよびホタルルシフェラーゼを発現するMesenchymalサブタイプ細胞のイン・ビボ生物発光イメージングシステムによる画像。マウス頭部に同所移植されたホタルルシフェラーゼ発現ＧＢＭ細胞からなる腫瘍の発光強度を移植から１５週間後に観察した。Ｕ３０５４ＭＧ細胞は各４匹のマウスを実験に用いた。マウス頭部において黒く示される領域がＧＢＭ細胞からなる腫瘍であり、その中心部の白い領域は発光強度（count per second；ｃｐｓ）が周辺部に比べて高い部分（約８００～３８００ｃｐｓ）である。 図５ｂは、例５における、ＨＶＥＭのサイレンシングが、Mesenchymalサブタイプ細胞のイン・ビボ腫瘍形成活性を弱めることを示す図である。ｓｈＲＮＡ発現Mesenchymalサブタイプ細胞由来の腫瘍を有するマウスの生存曲線（Ｕ３０３１ＭＧについては各群ｎ＝８、Ｕ３０５４ＭＧについては各群ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ボンフェローニ補正を伴う両側ログランク検定）。 図６ａは、例６における、異所性ＨＶＥＭが、非Mesenchymalサブタイプ細胞の増殖を促進することを示す図である。ＨＶＥＭまたはＥＧＦＰ（対照）を発現する非Mesenchymalサブタイプ細胞の増殖曲線。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側unpairedスチューデントｔ検定）として示される。 図６ｂは、例６における、異所性ＨＶＥＭが、非Mesenchymalサブタイプ細胞のニューロスフェア形成を促進することを示す図である。ＨＶＥＭまたはＥＧＦＰ（対照）を発現する非Mesenchymalサブタイプ細胞のスフェア形成。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側unpairedスチューデントｔ検定）として示される。 図７ａは、例６における、異所性ＨＶＥＭが、非Mesenchymalサブタイプ細胞のイン・ビボ腫瘍形成活性を増強することを示す図である。マウス頭蓋内に増殖したＥＧＦＰまたはＨＶＥＭを発現する非Mesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０４７ＭＧ）のイン・ビボ生物発光イメージングシステムによる画像。マウス頭部に同所移植されたホタルルシフェラーゼとＥＧＦＰまたはＨＶＥＭとを発現する非Mesenchymalサブタイプ細胞からなる腫瘍の発光強度を移植から７週間後に観察した。各６匹のマウスを実験に用いた。マウス頭部において黒く示される領域がＧＢＭ細胞からなる腫瘍であり、その内側の白い領域は発光強度が周辺部に比べて高い部分（ｃｐｓ約１００００～４００００）、さらにその中心部に見える黒い領域は発光強度がさらに高い部分（ｃｐｓ約４００００以上）である。 図７ｂは、例６における、ＥＧＦＰまたはＨＶＥＭを発現する非Mesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０４７ＭＧ）由来の腫瘍を有するマウスの生存曲線（群当たりｎ＝６マウス；＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側ログランク検定）。 図８ａおよびｂは、例７における、マウス神経膠腫細胞のイン・ビボでの進行には、ＨＶＥＭが必要であることを示す図である。（ａ）マウス神経膠腫ＧＬ２６１細胞株におけるＨＶＥＭの発現レベル。ＧＬ２６１細胞をウシ胎児血清含有分化培地または無血清幹細胞培地で培養した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３生物学的反復；＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側unpairedスチューデントｔ検定）として示される。（ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳におけるＨＶＥＭまたは対照のｓｈＲＮＡを発現するＧＬ２６１細胞の頭蓋内増殖。ＥＧＦＰおよびｓｈＲＮＡをレンチウイルスでＧＬ２６１細胞に同時に形質導入した。マウス脳組織を、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色またはＥＧＦＰの生物発光イメージングに供した。 図８ｃは、例７における、マウス神経膠腫細胞のイン・ビボでの進行には、ＨＶＥＭが必要であることを示す図である。上の図は、マウス膠腫細胞ＧＬ２６１の頭蓋内同所移植から２５日後においてヘマトキシリン・エオジン染色をした脳組織を示す。下の図は、抗ＨＶＥＭ抗体投与群と対照におけるＧＬ２６１由来腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存曲線（群当たりｎ＝６マウス；＊＊Ｐ＜０．０１；両側ログランク検定）を示す。ＧＬ２６１細胞の頭蓋内注射の５日後に、抗マウスＨＶＥＭ抗体またはアイソタイプ対照抗体を５日毎にマウスに腹腔内注射した。 図９ａおよびｂは、例８における、脳腫瘍におけるＨＶＥＭのリガンドの発現を示す図である。（ａ）ＴＣＧＡデータセットの正常な脳組織および脳腫瘍におけるＨＶＥＭのリガンドおよびＡＰＲＩＬの発現レベル（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意ではない（Ｐ＞０．０５）；両側クラスカル・ウォリス検定）。（ｂ）サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定された、ＨＧＣＣリソースからのｈＮＳＣおよびＧＢＭ細胞におけるＬＴＡ、ＬＩＧＨＴおよびＡＰＲＩＬの発現レベル。 図１０ａ、ｂおよびｃは、例９における、ｓｈＲＮＡによるＡＰＲＩＬノックダウンの影響を示す図である。（ａ）Mesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０５４ＭＧ）におけるレンチウイルス媒介ｓｈＲＮＡによるＡＰＲＩＬノックダウン時のＡＰＲＩＬの定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析を示す図である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復）として示される。（ｂ）ＡＰＲＩＬの遮断により細胞培養においてMesenchymalサブタイプ細胞の増殖が阻害されることを示す図である。ＡＰＲＩＬｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するMesenchymalサブタイプ細胞の増殖曲線。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３細胞増殖アッセイのための生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側unpairedスチューデントｔ検定）として示された。（ｃ）ＡＰＲＩＬの遮断により細胞培養においてMesenchymalサブタイプ細胞のニューロスフェア形成が阻害されることを示す図である。ＡＰＲＩＬｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するMesenchymalサブタイプ細胞のスフェア形成。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３スフェア形成アッセイのための生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側unpairedスチューデントｔ検定）として示された。 図１０ｄおよびｅは、例９における、ＡＰＲＩＬ阻害の影響を示す図である。（ｄ）抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体がMesenchymalサブタイプ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側unpairedスチューデントｔ検定）として示される。（ｅ）抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体が非Mesenchymalサブタイプ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３の生物学的反復）として示される。 図１０ｆは、例９における、Mesenchymalサブタイプ細胞におけるＡＰＲＩＬの受容体の発現を示す図である。ＴＣＧＡデータセットの正常な脳組織および脳腫瘍におけるＡＰＲＩＬの既知のレセプター（ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ）およびＨＶＥＭの発現レベル（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意ではない（Ｐ＞０．０５）；両側クラスカル・ウォリス検定）。 図１１は、例１０における、ＡＰＲＩＬがＨＶＥＭのシグナルを伝達することを示す図である。（ａ）ＨＶＥＭを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、可溶性のリガンド（ＡＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴまたはＳＡＬＭ５）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共培養した。データは、ＨＶＥＭまたはコントロールベクターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＮＦ－κＢ相対活性の平均±ＳＤとして示される。（ｂ）ＨＶＥＭまたはコントロールベクターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＡＰＲＩＬまたはＳＡＬＭ５－Ｆｃキメラによって刺激された。データは、ＮＦ－κＢ相対活性の平均±ＳＤとして示される。 図１２は、例１１における、ゲノム編集によるＨＶＥＭ遺伝子のノックアウト（ＫＯ）の影響を示す図である。（ａ）ヒトＨＶＥＭ遺伝子ノックアウトにより細胞培養においてMesenchymalサブタイプ細胞の増殖が阻害されることを示す図である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４細胞増殖アッセイのための生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ボンフェローニ補正を伴う両側unpairedスチューデントｔ検定）として示された。（ｂ）ヒトＨＶＥＭ遺伝子ノックアウトにより細胞培養においてMesenchymalサブタイプ細胞のニューロスフェア形成が阻害されることを示す図である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３細胞増殖アッセイのための生物学的反復；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ボンフェローニ補正を伴う二元配置分散分析）として示された。（ｃ）マウスＨＶＥＭ遺伝子（Ｔｎｆｒｓｆ１４）ノックアウトにより細胞培養において細胞増殖が阻害されることを示す図である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ボンフェローニ補正を伴う両側unpairedスチューデントｔ検定）として示された。 図１３は、例１２における、ヒトＨＶＥＭタンパク質を抗原としたアルパカ由来のＶＨＨ抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲは相補性決定領域を、ＦＲはフレームワーク領域を表す。 図１４は、例１２における、抗ヒトＨＶＥＭ抗体がMesenchymalサブタイプ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝２の生物学的反復）として示される。
発明の具体的説明
神経膠腫の治療または予防剤
　本発明の用剤および組成物は、ＨＶＥＭ阻害剤を有効成分として含んでなるものである。ここで、「ＨＶＥＭ」とはHerpes Virus entry mediatorの略語であり、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質をいう。ＨＶＥＭは、ＴＮＦＲＳＦ１４（tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member 14）、ＣＤ２７０、ＬＩＧＨＴＲまたはＡＴＡＲとも呼ばれる。すなわち、本発明における「ＨＶＥＭ」は「ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４」と同義である。
　ＨＶＥＭは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、造血細胞および非造血細胞（実質細胞）を含む様々な組織並びに細胞上に発現される（Pasero C et al., Curr Opin Pharmacol., 12: 478-485(2012)）。ＬＩＧＨＴおよびＬＴαなどのＴＮＦ関連サイトカイン並びにＢＴＬＡ、ＣＤ１６０およびＳＡＬＭ５などの非ＴＮＦ関連サイトカインを含む複数のリガンドが、ＨＶＥＭに結合することが知られている。
　本発明においては、ヒトＨＶＥＭ遺伝子は、HGNC:11912で公表された塩基配列を基準とし、マウスＨＶＥＭ遺伝子は、MGI:2675303で公表された塩基配列を基準とする。本発明においてはまた、ヒトＨＶＥＭタンパク質は、GenBank Accession No. NP_003811.2で公表されたアミノ酸配列を基準とし、マウスＨＶＥＭタンパク質は、GenBank Accession No. NP_849262.1で公表されたアミノ酸配列を基準とする。本発明においてはさらに、ヒトＨＶＥＭのｍＲＮＡは、GenBank Accession No. NM_003820.3を基準とし、マウスＨＶＥＭのｍＲＮＡは、GenBank Accession No. NM_178931.2を基準とする。
　本発明においてＨＶＥＭ阻害剤とは、ＨＶＥＭの発現を阻害する物質およびＨＶＥＭの機能を阻害する物質を含む意味で用いられる。ＨＶＥＭの発現を阻害する物質としては、ＨＶＥＭに対する核酸（例えば、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｇＲＮＡ、リボザイム等のＨＶＥＭを標的にした核酸）が挙げられる。ＨＶＥＭの機能を阻害する物質としては、ＨＶＥＭと相互作用して当該機能を阻害する物質の他、ＨＶＥＭとリガンドとの結合を阻害する物質等も含まれ、例えば、抗体、アプタマーが挙げられる。
　ここで、ＨＶＥＭのリガンドとしてはＡＰＲＩＬが挙げられる。後記実施例に示されるように、ＡＰＲＩＬからＨＶＥＭを経由するシグナル伝達により腫瘍（特に神経膠腫のような悪性度の高い脳腫瘍）の形成促進が確認されたことから、ＨＶＥＭとＡＰＲＩＬとの結合を阻害する物質を用いることにより、該腫瘍形成を効果的に抑制することができる。ここで、「ＡＰＲＩＬ」とは「a proliferation-inducing ligand」の略語であり、ＴＮＦＲＳＦ１３（tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member 13）とも呼ばれる。すなわち、本発明における「ＡＰＲＩＬ」は「ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＲＳＦ１３」と同義である。
　アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
　ＨＶＥＭに対するアンチセンス核酸は、例えば、前述のＨＶＥＭの遺伝子配列、前述のＨＶＥＭのアミノ酸配列をコードする塩基配列および前述のＨＶＥＭのｍＲＮＡ配列から選ばれる一部の塩基配列と相補的な一本鎖核酸をいう。当該核酸は、天然由来の核酸でも人工核酸でもよく、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれに基づくものでもよい。アンチセンス核酸の長さは、通常約１５塩基からｍＲＮＡの全長と同程度の長さであり、約１５～約３０塩基長が好ましい。アンチセンス核酸の相補性は必ずしも１００％である必要はなく、生体内でＨＶＥＭをコードするＤＮＡまたはＲＮＡと相補的に結合しうる程度でよい。
　ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ｍＲＮＡの分解）による遺伝子サイレンシングのために用いられる、人工的に合成された低分子２本鎖ＲＮＡであり、当該二本鎖ＲＮＡを生体内で供給することのできるｓｉＲＮＡ発現ベクターを含む意味で用いられるものとする。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断し、これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０～９５℃で約１分程度変性させた後、３０～７０℃で約１～８時間アニーリングさせることにより調製することができる。ｓｉＲＮＡの長さは、１９～２７塩基対が好ましく、２１～２５塩基対または２１～２３塩基対がより好ましい。
　ＨＶＥＭに対するｓｉＲＮＡは、ＨＶＥＭ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解（ＲＮＡ干渉）を引き起こすようにその塩基配列に基づいて設計することができる。ＨＶＥＭの発現を阻害するｓｉＲＮＡとしては、例えば、前述のＨＶＥＭのｍＲＮＡ配列を標的配列とするｓｉＲＮＡが挙げられる。
　ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ｍＲＮＡの分解）による遺伝子サイレンシングのために用いられる、人工的に合成されたヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断し、これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制することができる。
　ＨＶＥＭに対するｓｈＲＮＡは、ＨＶＥＭ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解（ＲＮＡ干渉）を引き起こすようにその塩基配列に基づいて設計することができる。ＨＶＥＭの発現を阻害するｓｈＲＮＡとしては、例えば、前述のＨＶＥＭのｍＲＮＡ配列を標的配列とするｓｈＲＮＡが挙げられる。
　ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に約２０塩基の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ、非コードＲＮＡ：タンパク質に翻訳されないＲＮＡの総称）に分類されており、他の遺伝子の発現を調節するという、生命現象において重要な役割を担っている。本発明においては特定の塩基配列を有するｍｉＲＮＡをベクターによって細胞に導入し、生体に投与することにより、ＨＶＥＭ遺伝子の発現を抑制することができる。
　ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）は、ゲノム編集技術に用いられるＲＮＡ分子である。ゲノム編集技術において、ｇＲＮＡは標的配列を特異的に認識し、Ｃａｓ９タンパク質の標的配列への結合を導き、遺伝子のノックアウトやノックインを可能とする。本発明においてはＨＶＥＭ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを生体内に投与することにより、生体内でＨＶＥＭ遺伝子の発現を抑制することができる。ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）を含む意味で用いられるものとする。ゲノム編集技術におけるｇＲＮＡの設計方法は広く知られており、例えば、Benchmarking CRISPR on-target sgRNA design, Yan et al., Brief Bioinform, 15 Feb 2017を参照することにより適宜設計することができる。
　リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
　アプタマーは、核酸アプタマーおよびペプチドアプタマーを含むものである。本発明において用いる核酸アプタマーおよびペプチドアプタマーは、ＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）やｍＲＮＡディスプレイ（mRNA display）法などに代表される、ライブラリー分子と標的分子との複合体を試験管内で形成させた後にアフィニティーを基準に選抜する、試験管内分子進化法を用いて得ることができる。
　アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムおよび核酸アプタマーは、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
　ＨＶＥＭに対する抗体とは、ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体であって、結合することによりＨＶＥＭの機能を阻害する抗体をいう。本発明では、抗体として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体、抗体フラグメント（例えば、Fab、Fv、Fab’、F(ab’)２、scFv)等のいずれを使用してもよく、これらは当業者であれば公知の手法に従って調製することができる。ＨＶＥＭに対する抗体は、後述の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、本発明の抗体および本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン多量体を用いることができる。
　ＨＶＥＭに対する抗体は、ＨＶＥＭタンパク質またはその一部を抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。ＨＶＥＭタンパク質またはその一部は、公知のタンパク質発現法および精製法によって調製することができる。ＨＶＥＭタンパク質としては、例えば前述のＨＶＥＭの配列情報によって規定されるヒトＨＶＥＭ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来のＨＶＥＭタンパク質を免疫原として用いてもよい。本発明に用いることができるＨＶＥＭに対する抗体はまた、ファージ・ディスプレー法（例えば、FEBS Letter, 441:20-24(1998)を参照）を介して作製することもできる。
　本発明の用剤および組成物は、神経膠腫の治療または予防に用いるためのものである。ここで、「神経膠腫」（glioma）とは、脳実質の神経外胚葉組織から発生した腫瘍の総称であり、原発性頭蓋内腫瘍の３０～４０％を占め、最も頻度の高い脳腫瘍である。神経膠腫に含まれるものに、乏突起膠腫（oligodendroglioma）、乏突起星細胞腫（oligoastrocytoma）、星細胞腫（astrocytoma）および多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme）等がある。「多形性膠芽腫」とは、膠芽腫（glioblastoma）または異型性グリオーマ（anaplastic glioma）とも呼ばれ、主に星細胞由来の未分化細胞からなる神経膠腫である。核の多形性が顕著で、壊死、血管内皮増殖がみられる。多形性膠芽腫は成長が早く、広範に浸潤し、成人の大脳に発生することが多い。多形性膠芽腫は、Proneural、Neural、ClassicalおよびMesenchymalの４つのサブタイプに分類されることが報告された（Verhaak R G et al., Cancer Cell, 17: 98-110(2010)）。後記実施例に示される通り、ＨＶＥＭはMesenchymalサブタイプの多形性膠芽腫において高発現していることから、本発明の用剤および組成物は多形性膠芽腫（特にMesenchymalサブタイプの多形性膠芽腫）の治療および予防に加え、後述のような神経膠腫（特にMesenchymalサブタイプの多形性膠芽腫）の発症リスクの低減に好ましくは用いることができる。
　後記実施例に示される通り、多形性膠芽腫細胞におけるＨＶＥＭの発現やＨＶＥＭの機能を阻害することにより、多形性膠芽腫細胞の増殖やニューロスフェア形成を抑制することができた。また、ＡＰＲＩＬからＨＶＥＭを経由するシグナル伝達により神経膠腫のような悪性度の高い脳腫瘍の形成促進が認められた。従って、本発明の有効成分であるＨＶＥＭ阻害剤は、ＨＶＥＭ発現量が健常な対象のＨＶＥＭ発現量または正常組織試料のＨＶＥＭ発現量を上回る対象（例えば、脳腫瘍患者）、特に、脳腫瘍患者のうち脳内においてＨＶＥＭを高発現している対象にＨＶＥＭ阻害剤を投与することができる。また本発明の治療および予防対象は、ＨＶＥＭ発現依存性の神経膠腫またはＨＶＥＭリガンド依存性の神経膠腫とすることができる。対象がＨＶＥＭを高発現しているか否か、神経膠腫がＨＶＥＭ依存性であるか否か、神経膠腫がＨＶＥＭリガンド依存性であるか否かは、例えば、脳腫瘍患者に対して実施された脳外科手術の際に切除された脳組織について評価することができ、詳細は後述の本発明の判定方法や実施例に記載された手順に従って決定することができる。
　本発明の用剤および組成物はまた、神経膠腫（特に多形性膠芽腫）の発症リスクがある対象に投与することができ、それにより、神経膠腫の発症リスクを低減することができる。ここで、「神経膠腫の発症リスクがある対象」は、神経膠腫の自覚症状がないか、あるいは神経膠腫の診断がなされていないが、将来において神経膠腫の発症の恐れがある対象を意味し、例えば、神経膠腫と診断されていない脳腫瘍患者や、脳腫瘍組織の切除術を受けた脳腫瘍患者が挙げられる。また、「神経膠腫の発症リスクの低減」は、神経膠腫の発症確率が低減されることを意味し、神経膠腫の発症確率の低減により悪性脳腫瘍の予後改善が図られる。
　すなわち、本発明の別の面によれば、ＨＶＥＭ阻害剤を有効成分として含んでなる、神経膠腫の発症リスクの低減剤および神経膠腫の発症リスクの低減用組成物が提供されるとともに、ＨＶＥＭ阻害剤を有効成分として含んでなる、悪性脳腫瘍の治療における予後改善剤および悪性脳腫瘍の治療における予後改善剤用組成物が提供される。
　本発明の用剤および組成物は、医薬品または医薬組成物として提供することができる。本発明の医薬品および医薬組成物は、ＨＶＥＭ阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含有してなるものである。本発明の医薬品および医薬組成物には遺伝子治療を目的とした医薬品および医薬組成物も含まれる。このような医薬品および医薬組成物は、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｇＲＮＡ、リボザイム等のＨＶＥＭを標的にした核酸を有効成分として含むものである。
　本発明の医薬品および医薬組成物は、ＨＶＥＭ阻害剤以外の有効成分を含んでいてもよく、あるいは、ＨＶＥＭ阻害剤以外の有効成分またはそれを含有する医薬品もしくは医薬組成物と併用してもよい。ＨＶＥＭ阻害剤以外の有効成分としては、抗癌剤（特に、悪性脳腫瘍の治療を目的とした抗癌剤）が挙げられる。
　本発明の有効成分であるＨＶＥＭ阻害剤を対象に投与する場合、神経膠腫（特に多形性膠芽腫）の治療または予防効果が得られる限り、投与経路は特に限定されるものではないが、非経口投与（例えば、静脈内投与、局所投与（カテーテルを用いた局所投与を含む）、皮下投与、腹腔内投与）が好ましい。
　非経口投与剤としては、具体的な投与形態に応じて適切な剤形を選択することができ、例えば、注射剤、坐剤が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法（例えば、第１５改正日本薬局方　製剤総則等に記載の公知の方法）により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
　本発明におけるＨＶＥＭ阻害剤の投与量は、有効成分の種類や、投与対象の性別、年齢および体重、症状、剤形および投与経路等に依存して決定できる。本発明においてＨＶＥＭ阻害剤を神経膠腫（特に多形性膠芽腫）の治療または予防を目的として投与する場合の成人１回あたりの投与量は、例えば、０．０００１ｍｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で決定することができるが、これに限定されるものではない。ＨＶＥＭ阻害剤の成人１日あたりの投与量は、有効成分の種類や、投与対象の性別、年齢および体重、症状、剤形および投与経路等に依存して決定できるが、例えば、上記投与量の有効成分を１日１回でまたは２～４回に分けて投与することができる。本発明の用剤および組成物は、それを必要とするヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル）に対しても投与することができる。
脳腫瘍の悪性度のマーカーおよび脳腫瘍の予後マーカー
　後記実施例に記載される通り、ＨＶＥＭの高発現が、脳腫瘍、特にMesenchymalサブタイプに属する多形性膠芽腫と相関すること、また、ＨＶＥＭの高発現が膠芽腫患者の予後不良と相関することが示された。また、ＨＶＥＭの過剰発現により多形性膠芽腫細胞の増殖、ニューロスフェア形成およびイン・ビボにおける腫瘍増殖がそれぞれ促進されることが確認された。従って、本発明によれば、ＨＶＥＭタンパク質またはＨＶＥＭ遺伝子からなる、脳腫瘍の悪性度のマーカーと、ＨＶＥＭタンパク質またはＨＶＥＭ遺伝子からなる、脳腫瘍の予後マーカーが提供される。本発明の脳腫瘍の悪性度のマーカーは、脳腫瘍患者における脳腫瘍の悪性度の判定に用いることができ、また、神経膠腫（特に多形性膠芽腫）の判定に用いることができる。本発明の脳腫瘍の予後マーカーは、脳腫瘍治療における脳腫瘍患者の予後の予測または推定に用いることができる。従って、本発明のこれらのマーカーは脳腫瘍の治療方針を決定する際の指標として有用である。
　本発明のマーカーは、ヒト患者の診断に用いるためには、ＨＶＥＭタンパク質またはＨＶＥＭ遺伝子はヒト由来のものであることが好ましい。また、本発明のマーカーにおいて、ＨＶＥＭ遺伝子は、ＨＶＥＭ遺伝子のゲノム配列からなるＤＮＡであってもよく、あるいはＨＶＥＭ遺伝子のｍＲＮＡや、ＨＶＥＭ遺伝子のｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡであってもよい。本発明のマーカーは、後述の本発明の脳腫瘍の悪性度の判定方法および本発明の脳腫瘍患者の予後の判定方法に従って実施することができる。
脳腫瘍の悪性度および予後の判定方法
　本発明の別の面によれば、対象（特に脳腫瘍患者）の生体試料中のＨＶＥＭ発現量を測定する工程を含んでなる、脳腫瘍の悪性度の判定方法が提供される。
　本発明において「生体試料」は、生体から分離された試料を意味し、例えば、脳外科手術の際に切除された脳組織が挙げられる。
　本発明の悪性度の判定方法においては、まず、（Ａ）被験対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量を測定する工程を実施する。ＨＶＥＭ発現量の測定は、公知の方法によりイン・ビトロにおいて実施することができる。
　例えば、生体試料中のＨＶＥＭの発現量はＨＶＥＭタンパク質の発現量に基づいて測定することができる。この場合、ＨＶＥＭタンパク質の発現量の測定は、ＨＶＥＭタンパク質に対する特異的結合物質を用いた公知の検出手段により実施することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色等により実施することができる。ＨＶＥＭタンパク質に対する特異的結合物質としては抗体が挙げられ、本発明の用剤および組成物や本発明の抗体について記載されたものを使用することができる。
　生体試料中のＨＶＥＭの発現量はまた、ＨＶＥＭ遺伝子の発現量に基づいて測定することができる。この場合、ＨＶＥＭ遺伝子の発現量の測定は、ＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等の公知の方法により実施することができる。ＨＶＥＭ遺伝子の発現量の測定に使用するプローブおよびプライマーセットは、後述の実施例を参照しつつ、前述のＨＶＥＭ遺伝子の配列情報に基づいて作製することができる。
　本発明の悪性度の判定方法においては、前記工程（Ａ）で測定されたＨＶＥＭ発現量に基づいて、生体試料に含まれる腫瘍細胞の悪性度の程度を決定する工程をさらに実施することができる。この工程では、対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中のＨＶＥＭ発現量を上回る場合に（好ましくは有意差をもって上回る場合に）、該生体試料が悪性度の高い腫瘍細胞集団（例えば神経膠腫細胞、特に多形性膠芽腫細胞）を含むことが示される。すなわち、本発明の悪性度の判定方法は、（Ｂ１）対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中のＨＶＥＭ発現量を上回る場合に（好ましくは有意差をもって上回る場合に）、該生体試料が悪性度の高い腫瘍細胞集団を含むと決定する工程をさらに含んでいてもよい。
　本発明の悪性度の判定方法においてはまた、前記工程（Ａ）で測定されたＨＶＥＭ発現量に基づいて、生体試料を採取した対象について脳腫瘍の悪性度を決定する工程をさらに実施することができる。この工程では、対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中のＨＶＥＭ発現量を上回る場合に（好ましくは有意差をもって上回る場合に）、対象が悪性度の高い脳腫瘍（例えば神経膠腫、特に多形性膠芽腫）に罹患していることが示される。すなわち、本発明の悪性度の判定方法は、（Ｂ２）対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中のＨＶＥＭ発現量を上回る場合に（好ましくは有意差をもって上回る場合に）、対象が悪性度の高い脳腫瘍に罹患していると決定する工程をさらに含んでいてもよい。
　本発明においては、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中のＨＶＥＭ発現量（カットオフ値）は、事前に複数の健常な対象から採取された生体試料、あるいは事前に複数の対象（脳腫瘍患者を含む）から採取された正常組織でのＨＶＥＭ発現量を測定して算出した平均値を用いることができ、あるいは、下記式（１）により算出された値を用いることもできる。
カットオフ値＝（健常対象の生体試料または正常組織試料のＨＶＥＭ発現量の平均値）±ｋ×（健常対象の生体試料または正常組織試料のＨＶＥＭ発現量の標準偏差）・・・式（１）
（上記式中、ｋは０～３の定数であり、好ましくはｋ＝１～３であり、特に２とすることができる。）
　本発明の悪性度の判定方法によれば、被験生体試料について神経膠腫細胞のような悪性度の高い腫瘍細胞集団を検出することができる。本発明の悪性度の判定方法によればまた、対象について神経膠腫のような悪性度の高い脳腫瘍を検出することができる。従って、本発明の悪性度の判定方法は、脳腫瘍の治療方針を決定する際の適切な判断材料を提供する点で有用である。すなわち、本発明の悪性度の判定方法は、神経膠腫（特に多形性膠芽腫）の診断および／または鑑別に補助的に用いることができ、対象が神経膠腫に罹っているか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。
　本発明の別の面によれば、対象（特に脳腫瘍患者）の生体試料中のＨＶＥＭ発現量を測定する工程を含んでなる、脳腫瘍患者の予後の判定方法が提供される。
　本発明の予後判定方法においては、まず、（Ｃ）被験対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量を測定する工程を実施する。ＨＶＥＭ発現量の測定は、本発明の悪性度の判定方法と同様に実施することができる。
　本発明の予後判定方法においては、前記工程（Ｃ）で測定されたＨＶＥＭ発現量に基づいて、生体試料を採取した対象について予後を決定する工程をさらに実施することができる。この工程では、対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中のＨＶＥＭ発現量を上回る場合に（好ましくは有意差をもって上回る場合に）、対象の予後が不良であることが示される。すなわち、本発明の悪性度の判定方法は、（Ｄ）対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中のＨＶＥＭ発現量を上回る場合に（好ましくは有意差をもって上回る場合に）、対象の予後が不良であると決定する工程をさらに含んでいてもよい。健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中のＨＶＥＭ発現量（カットオフ値）は、事前に複数の健常な対象から採取された生体試料、あるいは事前に複数の対象（脳腫瘍患者を含む）から採取された正常組織でのＨＶＥＭ発現量を測定して算出した平均値を用いることができ、あるいは、前記式（１）により算出された値を用いることができる。また、本発明の悪性度の判定方法において、予後が不良であるとは、所定期間内の生存率がより低いこと、悪性度が高い脳腫瘍（例えば、神経膠腫、特に多形性膠芽腫）を発症する確率が高いこと等を意味する。
　本発明の予後判定方法によれば、脳腫瘍治療において脳腫瘍患者の予後を予測または推定することができる。従って、本発明の予後判定方法は、脳腫瘍の治療方針を決定する際の適切な判断材料を提供する点で有用である。すなわち、本発明の予後判定方法は、脳腫瘍（例えば、神経膠腫、特に多形性膠芽腫）の治療に補助的に用いることができ、対象の予後が不良か否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。
単一可変ドメインおよび抗体
　本発明によれば、ＨＶＥＭと特異的に結合し、かつ、腫瘍細胞の増殖（特に悪性腫瘍細胞の増殖）を抑制する、免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。本発明の単一可変ドメインはＨＶＥＭに対して８０ｎＭ未満のＥＣ５０値で結合することができる。
　本発明の単一可変ドメインは、相補性決定領域１～３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）により特徴付けることができ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、前記（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）、（vi）および（vii）からなる群から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせにより特定することができる。
　本発明の単一可変ドメインはまた、フレームワーク領域１～４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）により特徴付けることができ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、前記（viii）、（ix）、（ｘ）、（xi）、（xii）、（xiii）および（xiv）からなる群から選択される、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の組み合わせにより特定することができる。本発明の単一可変ドメインは、相補性決定領域１～３とフレームワーク領域１～４により特定することができ、この場合、本発明の単一可変ドメインは、Ｎ末端側からＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順に連結してなるものとすることができる。
　本発明の単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が前記（ｉ）の組み合わせである場合にはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の組み合わせは前記（viii）を選択することができる。本発明の単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が前記（ii）の組み合わせである場合にはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の組み合わせは前記（ix）を選択することができる。本発明の単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が前記（iii）の組み合わせである場合にはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の組み合わせは前記（ｘ）を選択することができる。本発明の単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が前記（iv）の組み合わせである場合にはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の組み合わせは前記（xi）を選択することができる。本発明の単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が前記（ｖ）の組み合わせである場合にはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の組み合わせは前記（xii）を選択することができる。本発明の単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が前記（vi）の組み合わせである場合にはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の組み合わせは前記（xiii）を選択することができる。本発明の単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が前記（vii）の組み合わせである場合にはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の組み合わせは前記（xiv）を選択することができる。
　本発明の単一可変ドメインはまた、実施例で配列決定された単一可変ドメイン（前記（xv）のポリペプチド）により特定することもできるが、本発明においてはこれに加えて前記（xv）のポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドも本発明の単一可変ドメインに含まれる。
　本発明の単一可変ドメインと実質的に同一のポリペプチドの例としては、ヒト化された単一可変ドメインが挙げられる。単一可変ドメインのヒト化方法は公知であり、例えば、天然に存在する単一可変ドメインのアミノ酸配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連したヒト単一可変ドメインのアミノ酸配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって、潜在的に有用なヒト化置換を確認し、その後、このようにして決定した潜在的に有用な１個または複数個のヒト化置換を本発明の単一可変ドメインのアミノ酸配列に導入することでヒト化単一可変ドメインを得ることができる。このようにして得られたヒト化単一可変ドメインは、標的に対する親和性、安定性、他の所望の特性について確認試験を行い、適切なヒト化単一可変ドメインのアミノ酸配列を決定することができる。
　本発明の単一可変ドメインと実質的に同一のポリペプチドは、前記（xvi）および(xvii)から選択されるポリペプチドで表すことができる。
　前記（xvi）において、「同一性」は「相同性」を含む意味で用いられる。ここで「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性については、例えば、配列におけるギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730（1983））。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的に、ＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990））、ＦＡＳＴＡ（Peasron et al., Methods in Enzymology 183:63-69 (1990）)、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Meth. Enzym., 164, 765 (1988））などの相同性検索ソフトウエアを使用することができる。また、同一性の算出は、例えば、前記のような公知の相同性検索プログラムを用いて行うことができ、例えば、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出することができる。
　前記（xvi）における同一性は、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上とすることができる。
　前記（xvii）において、「アミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、例えば、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の数のアミノ酸、または、天然に生じる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入および／または付加によって改変されたことを意味する。前記置換などにより改変されるアミノ酸の個数は、例えば、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個である。前記アミノ酸配列において、前記改変は、例えば、連続して生じてもよいし、不連続に生じてもよい。
　前記（xvii）におけるアミノ酸の挿入としては、例えば、アミノ酸配列の内部への挿入が挙げられる。さらに、前記（xvii）におけるアミノ酸の付加は、例えば、アミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端への付加であっても、Ｎ末端およびＣ末端の両末端への付加であってもよい。
　前記（xvii）におけるアミノ酸の置換は、アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が別の種類のアミノ酸残基に置き換えられることを意味する。前記（xvii）におけるアミノ酸の置換は、例えば、保存的置換であってもよい。「保存的置換」は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または複数個のアミノ酸を、別のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体に置換することを意味する。保存的置換において、置換されるアミノ酸と置換後のアミノ酸とは、例えば、性質および／または機能が類似していることが好ましい。具体的には、疎水性および親水性の指標、極性、電荷などの化学的性質、あるいは二次構造などの物理的性質が類似していることが好ましい。このように、性質および／または機能が類似するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、当該技術分野において公知である。例えば、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ）酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　前記（xvii）における好ましいアミノ酸の改変としては、一アミノ酸置換、二アミノ酸置換、三アミノ酸置換、四アミノ酸置換、五アミノ酸置換、六アミノ酸置換または七アミノ酸が挙げられ、より好ましくは該置換が保存的置換であるものである。前記（xvii）における好ましいアミノ酸の改変としてはまた、改変がフレームワーク領域１～４に生じているものが挙げられ、より好ましくは改変がフレームワーク領域１～４のみに生じているものである。前記（xvii）における好ましいアミノ酸の改変としてはまた、改変が一アミノ酸置換、二アミノ酸置換、三アミノ酸置換、四アミノ酸置換、五アミノ酸置換、六アミノ酸置換または七アミノ酸であり、かつ、改変がフレームワーク領域１～４に生じているものが挙げられ、より好ましくは改変が一アミノ酸置換、二アミノ酸置換、三アミノ酸置換、四アミノ酸置換、五アミノ酸置換、六アミノ酸置換または七アミノ酸であり、かつ、改変がフレームワーク領域１～４のみに生じているものである。
　本発明の別の面によれば、本発明の単一可変ドメインを含んでなる、抗体および免疫グロブリン単一可変ドメイン多量体が提供される。このような抗体には可変領域として２本の重鎖のみから構成されるいわゆる重鎖抗体（あるいはＶＨＨ抗体）が含まれる。また前記多量体には複数の本発明の単一可変ドメインが互いに直接あるいはリンカーを介して結合してなる複合体が含まれ、このような複合体には本発明の単一可変ドメイン以外の１種または２種以上の任意成分（例えば、生理活性ペプチド、安定化物質）がさらに連結されていてもよい。
　本発明の単一可変ドメイン、抗体および多量体は、例えば、これらをコードするポリヌクレオチドを宿主において発現させて、発現産物を回収することにより製造することができる。従って、本発明のさらに別の面によれば、本発明の単一可変ドメイン、抗体または多量体をコードするポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドが作動可能に連結されたベクターが導入されてなる宿主細胞が提供される。「単一可変ドメイン等をコードするポリヌクレオチド」とは、単一可変ドメイン等のアミノ酸配列を元に、遺伝暗号（すなわち、コドン）に基づいて特定することができる。本発明において「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、さらには、これらの修飾体や人工核酸が含まれるが、好ましくはＤＮＡである。また、ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。
　本発明のポリヌクレオチドは、使用する宿主において発現可能で、かつ、ＨＶＥＭ結合活性を有する単一可変ドメイン等をコードするコドンで構成されたものであれば特に限定されることなく、使用する宿主において発現可能にするため、あるいは、発現量を増加させるためにコドンの最適化を行ってもよい。コドン最適化は、本分野において通常使用されている公知の方法によって行うことができる。
　本発明の単一可変ドメイン等は、種々の宿主細胞、例えば、細菌細胞、カビ、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞を使用し、これらの細胞内で発現させることができる。本発明の単一可変ドメイン等を発現させるための発現用ベクターは公知であり、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。
　宿主において発現させた単一可変ドメイン等を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得し、得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的の単一可変ドメイン等を取得することができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などを用いることができる。
　本発明の単一可変ドメイン、抗体または多量体はＨＶＥＭ結合活性を有し、かつ、腫瘍増殖を抑制することができる。前述の通り、ＨＶＥＭの発現を阻害する物質やＨＶＥＭの機能を阻害する物質は、神経膠腫の治療または予防に用いることができることから、本発明の単一可変ドメイン、抗体または多量体は医薬組成物の有効成分として用いることができ、特に本発明の用剤および組成物（すなわち神経膠腫の治療剤および予防剤）の有効成分として用いることができる。
本発明の他の側面について
　本発明の別の面によれば、有効量のＨＶＥＭ阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、神経膠腫の治療または予防方法が提供される。本発明の別の面によればまた、有効量のＨＶＥＭ阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、神経膠腫の発症リスクの低減方法が提供される。本発明の別の面によればまた、有効量のＨＶＥＭ阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、悪性脳腫瘍の治療における予後改善方法が提供される。本発明の方法は、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
　本発明の別の面によれば、本発明の悪性度の判定方法を実施し、次いで、有効量の抗癌剤（例えば、悪性脳腫瘍の治療を目的とした抗癌剤、好ましくはＨＶＥＭ阻害剤、特にＨＶＥＭとＡＰＲＩＬとの結合を阻害する物質）を、悪性度の高い脳腫瘍に罹患しているか、または罹患している可能性が高いと判定された対象（あるいは神経膠腫に羅患しているか、または羅患している可能性が高いと判定された対象）に投与することを含んでなる、悪性腫瘍または神経膠腫の治療方法が提供される。本発明の方法は、本発明の悪性度の判定方法に関する記載と、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
　本発明の別の面によれば、神経膠腫の治療または予防剤の製造のための、あるいは、神経膠腫の治療または予防剤としての、ＨＶＥＭ阻害剤の使用が提供される。本発明の別の面によればまた、神経膠腫の発症リスクの低減剤の製造のための、あるいは、神経膠腫の発症リスクの低減剤としての、ＨＶＥＭ阻害剤の使用が提供される。本発明の別の面によればまた、悪性脳腫瘍の治療における予後改善剤の製造のための、あるいは、悪性脳腫瘍の治療における予後改善剤としての、ＨＶＥＭ阻害剤の使用が提供される。本発明の使用は、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
　本発明の別の面によれば、神経膠腫の治療または予防薬としての、神経膠腫の治療または予防に用いるための、あるいは、本発明の治療または予防方法に用いるための、ＨＶＥＭ阻害剤が提供される。本発明の別の面によればまた、神経膠腫の発症リスクの低減剤としての、神経膠腫の発症リスクの低減に用いるための、あるいは、本発明のリスク低減方法に用いるための、ＨＶＥＭ阻害剤が提供される。本発明の別の面によればまた、悪性脳腫瘍の治療における予後改善剤としての、悪性脳腫瘍の治療における予後改善に用いるための、あるいは、本発明の予後改善方法に用いるための、ＨＶＥＭ阻害剤が提供される。上記のＨＶＥＭ阻害剤は、本発明の用剤および組成物に関する記載に従って実施することができる。
　本発明の方法および本発明の使用はヒトを含む哺乳動物における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。本明細書において、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。
　以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
データベース
　分子脳のためのリポジトリ新生児データRepository for Molecular Brain Neoplasia Data（REMBRANDT）およびThe Cancer Genome Atlas（TCGA）は、Project Betastasis（http://www.betastasis.com）、TCGAデータポータル（https://tcga-data.nci.nih.gov）およびNIH’s Genome Data Commons（https://api.gdc.cancer.gov）から抽出した。
統計解析
　統計解析（ウェルチのｔ検定、スチューデントｔ検定、二元配置分散分析、クラスカル・ウォリス検定およびログランク検定）は、統計ソフトウェアR（http://www.R-project.org）によって実施した。
例１：ＧＢＭ細胞株の増殖およびニューロスフェア形成に対するＢＭＰ－４の阻害効果
（１）ヒト膠芽腫細胞の培養条件
　ヒト多形性膠芽腫細胞であるＵ３０２４ＭＧ、Ｕ３０３１ＭＧおよびＵ３０５４ＭＧ細胞株をヒト膠芽腫細胞培養物リソース（Human Glioblastoma Cell Culture、http://www.hgcc.se/#、本明細書において単に「ＨＧＣＣ」ということがある）から得て、膠芽腫幹細胞（glioma-initiating cells、本明細書において単に「ＧＩＣ」ということがある）特性（Xie Y et al., EBioMedicine, 2:1351-63(2015)）を維持する条件下で維持した。具体的には、Ｂ－２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｎ－２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（Epidermal Growth Factor；ＥＧＦ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）および塩基性線維芽細胞増殖因子（Fibroblast growth factor-basic；ｂＦＧＦ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）で富化した、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で培養した。
（２）ＢＭＰ－４処理
　上記（１）で調製した細胞に、３０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＢＭＰ－４（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加した。また、対照として該ＢＭＰ－４を添加しない群を作製した。
（３）イン・ビトロ細胞増殖アッセイ
　上記（２）で調製した細胞を７日間培養し、イン・ビトロ細胞増殖アッセイを行った。細胞カウントキット－８（ナカライテスク社製）を製造者の指示に従って使用した。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ６８０、バイオラッド社製）またはＥｎｓｐｉｒｅ（パーキンエルマー社製）を用いて、４５０ｎｍおよび５９５ｎｍでの吸光度を測定することにより細胞数を測定した。
（４）スフェア形成アッセイ
　上記（２）で調製した細胞を１～１００細胞／ウェルの密度で超低付着性マイクロプレート（コーニング社製）上に播種し、７日間培養した。直径が２０μｍ以上の細胞塊をスフェアとみなした。スフェアがないウェルを各条件において計測した。
（５）結果
　結果は図１に示した通りであった。無血清条件下の細胞増殖アッセイおよびニューロスフェア形成（Lenkiewicz M. et al., Curr Protoc Stem Cell Biol., Chapter 3: Unit3.3 (2009)）において、ＢＭＰ－４はＵ３０２４ＭＧおよびＵ３０３１ＭＧ細胞の増殖を強力に阻害することを見出した。対照的に、ＢＭＰ－４は、Ｕ３０５４ＭＧ細胞の増殖およびスフェア形成を阻害しないことが確認された。
例２：ＢＭＰ－４標的遺伝子の探索
（１）ＲＮＡ配列分析
　ヒト膠芽腫細胞ＴＧＳ－０４を用いてＢＭＰ標的遺伝子を同定するためにＲＮＡ配列分析を行った（Raja E. et al., Oncogene, 36: 4963-4974 (2017)）。ＲＮＡ配列データにおいてＢＭＰ－４刺激により制御される遺伝子の発現量をそのＦＰＫＭ値（fragments per kilobase of exon per million fragments）に基づいて解析し、ＦＰＫＭ値がＢＭＰ－４刺激により１／２以下に抑制される遺伝子を抽出した。さらに抽出された遺伝子の中から膜貫通タンパク質をコードする遺伝子を探索した。その結果、ＴＧＳ－０４細胞においてＢＭＰ－４によりＨＶＥＭの発現が１／２以下に抑制されることが確認された（データ示さず）。
（２）定量的リアルタイム（ＲＴ）－ＰＣＲ分析
　例１（２）で調製したＧＢＭ細胞（Ｕ３０２４ＭＧ細胞またはＵ３０３１ＭＧ細胞）から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ヒトＨＶＥＭおよびヒトＧＡＰＤＨ（相対発現量の標準化のために使用）の発現を解析した。定量的ＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマーを表１に示す。相補ＤＮＡは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製）を用いて合成した。遺伝子発現レベルを、ＦａｓｔＳｔａｒｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＳｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で定量した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　結果は図２に示した通りであった。Ｕ３０２４ＭＧ細胞およびＵ３０３１ＭＧ細胞ではＢＭＰ－４によりＨＶＥＭの発現が強く抑制された。
例３：ＨＶＥＭ発現とＧＢＭ患者の予後不良との相関関係
　国立がん研究所ゲノムデータコモンズ（The National Cancer Institute Genomic Data Commons、本明細書において単に「ＧＤＣ」ということがある）ＴＣＧＡ脳腫瘍データセットを用いて、下記（１）～（４）の解析を行った。
（１）ＧＢＭにおけるＨＶＥＭの発現
　脳腫瘍におけるＨＶＥＭの機能を調べるために、ＧＤＣ　ＴＣＧＡデータセットを用いてＨＶＥＭｍＲＮＡの発現レベルを解析した。結果は図３ａに示される通りであった。正常な脳組織や、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫および星細胞腫などの低悪性度神経膠腫組織と比較して、ＧＢＭにおいては有意に上昇したＨＶＥＭの発現が観察された。正常脳および低悪性度神経膠腫における発現レベル間に有意差は観察されなかった。しかし、星細胞腫では乏突起膠腫や乏突起星細胞腫と比較して有意に上昇したＨＶＥＭの発現が観察された。
（２）脳腫瘍患者の生存とＨＶＥＭの発現
　ＧＤＣ　ＴＣＧＡデータセットを用いて脳腫瘍患者の生存を分析した。結果は図３ｂに示される通りであった。腫瘍におけるＨＶＥＭの発現が低いＧＢＭ患者では、ＨＶＥＭの発現が高い患者と比較して有意に長い生存期間が観察され、同様の結果が低グレードの神経膠腫（Lower Grade Glioma、ＬＧＧ）、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫および星細胞腫の患者においても確認された。
（３）ＧＢＭサブタイプにおけるＨＶＥＭの発現
　ＧＢＭの４つのサブタイプ（Proneural、Neural、ClassicalおよびMesenchymal、Verhaak et al., Cancer Cell, 17:98-110 (2010)の分類に基づく）におけるＨＶＥＭの発現を解析した。結果は図３ｃに示される通りであった。Mesenchymalサブタイプでは最も高いＨＶＥＭの発現が観察されたが、Proneuralサブタイプでは最も低い発現が観察された。
（４）ＧＢＭサブタイプにおけるＨＶＥＭの発現
　１３の異なるＧＢＭ細胞株（ＨＧＣＣリソースより入手（Xie Y et al., EBioMedicine, 2:1351-63(2015)）およびＨ９　ｈＥＳＣ由来ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）におけるＨＶＥＭの発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより解析した。なお、ｈＮＳＣは、ＳｔｅｍＰｒｏ神経サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で培養した。該細胞について、プライマーは表１に記載の配列番号１～４を使用し、例２（２）に記載の方法に従って、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。結果は図３ｄに示される通りであった。Mesenchymalサブタイプの５株すべてにおいて、ＨＶＥＭの高発現が見られた。対照的に、Proneural、NeuralおよびClassicalサブタイプのそれぞれにおいて試験された２～３株のうちの１株のみが、増加したＨＶＥＭの発現を示し、MesenchymalサブタイプにおけるＨＶＥＭ発現のレベルは、一般に他のサブタイプよりも高いことが確認された。これらの結果から、特定のヒト脳腫瘍、特にＧＢＭのMesenchymalサブタイプにおいて、ＨＶＥＭ発現が増加し、ＨＶＥＭの高発現が、膠芽腫患者の予後不良と相関することが示された。
例４：ＨＶＥＭの阻害によるＧＢＭ細胞の増殖およびニューロスフェア形成の抑制
（１）ｓｈＲＮＡによるＨＶＥＭの阻害
　表２に示すショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列をｐＥＮＴＲ４－Ｈ１またはｐＥＮＴＲ４－ｍＵ６ベクターに挿入した。ｐＥＮＴＲ４－Ｈ１とＣＳ－ＲｆＡ－ＣＭＶ－ＰｕｒｏＲベクター間、またはｐＥＮＴＲ４－ｍＵ６とＣＳ－ＲｆＡ－ＣＧとの間のＬＲ反応をＬＲクローナーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によって触媒した。ベクタープラスミドｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－Ｒｅｖを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に形質導入した。レンチウイルス粒子をＬｅｎｔｉ－Ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラバイオ社製）で濃縮し、次いで無血清緩衝液で再構成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　調製した各ｓｈＲＮＡを例１（１）に記載の条件で培養しているMesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０２４ＭＧ細胞、Ｕ３０３１ＭＧ細胞またはＵ３０５４ＭＧ細胞）に導入した。次いで、各ｓｈＲＮＡを導入したＧＢＭ細胞（Ｕ３０２４ＭＧ細胞、Ｕ３０３１ＭＧ細胞またはＵ３０５４ＭＧ細胞）におけるＨＶＥＭ発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより解析した。具体的には、プライマーは表１に記載の配列番号１～４を使用し、例２（２）に記載の方法に従ってＲＴ－ＰＣＲを実施した。
（２）抗体によるＨＶＥＭの阻害
　ヒトＨＶＥＭに対する抗体（ＭＡＢ３５６、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）または対照としてマウスＩｇＧ１抗体（ＭＡＢ００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いて、ＧＢＭ細胞（Ｕ３０２４ＭＧ細胞、Ｕ３０３１ＭＧ細胞またはＵ３０５４ＭＧ細胞）表面のＨＶＥＭの機能を抑制することによるＧＢＭ細胞の増殖を調べた。具体的には、１０μｇ／ｍＬのヒトＨＶＥＭ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を培養液に添加して、ＧＢＭ細胞を抗ヒトＨＶＥＭ抗体または対照抗体により処理した。
（３）イン・ビトロ細胞増殖アッセイ
　上記（１）および（２）で調製した細胞について、例１（３）に記載の方法に従ってイン・ビトロ細胞増殖アッセイを行った。
（４）スフェア形成アッセイ
　上記（１）で調製した細胞について、例１（４）に記載の方法に従って、スフェア形成アッセイを行った。
（５）結果
　結果は図４に示される通りであった。ｓｈＲＮＡによるＨＶＥＭのノックダウンは、３つのMesenchymalサブタイプ細胞株すべての増殖を減弱させた（図４ａ、ｂ）。また、Mesenchymalサブタイプ細胞のスフェア形成能は、ＨＶＥＭ発現のノックダウンにより強力に抑制された（図４ｃ）。また、抗ヒトＨＶＥＭ抗体により処理したMesenchymalサブタイプ培養細胞においては、細胞増殖が有意に減弱されることが確認された（図４ｄ）。なお、Ｕ３０５４ＭＧ細胞における細胞増殖およびスフェア形成は、ＢＭＰ－４により阻害されなかった（図１参照）が、ＨＶＥＭｓｈＲＮＡにより阻害されることが示された。これらの結果から、ＨＶＥＭがＢＭＰ－４以外のシグナル系においてもMesenchymalサブタイプ細胞の細胞増殖およびスフェア形成を促進する作用を有することが示唆された。
例５：ＨＶＥＭのサイレンシングによるＧＢＭ細胞のイン・ビボ腫瘍増殖の抑制
（１）ＧＢＭ細胞におけるｓｈＲＮＡによるＨＶＥＭの阻害
　ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２、プロメガ社製、以下同様）をｐＥＮＴＲ２０１ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にクローニングし、ｐＥＮＴＲ２０１－Ｌｕｃ２およびＣＳ－ＣＭＶ－ＲｆＡベクター間の組換えをＬＲクローナーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によって触媒した以外は、例４（１）の記載と同様にして、ホタルルシフェラーゼＬｕｃ２をMesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０３１ＭＧ細胞またはＵ３０５４ＭＧ細胞）に導入し、ホタルルシフェラーゼを発現するMesenchymalサブタイプ細胞を調製した。該Mesenchymalサブタイプ細胞に、表２に記載の対照ｓｈＲＮＡ＃１（配列番号５）またはＨＶＥＭｓｈＲＮＡ＃１または＃２（配列番号７または８）を例４（１）に記載の方法に従って導入することにより、ホタルルシフェラーゼおよび対照ｓｈＲＮＡまたはＨＶＥＭｓｈＲＮＡを発現するMesenchymalサブタイプ細胞を調製した。
（２）ＧＢＭ細胞の頭蓋内移植
　上記（１）で調製したＧＢＭ細胞をヌードマウスに頭蓋内に同所移植することにより、ＨＶＥＭの腫瘍形成活性を調べた。具体的には、全部で１×１０５個の生存細胞をＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕの頭蓋骨の前項から矢状縫合の右方向に２ｍｍ、頭蓋骨の表面から３ｍｍ下の位置に移植した。ホタルルシフェリン（プロメガ社製）をマウスに腹腔内注射した後、ＮｉｇｈｔＯＷＬ　ＬＢ９８１　ＮＣ１００Ｔ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）でイン・ビボ生物発光イメージングを行った。東京大学動物倫理委員会の規則に従って、体重が２０％以上減少するまで、あるいは片側不全麻痺などの神経学的徴候を示すまでマウスをモニターした。
（３）結果
　結果は図５に示される通りであった。非標的化対照ｓｈＲＮＡ＃１で処理したＵ３０３１ＭＧおよびＵ３０５４ＭＧ細胞の両方が、細胞の移植後に腫瘍を形成したことがイン・ビボ生物発光イメージングにより示された。対照的に、ＨＶＥＭｓｈＲＮＡ＃１または＃２で処理された細胞は対照細胞よりも小さな腫瘍を形成し、細胞の移植１５週間後にマウスにおいて生物発光シグナルが減少したかあるいは検出されなかった（図５ａ）。また、ＧＢＭ細胞におけるＨＶＥＭ発現のサイレンシングは、対照ｓｈＲＮＡを発現するＧＢＭ細胞を有するマウスと比較して、マウスの生存期間を延長させることが確認された（図５ｂ）。
例６：ＨＶＥＭの過剰発現によるＧＢＭ細胞の細胞増殖、ニューロスフェア形成およびイン・ビボ腫瘍増殖の促進
（１）イン・ビトロにおけるＨＶＥＭの過剰発現
　改良型緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescent Protein；ＥＧＦＰ）、ＨＶＥＭまたはＬｕｃ２　ｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ２０１ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にクローニングし、ｐＥＮＴＲ２０１、ＣＳＩＩ－ＥＦ－ＲｆＡまたはＣＳ－ＣＭＶ－ＲｆＡベクター間の組換えをＬＲクローナーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によって触媒した以外は、例４（１）の記載と同様にして、ＥＧＦＰまたはＨＶＥＭを例１（１）に記載の条件で培養しているＧＢＭ非Mesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０４７ＭＧ、Ｕ３０８５ＭＧおよびＵ３０１７ＭＧ細胞）において発現させた。
（２）イン・ビトロ細胞増殖アッセイ
　上記（１）で調製した細胞について、例１（３）に記載の方法に従ってイン・ビトロ細胞増殖アッセイを行った。
（３）スフェア形成アッセイ
　上記（１）で調製した細胞について、例１（４）に記載の方法に従って、スフェア形成アッセイを行った。
（４）イン・ビボにおけるＨＶＥＭの過剰発現
　上記（１）で調製したＥＧＦＰまたはＨＶＥＭを過剰発現するＵ３０４７ＭＧ細胞について、イン・ビボ腫瘍形成活性を検討した。具体的には、例５（２）に記載の方法に従って、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕ）頭蓋内へ該Ｕ３０４７ＭＧ細胞を同所移植し、イン・ビボ生物発光イメージングを行った。
（５）結果
　結果は、図６および図７に示される通りであった。Ｕ３０４７ＭＧ、Ｕ３０８５ＭＧおよびＵ３０１７ＭＧ細胞は、それぞれＧＢＭ細胞のProneural、NeuralおよびClassicalサブタイプであり、Mesenchymalサブタイプ細胞（図３ｄ参照）と比較してＨＶＥＭの発現レベルは低い。これらの細胞においてＨＶＥＭを過剰発現させた場合、ＥＧＦＰを導入した対照細胞と比較して細胞の増殖を増加させた（図６ａ）。さらに、スフェア形成能は、ＨＶＥＭの過剰発現によって増強された（図６ｂ）。これらの知見から、膠芽腫細胞の幹細胞様特性の維持におけるＨＶＥＭの役割が確認された。また、図７において、各マウス間で生物発光シグナルが変化したが、ＨＶＥＭはイン・ビボで腫瘍増殖を促進し（図７ａ）、ＨＶＥＭを発現するＵ３０４７ＭＧ細胞を移植したマウスでは対照マウスと比較して生存期間が短くなることが確認された（図７ｂ）。
例７：ＨＶＥＭ阻害によるマウス神経膠腫細胞の腫瘍形成能の抑制
（１）ＨＶＥＭ発現と血清
　マウス神経膠腫細胞株ＧＬ２６１（パーキンエルマー社製）を用いてＨＶＥＭの機能を解析した。ＧＬ２６１細胞を１０％ウシ胎児血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を添加したＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）培地（ウシ胎児血清含有分化培地）あるいは例１（１）に記載の無血清幹細胞培地で培養した。例２（２）に記載の方法に従って、表３に示すプライマーを使用して定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　結果は図８ａに示される通りであった。ＨＶＥＭの発現は、細胞を無血清培地中で増殖させたときに検出されたが、血清存在下では減少した。これらの結果から、血清存在下ではＧＬ２６１細胞が分化し、ＨＶＥＭ発現が減少することが確認された。
（２）ＨＶＥＭの腫瘍形成活性
　表４に示すＨＶＥＭｓｈＲＮＡ＃１または＃２（配列番号１３または１４）あるいは対照ｓｈＲＮＡ＃１（配列番号５）をコードするＤＮＡ配列およびＥＧＦＰ配列を有するベクターを、例４（１）に記載の方法に従って、ＧＬ２６１細胞に導入した。該ＧＬ２６１細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスへ頭蓋内に同所移植することにより、ＨＶＥＭの発現を抑制した後のＧＬ２６１細胞におけるＨＶＥＭの腫瘍形成活性を検討した。具体的には、全部で１×１０５個の生存細胞を頭蓋骨の前項から矢状縫合の右方向に２ｍｍ、頭蓋骨の表面から３ｍｍ下の位置に移植した。膠芽腫細胞を移植したマウスを、４％パラホルムアルデヒドで経心灌流した。マウスの脳組織を１０～２０％スクロースで凍結保護し、組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色をした。結果は図８ｂに示される通りであった。対照ｓｈＲＮＡで処理されたＧＬ２６１細胞は、細胞の移植後に腫瘍を形成した（ＥＧＦＰシグナルが観察された）が、ＨＶＥＭｓｈＲＮＡで処理したマウス神経膠腫細胞は腫瘍を形成しなかった（図８ｂ）。これらの結果から、神経膠腫細胞においてＨＶＥＭの発現を抑制することにより神経膠腫細胞の腫瘍形成活性を抑制できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（３）抗ＨＶＥＭ抗体による生存確率の増加
　ホタルルシフェラーゼ（ＲｅｄＦＬｕｃ）を発現するＧＬ２６１細胞（BW134246V、パーキンエルマー社製）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの頭蓋内に同所移植することにより、抗ＨＶＥＭ抗体を用いてＨＶＥＭの機能をイン・ビボで調べた。具体的には、上記（２）に記載の方法に従ってＧＬ２６１細胞を頭蓋内に移植してから５日後に、イン・ビボ生物発光イメージングに基づいて、ホタルルシフェラーゼの発光強度をもとにマウスを均等に２群（抗マウスＨＶＥＭ抗体群およびアイソタイプ対照ＩｇＧ１群）に分けた。次いで、ＧＬ２６１細胞を頭蓋内に移植してから５日後に７．５ｍｇ／ｋｇの抗マウスＨＶＥＭハムスターモノクローナルＩｇＧ抗体（ＬＢＨ１、Xu Y et al., Blood, 109:4097-4104(2007)に従って作製）または対照としてハムスターアイソタイプＩｇＧ抗体（I-140、Leinco Technologies社製）を腹腔内注射し、これを５日おきに計５回実施した。結果は図８ｃに示される通りであった。脳組織におけるヘマトキシリン・エオジン染色により、ＧＬ２６１細胞の移植から２５日後の対照群では腫瘍を形成するが、抗マウスＨＶＥＭ抗体を投与した群では、腫瘍の形成が抑制されることが確認された。対照抗体で処置した群のマウスはすべて３５日以内に死亡したが、抗マウスＨＶＥＭ抗体で処置した群の全てのマウスが４５日より長く生存した。これらの結果から、神経膠腫細胞においてＨＶＥＭの機能を阻害することにより、神経膠腫細胞の腫瘍形成活性を抑制できること、また、生存期間を延長できることが確認された。
例８：ＨＶＥＭのリガンドのＧＢＭにおける発現
（１）ＧＢＭにおけるＨＶＥＭのリガンドの発現
　脳腫瘍におけるＨＶＥＭのリガンドの機能を調べるために、ＧＤＣ　ＴＣＧＡデータセットを用いてＡＰＲＩＬおよびＨＶＥＭの既知のリガンド（ＬＩＧＨＴ、ＬＴＡ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＳＡＬＭ５）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した。結果は図９ａに示される通りであった。正常な脳組織とＧＢＭにおいてＡＰＲＩＬはＨＶＥＭの既知リガンドと比較して高発現していることが観察された。
（２）ＧＢＭサブタイプにおけるＨＶＥＭのリガンドの発現
　１３の異なるＧＢＭ細胞株およびＨ９　ｈＥＳＣ由来ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）の培養上清中のＡＰＲＩＬおよびＨＶＥＭの既知のリガンド（ＬＴＡ、ＬＩＧＨＴ）の量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。具体的には、細胞上清中のヒトＡＰＲＩＬ、ＬＴＡおよびＬＩＧＨＴは、以下の試薬を使用したイムノアッセイで定量した：ヒトＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３　ＤｕｏＳｅｔ　ＥＬＩＳＡ（ＤＹ８８４Ｂ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ヒトＬｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－ａｌｐｈａ／ＴＮＦ－ｂｅｔａ　ＤｕｏＳｅｔ　ＥＬＩＳＡ（ＤＹ２１１、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ヒトＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡキット（ＤＬＩＴ００、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、補助試薬キット２（ＤＹ００８、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）。４５０ｎｍおよび５７０ｎｍの吸光度をＭｏｄｅｌ６８０マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）またはＥｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）で測定した。結果は、図９ｂに示される通りであった。ＬＴＡとＬＩＧＨＴの培養上清中の濃度は検出感度以下であった。これに対しＡＰＲＩＬは正常の脳組織（ｈＮＳＣ）および１３種類のＧＢＭの全てにおいて５０ｐｇ／ｍＬ以上の濃度で存在すること、ＧＢＭでは正常脳組織よりも発現量が高いことが確認された。
　これらの結果から、既知のＨＶＥＭのリガンドでＧＢＭにおいて高発現しているものは見られず、ＨＶＥＭのリガンドとしては報告されていないＡＰＲＩＬの発現が高いことが明らかとなった。なお、ＡＰＲＩＬはＴＮＦスーパーファミリーのリガンドであり、ＡＰＲＩＬのレセプターとしてはＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７とＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂが知られている。ＡＰＲＩＬがＨＶＥＭに結合してシグナルを伝えるということはこれまで報告されていなかった。
例９：ＡＰＲＩＬの阻害によるＧＢＭ細胞の増殖およびニューロスフェア形成の抑制
（１）ｓｈＲＮＡによるＡＰＲＩＬの阻害
　表５に示すショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列、Mesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０５４ＭＧ細胞）および表６に示すＡＰＲＩＬのプライマーを用いた以外は、例４（１）に記載の方法に従って、ｓｈＲＮＡによりＡＰＲＩＬを阻害した（図１０ａ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）抗体によるＡＰＲＩＬの阻害
　ヒトＡＰＲＩＬに対する抗体（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＭＡＢ５８６０、Ｒ＆Ｄシステムズ社製、以下同様）１０μｇ／ｍＬを用いた以外は、例４（２）の記載に従ってＧＢＭ細胞表面のＡＰＲＩＬの機能を抑制することによるＧＢＭ細胞の増殖を調べた（図１０ｄ）。また、ヒトＡＰＲＩＬに対する抗体１０μｇ／ｍＬおよびＧＢＭ非Mesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０４７ＭＧ）を用いた以外は、例４（２）の記載に従って非Mesenchymalサブタイプ細胞表面のＡＰＲＩＬの機能を抑制することによる非Mesenchymalサブタイプ細胞の増殖を調べた（図１０ｅ）。
（３）イン・ビトロ細胞増殖アッセイ
　上記（１）および（２）で調製した細胞について、例１（３）に記載の方法に従ってイン・ビトロ細胞増殖アッセイを行った（図１０ｂ、図１０ｄ、図１０ｅ）。
（４）スフェア形成アッセイ
　上記（１）で調製した細胞について、例１（４）に記載の方法に従って、スフェア形成アッセイを行った（図１０ｃ）。
（５）ＧＢＭにおけるＡＰＲＩＬのレセプターの発現
　脳腫瘍におけるＨＶＥＭのリガンドの機能を調べるために、ＧＤＣ　ＴＣＧＡデータセットを用いてＨＶＥＭおよびＡＰＲＩＬの既知のレセプター（ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７とＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）の正常脳組織とＧＢＭにおけるｍＲＮＡの発現レベルを解析した（図１０ｆ）。
（６）結果
　結果は図１０に示される通りであった。
ｓｈＲＮＡによるＨＶＥＭのノックダウンは、Mesenchymalサブタイプ細胞株の増殖を減弱させた（図１０ｂ）。また、Mesenchymalサブタイプ細胞のスフェア形成能は、ＡＰＲＩＬ発現のノックダウンにより強力に抑制された（図１０ｃ）。また、抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体により処理したMesenchymalサブタイプ培養細胞においては、細胞増殖が有意に減弱されることが確認された（図１０ｄ）。一方、抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体により処理した非Mesenchymalサブタイプ培養細胞（Ｕ３０４７ＭＧ）においては、細胞増殖が減弱されなかった（図１０ｅ）。Ｕ３０４７ＭＧ細胞はＨＶＥＭを発現していないがＡＰＲＩＬを発現している細胞株であることから、ヒトＡＰＲＩＬ抗体による細胞増殖の抑制には、脳腫瘍細胞上にＨＶＥＭの発現が必要であることが示唆された。また、ＧＢＭにおいてＡＰＲＩＬの２つのレセプター（ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ）はともにＨＶＥＭに比べて発現が極めて低いことが確認されたことから、ＡＰＲＩＬがＧＢＭにおいてＡＰＲＩＬの既知のレセプターと結合して作用している可能性は低いことが示唆された。これらの結果から、ＧＢＭにおけるＡＰＲＩＬの細胞増殖能やスフェア形成能にはＨＶＥＭの発現が必要であることが示唆された。
例１０：ＨＶＥＭのリガンドとしてのＡＰＲＩＬの作用
（１）ＨＶＥＭのリガンドの同定
　ＮＦ－κＢの応答配列を有するｍｉｎｉｍａｌプロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ２、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、ＣＭＶプロモーターの下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲｌｕｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）をそれぞれクローニングしたｐＣＳ－ＮＦ－κＢ－ＲＥ－ｍｉｎＰ－Ｌｕｃ２－ＣＭＶ－ｈＲｌｕｃを作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にヒト由来のＨＶＥＭをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、以下同様）を用いて導入した後、ＮＦ－κＢの応答性のＬｕｃ２遺伝子および恒常的に発現するｈＲｌｕｃ遺伝子を導入した（ＨＶＥＭ発現細胞）。一方、ヒト由来のＬＩＧＨＴ、ＡＰＲＩＬおよびＳＡＬＭ５の遺伝子をｐＥＮＴＲ４－ＣＭＶベクターにクローニングし、ｐＥＮＴＲ４－ＣＭＶとＣＳ－ＲｆＡ－ＥＦ－ＰｕｒｏＲの間の組換えをＬＲクローナーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によって触媒した。次いで、ＬＩＧＨＴ、ＡＰＲＩＬおよびＳＡＬＭ５をそれぞれ前述とは別のＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００を用いて発現させて、可溶性のリガンドを発現する細胞を作製した（リガンド発現細胞）。対照細胞として、ＮＦ－κＢのレポーター遺伝子を発現するが、ＨＶＥＭおよびリガンドのいずれも発現しない細胞を作製した（Ｅｍｐｔｙ）。ＨＶＥＭ発現細胞とリガンド発現細胞とを共培養し、ＨＶＥＭ発現細胞におけるＮＦ－κＢの活性をＤｕａｌ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、以下同様）を用いて評価した。
（２）市販のＡＰＲＩＬとＳＡＬＭ５の作用
　上記（１）で作製したＨＶＥＭ発現細胞をリコンビナントＡＰＲＩＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、リコンビナントｈｕｍａｎ　ＩｇＧ１　Ｆｃ（Ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｆｃ，Ｒ＆Ｄシステムズ社）またはリコンビナントＳＡＬＭ５－Ｆｃ（免疫グロブリンのＦｃ部位とのキメラタンパク、Ｒ＆Ｄシステムズ社）で刺激し、ＨＶＥＭ発現細胞におけるＮＦ－κＢの活性をＤｕａｌ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔを用いて評価した。
（３）結果
　結果は、図１１に示される通りであった。ＨＶＥＭのリガンドであるＬＩＧＨＴやＳＡＬＭ５と同様に、ＡＰＲＩＬもＨＶＥＭ発現細胞でシグナルを伝達し、ＮＦ－κＢシグナルを活性化させることが示された（図１１ａ）。また、ＡＰＲＩＬは、ＳＡＬＭ５－Ｆｃと同様に１０～３０ｎＭ以上の濃度でＨＶＥＭ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてシグナルを伝達し、ＮＦ－κＢシグナルを活性化させることが示された（図１１ｂ）。これらの結果から、これまでＨＶＥＭのリガンドとしては報告されてこなかったＡＰＲＩＬが、ＨＶＥＭの既知のリガンド（ＬＩＧＨＴ、ＳＡＬＭ５）と同様に、ＨＶＥＭのリガンドとして作用することが示された。また、ＡＰＲＩＬがＳＡＬＭ５と同程度の濃度で作用することが示された。
例１１：ＨＶＥＭ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたノックアウトの効果
（１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム
　表７に示すＤＮＡ配列を標的とする、表８に示すｇＲＮＡをコードするｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ　ｖ２ベクターを作製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００を用いて、ｈＣａｓ９と各ｇＲＮＡをMesenchymalサブタイプ細胞（Ｕ３０５４ＭＧ細胞）またはマウス神経膠腫細胞株ＧＬ２６１（パーキンエルマー社）に導入した。各細胞を限界希釈法でクローニングした。なお、ｇＲＮＡ配列はフリーソフト（CHOP CHOP: http://chopchop.cbu.uib.no/）で選定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（３）イン・ビトロ細胞増殖アッセイ
　上記（１）で調製した細胞について、例１（３）に記載の方法に従ってイン・ビトロ細胞増殖アッセイを行った。なお、ＧＬ２６１細胞は例１（１）の記載に従って、無血清幹細胞培地で培養した。
（４）スフェア形成アッセイ
　上記（１）で調製した細胞について、例１（４）に記載の方法に従って、スフェア形成アッセイを行った。
（５）結果
　結果は図１２に示される通りであった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるＨＶＥＭ遺伝子のノックアウトは、Mesenchymalサブタイプ細胞株の増殖を強力に低下させることが確認された（図１２ａ）。また、Mesenchymalサブタイプ細胞のスフェア形成能は、ＨＶＥＭ遺伝子のノックアウトにより抑制された（図４ｂ）。また、マウス神経膠腫細胞株ＧＬ２６１細胞は無血清で培養するとＨＶＥＭの発現が上昇する（例７参照）細胞であり、該細胞においてもマウスＨＶＥＭ遺伝子のノックアウトにより、細胞増殖が減弱されることが確認された（図１２ｃ）。
例１２：アルパカを用いたＨＶＥＭ抗体の作製
（１）アルパカにおける抗体作製
　ヒトＨＶＥＭ遺伝子（GenBank Accession No. NM_003820.3あるいはHGNC:11912）を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をアルパカの皮下に免疫し、抗ヒトＨＶＥＭアルパカＶＨＨ抗体を作製した。表９に示すアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体を取得した。相補性決定領域（ＣＤＲ）をＫａｂａｔの分類法に従って同定した。結果は、図１３に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（２）ＨＶＥＭ抗体の抗原への結合
　上記（１）で調製したＶＨＨ抗体を用いて、ＨＶＥＭを発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞膜表面上のＨＶＥＭにおいてＶＨＨ抗体の検出の有無を測定した。具体的には、ＨＶＥＭを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞および陰性対照としてＨＶＥＭを発現しないＨＥＫ２９３Ｔ細胞をそれぞれ１×１０４細胞／ウェルで播種し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、６×Ｈｉｓタグが付加されているＶＨＨ抗体を反応させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼＨＲＰで標識された抗ヒスチジンタグ抗体ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｔａｇ　ｍＡｂ－ＨＲＰ－ＤｉｒｅｃＴ（ＭＢＬ社）を反応させ、ＥＬＩＳＡ　ＰＯＤ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ＴＭＢ　Ｋｉｔ（ナカライテスク社）を用いてＨＲＰと基質の酵素反応を測定した。抗体の濃度に対して得られた効果量データを下記式
効果量＝バックグラウンド＋最大効果量／（１＋１０＾（ヒル係数×（ｌｏｇＥＣ５０－ｌｏｇ（抗体濃度））））
に基づいてシグモイド曲線に非線形回帰し，５０％効果濃度ＥＣ５０を求めた。その結果、ＶＨＨ＃１～５のＥＣ５０はいずれも８０ｎＭ未満であった。なお、ＶＨＨ＃６およびＶＨＨ＃７のクローンはファージ・ディスプレー法を用いた抗体スクリーニングで取得した。
（３）ＶＨＨ抗体の増殖抑制効果
　Mesenchymalサブタイプ細胞株（Ｕ３０５４ＭＧ細胞）に対して、ＶＨＨ（Ｉ）（ＶＨＨ＃３）およびＶＨＨ（ＩＩ）（ＶＨＨ＃２）を１００～３００ｎＭの濃度で処理し、Ｕ３０５４ＭＧ細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件で７日間培養した。陰性対照としてＰＢＳで処理した。Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＳＦ（ナカライテスク社）を用いて細胞増殖を定量し、ＰＢＳ処理群に対する細胞増殖を計測した。結果は、図１４に示される通りであった。ＶＨＨで処理した細胞では、増殖が抑制されることが示された。

Claims (22)

  1. 　ＨＶＥＭ阻害剤を有効成分として含んでなる、神経膠腫の治療または予防剤。
  2. 　神経膠腫が、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、星細胞腫および多形性膠芽腫のいずれかである、請求項１に記載の治療または予防剤。
  3. 　多形性膠芽腫が、Proneuralサブタイプ、Neuralサブタイプ、ClassicalサブタイプおよびMesenchymalサブタイプのいずれかに属する、請求項２に記載の治療または予防剤。
  4. 　ＨＶＥＭ阻害剤が、ＨＶＥＭに対する抗体または核酸である、請求項１～３のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
  5. 　ＨＶＥＭに対する抗体がＨＶＥＭとリガンドとの結合を阻害する抗体である、請求項４に記載の治療または予防剤。
  6. 　神経膠腫がＨＶＥＭ発現依存性またはＨＶＥＭリガンド依存性である、請求項１～５のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
  7. 　リガンドがＡＰＲＩＬである、請求項５または６に記載の治療または予防剤。
  8. 　ＨＶＥＭ発現量が健常な対象のＨＶＥＭ発現量または正常組織試料のＨＶＥＭ発現量を上回る対象に投与するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の治療または予防剤。
  9. 　ＨＶＥＭタンパク質またはＨＶＥＭ遺伝子からなる、脳腫瘍の悪性度のマーカーまたは脳腫瘍の予後マーカー。
  10. 　対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量を測定する工程を含んでなる、脳腫瘍の悪性度の判定方法。
  11. 　前記対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中の当該ＨＶＥＭ発現量を上回る場合に、該生体試料が悪性度の高い腫瘍細胞集団を含むことが示される、請求項１０に記載の判定方法。
  12. 　前記対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中の当該ＨＶＥＭ発現量を上回る場合に、対象が悪性度の高い脳腫瘍に罹患していることが示される、請求項１０に記載の判定方法。
  13. 　対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量を測定する工程を含んでなる、脳腫瘍患者の予後の判定方法。
  14. 　前記対象の生体試料中のＨＶＥＭ発現量が、健常な対象の生体試料中のまたは正常組織試料中の当該ＨＶＥＭ発現量を上回る場合に、対象の予後が不良であることが示される、請求項１３に記載の判定方法。
  15. 　８０ｎＭ未満のＥＣ５０値でＨＶＥＭと結合し、かつ、腫瘍増殖を抑制する、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  16. 　相補性決定領域１～３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含み、かつ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が下記の（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）、（vi）または（vii）である、請求項１５に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン
    （ｉ）配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （ii）配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （iii）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （iv）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （ｖ）配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （vi）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （vii）配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。
  17. 　免疫グロブリン単一可変ドメインが、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列が下記（viii）、（ix）、（ｘ）、（xi）、（xii）、（xiii）または（xiv）である、請求項１６に記載の免疫グロブリン可変ドメイン
    （viii）配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
    （ix）配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
    （ｘ）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
    （xi）配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
    （xii）配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
    （xiii）配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４；
    （xiv）配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含むＦＲ４。
  18. 　下記（xv）、（xvi）または（xvii）のポリペプチドを含んでなる、請求項１５に記載の免疫グロブリン可変ドメイン
    （xv）配列番号２９～３５のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （xvi）配列番号２９～３５のいずれかのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＶＥＭ結合能および腫瘍増殖抑制能を有するポリペプチド；
    （xvii）配列番号２９～３５のいずれかのアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＨＶＥＭ結合能および腫瘍増殖抑制能を有するポリペプチド。
  19. 　請求項１５～１８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなる、抗体または免疫グロブリン単一可変ドメイン多量体。
  20. 　請求項１５～１８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項１９に記載の抗体または多量体をコードするポリヌクレオチド。
  21. 　請求項１５～１８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項１９に記載の抗体または多量体を含んでなる、医薬組成物。
  22. 　神経膠腫の治療または予防に用いるための、請求項２１に記載の医薬組成物。

     
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