CN103889451B - 与C-Met相关的生物物质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可能与VEGF和/或EGFR组合地与c-Met相关的生物物质，并且更特别地涉及多肽、编码所述多肽的核酸；涉及用于制备所述多肽的方法；涉及表达或能够表达所述多肽的宿主细胞；涉及包含所述多肽的组合物，特别是药物组合物，其用于预防、治疗或诊断目的。本发明还描述并提供了用于评估患者对c-Met治疗的响应性的方法和试剂盒。

Description

与C-Met相关的生物物质
发明领域
本发明涉及与c-Met相关的生物物质，并且更特别地涉及多肽、编码所述多肽的核酸；涉及用于制备所述多肽的方法；涉及表达或能够表达所述多肽的宿主细胞；涉及包含所述多肽的组合物，特别是药物组合物，其用于预防、治疗或诊断目的。本发明还描述并提供了用于评估患者对c-Met治疗的响应性的方法和试剂盒。
发明背景
受体酪氨酸激酶(RTKs)是重要细胞过程（诸如细胞生长、分化、新血管生成和组织修复）的关键调控剂。除了其在正常生理学中的重要性之外，某些RTKs的异常表达已经参与多种类型的癌症的形成和进展。这些RTKs已经成为用于癌症治疗的有希望的药物靶标。
RTKc-Met是针对肝细胞生长因子((HGF)，也称为分散因子)的细胞表面受体(Cooper等，Nature（自然）1984;311:29-33;Bottaro等，Science（科学）1991;251:802–4)。HGF是90kD的多结构域糖蛋白，其与纤维蛋白酶原丝氨酸蛋白酶家族的各成员高度相关。其由间充质细胞分泌为单链的无活性的多肽，并且由多种蛋白酶裂解为其活性的α/β异源二聚体细胞外形式(Birchmeier等，NatRevMolCellBiol（自然分子细胞生物学综述）2003;4:915–25)。α链NH2-末端部分包含高亲和力c-Met受体结合结构域，但是β链是与c-Met受体相互作用用于受体激活所必需的(Matsumoto&NakamuraCancerSci（Matsumoto&Nakamura癌症科学）2003;94:321–7)。c-Met受体，与其配体相似，是由细胞外α和β链组成的二硫键连接的异源二聚体。α链异源二聚体化到β链的氨基端部分，形成细胞外结构域中的主要配体结合位点。c-Met的羧基端尾部包含酪氨酸Y1349和Y1356，其在被磷酸化时作为细胞内衔接蛋白（intracellularadaptorproteins）的停靠位点，引起下游信号传导（Ponzetto等，MolCellBiol（分子细胞生物学）1993;13:4600–8）。c-Met/HGF途径是侵袭性生长程序（invasivegrowthprogram）的主要驱动者，所述侵袭性生长程序是一系列的事件，包括细胞增殖、分散、迁移、存活和组织侵袭。在正常情况下，侵袭性生长程序对于胚胎发生过程中的正确的器官形成和成年人内稳态是重要的。重要的是，其还参与肿瘤发生、肿瘤血管形成和转移。
使用防止配体/受体结合的HGF-或c-Met-特异性抗体，通过抑制增殖并且增强细胞凋亡而导致生长抑制和肿瘤消退。三种单克隆抗体的组合在体外和体内表现出针对HGF的高中和活性，并且表现出针对自分泌HGF-Met-表达性神经胶质瘤异种移植物肿瘤的显著的肿瘤生长抑制(Cao等，ProcNatlAcadSciUSA（美国国家科学院学报）2001;98:7443–8)。使用单克隆抗体的策略允许针对HGF/c-Met的排他性的特异性，与小分子激酶抑制剂相比相对长的半衰期，以及激发针对肿瘤细胞的宿主免疫应答的潜力(Liu等，ExpertOpinInvestigDrugs（药物研究的专家观点）2008;17:997–1011)。
AMG102(Amgen,Inc.)是完全的人IgG2单克隆抗体，其选择性结合并且中和HGF，由此防止其与c-Met结合以及随后的活化(Kakkar等，PharmRes（药物研究）2007;24:1910–8;Burgess等，CancerRes（癌症研究）2006;66:1721–9)。
单臂5D5(OA5D5,MetMAb;Genentech)是来源于激动性单克隆抗体5D5的人源化的、单价的、拮抗性抗-c-Met抗体(Nguyen等，CancerGeneTher（癌症基因治疗）2003;10:840–9)。MetMAb以高亲和力结合c-Met，并且保持在具有c-Met的细胞表面上，防止HGF结合和随后的c-Met磷酸化以及下游信号传导活动和细胞反应。
不幸的是，使用大的单克隆和/或极大改造的抗体还带有高的制备成本，并且与其他策略相比，导致不是最理想的肿瘤透过性。
根据目前的生物医学理解，耐药性由负责调节细胞增殖、凋亡、迁移和侵入的复杂的蛋白网络引起。目前，还没有关于生长因子受体依赖性信号传导途径的系统性描述。事实上，c-Met异常性推动癌症发展的分子途径是极端复杂的，并且涉及多种相互连接的信号传导途径，包括信号传导分子（如Ras和PI3K）、受体（如EGFR）和生长因子（如VEGF）。
已经描述了靶向血清白蛋白来延长生物分子（诸如例如免疫球蛋白单可变结构域）的半衰期，例如，在WO2008/028977，WO04/041865和WO08/122787中，和未公布的2011年6月23日提交的US61/500,464。
发明概述
本领域需要更有效的c-Met（或者本文中还称为c-MET）拮抗剂，与小分子药物相比，其具有优越的选择性和特异性，调节半衰期的能力，和/或优越的肿瘤靶向性，即，比常规抗体小，并且具有基于白蛋白的肿瘤靶向策略。此外，本领域还需要诊断、预防和/或治疗适用的c-Met拮抗剂，如本文所提供的。
在研究和治疗应用中，免疫球蛋白序列，如抗体和来源于其的抗原结合片段(例如，免疫球蛋白单可变结构域)用于特异性靶向其各自的抗原。免疫球蛋白单可变结构域诸如例如VHHs的产生可能包括免疫实验动物，如美洲驼（Llama），从免疫组织构建噬菌体文库，选择结合噬菌体展示的抗原的免疫球蛋白单可变结构域并针对需要的特异性筛选所述结构域及其改造的构建体(WO94/04678)。备选地，通过直接从首次用于实验的文库或合成的文库中选择结合噬菌体展示的抗原的免疫球蛋白单可变结构域，并且随后针对需要的特异性筛选所述结构域及其改造的构建体可以产生相似的免疫球蛋白单可变结构域，诸如例如，dAbs(Ward等，Nature（自然），1989,341:544-6;Holt等,TrendsBiotechnol.（生物技术趋势）,2003,21(11):484-490;以及例如，WO06/030220,WO06/003388和DomantisLtd.的其他公布的专利申请)。
本发明涉及特定的多肽，其也称为“本发明的多肽”或“本发明的免疫球蛋白单可变结构域”或“本发明的ISVD”，所述多肽包含下述，或者，更优选地，基本上由下述组成：(i)基本上由一个或多个（优选一个）免疫球蛋白单可变结构域组成的第一结构单元，其中所述免疫球蛋白单可变结构域针对c-Met，特别是针对人c-Met；(ii)任选地基本上由一个或多个（优选一个）免疫球蛋白单可变结构域组成的第二结构单元，其中所述免疫球蛋白单可变结构域针对血清白蛋白，特别是针对人血清白蛋白（并且甚至更优选地，其中所述免疫球蛋白单可变结构域是Alb11或Alb23(如本文定义)）；(iii)任选地基本上由一个或多个（优选一个）免疫球蛋白单可变结构域组成的第三和/或第四结构单元，其中所述免疫球蛋白单可变结构域针对EGFR，特别是针对人EGFR，和/或针对VEGF，特别是针对人VEGF。此外，本发明还涉及编码所述多肽的核酸；涉及用于制备所述多肽的方法；涉及表达或能够表达所述多肽的宿主细胞；涉及包含所述多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，特别是药物组合物；并且涉及所述多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物用于预防、治疗或诊断目的的应用。本发明还描述并提供了用于评估患者对c-Met治疗的响应性的方法和试剂盒。本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将通过本文的进一步描述而变得清楚。
如已经提及的，在一些具体的而非限制性的方面中（在本文中更详细地描述），本发明提供：针对(如本文定义)c-Met并且能够抑制或阻断（完全地或部分地，如本文进一步所述）配体结合，且特别是抑制或阻断（完全地或部分地，如本文进一步所述）HGF与c-Met的结合(如本文进一步所述)的氨基酸序列。这些氨基酸序列在本文中还称为“c-Met-阻断氨基酸序列”或“c-Met-阻断结构单元”。优选地，这些c-Met-阻断氨基酸序列为ISVD’s(如本文所述)，在这种情形中，其还称为“c-Met-阻断ISVD’s”。优选地，任意c-Met-阻断氨基酸序列、c-Met-阻断结构单元或c-Met-阻断ISVD’s是这样的，以使其具有阻断活性，即，部分或完全阻断HGF与c-Met的结合，这可以通过本领域技术人员已知的任何适当的测定来确定，诸如，例如，通过α筛选测定（Alphascreenassay）或通过FACS竞争性测定（如本文所述，例如，实施例2.3.2基于流式细胞术测定的HGF/c-Met竞争性测定）来确定。优选地，阻断活性通过实施例2.3.2所述的FACS竞争性测定来确定。优选地，所述ISVD在A549细胞中具有IC50小于600nM，但是优选为500nM,400nM,300nM,200nM,100nM或者甚至更小的阻断或竞争HGF与c-Met结合的阻断活性或竞争能力。例如，04E09-样ISVD在该测定中具有IC50小于100nM，更优选地，小于75nM，50nM或者甚至更小，诸如小于20nM或15nM，10nM，5nM，4nM，3nM，2nM，1nM或甚至更优选地小于0.75nM或者甚至小于0.5nM的阻断活性或竞争能力。
例如，33H10-样ISVD在该测定中具有IC50小于100nM，更优选地，小于75nM,50nM或者甚至更小，诸如小于20nM或15nM,10nM,5nM,4nM,3nM,2nM,1nM或者甚至更优选地小于0.75nM,0.5nM,0.25nM或者甚至小于0.1nM的阻断活性或竞争能力。在一个具体的而非限制性的方面中，“c-Met-阻断氨基酸序列”或“c-Met-阻断结构单元”（中的一些）可以是（并且优选也是）这样的，以使其能够抑制或阻断c-Met信号传导(例如，参见实施例2.4-2.6和22)，例如，在用于实施例2.4的磷酸化测定，实施例2.5的增殖测定和/或实施例2.6的趋化性测定中。优选地，任意c-Met-阻断氨基酸序列,c-Met-阻断结构单元或c-Met-阻断ISVD’s是这样的，以使其具有阻断活性，即，部分或完全阻断或抑制HGF介导的c-Met磷酸化，这可以通过本领域技术人员已知的任何适当的测定来确定，诸如，例如，通过任意适当的磷酸化测定，诸如，例如，如本文所述的HGF-诱导的c-Met磷酸化测定。优选地，通过实施例1.6,2.4和22中所述的HGF介导的c-Met磷酸化来确定对磷酸化的阻断活性或抑制能力。优选地，所述ISVD在A549肿瘤细胞中具有IC50小于600nM,但是优选地，500nM,400nM,300nM,200nM,100nM或甚至更小的对配体(例如，HGF)诱导的Tyr1349-磷酸化的c-Met的阻断活性或抑制能力。例如，04E09-样ISVD在该测定中具有IC50小于100nM,更优选地，小于75nM,50nM或甚至更小，诸如小于40nM或30nM,25nM,20nM,15nM,14nM,13nM或12nM或甚至更优选地小于11,10,9,8或7nM的阻断活性或竞争能力。例如，33H10-样ISVD在该测定中具有IC50小于100nM,更优选地，小于75nM,50nM或甚至更小，诸如小于40nM或30nM,25nM,20nM,15nM,14nM,13nM或12nM或者甚至更优选地小于11,10,9,8,7,6,5,4或3nM的阻断活性或竞争能力。
优选地，通过如实施例2.5和22中所述的HGF-诱导的增殖测定来确定对信号传导的阻断活性或抑制能力。优选地，所述ISVD具有IC50小于600nM,但是优选地，500nM,400nM,300nM,200nM,100nM或甚至更小的对配体(例如，HGF)诱导的BxPC-3细胞增殖的阻断活性或抑制能力。例如，04E09-样ISVD在该测定中具有IC50小于100nM,更优选地，小于80nM,70nM或甚至更小，诸如小于60nM或50nM,45nM,40nM,35nM,30nM或者甚至更优选地小于20nM,诸如15,12,10,8,7,6,5,4,3,或者甚至小于2nM的阻断活性或竞争能力。例如，33H10-样ISVD在该测定中具有IC50小于100nM,更优选地，小于80nM,70nM或甚至更小，诸如小于60nM或50nM,45nM,40nM,35nM,30nM或者甚至更优选地小于20nM,诸如15,12,10,8,7,6,5,4,3,或者甚至小于2nM的的阻断活性或竞争能力。
优选地，通过实施例2.6中所述的HGF-依赖性趋化性测定来确定对信号传导的阻断活性或抑制能力。优选地，所述ISVD具有IC50小于600nM,但是优选地，500nM,400nM,300nM,200nM,150nM或甚至更小的对配体(例如，HGF)诱导的A549细胞趋化性的阻断活性或抑制能力。例如，04E09-样ISVD在该测定中具有IC50小于150nM,更优选地，小于100nM,90nM,80nM或甚至更小，诸如小于80nM,70nM或60nM,55nM或50nM或甚至更小，诸如小于60nM或50nM,45nM,40nM,35nM,30nM或者甚至更优选地小于20nM,诸如15,12,10,8,7,6,5,4,3,或者甚至小于2nM的阻断活性或竞争能力。
附图简述
图1显示本发明的纳米抗体抑制HGF-依赖性c-Met磷酸化。标准化的比率（如实施例1中标题1.6所述）针对纳米抗体或5D5Fab（三角形）的浓度绘图。标记的纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)作为封闭的圆形绘图（封闭的圆形）。所述纳米抗体与5D5Fab一起评估，并且在图中用实线(SEQIDNO:7)和虚线(5D5Fab)绘制。
图2显示纳米抗体形式04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)和06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9)的激动性活性的分析和与5D5mAb和HGF的比较。标准化的比率（如实施例1中标题1.6所述）针对化合物的浓度绘图，分析其使c-Met磷酸化的能力。阳性对照HGF用菱形绘制，5D5mAb用封闭的圆形绘制，04E09-9GS-Alb11用向上的三角形绘制，并且06C12-9GS-Alb11用倒三角性绘制。
图3显示本发明的纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)抑制BxPC3细胞的HGF-依赖性的增殖。每个孔的阻抗值用来计算‘标准化的细胞指数’(NCI)，其指示细胞增殖。在该图中，在生长3天后记录两种样品的NCI。所述纳米抗体作为封闭的圆形绘制。所述纳米抗体与5D5Fab(三角形)一起测定并且在图中用虚线绘制。
图4显示c-Met阻断纳米抗体04E09-9GS-Alb11抑制A549细胞的HGF-依赖性的迁移。测定读数‘相对荧光单位’指示A549细胞穿过膜进入到包含HGF的下层区室中。RFU针对所选用的纳米抗体的浓度绘图。所述纳米抗体用封闭的圆形绘制。所述纳米抗体与5D5Fab(三角形)一起评估并且在图中用实线(SEQIDNO:7)和虚线(5D5Fab)绘制。
图5.在HGF-依赖性U87MG胶质母细胞瘤异种移植物模型中，A00790035纳米抗体治疗(10mg/kg;3x/周IP)对肿瘤生长的作用。替莫唑胺（Temozolomide）用作阳性对照组中的参比化合物。包括赋形剂组作为阴性对照组。箭头表示不同的A00790035给药。肿瘤体积表示为平均肿瘤体积±SE(mm3)。曲线上部的数字表示在不同时间点每组剩余的小鼠数目。（A00790035或纳米抗体4E09-9GS-Alb11;SEQIDNO:7）
图6.在HGF-依赖性KP4胰腺异种移植物模型中，A00790035纳米抗体治疗(10mg/kg;3x/周IP)对肿瘤生长的作用。吉西他滨（Gemcitabine）用作阳性对照组中的参比化合物。包括赋形剂组作为阴性对照组。箭头表示不同的A00790035给药。肿瘤体积表示为平均肿瘤体积±SE(mm3)。（A00790035或纳米抗体4E09-9GS-Alb11;SEQIDNO:7）
图7.在用剂量范围系列的A00790171温育后对ANBL-6HGF自分泌人多发性骨髓瘤细胞增殖的完全抑制。(抗-c-Met纳米抗体,A00790171;SEQIDNO:113;cpmavg,每分钟计数平均数)
图8.在用10nMA00790171温育后对INA-6HGF旁分泌人多发性骨髓瘤细胞的HGF-诱导的增殖的完全和特异性的抑制。包括小分子c-Met抑制剂PHA-665752作为阳性对照(40nM)。(抗-c-Met纳米抗体,A00790171;SEQIDNO:113;cpmavg,每分钟计数平均数；p=显著性值；N.S.，不显著)。
图9.在用1μMA00790171温育后对INA-6HGF旁分泌人多发性骨髓瘤细胞的HGF-诱导的迁移的完全和特异性的抑制。包括小分子c-Met抑制剂PHA-665752作为阳性对照(100nM)。包括促迁移性细胞因子SDF-1α作为诱导迁移的阳性对照。（抗-c-Met纳米抗体,A00790171;SEQIDNO:113;NS,不显著的）。
图10.在KP4异种移植物模型中，可溶性c-Met对纳米抗体04E09-9GS-Alb11(A00790035,SEQIDNO:7)的响应。对于每只动物显示可溶性c-MET水平，对于两个治疗组显示平均值±平均数的标准误差。与赋形剂(PBS,10ml/kgi.p.)治疗的小鼠(5.348ng/ml)相比，在04E09-9GS-Alb11纳米抗体(NB)治疗的小鼠(0.507ng/ml)中，中值可溶性c-MET水平极大减小。
图11.在INA-6细胞中用200ng/mlHGF刺激后，A00790171减少c-Met酪氨酸残基Tyr1349（A），Tyr1234/35（B）和Tyr1003（C）的磷酸化。包括PHA-665752作为阳性对照（200nM）。细胞用HGF处理5分钟，然后将其裂解并加工作为总裂解物进行蛋白凝胶电泳。
图12.在INA-6细胞中用150ng/mlHGF刺激后，A00790171减少Akt（A）和MAPK（B）的磷酸化。细胞用HGF处理7分钟，然后将其裂解并加工作为总裂解物进行蛋白凝胶电泳。
图13.A00790171（100nM）阻断HGF诱导的INA-6细胞与纤连蛋白的粘附。在用BCECF-AM（一种荧光染料）预先温育后，5×104个细胞用或不用细胞因子HGF（150ng/ml）或SDF-1α（75ng/ml）温育1小时。线条表示来自代表三次独立的实验的一次实验的四份样品的平均数（+SD）。
图14.A00790171消除HGF（100ng/ml）对hMSCs的BMP-2-诱导的ALP-活性和矿化的抑制作用。hMSCs的ALP活性（A）。通过茜素红-S（ARS）染色定量（B）或显现（C）治疗21天（5nMA00790171）后的MSCs的矿化。
发明描述
定义
a)除非另外指明或限定，所用的所有术语具有它们在本领域内的通用意思，其对于熟练的技术人员应该是清楚的。例如，参考WO08/020079第46页段落a)中提及的标准手册。
b)除非另外指明，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或"ISVD"用作一般术语，包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如VHH结构域或VH或VL结构域。术语抗原结合分子或抗原结合蛋白可互换使用，并且还包括术语纳米抗体。所述免疫球蛋白单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL-序列),或重链可变结构域序列(例如，VH-序列)；更具体地，其可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。因此，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是结构域抗体,或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列,单结构域抗体,或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列,"dAbs”,或适于用作dAbs的免疫球蛋白序列,或纳米抗体,包括但不限于VHH序列。本发明包括不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物（camelid）免疫球蛋白序列。所述免疫球蛋白单可变结构域包括完全人、人源化的、另外序列优化或嵌合的免疫球蛋白序列。可以考虑所述免疫球蛋白单可变结构域和免疫球蛋白单可变结构域的结构——然而，不限于此——包括四个构架区或“FR’s”，其在本领域和本文中分别称为“构架区1”或“FR1”;“构架区2”或“FR2”;“构架区3”或“FR3”;和“构架区4”或“FR4”；所述构架区由三个互补决定区或“CDR’s”中断，其在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”;“互补决定区2”或“CDR2”;“互补决定区3”或“CDR3”。应该注意到术语纳米抗体（Nanobody或Nanobodies）是埃博灵克斯股份有限公司（AblynxN.V.）的注册商标，并且因此还可以分别称为纳米抗体（或）。
c)除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”,“序列”,“核苷酸序列”和“核酸”如WO08/020079第46页段落b)中所述。
d)除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经进行，这对于熟练的技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考本发明所提及的公知背景技术以及其中所引用的其他参考文献；以及例如参考下述综述：Presta,Adv.DrugDeliv.Rev.（高级药物递送综述）2006,58(5-6):640-56;Levin和Weiss,Mol.Biosyst.2006,2(1):49-57;Irving等,J.Immunol.Methods,（免疫学方法杂志）2001,248(1-2),31-45;Schmitz等,Placenta,2000,21增刊.A,S106-12,Gonzales等,TumourBiol.（肿瘤生物学）,2005,26(1),31-43,其描述了用于蛋白质改造的技术，诸如亲和力成熟，和用于提高蛋白如免疫球蛋白的特异性和其他需要的特性的其他技术。
e)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示。参考埃博灵克斯股份有限公司（AblynxN.V.）的题目为“ImmunoglobulinsinglevariabledomainsdirectedagainstIL-6RandpolypeptidescomprisingthesameforthetreatmentofdiseasesanddisordersassociatedwithIl-6mediatedsignalling（针对IL-6R的免疫球蛋白单可变结构域和包含其的多肽用于治疗与Il-6介导的信号传导相关的疾病和病症）”的国际申请WO08/020079第48页表A-2。
f)出于比较两种或更多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分数可以如WO08/020079（通过引用结合在本文中）第49页段落e)所述进行计算或确定，诸如通过用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并且乘以[100％]而计算，其中，与第一核苷酸序列相比，在第二核苷酸序列中核苷酸的每一缺失、插入、取代或添加都视作在单一核苷酸（位置）的差异；或者使用适当的计算机算法或技术，同样如WO08/020079（通过引用结合在本文中）第49页段落e)所述。
g)出于比较两种或更多种免疫球蛋白单可变结构域或其他氨基酸序列（诸如例如，本发明的多肽等）的目的，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数(在本文也称为“氨基酸同一性”)可以如WO08/020079（通过引用结合在本文中）第49和50页段落f)所述进行计算或确定，诸如通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中，与第一氨基酸序列相比，第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一个缺失、插入、取代或添加都视作在单一氨基酸残基（位置）上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”；或者使用适当的计算机算法或技术，同样如WO08/020079（通过引用结合在本文中）第49和50页段落f)所述。
此外，在确定两种免疫球蛋白单可变结构域之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，如WO08/020079第50页所述。
用于本文所述的多肽的任意氨基酸取代也可以是基于Schulz等,PrinciplesofProteinStructure（蛋白质结构原理）,Springer-Verlag,1978开发的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率分析，基于Chou和Fasman,Biochemistry（生物化学）13:211,1974和Adv.Enzymol.（酶学进展）,47:45-149,1978开发的结构形成潜力分析，并且基于Eisenberg等,Proc.Natl.AcadSci.USA（美国国家科学院学报）81:140-144,1984;Kyte&Doolittle;JMolec.Biol.（分子生物学杂志）157:105-132,1981,和Goldman等,Ann.Rev.Biophys.Chem.（生物物理和化学年度综述）15:321-353,1986开发的蛋白质疏水性模式的分析，所有这些通过引用完全结合在本文中。本文的说明书和上文引用的一般背景技术中给出了关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。此外，为了这一目的，例如，Desmyter等,NatureStructuralBiology（自然结构生物学）,卷3,9,803(1996);Spinelli等,NaturalStructuralBiology（自然结构生物学）(1996);3,752-757;和Decanniere等,Structure（结构）,卷7,4,361(1999)给出了来自美洲驼的VHH结构域的晶体结构。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和潜在的骆驼源化取代的进一步的信息可见于上文引用的现有技术。
h)如果在它们的全长有100％的序列同一性（如本文所定义），那么认为免疫球蛋白单可变结构域和核酸序列“完全相同”。
i)当比较两个免疫球蛋白单可变结构域时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应该理解两个免疫球蛋白单可变结构域可以包含1个、2个或更多个这样的氨基酸差异。
j)当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包括”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这具有在WO08/020079第51-52页段落i)中给出的意思。
k)术语“以基本上分离的形式存在”具有WO08/020079第52和53页段落j)中关于该术语给出的意思。
l)术语“结构域”和“结合结构域”具有WO08/020079第53页段落k)中关于该术语给出的意思。
m)术语“抗原决定簇”和“表位”，在本文中也可以互换使用，具有WO08/020079第53页段落l)中关于该术语给出的意思。
n)如WO08/020079第53页段落m)中进一步所述，对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白（或针对其至少一部分、片段或表位）能够（特异性）结合、具有亲和力和/或具有特异性的氨基酸序列（诸如抗体、本发明的多肽或一般是抗原结合蛋白或多肽或其片段）认为是“针对（against）”或者“针对（directedagainst）”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
o)术语“特异性”具有WO08/020079第53-56页段落n)中关于该术语给出的意思；并且如其中提及的，是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白（诸如本发明的多肽）分子可以结合的许多不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗原性（avidity）而确定，如在WO08/020079第53-56页中所述（通过引用结合在本文中），其还描述了用于测量抗原结合分子（诸如本发明的多肽）与相关抗原之间的结合的一些优选的技术。典型地，抗原-结合蛋白（诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽）将以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)（即，以105-1012升/摩尔或以上、并且优选地107-1012升/摩尔或以上、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA)）而结合它们的抗原。任何大于10-4摩尔/升的KD值（或任何小于104升/摩尔的KA值）通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白单可变结构域将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如小于500pM的亲和力与理想的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析（Scatchardanalysis）和/或竞争结合测定，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变型；以及本文提及的其他技术。技术人员应该清楚，并且如WO08/020079第53-56页所述，解离常数可以是实际的或表观解离常数。确定解离常数的方法对于熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如，包括WO08/020079第53-56页提及的技术。
p)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以如WO08/020079第57页段落o)所述那样定义，并且如其中提及的，是指所述氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50%所花费的时间，例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通过天然机制对所述序列或化合物的清除或螯合（sequestration）。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物动力学分析。适当的技术对于本领域熟练的技术人员应该是清楚的，并且，例如，可以通常如WO08/020079第57页段落o)中所述。还如在WO08/020079第57页段落o)中所提及的，半衰期可以用参数如t1/2-α,t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。例如，参考下述实验部分，以及标准手册，诸如Kenneth,A等:药物的化学稳定性：药剂师手册（ChemicalStabilityofPharmaceuticals:AHandbookforPharmacists）和Peters等,药物动力学分子：实践方法（Pharmacokineteanalysis:APracticalApproach）(1996)。还参考"药物动力学（Pharmacokinetics）",MGibaldi&DPerron,MarcelDekker出版,第2修订版(1982)。术语“半衰期增加”或“增加的半衰期”也如WO08/020079第57页段落o)中所定义，并且特别是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
q)关于靶标或抗原，术语在所述靶标或抗原上的“相互作用位点”意指在所述靶标或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列，其是所述靶标或抗原的用于结合配体、受体或其他结合配偶体的位点、催化位点、切割位点、别构相互作用的位点、参与多聚体化（如同源多聚体化或异源多聚体化）的位点；或是在所述靶标或抗原上的参与所述靶标或抗原的生物学作用或机制的任何其他位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列。更一般地，“相互作用位点”可以是在所述靶标或抗原上的本发明的氨基酸序列或多肽可以与之结合的任何位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列，以致调节（如本文定义）所述靶标或抗原（和/或其中涉及所述靶标或抗原的任何途径、相互作用、信号传导、生物学机制或生物学作用）。
r)与第二靶标或抗原相比较，当与第一抗原以是所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或多肽结合的亲和力的至少10倍、如至少100倍、且优选至少1000倍、且多至10000倍或更多的亲和力/抗体亲抗原性（如上述，且适当表示为KD值、KA值、koff速率和/或kon速率）结合时，认为这样的免疫球蛋白单可变结构域或多肽是对第一靶标或抗原“特异性的”。例如，所述第一抗原可以以比所述氨基酸序列或多肽与所述第二靶标或多肽结合的KD小至少10倍、如小至少100倍、且优选小至少1000倍、如小10000倍或者甚至更小的KD值结合所述靶标或抗原。优选地，当免疫球蛋白单可变结构域或多肽与第二靶标或抗原相比较对第一靶标或抗原是“特异性的”时，它针对（如本文定义）所述第一靶标或抗原，但是不针对所述第二靶标或抗原。
s)术语“交叉阻断（cross-block）”,“被交叉阻断的（cross-blocked）”和“交叉阻断（cross-blocking）”在本文可以互换使用，用来意指免疫球蛋白单可变结构域或多肽分别干扰天然配体HGF与c-Met的结合或干扰天然配体EGF与EGFR的结合、或干扰天然配体VEGF与VEGF受体(如VEGFR-1R(Flt-1),VEGFR-2(KDR/Flk-1)和/或VEGFR-3(Flt-4))的结合的能力。本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽能够干扰另一种化合物诸如天然配体对其靶标（例如，c-Met,VEGF或EGFR）的结合的程度，且因此其能否被认为是本发明所述的交叉阻断的，可以使用竞争结合测定法确定。一种特别适当的定量交叉阻断测定法使用基于FACS或基于ELISA的方法或α筛选来测量在本发明的标记的（例如，His标记的或生物素酰化的）免疫球蛋白单可变结构域或多肽与另一种结合剂关于它们与靶标的结合的竞争。实验部分一般地描述了适当的用于确定结合分子是否交叉阻断或能够交叉阻断本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的基于FACS、基于ELISA或基于α筛选-置换的测定。应该理解，所述测定可以与本文所述的免疫球蛋白单可变结构域或其他结合剂中的任一种一起使用。因此，通常，例如，本发明所述的交叉阻断的氨基酸序列或其他结合剂是一种将在上述交叉阻断测定法中与靶标结合的，以致在该测定法中且在存在本发明的第二氨基酸序列或其他结合试剂时，所记录的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的置换是最大理论置换（例如，由需要被交叉阻断的无活性的（cold）(例如，未标记的)免疫球蛋白单可变结构域或多肽的置换）的60%-100%(例如，在基于ELISA/α筛选的竞争性测定中)或80%-100%(例如，在基于FACS的竞争性测定中)，所述最大理论置换由以0.01mM以下的量存在的潜在交叉阻断剂检测，所述潜在交叉阻断剂（交叉阻断剂可以是另一种常规的单克隆抗体，诸如IgG，典型的单价抗体片段(Fab,scFv)和改造的变体（例如，二抗体、三抗体、小抗体（minibodies）、VHHs、dAbs、VHs、VLs））。
t)如果所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域或VHH型1序列与VHH1共有序列(SEQIDNO:99:
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA)
具有85%的同一性(使用VHH1共有序列作为查询序列，使用具有标准设置的blastp算法，即，blosom62评分矩阵（blosom62scoringmatrix）)并且任选地在位置50具有半胱氨酸，即C50(使用Kabat编号方式)，则认为氨基酸序列，诸如例如，本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽，是“VHH1型免疫球蛋白单可变结构域”或“VHH型1序列”。
u)如果其对这些不同的抗原或抗原决定簇是特异性的（如本文定义），则认为氨基酸序列，诸如例如，本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽，针对两种不同的抗原或抗原决定簇（诸如来自两种不同的哺乳动物物种的血清白蛋白，诸如人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白）是“交叉反应性的”。
v)如WO08/020079（通过引用结合在本文中）第58和59页段落q)进一步所述，免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸残基按照Kabat等，(“Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest（免疫感兴趣的蛋白的序列）”,USPublicHealthServices,NIHBethesda,MD,PublicationNo.91)提供的用于VH结构域的一般编号方式进行编号，这在Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods（免疫方法杂志）2000年6月23日;240(1-2):185-195的论文中用于来自骆驼科动物的VHH结构域（例如，参见该出版物的图2），并且因此，免疫球蛋白单可变结构域的FR1包含位置1-30的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR1包含位置31-35的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR2包含位置36-49的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR2包含位置50-65的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR3包含位置66-94的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR3包含位置95-102的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR4包含位置103-113的氨基酸残基。
w)给出附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明，并且不应该被以任何方式解释为或者认为限制本发明和/或附上的权利要求的范围，除非本文中另外明确指明。
1.本发明的多肽及其应用
1.1抗-c-Met结构单元
本发明的多肽通常可以用于调节、特别是抑制和/或防止c-Met、特别是人c-Met(SEQIDNO:1)与HGF且特别是人HGF(瑞士蛋白质数据库（SwissProtdatabase）:P14210)的结合，并且因此调节、且特别是抑制或防止由c-Met、特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或HGF、特别是人HGF(瑞士蛋白质数据库:P14210)介导的信号传导，调节其中涉及c-Met、特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或HGF、特别是人HGF的生物途径，和/或调节与所述信号传导或这些途径相关的生物学机制、反应和作用。
因此，本发明的多肽和组合物可以用于诊断、预防和治疗本发明的疾病和病症（本文中也称为“本发明的疾病和病症”），并且包括，但不限于，癌症（cancer），例如，癌（carcinomas）,神经胶质瘤（gliomas）,间皮瘤（mesotheliomas）,黑素瘤（melanomas）,淋巴瘤（lymphomas）,白血病（leukemias）,腺癌（adenocarcinomas）:乳腺癌（breastcancer）,卵巢癌（ovariancancer）,宫颈癌（cervicalcancer）,胶质母细胞瘤（glioblastoma）,多发性骨髓瘤（multiplemyeloma）(包括意义未明单克隆γ球蛋白病（monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance），无症状的和有症状的黑素瘤（asymptomaticandsymptomaticmyeloma）),前列腺癌（prostatecancer）,和伯基特淋巴瘤（Burkitt'slymphoma）,头颈癌（headandneckcancer）,结肠癌（coloncancer）,结直肠癌（colorectalcancer）,非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer）,小细胞肺癌（smallcelllungcancer）,食道癌（canceroftheesophagus）,胃癌（stomachcancer）,胰腺癌（pancreaticcancer）,肝胆管癌（hepatobiliarycancer）,胆囊癌（cancerofthegallbladder）,小肠癌（cancerofthesmallintestine）,直肠癌（rectalcancer）,肾癌（kidneycancer）,膀胱癌（bladdercancer）,前列腺癌（prostatecancer）,阴茎癌（penilecancer）,尿道癌（urethralcancer）,睾丸癌（testicularcancer）,阴道癌（vaginalcancer）,子宫癌（uterinecancer）,甲状腺癌（thyroidcancer）,甲状旁腺癌（parathyroidcancer）,肾上腺癌（adrenalcancer）,胰腺内分泌癌（pancreaticendocrinecancer）,类癌（carcinoidcancer）,骨癌（bonecancer）,皮肤癌（skincancer）,视网膜母细胞瘤（retinoblastomas）,霍奇金淋巴瘤（Hodgkin'slymphoma）,非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin'slymphoma）,卡波西肉瘤（Kaposi'ssarcoma）,多中心卡斯尔曼病（multicentricCastleman'sdisease）或艾滋病相关的原发性渗出性淋巴瘤（AIDS-associatedprimaryeffusionlymphoma）,神经外胚瘤（neuroectodermaltumors）,横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma）(例如，关于另外的癌症参见Cancer,Principlesandpractice（癌症、原理与实践）(DeVita,V.T.等编，1997));以及上述任一种癌症的任意转移病，以及非癌症适应证，如鼻息肉病；以及本文所述的其他病症和疾病。具体地，本发明的多肽和组合物可以用于诊断、预防和治疗涉及c-Met介导的转移、趋化性、细胞粘着、经内皮迁移、细胞增殖和/或存活的疾病，特别是非小细胞肺癌和多发性骨髓瘤。本发明的多肽和组合物还可以用于诊断、预防和/或治疗骨转移癌中的骨骼疾病，包括多发性骨髓瘤。本发明的多肽和组合物还可以用于诊断、预防和/或治疗骨转移癌中的溶骨性损伤，包括多发性骨髓瘤。
通常，所述“本发明的疾病和病症”可以定义为这样的疾病和病症，所述疾病和病症可以通过给有此需要（即，患有所述疾病或病症或具有其至少一种症状和/或有危险引起或发展所述疾病或病症）的受试者适当地施用本发明的多肽或组合物（并且特别是药物活性量的）和/或已知的针对c-Met、特别是人c-Met(SEQIDNO:1)或者涉及c-Met、特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的生物学途径或机制有活性的活性成分（并且特别是药物活性量的）而分别得到诊断、预防和/或治疗。
具体地，本发明的多肽可以用于诊断、预防和治疗本发明的疾病和病症，所述疾病和病症特征在于由c-Met、特别是人c-Met(SEQIDNO:1)或涉及c-Met、特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的途径(例如，HGF/c-Met轴)介导的过量的和/或不需要的HGF信号传导，特别是人HGF信号传导。基于本文公开的内容，技术人员也应该清楚本发明的所述疾病和病症的实例。
因此，不希望限于此，例如，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以用于诊断、预防和/或治疗目前用能够调节c-Met且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)-介导的信号传导的活性成分进行诊断、预防或治疗的所有疾病和病症，诸如疾病和上述现有技术中提及的那些。还考虑到本发明的多肽可以用于诊断、预防和/或治疗已经提议或在将来将要提议或研发的目前正开发使用所述活性成分的治疗的所有疾病和病症。另外，由于其如本文进一步所述的有利特性，考虑到本发明的多肽可以用于诊断、预防和治疗除对其正使用或将要提议或研发这些已知的活性成分的那些疾病和病症之外的其他疾病和病症；和/或本发明的多肽可以提供用于治疗本文所述的疾病和病症的新方法和方案。
因此，本发明涉及本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽，其用于治疗。
通过本文的进一步公开的内容，技术人员应该清楚本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽的其他应用和用途。
通常，本发明的一个目的是提供可以用于诊断、预防和/或治疗本发明的疾病和/或病症的药物活性试剂，以及包含其的组合物；提供用于诊断、预防和/或治疗所述疾病和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用所述试剂和组合物。
特别地，本发明的一个目的是提供所述药物活性试剂、组合物和/或方法，与目前所用的和/或本领域中已知的试剂、组合物和/或方法相比，所述药物活性试剂、组合物和/或方法具有某些优点。这些优势从以下进一步描述中将变得清楚。
更特别地，本发明的目的是提供可以用作药物活性试剂的治疗性蛋白，以及包含其的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗本发明的疾病和/或病症以及本文提及的其他疾病和病症；并且提供用于诊断、预防和/或治疗所述疾病和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用所述治疗性蛋白和组合物。
因此，本发明的一个特定目的是提供针对c-Met、特别是针对来自温血动物的c-Met、更特别是针对来自哺乳动物（诸如例如，小鼠）、且尤其是针对人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域；并且提供包含至少一种所述免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成的蛋白和多肽。
特别地，本发明的一个特定目的是提供所述免疫球蛋白单可变结构域和所述蛋白和/或多肽，其适于在温血动物、特别是哺乳动物、更特别是人中的预防、治疗和/或诊断应用。
更特别地，本发明的一个特定目的是提供所述免疫球蛋白单可变结构域和所述蛋白和/或多肽，其可以用于预防、治疗、减轻和/或诊断温血动物、特别是哺乳动物、更特别是人中的与c-Met相关和/或由c-Met介导的一种或多种疾病、病症或病况（诸如本文提及的疾病、病症和病况）。
本发明还有一个特定的目的是提供所述免疫球蛋白单可变结构域和所述蛋白和/或多肽，其可以用于制备药物组合物或兽医用组合物，所述组合物用于预防和/或治疗温血动物、特别是哺乳动物、更特别是人中的一种或多种与c-Met相关的和/或由c-Met介导的疾病、病症或病况（诸如本文提及的疾病、病症和病况）。
通常，在本发明中，这些目的通过使用本文所述的免疫球蛋白单可变结构域、蛋白、多肽和组合物而实现。
通常，本发明提供针对(如本文定义)和/或能够特异性结合(如本文定义)c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域；以及包含至少一种此类氨基酸序列的化合物和构建体，特别是蛋白和多肽。
更特别地，本发明提供能够以如本文定义的亲和力（适当地测量的和/或表示为KD-值（实际的或表观的）、KA-值(实际的或表观的)、kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本文进一步所述）结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域和多肽；以及包含至少一种此类氨基酸序列的化合物和构建体，特别是蛋白和多肽。
特别地，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽是这样的，以致：
-其在α筛选测定（例如，如在实验部分所述（参见实施例2.3.1））中以1.2nM以下、更优选地500pM以下、甚至更优选地200pM以下、最优选地150pM以下的IC50结合人c-Met(SEQIDNO:1)，并且其中所述多肽仅包含一个人c-Met结合免疫球蛋白单可变结构域单位，并且其中完全的置换意指约60%-80%且更多、优选95%以上的平均HGF置换（例如，当按照实施例2.3.1中的配体置换测定测量时）；
和/或是这样的，以致：
-其在测定（例如，如在实验部分(实施例2.3)中所述）中以2.5nM以下的平均IC50值、更优选地2nM以下的平均IC50值、甚至更优选地1.5nM以下的平均IC50值将人HGF完全从人c-Met(SEQIDNO:1)置换下来，并且其中所述多肽仅包含一个人c-Met结合免疫球蛋白单可变结构域单位，并且其中完全的置换意指约60%-80%且更多、优选95%以上的平均HGF置换（例如，当按照实施例2.3.2中的配体置换测定测量时）；
通过本文的进一步描述和实施例，本发明的针对c-Met、且特别是针对人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的结合、置换、迁移或其他体内和/或体外功效的一些优选的技术价值将变得清楚。
对于与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的结合，本发明的氨基酸序列通常将在其氨基酸序列内包含一个或多个氨基酸残基或一个或多个氨基酸残基片段（即，每个“片段”包含两个以上彼此相邻或彼此紧密接近的氨基酸残基，即，在氨基酸序列的一级或三级结构中），通过其本发明的氨基酸序列能够结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，因此，所述氨基酸残基或氨基酸残基的片段形成用于结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的“位点”（本文中还称为“抗原结合位点”）。
本发明提供的免疫球蛋白单可变结构域优选是以基本上分离的形式(如本文定义)存在，或形成本发明的蛋白或多肽的一部分(如本文定义)，其可以包含一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成，并且其可以任选地进一步包含一个或多个其他免疫球蛋白单可变结构域（所有任选地通过一个或多个适当的接头连接）。例如，并且不限于，本发明的优选方面分别提供基本上由下述组成的多肽：通过肽接头(如本文定义)连接的一个针对人c-Met的免疫球蛋白单可变结构域和针对人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域，以提供本发明的双特异性多肽，和/或也通过肽接头(如本文定义)连接的针对人EGFR的免疫球蛋白单可变结构域，以提供本发明的另外的双特异性或三特异性的多肽，均如本文所述。所述蛋白或多肽也可以是基本上分离的形式(如本文定义)。
因此，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽优选基本上由不通过二硫键与任意其他氨基酸序列或链连接的单个氨基酸链组成（但是其可以或不可以包含一个或多个分子内二硫键。例如，已知本发明的试剂——如本文所述——有时可能包含在CDR3与CDR1或FR2之间的二硫键）。然而，应该注意的到，本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域可以彼此连接和/或与其他免疫球蛋白单可变结构域连接（例如，通过二硫键），以提供也可以用于本发明的肽构建体（例如，Fab’片段,F(ab’)2片段,ScFv构建体,“二抗体”和其他多特异性构建体）。例如，参考Holliger和Hudson,NatBiotechnol.（自然生物技术）2005;23:1126-36(通过引用结合)的综述。
通常，当意欲将本发明的氨基酸序列（或包含其的化合物、构建体或多肽）用于施用给受试者时（例如，用于本文所述的治疗和/或诊断目的），优选在所述受试者中天然不存在的氨基酸序列；或者，当其确实在所述受试者中天然存在时，其是基本上分离的形式(如本文定义)。
技术人员还应该清楚，对于制药用途，本发明的免疫球蛋白单可变结构域（以及包含其的化合物、构建体和多肽）优选是针对人c-Met，特别是针对人c-Met(SEQIDNO:1)；而对于兽医用目的，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽优选是针对来自待治疗的物种的c-Met，或者至少与来自待治疗的物种的c-Met交叉反应。
此外，本发明的氨基酸序列可以任选地，并且除了至少一个用于针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)结合的结合位点之外，包含一个或多个用于针对其他抗原、蛋白或靶标结合的其他结合位点。
取决于所涉及的具体的疾病或病症，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽以及包含其的组合物的功效可以使用任何适当的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型或它们的任意组合来检测。适当的测定和动物模型应该是技术人员所清楚的，并且，例如，包括配体置换测定(Burgess等,CancerRes（癌症研究）200666:1721-9)，二聚体化测定(WO2009/007427A2,Goetsch,2009)，信号传导测定(Burgess等,MolCancerTher（分子癌症治疗法）9:400-9)，增殖/存活测定(Pacchiana等,JBiolChem（生物化学杂志）2010年9月，M110.134031)，细胞粘着测定(Holt等,Haematologica（血液病学）200590:479-88)和迁移测定(Kong-Beltran等,CancerCell（癌细胞）6:75-84)，内皮细胞出芽测定(Wang等,JImmunol.（免疫学杂志）2009;183:3204-11)，成骨细胞分化测定，ALP测定(Standal等，Blood2007四月一日；109(7):3024-30)，和体内异种移植物模型(Jin等,CancerRes.（癌症研究）200868:4360-8)，以及在下述实验部分和在本文引用的现有技术中所用的测定和动物模型。
此外，按照本发明，针对来自第一温血动物物种的c-Met的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以或不可以表现出与来自一种或多个其他温血动物物种的c-Met的交叉反应性。例如，针对人c-Met、且特别是针对人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以或不可以表现出与来自一种或多种其他灵长类动物物种（诸如，不限于，来自猕猴属（Macaca）的猴子（诸如，且特别是食蟹猴（食蟹猴(Macacafascicularis)）和/或恒河猴（恒河猴(Macacamulatta)））和狒狒（豚尾狒狒(Papioursinus)））的c-Met的交叉反应性，和/或与来自通常用在疾病动物模型（例如，小鼠、大鼠、兔、猪或狗）中、且特别是用在与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)相关的疾病和病症的动物模型中的一种或多种动物物种（诸如，本文提及的物种和动物模型）的c-Met的交叉反应性。在这一方面，技术人员应该清楚，从药物开发观点来看，所述交叉反应性，当存在时，可能具有优点，原因在于这允许在所述疾病模型中检测针对人c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域和多肽。
更一般地，由于允许所述氨基酸序列或多肽跨多个物种使用，所以，本发明与来自多种哺乳动物物种的c-Met交叉反应的免疫球蛋白单可变结构域和多肽通常有利地用在兽医应用中。因此，本发明的范围还包括针对来自一个动物物种的c-Met的免疫球蛋白单可变结构域和多肽（诸如针对人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域和多肽）可以用于治疗另一个动物物种，只要所述免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽的应用在待治疗的物种中提供需要的作用。
本发明在其最广泛的意义上不特别局限于或限制为本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽所针对的c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的特定的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象（confirmation）。例如，所述免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以或不可以针对HGF/c-Met相互作用位点、c-Met的细胞内在化位点、c-Met的脱落位点（sheddingsite）和/或c-Met/c-Met同源二聚体化位点，并且如本文进一步所定义。
此外，具有针对c-Met和RON、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和人RON((Ming-HaiWang等,ActaPharmacologicaSinica(2010)31:1181–1188)的双重特异性的免疫球蛋白单可变结构域在本发明的范围内。
如本文进一步所述，本发明的多肽可以包含（尽管不优选）两个以上本发明的针对c-Met且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域。通常，与本发明的单个氨基酸序列相比，所述多肽将以增加的抗体亲抗原性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。例如，所述多肽可以包含两个本发明的针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的相同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象（当适用时）（其可以或不可以是相互作用位点）的免疫球蛋白单可变结构域；或包含至少一个本发明的针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象（当适用时）（其可以或不可以是相互作用位点）的“第一”氨基酸序列；和至少一个本发明的针对与第一不同的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象（当适用时）（并且其可以或不可以是相互作用位点）的“第二”氨基酸序列。优选地，在所述本发明的“二互补位”多肽中，至少一个本发明的氨基酸序列是针对相互作用位点(如本文定义)，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此。例如，本发明的多肽可以被格式化（formatted），例如，以二互补位方式格式化，以组合如实验部分所表征的针对不同表位的单价结构单元。
此外，当靶标是结合对（例如，受体-配体结合对）的一部分时，所述免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以是这样的，以致其与关联结合配偶体（例如，HGF）竞争与c-Met的结合，和/或是这样的，以致其（完全或部分地）中和所述结合配偶体与所述靶标的结合。
还预测到本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽通常将与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段结合；或至少与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的包含与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的抗原决定簇或表位基本上相同的一个或多个抗原决定簇或表位的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段结合。
同样，在这样的情形中，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域与（野生型）c-Met结合的亲和力和特异性相同的或不同的（即，高于或低于其）的亲和力和/或特异性结合所述类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。
由于c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)以单体形式和一个或多个多聚体形式存在，例如，以同源二聚体形式存在，因此，下述也在本发明的范围内：本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽i)仅结合单体形式的c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，ii)仅结合多聚体/二聚体（同源和/或异源二聚体）形式的c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，或iii)结合单体和多聚体形式二者。在本发明的优选方面中，本发明的多肽防止形成同源二聚体化的人c-Met复合物。在本发明的另一个优选的方面中，本发明的多肽不诱导（甚至在较高的浓度，如10nM以下，50nM以下，100nM以下或500nM以下）同源二聚体化人c-Met复合物的形成。同样地，在这样的情形中，本发明的多肽可以以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域结合多聚体形式的亲和力和特异性相同或不同（即，高于或低于其）的亲和力和/或特异性结合单体形式。
此外，当c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)能够与其他蛋白或多肽缔合形成蛋白复合物时（例如，与HGF缔合，而且还与其他受体如EGFR,HER3,丛蛋白,整联蛋白,CD44,RON缔合），下述在本发明的范围内：本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽结合处于其非缔合状态的c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)（并且例如，防止配体结合和/或防止信号传导），结合处于其缔合状态的c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，或者结合二者（优选结合非缔合状态）。在所有这些情形中，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽结合处于其非缔合状态的c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力和/或特异性相同或不同的（即，高于或低于其）亲和力和/或特异性结合所述缔合的蛋白复合物。
此外，技术人员应该清楚，包含两个以上针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白或多肽，例如，本发明的“二互补位”多肽，可以以比相对应的单体氨基酸序列更高的抗体亲抗原性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。例如，不限于，包含两个以上针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的不同表位的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白或多肽可以（并且通常）以比不同单体中的每一个更高的抗体亲抗原性结合，并且包含两个以上针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白或多肽可以（并且通常）还以更高的抗体亲抗原性结合c-Met的多聚体（例如，同源二聚体），且特别是结合人c-Met(SEQIDNO:1)的多聚体（例如，同源二聚体）。
通常，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽至少结合与生物学和/或治疗观点最相关的形式的那些形式的c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)（包括单聚体、多聚体、缔合的和不同的构象形式），这将是技术人员所清楚的。
使用本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物，和/或使用包含一个或多个所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物或基本上由其组成的蛋白或多肽也在本发明的范围内，只要这些适合用于本文所考虑的应用。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物通常包含用于结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的功能性抗原-结合位点（的至少一部分）；并且更优选地能够特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，并且甚至更优选地能够以如本文定义的EC50值、平均Ki、IC50值（涉及结合、迁移、置换和/或增殖阻断和/或其他效果测量，如本文进一步所述（例如，在实验部分））结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，并且所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物可以更有效、更稳定、更可溶，并且可以具有相同的表位。通过本文的进一步描述，所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性的实例将变得清楚。本发明的另外的片段或多肽也可以通过适当组合（即，通过连接或遗传融合）一种或多种如本文所述的（较小的）部分或片段而提供。
关于免疫球蛋白单可变结构域的一般描述，参考下文的进一步描述，以及参考本文引用的现有技术。然而，在这一方面，应该注意到本说明书和现有技术主要描述所谓的“VH3种类”的免疫球蛋白单可变结构域（即，与人种系VH3序列（如DP-47,DP-51或DP-29）具有高度的序列同源性的免疫球蛋白单可变结构域），这形成本发明的优选方面。然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义上通常涵盖任意类型的针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域，并且例如还涵盖属于所谓的“VH4种类”的免疫球蛋白单可变结构域（即，与人种系VH4种类序列（如DP-78）具有高度的序列同源性的免疫球蛋白单可变结构域），如例如在WO07/118670中所述。
通常，免疫球蛋白单可变结构域(特别是VHH序列和序列优化的免疫球蛋白单可变结构域)可以特别地特征在于在一个或多个构架序列（同样如本文进一步所述）中存在一个或多个“标志残基”(如本文所述)。
因此，通常，免疫球蛋白单可变结构域可以定义为具有下述（通用）结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4,并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3。
在一个优选的方面，本发明提供包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，所述免疫球蛋白单可变结构域是具有下述（通用）结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4,并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3,并且其中：
i)在按照Kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的至少一个氨基酸残基选自下表A-1中提及的标志残基；并且其中：
ii)所述氨基酸序列与WO2009/138519中所示的（参见WO2009/138519的SEQIDNO:s1-125）至少一种免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%、更优选地90%、甚至更优选地95%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基（在所述序列中表示为X）；并且其中：
iii)所述CDR序列通常如本文进一步所定义（如表(B-2)中提供的组合的CDR1、CDR2和CDR3，注意CDR定义按照Kabat编号系统考虑）。
表A-1:VHHs中的标志残基
同样地，所述免疫球蛋白单可变结构域可以以任何适当的方式来源并且来源于任意适当的来源，并且，例如，可以是天然存在的VHH序列(即，来自适当的骆驼科动物物种，例如，美洲驼)或合成的或半合成的VHs或VLs(例如，来自人)。所述免疫球蛋白单可变结构域可以包括“人源化的”或另外“序列优化的”VHHs，“骆驼源化的”免疫球蛋白序列（并且特别是骆驼源化的重链可变结构域序列，即，骆驼源化的VHs），以及已经通过下列技术改变的人VHs、人VLs、骆驼VHHs：诸如亲和力成熟（例如，起始于合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列），CDR移植，镶盖术（veneering），组合来源于不同的免疫球蛋白序列的片段，利用重叠的引物进行的PCR装配，以及熟练的技术人员公知的改造免疫球蛋白序列的相似技术；或如本文进一步所述的前述任一项的任何适当的组合。
在一个进一步优选的方面，本发明提供包含一个具有选自由SEQIDNO:s23-29,102和187,优选SEQIDNO:26和/或187(参见实验部分)的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域和一个具有选自由提供增加的半衰期（参见下文）的结构部分组成的组的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。
在一个进一步优选的方面，本发明提供包含至少一种具有选自由基本上由4个构架区（分别为FR1-FR4）和3个互补决定区（分别为CDR1-CDR3）组成的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中所述氨基酸序列的CDR序列与SEQIDNO:s23-29,102和187，优选与SEQIDNO:26和/或187(参见实验部分)的至少一个免疫球蛋白单可变结构域的CDR序列(参见表B-2)具有至少70%的氨基酸同一性、优选至少80%的氨基酸同一性、更优选地至少90%的氨基酸同一性、诸如95%的氨基酸同一性或更多或者甚至基本上100%的氨基酸同一性。例如，这种氨基酸同一性程度可以通过确定在所述氨基酸序列与SEQIDNO:s23-29,102和187、优选与SEQIDNO:26和/或187（参见实验部分）中的一个或多个序列之间的氨基酸同一性程度（以本文所述的方式）来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。本发明的此类多肽和/或免疫球蛋白单可变结构域可以进一步提供下述：
(i)包含至少一个（优选一个）免疫球蛋白单可变结构域的多肽，所述免疫球蛋白单可变结构域针对(如本文定义)c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，并且与SEQIDNO:s23-29,102和187、优选与SEQIDNO:26和/或187（参见实验部分）中的至少一个免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%、优选至少85%、诸如90%或95%或更多的序列同一性；和/或
(ii)包含至少一个（优选一个）免疫球蛋白单可变结构域的多肽，所述免疫球蛋白单可变结构域针对(如本文定义)c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，并且交叉阻断(如本文定义)SEQIDNO:s23-29,102和187、优选SEQIDNO:26和/或187（参见实验部分）中的至少一个免疫球蛋白单可变结构域与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的结合，和/或与SEQIDNO:s23-29,102和187、优选SEQIDNO:26和/或187（参见实验部分）中的至少一个免疫球蛋白单可变结构域竞争与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的结合，并且其中所述免疫球蛋白单可变结构域可以如本文进一步所述；和/或
(iii)包含一个或多个（优选一个）所述免疫球蛋白单可变结构域的本发明的多肽（其可以如本文进一步所述，并且，例如，可以是双特异性的（例如，还与血清白蛋白结合）和/或二互补位的多肽，如本文所述），以及编码所述免疫球蛋白单可变结构域和多肽的核酸序列。所述免疫球蛋白单可变结构域和多肽不包含任何天然存在的配体。
本发明的多肽包含至少一个本发明的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成。本发明的免疫球蛋白单可变结构域的一些优选的但非限制性的实例在SEQIDNO:s23-29,102和187、优选SEQIDNO:26和/或187（参见实验部分）中给出。
1.2抗-EGFR结构单元
EGFR由细胞外配体-结合结构域、跨膜结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域组成(Yarden等，2001,NatureRev.Mol.CellBiol.（自然分子细胞生物学综述）2:127-137)。EGFR介导的信号传导的异常激活已经参与肿瘤生长和进展所涉及的过程，包括肿瘤细胞增殖、血管生成、转移、凋亡抑制和对放疗或化疗的抗性(Grünwald,Hidalgo2003J.Natl.CancerInst.（国家癌症学会杂志）95:851-867;及其中的参考文献)。EGFR在宽泛种类的上皮来源的肿瘤中表达，包括>40%NSCLC（非小细胞肺癌），>95%的头颈癌，>30%的胰腺癌，>90%的肾癌，>35%的卵巢癌，>40%的神经胶质瘤和>31%的膀胱癌(Salomon等，1995.Crit.ReviewOncol.Hematol（肿瘤学和血液病学重要综述）,19:183-232)。由于高水平的EGFR表达与疾病进展、增加的转移和差的预后相关，所以，这为研发用于治疗多种实体瘤的有效的靶向EGFR的抗体提供了坚实的理论基础。
鉴定抑制EGFR的MAbs是用于临床开发的方法，以靶向恶性肿瘤中异常的EGFR信号传导。所述靶向EGFR的抗体的实例是IMC-C225(爱必妥（Erbitux）,Imclone),EMD72000(MerckDarmstadt),ABX-EGF(Abgenix),h-R3(theraCIM,YMBiosciences)和Humax-EGFR(Genmab)。这些抗体的作用机制依赖于对配体与受体结合的抑制以及随后对受体磷酸转移和下游信号传导级联的抑制。Mab225（其中爱必妥是嵌合衍生物），225-衍生的F(ab’)2片段能够诱导EGFR内在化和适度的受体螯合，但是仅在与表达EGFR的细胞持续温育后能够诱导。然而，单价225-衍生的Fab’片段仅在与兔抗-小鼠抗体预先温育后诱导受体下调(Fan等1993J.Biol.Chem.（生物化学杂志）268:21073-21079;Fan等,1994J.Biol.Chem.（生物化学杂志）269:27595-27602)。这些抗体表现出针对广泛组的人肿瘤异种移植物的抗肿瘤活性（Grünwald&Hidalgo2003J.Natl.CancerInst.（国家癌症学会杂志）95:851-867中的综述）。
然而，已知的与EGF受体结合的基于抗体的治疗剂是细胞增殖抑制药而不是细胞毒性药。事实上，这些抗体和目前可用的小分子药中没有一种对于癌症治疗是完全有效的。此外，对于一些患者，EGFR抑制剂的治疗性应用受到严重的毒性的限制。
WO05/044858,WO04/041867和WO07/042289已经描述了与标准抗体相比具有改善的特性的抗-EGFR纳米抗体和多肽。
然而，与本发明的单个多肽的组合相比，包含本发明的多肽的多特异性构建体在调节信号传导方面具有提高的功效。特别地，包含(a)一个或多个如本文所述的调节c-Met信号传导的多肽，和(b)一个或多个调节EGFR-介导的信号传导的多肽的多特异性构建体特别有效地用于上文列出的疾病和病症的诊断、预防和治疗。所述多特异性构建体特别有效地用于癌症的诊断、预防和治疗，特别是非小细胞肺癌的诊断、预防和治疗。
WO05/044858,WO04/041867和/或WO07/042289中所述的多肽和纳米抗体特别优选地作为本发明的多特异性构建体中的调节EGFR-介导的信号传导的多肽。因此，本发明涉及多特异性的构建体，诸如例如二特异性或三特异性的构建体，其包含至少一个针对EGFR的ISVD和至少一个针对c-Met的ISVD，以及任选地针对VEGF的ISVD。在这样的多特异性（例如，二特异性或三特异性）多肽构建体中，本文所述的针对c-Met的纳米抗体和多肽可以与WO05/044858,WO04/041867和WO07/042289（所有这些特别完全地结合在本文中）中所述的抗-EGFR纳米抗体和多肽中的一种或多种组合。
因此，本发明涉及(a)一个或多个调节c-Met信号传导的多肽和(b)一个或多个调节EGFR-介导的信号传导（特别是EGFR-介导的信号传导）的多肽的多特异性构建体，其用于上文列出的疾病和病症、特别是非小细胞肺癌的诊断、预防和治疗。
1.3抗-VEGF结构单元
血管系统的发育是多种生理和病理过程的基本需要。现在充分确定了血管生成参与包括实体瘤和转移的多种病症的发病机制。在肿瘤生长的情形中，血管发生对于从增生转变成肿瘤和对于为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是非常重要的。Folkman等,Nature（自然）339:58(1989)。血管发育过程是紧密调控的，其中已经鉴定血管内皮生长因子(VEGF)是参与刺激血管发生和诱导血管渗透性的重要因子。Ferrara等,Endocr.Rev.18:4-25(1997)。术语"VEGF"或"VEGF-A"用来指165-个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子和相关的121-,189-和206-个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等，Science（科学）,246:1306(1989),和Houck等，MoI.Endocrin.（分子内分泌学）,5:1806(1991)所述，及其天然存在的等位基因和加工的形式。"VEGF生物学活性"包括与任意VEGF受体结合或任意VEGF信号传导活性，诸如调节正常的和异常的血管发生和血管生成(Ferrara和Davis-Smyth(1997)EndocrineRev.（内分泌学综述）18:4-25;Ferrara(1999)J.MoI.Med.（分子医学杂志）77:527-543)。
使用A4.6.1（还称为贝伐珠单抗（bevacizumab）(（阿瓦斯丁）;Genentech,SanFrancisco,CA)）已经获得了大部分临床经验。然而，阿瓦斯丁与化疗组合受到副作用（出血,动脉血栓栓塞,高血压,胃肠道(GI)穿孔,伤口愈合问题,蛋白尿（proteinuria）和充血性心力衰竭（congestiveheartfailure））的困扰，所述副作用主要是由于这样的事实所导致：抗-VEGF活性不是局限在肿瘤部位，而是在长时间时期内持续在循环中。这导致外周内皮细胞（peripheralendothelialcells）的生理活性向病理生理活性的转换。然而，由于眼内炎（endophthalmitis）、玻璃体出血（vitreoushemorrhage）和视网膜脱落（retinaldetachment）的危险，使用重组人源化的抗-VEGFFab(rhuFabVEGF,雷珠单抗（Ranibizumab）或LucentisTM)治疗慢性疾病的抗-VEGF策略并不理想。
WO08/101985已经描述了与标准抗体相比具有改善的特性的抗-VEGF纳米抗体和多肽。
然而，与本发明的单个多肽的组合相比，包含本发明的多肽的多特异性构建体在调节信号传导方面具有提高的功效。特别地，包含(a)一个或多个如本文所述的调节c-Met信号传导的多肽，和(b)一个或多个调节VEGF-介导的信号传导以及任选地EGFR-介导的信号传导的多肽的多特异性构建体特别有效地用于上文列出的疾病和病症的诊断、预防和治疗。所述多特异性构建体特别有效地用于癌症的诊断、预防和治疗，特别是非小细胞肺癌的诊断、预防和治疗。
WO08/101985中所述的多肽和纳米抗体特别优选地作为本发明的多特异性构建体中的调节VEGF-介导的信号传导的多肽。因此，本发明涉及多特异性的构建体，诸如例如二特异性、三特异性或四特异性的构建体，其包含至少一个针对c-Met的ISVD和至少一个针对VEGF的ISVD，以及任选地针对EGFR的ISVD。在这样的多特异性（例如，二特异性、三特异性或四特异性）多肽构建体中，本文所述的针对c-Met的纳米抗体和多肽可以与WO08/101985（其特别完全地结合在本文中）中所述的抗-VEGF纳米抗体和多肽中的一种或多种组合。
因此，本发明涉及(a)一个或多个调节c-Met信号传导的多肽和(b)一个或多个调节VEGF-介导的信号传导、特别是人VEGF-介导的信号传导的多肽，和任选地(c)一个或多个调节EGFR-介导的信号传导、特别是人EGFR-介导的信号传导的多肽的多特异性构建体，其用于上文列出的疾病和病症、特别是非小细胞肺癌的诊断、预防和治疗。在具体的方面中，本发明提供用于治疗诸如癌症的病理病症的组合疗法，其中c-Met拮抗剂与VEGF拮抗剂组合，或者其中c-Met拮抗剂与VEGF拮抗剂和EGFR拮抗剂组合，由此提供显著的抗肿瘤活性。
1.4价
通常，包含单个免疫球蛋白单可变结构域或基本上由其组成的蛋白或多肽在本文中称为“单价”蛋白或多肽或称为“单价构建体”。包含两个以上免疫球蛋白单可变结构域（诸如至少两个本发明的免疫球蛋白单可变结构域或至少一个本发明的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个其他的免疫球蛋白单可变结构域）或基本上由其组成的蛋白或多肽在本文中称为“多价”蛋白或多肽或称为“多价构建体”，并且与相对应的本发明的单价免疫球蛋白单可变结构域相比，这些可以提供某些优点。通过本文的进一步描述，所述多价构建体的一些非限制性的实例将变得清楚。
例如，本发明的“二价”多肽包含两个ISVDs，任选地通过一个接头序列连接，而本发明的“三价”多肽包含三个ISVDs，任选地通过两个接头序列连接，而本发明的“四价”多肽包含四个ISVDs，任选地通过三个接头序列连接，等等；其中在所述多肽或构建体中存在的至少一个ISVDs，以及至多在所述多肽或构建体中存在的所有ISVDs是ISVD(s)。
在本发明的多价多肽中，所述两个以上的ISVDs可以是相同的或不同的，并且可以针对相同的抗原或抗原决定簇（例如，针对相同的部分或表位或针对不同的部分或表位）或者可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或者它们任意适当的组合。例如，本发明的二价多肽可以包含(a)两个相同的ISVDs;(b)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一ISVD和与所述第一ISVD不同的针对所述蛋白或抗原的相同抗原决定簇的第二ISVD；(c)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一ISVD和针对所述蛋白或抗原的另一个抗原决定簇的第二ISVD；或(d)针对第一蛋白或抗原的第一ISVD和针对第二蛋白或抗原（即，不同于所述第一抗原）的第二ISVD。类似地，本发明的三价多肽可以，例如，并且不限于此，包含(a)三个相同的ISVDs;(b)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的ISVDs和针对相同抗原的不同抗原决定簇的第三ISVD；(c)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的ISVDs和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三ISVD；(d)针对第一抗原的第一抗原决定簇的第一ISVD，针对所述第一抗原的第二抗原决定簇的第二ISVD和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三ISVD；或(e)针对第一抗原的第一ISVD，针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第二ISVD，和针对不同于所述第一和第二抗原的第三抗原的第三ISVD。类似地，本发明的四价多肽可以，例如，并且不限于此，包含(a)四个相同的ISVDs;(b)针对第一抗原的第一抗原决定簇的三个相同的ISVDs和针对相同抗原的不同抗原决定簇的一个ISVD；(c)针对第一抗原的第一抗原决定簇的三个相同的ISVDs和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的一个ISVD；(d)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的ISVDs和针对相同抗原的不同抗原决定簇的两个ISVDs；(e)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的ISVDs，针对相同抗原的不同抗原决定簇的一个ISVD，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的一个ISVDs；(f)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的ISVDs，针对第二抗原的两个ISVDs，其中所述第二抗原不同于所述第一抗原；(g)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的ISVDs，针对第二抗原的一个ISVD，其中所述第二抗原不同于所述第一抗原，和针对第三抗原的一个ISVD，其中所述第三抗原不同于所述第一和第二抗原；(h)针对第一抗原的第一抗原决定簇的第一ISVD，针对所述第一抗原的第二抗原决定簇的第二ISVD，针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三和第四ISVD；(i)针对第一抗原的第一抗原决定簇的第一ISVD，针对所述第一抗原的第二抗原决定簇的第二ISVD，针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三ISVD和针对不同于所述第一抗原和所述第二抗原的第三抗原的第四ISVD；或(j)针对所述第一抗原的第一ISVD，针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第二ISVD，针对不同于所述第一和第二抗原的第三ISVD，和针对不同于所述第一、所述第二和所述第三抗原的第四抗原的第四ISVD。
本发明的多肽包含至少两个ISVDs，其中至少一个ISVD针对第一抗原（即，针对c-Met），并且至少一个ISVD针对第二抗原（即，不同于c-Met，例如，EGFR或VEGF），所述多肽还被称为本发明的“多特异性”多肽，并且所述多肽中存在的ISVDs在本文中还被称为处于“多价形式”。因此，例如，本发明的“二特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即c-Met)的ISVD和至少一个针对第二抗原(即，不同于c-Met,诸如，例如，EGFR或VEGF)的另一个ISVD的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽：其包含至少一个针对第一抗原(即c-Met)的ISVD，至少一个针对第二抗原(即，不同于c-Met,诸如，例如，EGFR或VEGF)的另一个ISVD和至少一个针对第三抗原(即，不同于c-Met和第二抗原，例如，EGFR或VEGF)的另一个ISVD，而本发明的“四特异性”多肽是这样的多肽：其包含至少一个针对第一抗原(即c-Met)的ISVD，至少一个针对第二抗原(即，不同于c-Met,诸如，例如，EGFR)的另一个ISVD，至少一个针对第三抗原(即，不同于c-Met和第二抗原EGFR，诸如，例如，VEGF)的另一个ISVD，至少一个针对第四抗原(即，不同于抗原c-Met、EGFR和VEGF，诸如，例如，血清白蛋白)的另一个ISVD；等等。
因此，以其最简单的形式，本发明的二特异性多肽是本发明的二价多肽(如本文定义)，其包含针对c-Met的第一ISVD，和针对第二抗原（诸如EGFR或VEGF）的第二ISVD，其中所述第一和第二ISVD可以任选地通过接头序列(如本文定义)连接；而本发明的三特异性多肽以其最简单的形式为本发明的三价多肽(如本文定义)，其包含针对c-Met的第一ISVD，针对第二抗原（诸如EGFR或VEGF）的第二ISVD，和针对第三抗原（例如，不同于c-Met和所述第二抗原（例如，EGFR或VEGF））的第三ISVD，其中所述第一、第二和第三ISVDs可以任选地通过一个或多个、并且特别是一个或多个、特别是两个接头序列连接；而本发明的四特异性多肽以其最简单的形式是本发明的四价多肽(如本文定义)，其包含针对c-Met的第一ISVD，针对第二抗原（诸如，例如，EGFR）的第二ISVD，针对第三抗原（诸如VEGF）的第三ISVD，和针对不同于c-Met、EGFR和VEGF的第四抗原的第四ISVD，其中所述第一、第二、第三和第四ISVDs可以任选地通过一个或多个、并且特别是一个或多个、特别是三个接头序列连接。
然而，从本说明书中应该清楚，本发明不限于此，在此意义上，本发明的多特异性多肽可以包含至少一个针对c-Met的ISVD和任意数量的分别针对一个或多个不同于c-Met的抗原的ISVDs。
按照一个具体的而非限制性实施方案，如本文所述的多肽包含任选地通过使用一个或多个适当的接头连接的至少一个针对c-Met的ISVD和至少一个针对EGFR和/或VEGF的ISVD。在这样的二特异性多肽构建体中，本文所述的针对c-Met的纳米抗体和多肽可以与WO05/044858,WO04/041867和/或WO07/042289中所述的抗-EGFR纳米抗体和多肽中的一种或多种组合，和/或与WO08/101985中所述的抗-VEGF纳米抗体和多肽中的一种或多种组合。
包含两个结合结构部分（诸如例如两个ISVDs）的二特异性多肽，其中每个结合结构部分对肿瘤相关的抗原（即，在肿瘤细胞上表达的抗原，也称为“肿瘤标记”）特异，所述二特异性多肽在肿瘤靶向方面是高度有利的。所述二特异性多肽能够同时靶向两种肿瘤相关的抗原，导致增强的肿瘤特异性。已知大部分肿瘤标记不真正是肿瘤特异性的，而是还存在于（通常以较低的水平）正常的组织或细胞中。因此，仅针对一种肿瘤标记的单特异性结合结构单位，ISVDs或多肽，还将识别那些正常的组织或细胞，这导致非特异性的细胞捕获（cellarrest）或杀伤。对一种或多种肿瘤细胞上的两种以上的标记特异性的多肽的肿瘤特异性要大得多，并且提供更加特异性的结合。因此，它们能够同时阻断多个受体激活和下游信号转导途径，并且提供更好的对肿瘤增殖的抑制和对肿瘤细胞的捕获或杀伤。
因此，本发明还涉及包含至少两个结合结构部分（如两个ISVDs）或基本上由其组成的二特异性或多特异性多肽，其中所述至少两个结合结构部分中的至少一个针对c-Met，另一个结合结构部分针对EGFR或VEGF。在一个具体的实施方案中，所述至少两个结合结构部分具有针对其各自的肿瘤相关抗原（诸如，例如，c-Met和EGFR或VEGF）的中等或低的亲和力，并且因此在表达所述肿瘤相关的抗原中的一种的正常的组织或细胞上仅具有减少的停留。然而，所述至少两个结合结构部分优先靶向（与之具有高的抗体亲抗原性）表达由所述二特异性或多特异性多肽识别的两种抗原（诸如，例如，c-Met和EGFR或VEGF）的肿瘤细胞。
因此，本发明还涉及包含至少三个结合结构部分（如三个ISVDs）或基本上由其组成的三特异性或多特异性多肽，其中所述至少三个结合结构部分中的至少一个针对c-Met，一个结合结构部分针对EGFR，并且一个结合结构部分针对VEGF。在一个具体的实施方案中，所述至少三个结合结构部分中的两个具有针对其各自的肿瘤相关抗原（诸如，例如，c-Met和EGFR）的中等或低的亲和力，并且因此在表达所述肿瘤相关的抗原中的一种的正常的组织或细胞上仅具有减少的停留。然而，所述至少两个结合结构部分优先靶向（与之具有高的抗体亲抗原性）表达由所述二特异性、三特异性或多特异性多肽识别的两种抗原（诸如，例如，c-Met和EGFR）的肿瘤细胞。
例如，EGFR在乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌和头颈癌的肿瘤上过表达。
通过同时靶向这些肿瘤相关抗原中的两种或这些肿瘤相关抗原中的一种上的不同表位，获得更加有选择性和/或增强的肿瘤靶向。
因此，在优选的实施方案中，本发明还提供二特异性或三特异性多肽，其包含针对c-Met的纳米抗体和针对EGFR的纳米抗体以及任选地针对VEGF的纳米抗体或者基本上由其组成。本发明的多肽可以包含针对c-Met的纳米抗体和针对EGFR的纳米抗体或者基本上由其组成。本发明的多肽包含针对c-Met的纳米抗体和针对VEGF的纳米抗体或者基本上由其组成。此外，本发明的多肽可以包含针对c-Met的纳米抗体、针对EGFR的纳米抗体和针对VEGF的纳米抗体或者基本上由其组成。
本发明的范围内还包括包含至少两个纳米抗体或者基本上由其组成的二特异性或多特异性多肽，其中当另一个纳米抗体与其抗原结合时，所述至少两个纳米抗体中的一个具有减少的或增加的针对其抗原的亲和力。所述结合称为‘条件性二特异性或多特异性结合’。所述二特异性或多特异性多肽也称为‘本发明的条件性结合的二特异性或多特异性多肽’。
所述至少两个纳米抗体中的第一个对抗原的结合可以调节，诸如增强、减少或抑制所述至少两个纳米抗体中的第二个对所述抗原的结合。在一个实施方案中，所述至少两个纳米抗体中的第一个的结合刺激所述至少两个纳米抗体中的第二个的结合。在另一个实施方案中，所述至少两个纳米抗体中的第一个的结合至少部分抑制所述至少两个纳米抗体中的第二个的结合。在这样的实施方案中，本发明的多肽可以，例如，通过与增加所述多肽的半衰期的蛋白结合而在体内维持在受试者生物体的体内持续这样的时间，直到其与其第二靶抗原结合并且与增加半衰期的蛋白解离。
在上述情形中，由于所述纳米抗体相对于彼此抗原结合位点在结构上邻近的原因，实现对结合的调节。所述结构上的邻近性通过连接所述两个以上结合位点的结构元件的性质而实现，例如，通过提供具有相对刚性的结构的接头，其保持抗原结合位点紧密邻近。有利地，所述两个以上的抗原结合位点在物理上彼此紧密邻近，以使一个位点通过涉及多肽内的空间位阻和/或构象改变的过程而调节在另一个位点的抗原结合。
1.5血清白蛋白结合结构单元或增加半衰期的其他结构单元
在另一个方面，本发明涉及这样的化合物或构建体，特别是蛋白或多肽（在本文中还分别称为“本发明的化合物”或“本发明的多肽”），其包含一个或多个（优选一个）针对人c-Met的免疫球蛋白单可变结构域（或其适当的片段）或者基本上由其组成，并且任选地还包含一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位。通过本文进一步公开的内容，技术人员应该清楚，所述其他基团、残基、结构部分、结合单位或免疫球蛋白单可变结构域能够或不能为本发明的氨基酸序列（和/或其中存在所述氨基酸序列的化合物或构建体）提供其他的官能性并且能够或不能改变本发明的氨基酸序列的特性。
从上文和此处的进一步描述应该清楚，这意指本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以用作“结构单元”来形成本发明的多肽，即，通过用其他基团、残基、结构部分或结合单位将它们适当地组合，从而形成如本文所述的化合物或构建体（诸如，不限于，本文所述的本发明的二互补位、三互补位、四互补位、二价/三价/四价/多价和二特异性/三特异性/四特异性/多特异性多肽），其在一个分子中组合一种或多种需要的特性或生物功能。
关于包含一个或多个纳米抗体的多价和多特异性多肽及其制备的一般描述，还参考Conrath等,J.Biol.Chem.（生物化学杂志）,卷276,10.7346-7350,2001;Muyldermans,ReviewsinMolecularBiotechnology（分子生物技术综述）74(2001),277-302;以及参考，例如WO96/34103,WO99/23221,WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164或WO2009/068627。
本发明的化合物或多肽通常可以通过这样的方法制备，所述方法包括将所述一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域任选地通过一个或多个适当的接头适当地连接到所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位上的至少一个步骤，以提供本发明的化合物或多肽。本发明的多肽还可以通过这样的方法制备，所述方法通常至少包括下述步骤：提供编码本发明的多肽的核酸，以适当方式表达所述核酸，和回收所表达的本发明的多肽。这样的方法可以以本身已知的方式进行，这对于专业技术人员将是清楚的，例如，基于本发明进一步所述的方法和技术。
由本发明的氨基酸序列起始，设计/选择和/或制备本发明的化合物或多肽的方法在本文中还称为“格式化”所述的本发明的氨基酸序列；并且组成本发明的化合物或多肽的一部分的本发明的氨基酸被认为是“格式化的”或采用所述的本发明的化合物或多肽的“格式”。基于本文的公开内容，专业技术人员将清楚本发明的氨基酸序列可以被格式化的方法的实例以及所述格式的实例；并且所述格式化的免疫球蛋白单可变结构形成本发明的另一个方面。
例如，所述其他基团、残基、结构部分或结合单位可以是一个或多个额外的免疫球蛋白单可变结构域，以致所述化合物或构建体是一种（融合）蛋白或（融合）多肽。在一个优选而非限制性的方面中，所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白序列。甚至更优选地，所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位选自由以下组成的组：结构域抗体、适合于用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合于用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域(ISVDs)、"dAb"’s、适合于用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域、或纳米抗体。备选地，例如，所述基团、残基、结构部分或结合单位可以是化学基团、残基、结构部分，其自身可以是或可以不是生物学和/或药理学活性的。例如，并且不限于，所述基团可以连接到一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域上，以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如本发明进一步所述。
也在本发明范围内的是这样的化合物或构建体，其包含一个或多个本文所述的衍生物或基本上由其组成，并且任选地还包含任选地通过一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位。优选地，所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白单可变结构域。在上述化合物或构建体中，所述一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域以及所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位可以彼此直接连接和/或通过一个或多个适当的接头或间隔体连接。例如，当所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白单可变结构域时，所述接头可以也是免疫球蛋白单可变结构域，以致所得到的化合物或构建体是融合（蛋白）或融合（多肽）。
在本发明的一个具体而非限制性的方面中（其将在本文中进一步描述），与它们由其衍生的免疫球蛋白单可变结构域相比，本发明的多肽具有增加的血清半衰期(如本文进一步所述)。例如，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以（化学或以另外的方式）连接一个或多个延长半衰期的基团或结构部分（如PEG），以提供具有增加的半衰期的本发明的氨基酸序列的衍生物。
在本发明的一个具体方面中，与相对应的本发明的氨基酸序列相比，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有增加的半衰期。基于本文进一步的公开内容，所述化合物和多肽的一些优选而非限制性的实例对于专业技术人员将变得清楚，并且例如包括下列各项：已经被化学修饰以增加其半衰期（例如，通过聚乙二醇化方式）的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽；包括至少一个用于结合血清蛋白（诸如血清白蛋白）的另外的结合位点的本发明的免疫球蛋白单可变结构域；或包括至少一个与增加本发明的氨基酸序列的半衰期的至少一个结构部分（并且特别是至少一个氨基酸序列）连接的本发明的氨基酸序列的本发明的多肽。基于本发明进一步的公开内容，包含所述延长半衰期的结构部分或免疫球蛋白单可变结构域的本发明的多肽的实例对于专业技术人员将变得清楚；并且例如，包括，但不限于，这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域适当地连接一个或多个血清蛋白或其片段（诸如（人）血清白蛋白或其适当的片段）或连接一个或多个可以结合血清蛋白的结合单位（诸如，例如，结构域抗体，适于用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域，单结构域抗体，适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域，"dAb"’s，适于用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域，或可以结合血清蛋白如血清白蛋白（诸如人血清白蛋白）、血清免疫球蛋白如IgG、或运铁蛋白的纳米抗体；参考进一步的描述和本发明提及的参考文献）；这样的多肽，其中本发明的氨基酸序列连接Fc部分(诸如人Fc)或其适当的部分或片段;或这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域适当连接一个或多个可以结合血清蛋白的小蛋白或肽，诸如，但不限于，记载在WO91/01743,WO01/45746,WO02/076489,WO2008/068280,WO2009/127691和PCT/EP2011/051559中的蛋白和肽。
通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽优选地具有是相对应的本发明的氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍高的半衰期。例如，与相对应的本发明的氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽可以具有（例如，在人中）增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的一个优选而非限制性方面中，与相对应的本发明的氨基酸序列本身相比，所述本发明的化合物或多肽具有（例如，在人中）增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。
在本发明的另一个优选而非限制性方面中，所述本发明的化合物或多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天（诸如约5-10天）、优选至少9天（诸如约9-14天）、更优选至少约10天（诸如约10-15天）、或至少约11天（诸如约11-16天）、更优选至少约12天（诸如约12-18天或更多）、或超过14天（诸如约14-19天）的半衰期。
在另一个方面，本发明涉及多特异性的(且特别是二特异性的)ISVD，诸如包含Alb11(SEQIDNO:5)或Alb23[SEQIDNO:101]和至少一个其他ISVD如纳米抗体(诸如一个或两个其他的ISVDs，例如，纳米抗体，其可以是相同的或不同的)的纳米抗体构建体，其中所述至少一个其他ISVD,例如，纳米抗体，优选地针对需要的靶标（其优选地是治疗靶标）和/或针对另一个有效地或适合用于治疗、预防和/或诊断目的的ISVD,例如，纳米抗体。同样地，Alb11(SEQIDNO:5)或Alb23[SEQIDNO:101]以及其他的纳米抗体可以彼此直接地或任选地通过一个或多个适当的接头或间隔臂适当地连接，并且按照一个具体而非限制性的方面，所述其他纳米抗体中的至少一个（并且至多全部）可以是VHH-1种类的。
本发明的一些具体的多特异性和/或多价多肽的一些其他的实例可见于本文提及的埃博灵克斯股份有限公司的申请。特别地，关于包含至少一个用于增加半衰期的针对血清蛋白的纳米抗体的多价和多特异性构建体、编码其的核酸、包含其的组合物、前述的制备以及前述的应用的一般描述，参考上文提及的国际申请WO04/041865和WO06/122787（本文所述的Alb-23[SEQIDNO:101]和Alb-23变体通常可以类似地用于其中所述的半衰期延长的纳米抗体，如Alb-8），以及参考WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164或WO2009/068627中提供的一般描述和所述构建体的具体实例。
在一个非限制性的实施方案中，所述多肽或蛋白构建体中存在的一个或多个其他纳米抗体可以针对c-Met，并且可以具体是针对c-Met的I型纳米抗体。
可以存在于所述多价和/或多特异性多肽中的一个特别优选的针对c-Met的I型纳米抗体（邻近Alb-23[SEQIDNO:101]或Alb-23变体）是04E09(SEQIDNO:26)或其变体，例如，04E09-样ISVD。
所述04E09的变体通常与04E09具有至少80%、诸如至少85%、例如至少90%或更多、如95%或更多的序列同一性，并且优选是这样的，以致：(i)其与04E09竞争与c-Met的结合（在适当的测定中，诸如实施例7中所述的α筛选测定，但是使用04E09替代在实施例7中所用的HGF）；和/或(ii)其与04E09结合c-Met上相同的表位；和/或(iii)其交叉阻断（如WO2009/068627中所述）04E09与c-Met的结合。例如，所述04E09的变体可以是04E09的人源化的和/或序列-优化的变体(如本文进一步所述)。在所述蛋白或多肽中可能存在的04E09的变体的一些优选而非限制性的实例是下述：04E09(L49S)(SEQIDNO:23);04E09(C50S/C100bG)(SEQIDNO:24);04E09(C22A/C92S)(SEQIDNO:25);A00790067=04E09(Q108L)(SEQIDNO:114);A00790068=04E09(A74S,K83R,Q108L)(SEQIDNO:115);A00790069=04E09(A74S,K83R,G88A,Q108L)(SEQIDNO:116)和A00790105=04E09(E1D,A74S,K83R,G88A,Q108L)(SEQIDNO:102)，其中后者是特别优选的。
因此，在一个具体而非限制性的方面中，本发明涉及这样的多肽或蛋白构建体，其包含与一个或两个针对c-Met的纳米抗体适当地连接（直接地或通过一个或多个适当的接头连接）的Alb-23[SEQIDNO:101](优选的)或Alb-23变体(如本文所述)或基本上由其组成。如提及的，按照一个具体而非限制性的方面，所述一个或两个针对c-Met的纳米抗体包含两个二硫键（即，是“I类”的）。
具体地，本发明涉及这样的多肽或蛋白构建体，其包含与一个或两个（并且优选仅一个）针对c-Met的纳米抗体适当地连接（直接地或通过一个或多个适当的接头连接）的Alb-23[SEQIDNO:101](优选的)或Alb-23变体(如本文所述)或基本上由其组成，其为04E09(SEQIDNO:26)或04E09的变体(如本文所述)，并且优选地是04E09的人源化的或序列优化的变体，并且更优选是A00790105(SEQIDNO:102)。
所述蛋白和多肽的一些具体而非限制性的实例是构建体Alb23-9GS-4E09(SEQIDNO:103),4E09-9GS-Alb23(SEQIDNO:104),Alb23-9GS-A00790105(SEQIDNO:105),A00790105-9GS-Alb23(SEQIDNO:106),Alb23-35GS-04E09(SEQIDNO:107),4E09-35GS-Alb23(SEQIDNO:108),Alb23-35GS-A00790105(SEQIDNO:109),A00790105-35GS-Alb23(SEQIDNO:110),A00790105-35GS-A00790105-35GS-Alb23(SEQIDNO:111)和A00790105-9GS-Alb23-A(SEQIDNO:188)。其中，构建体A00790105-9GS-Alb23(SEQIDNO:106)和A00790105-9GS-Alb23-A(SEQIDNO:188)是特别优选的，并且因此本发明的一个方面还涉及与SEQIDNO:106和188的多肽具有至少80%、如至少85%、例如至少90%、如至少95%或更多的序列同一性的多肽。
可能存在于多价和/或多特异性多肽中的更特别优选的针对c-Met的I型纳米抗体（紧邻Alb-11[SEQIDNO:5]或Alb-11变体）是33H10(SEQIDNO:187)或其变体，例如，33H10-样ISVD，其完全出乎意料地在不同宿主中便利地产生。所述33H10的变体通常与33H10具有至少80%、如至少85%、例如至少90%或更多、如95%或更多的序列同一性，并且优选是这样的，以致：(i)其与33H10竞争与c-Met的结合（在适当的测定中，诸如实施例21或22中所述的α筛选测定，但是使用33H10替代在实施例1.5中所用的HGF）；和/或(ii)其与33H10结合c-Met上相同的表位；和/或(iii)其交叉阻断（如2009/068627中所述）33H10与c-Met的结合。例如，所述33H10的变体可以是33H10的人源化的和/或序列-优化的变体(如本文进一步所述)。在所述蛋白或多肽中可能存在的33H10的变体的一些优选而非限制性的实例是下述：克隆A007900184(wt;SEQIDNO:151),A007900738-A007900753,A007901245-A007901253和A007901255-A007901263(分别为SEQIDNO:s117-150)，其中A007901256(SEQIDNO:143),A007901259(SEQIDNO:146)和A007901260(SEQIDNO:147)是特别优选的。
此外，特别地，本发明涉及这样的多肽或蛋白构建体，其包含与一个或两个（优选地仅一个）针对c-Met的纳米抗体适当地连接（直接地或通过一个或多个适当的接头连接）的Alb-11[SEQIDNO:5](优选的)或Alb-11变体(如本文所述)或基本上由其组成，其为33H10(SEQIDNO:187)或33H10的变体(如本文所述)，并且优选地是33H10的人源化的或序列优化的变体，并且更优选是A007901256(SEQIDNO:143),A007901259(SEQIDNO:146)和A007901260(SEQIDNO:147)。
所述蛋白和多肽的一些具体而非限制性的实例是构建体A007901255(SEQIDNO:142);A007901256(SEQIDNO:143);A007901257(SEQIDNO:144);A007901258(SEQIDNO:145);A007901259(SEQIDNO:146);A007901260(SEQIDNO:147);A007901261(SEQIDNO:148);A007901262(SEQIDNO:149);A007901263(SEQIDNO:150)。其中，构建体A007901256(SEQIDNO:143),A007901259(SEQIDNO:146)和A007901260(SEQIDNO:147)是特别优选的，并且因此本发明的一个方面还涉及与SEQIDNO:s143,146和147的多肽具有至少80%、如至少85%、例如至少90%、如至少95%或更多的序列同一性的多肽。
在本发明的一个特别优选而非限制性的方面，本发明提供包含下述的本发明的多肽：i)一个如本文所述的结合c-Met的免疫球蛋白单可变结构域；和ii)一个或多个(优选一个)如本文所述的结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。
在一个进一步优选的方面，本发明提供包含下述的本发明的多肽：i)一个如本文所述的结合c-Met的免疫球蛋白单可变结构域；和ii)一个或多个(优选一个)SEQIDNO:5或SEQIDNO:101的结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域（参考表A-2和B-1）。
在一个进一步优选的方面，本发明提供包含下述的本发明的多肽：i)一个如本文所述的结合c-Met的免疫球蛋白单可变结构域；和ii)一个或多个(优选一个)具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:101的CDRs（按照Kabat编号方式定义）的结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域（参考表A-2和B-1）。
因此，例如，进一步的参考（并且通过引用结合）特别参见WO2008/068280的实验部分和进一步的描述，其中公开了关于SEQIDNO:5或SEQIDNO:101的进一步的详情，并且，例如，公开了包含所述序列的免疫球蛋白单可变结构域构建体在恒河猴中的半衰期。
这些可以由两个免疫球蛋白单可变结构域组成，诸如由一个针对c-Met的免疫球蛋白单可变结构域和一个针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域组成。基于本文公开的内容，所述多特异性构建体是技术人员所清楚的，所述多特异性免疫球蛋白单可变结构域的一些优选的而非限制性的实例是SEQIDNO:s7-12,103-111,113,188和142-150的构建体，优选是SEQIDNO:s7,106,113,188,143,146和147的构建体（参见实验部分）。
按照另一个具体的而非限制性的方面，本发明的多肽包含至少一个本发明的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个其他结合单位（即，针对另一个表位、抗原、靶标、蛋白或多肽）或基本上由其组成，所述至少一个其他结合单位优选地也是免疫球蛋白单可变结构域。所述蛋白或多肽在本文中还称为“多特异性的”蛋白或多肽或者称为“多特异性的构建体”，并且这些可以包括两个免疫球蛋白单可变结构域（诸如一个本发明的针对c-Met的免疫球蛋白单可变结构域和一个针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域）或者基本上由其组成。基于本文的公开内容，技术人员应该清楚所述多特异性构建体；所述多特异性免疫球蛋白单可变结构域的一些优选的而非限制性的实例是SEQIDNO:s7-12,103-111,113,188和142-150的构建体，优选是SEQIDNO:s7,106,113,188,143,146和147的构建体(参见实验部分)。
按照另一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽包含至少一个本发明的免疫球蛋白单可变结构域、任选地一个或多个其他免疫球蛋白单可变结构域和至少一个其他氨基酸序列（诸如蛋白或多肽）或基本上由其组成，所述至少一个其他氨基酸序列赋予本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或所得到的融合蛋白至少一种需要的特性。同样地，与相对应的本发明的单价的免疫球蛋白单可变结构域相比，所述融合蛋白可以提供某些优点。诸如，例如，可以提供增加的半衰期。
在上述构建体中，所述一个或多个免疫球蛋白单可变结构域和/或其他免疫球蛋白单可变结构域可以直接彼此连接和/或通过一个或多个接头序列适当地彼此连接。通过本文的进一步描述，所述接头的一些适当的而非限制性的实例将变得清楚。
在一个实施方案中，连接所述免疫球蛋白单可变结构域的接头序列选自SEQIDNO:s13-22，优选选自SEQIDNO:s15-22，或是本领域中已知的。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及三特异性的或多特异性的多肽，其包含至少三个ISVDs或基本上由其组成，其中所述至少三个ISVDs中的两个针对肿瘤相关的抗原（诸如，例如，c-Met和EGFR或VEGF），并且另一个结合结构部分针对另一种靶标或抗原。优选地，该靶标或抗原是可以增加所述多肽的体内半衰期（如进一步所述）的分子或具有效应子功能的分子，如CD3，Fc受体或补体蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供包含针对EGFR的纳米抗体或针对VEGF的纳米抗体、针对c-Met的纳米抗体和针对人血清白蛋白的纳米抗体或者基本上由其组成的三特异性多肽。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种四特异性的或多特异性的多肽，其包含至少四个ISVDs或基本上由其组成，其中所述至少四个ISVDs中的三个针对肿瘤相关抗原(诸如，例如，c-Met,EGFR和VEGF)。并且另一个结合结构部分针对另一种靶标或抗原。优选地，所述靶标或抗原是可以增加所述多肽的体内半衰期（如进一步所述）的分子或具有效应子功能的分子，如CD3，Fc受体或补体蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供包含针对EGFR的纳米抗体、针对VEGF的纳米抗体、针对c-Met的纳米抗体和针对人血清白蛋白的纳米抗体或者基本上由其组成的四特异性多肽。
此外，尽管所述多个纳米抗体在本发明的多肽中的特定顺序或排列可能对本发明最终的多肽的特性有一些影响（包括，但不限于分别针对VEGF、EGFR或c-Met的或针对所述一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或抗体亲抗原性）也包括在本发明的范围内，但是所述顺序或排列通常不是关键的，并且可以由熟练的技术人员适当选择，任选地基于本发明的公开内容在一些有限的常规实验之后选择。因此，当提及本发明的特定的多特异性多肽时，应该注意到，这包括相关纳米抗体的任何顺序或排列，除非另外明确指明。
按照另一个具体的而非限制性的方面，本发明的多肽可以，例如，选自由与SEQIDNO:s23-29,102和187、优选与SEQIDNO:26和187(参见实验部分)中的一种或多种具有大于80%、优选大于90%、更优选地大于95%、如99%或更多的“序列同一性”(如本文定义)的免疫球蛋白单可变结构域组成的组，其中所述多肽优选如本文进一步定义，即，以一个针对c-Met的免疫球蛋白单可变结构域和一个针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域的优选形式存在。
按照另一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽可以，例如，选自由与SEQIDNO:s7-12,103-111,113,188和142-150、优选与SEQIDNO:s7,106,113,188,143,146和147的多肽中的一种或多种有大于80%、优选大于90%、更优选地大于95%、如99%或更多的“序列同一性”(如本文定义)的多肽组成的组。
1.6本发明的组合物和药物组合物
通常，对于药物应用，本发明的多肽可以配制成药物制剂或组合物，其包含至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅剂，和任选地一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服给药，肠胃外给药（诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注），局部给药，通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂给药，等等，其中优选肠胃外给药。所述适宜的给药形式――取决于给药的方式，其可以是固体、半固体或液体――以及制备其所用的方法和载体，对熟练的技术人员是清楚的，并且在本文中进一步描述。所述药物制剂或组合物在本文中通常称为“药物组合物”。用于非人生物体的药物制剂或组合物在本文中通常称为“兽医用组合物”。
因此，在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的氨基酸，至少一种本发明的多肽，或至少一种本发明的多肽以及至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂（即，适于药用），以及任选地一种或多种其他活性物质。
通常，本发明的多肽可以以本身已知的任何适当的方式配制和施用。例如，参考上文引用的公知背景技术（并且特别参见WO04/041862,WO04/041863,WO04/041865,WO04/041867和WO08/020079），以及参见标准手册，诸如雷明顿制药科学（Remington’sPharmaceuticalSciences）,第18版,Mack出版公司,美国(1990)，雷明顿，制药科学和实践（Remington,theScienceandPracticeofPharmacy）,第21版,LippincottWilliams和Wilkins(2005)；或治疗性抗体手册（HandbookofTherapeuticAntibodies）(S.Dubel编),Wiley,Weinheim,2007(例如，参见第252-255页)。
例如，本发明的多肽可以本身已知的用于常规抗体及抗体片段（包括ScFv’s和双抗体）和其他药物活性蛋白的任何方式配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，包括适于肠胃外给药（例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药）或适于局部（及透皮的或皮内）给药的制剂。
例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于，WO08/020079第143页提及的那些。在一些实施方案中，所述制剂是无菌溶液或混悬液。
本发明的多肽还可以使用由基因治疗已知的递送方法进行施用，例如，参见美国专利号5,399,346，其通过对其基因治疗递送方法的引用而结合在本文中。使用基因治疗的递送方法，转染了编码本发明的氨基酸序列、多肽的基因的原代细胞另外可以用组织特异性启动子转染，以靶向特定的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，并且另外可以使用用于亚细胞定位表达的信号和稳定序列进行转染。
因此，本发明的多肽可以系统施用，例如，口服地，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体组合。它们可以包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患者日常饮食的食物组合。对于口服治疗性施用，本发明的多肽可以与一种或多种赋形剂组合，并且以可吸收的片剂、颊含片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述组合物和制剂应该包含至少0.1％的本发明的多肽。当然，其在所述组合物和制剂中的百分数可以变化，并且可以便利地在所给单位剂型的约2-约60重量％之间。本发明的多肽在这样的治疗有效组合物中的量是这样的，以致将获得有效的剂量水平。
对于在肿瘤切除部位的局部施用，本发明的多肽可以用在可生物降解的聚合物药物递送系统、缓慢释放的聚（乳酸-共-乙醇酸）制剂等中(Hart等,CochraneDatabaseSystRev.2008年7月16日;(3):CD007294)。
在本发明的另一个优选的方面，与常规抗体（诸如，例如，IgG）相比，本发明的多肽，诸如基本上由通过GS接头连接的一个单价抗-人c-Met免疫球蛋白单可变结构域和一个单价抗-人血清白蛋白免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽，在实体瘤中可能具有有利的分布和动力学特征。
所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下列各项：粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂和甜味剂或调味剂，例如，WO08/020079第143-144页提及的那些。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其他物质可以作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以包含本发明的多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药物可接受的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，本发明的多肽可以结合在缓释的制剂和装置中。
用于口服给药的制备物和制剂还可以被提供有肠衣，所述肠衣允许本发明的构建体抵抗胃环境，并且进入肠内。更一般地，用于口服给药的制备物和制剂可以适当地配制成用于递送到胃肠道的任何理想的部分。另外，适宜的栓剂可以用于递送到胃肠道内。
本发明的多肽还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用。WO08/020079第144和145页或在PCT/EP2010/062975（整个文件）中进一步描述了具体实例。
对于局部给药，本发明的多肽可以以纯的形式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体。WO08/020079第145页进一步描述了具体的实例。
通常，本发明的多肽在液体组合物诸如洗液中的浓度为约0.1-25重量-%，优选地约0.5-10重量-%。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度为约0.1-5重量-%，优选地约0.5-2.5重量-%。
需要用于治疗的本发明的多肽的量不但随着所选的特定的多肽而变化，而且随着给药途径、要治疗的病症的性质以及患者的年龄和病症而变化，并且最终取决于随从医生或临床医生的判断力。此外，本发明的多肽的剂量变化取决于靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官。
理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为以适当的时间间隔施用的分剂量而存在，例如，作为每天2、3、4次或更多的亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的施用。
施用方案可以包括长期的、日常的治疗。“长期”意指至少两周，并且优选地持续数周、数月或数年。在这一剂量范围的必要的修改可以由本领域的普通技术人员仅仅使用本文的教导所给出的常规实验而确定。参见雷明顿制药科学（Remington’sPharmaceuticalSciences）(Martin,E.W.,第4版),Mack出版公司,Easton,PA。在任何并发症情形中，剂量还可以由个别医生进行调整。
在另一方面中，本发明涉及预防和/或治疗至少一种与c-Met相关的疾病或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的多肽和/或包括其的药物组合物。
在本发明的内容中，术语“预防和/或治疗”不但包括预防和/或治疗疾病，而且通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病的严重性和/或与之相关的任何症状的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病引起的任何生理损害以及通常对被治疗的患者有益的任何药理学作用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的人。
本发明涉及预防和/或治疗至少一种与c-Met、与其生物学或药理学活性、和/或与其中涉及c-Met的生物学途径或信号传导相关的疾病或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的多肽和/或包含其的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于预防和/或治疗可以通过调节c-Met、其生物学或药理学活性和/或其中涉及c-Met的生物学途径或信号传导进行治疗的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明多肽和/或包含其的药物组合物。在一个实施方案中，所述药用有效量可以是足以调节c-Met、其生物学或药理学活性和/或其中涉及c-Met的生物学途径或信号传导的量；和/或在循环中提供足以调节c-Met、其生物学或药理学活性、和/或其中涉及c-Met的生物学途径或信号传导的本发明的多肽的水平的量。
在一个实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的多肽、本发明的编码其的核苷酸构建体和/或包含其的药物组合物而预防和/或治疗的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的编码其的核苷酸构建体和/或包含其的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种可以通过在待治疗的受试者的特定细胞或特定组织中抑制HGF与c-Met的结合（并且特别是通过在待治疗的受试者中存在的癌细胞或肿瘤中抑制HGF与c-Met的结合）而得到预防和/或治疗的疾病和病症的方法，所述方法包括给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的编码其的核苷酸构建体和/或包含其的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗至少一种选自由本文列出的疾病和病症组成的组中的疾病或病症的方法，所述方法包括给需要所述方法的受试者施用本发明的多肽、本发明的编码其的核苷酸构建体和/或包含其的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及免疫治疗的方法，并且特别涉及被动免疫治疗的方法，所述方法包括给患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的受试者施用药物活性量的本发明的多肽、本发明的编码其的核苷酸构建体和/或包括其的药物组合物。
在上述方法中，取决于要用的特定的药物制剂或组合物，本发明的氨基酸序列、多肽和/或包含其的组合物可以以任何适当的方式施用。因此，例如，同样取决于要用的特定药物制剂或组合物，本发明的多肽和/或包含其的组合物可以口服、腹膜内（例如，静脉内、皮下、肌内或者通过避开胃肠道的任何其他施用途径）、鼻内、透皮地、局部施用，通过栓剂、通过吸入方式施用。取决于要预防或治疗的疾病或病症以及临床医生公知的其他因素，临床医生能够选择适当的施用途径和用于所述施用的适当的药物制剂或组合物。
本发明的多肽和/或包含其的组合物按照治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的疾病或病症。临床医生通常能够确定适宜的治疗方案，这取决于下列因素：诸如要被预防或治疗的疾病或病症，要被治疗的疾病的严重性和/或其症状的严重性，要用的本发明的多肽，要用的特定的施用途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、综合病况，以及临床医生公知的类似因素。
一般地，所述治疗方案包括以一种或多种药物有效量或剂量施用一种或多种本发明的多肽，或者包含其的一种或多种组合物。同样基于上文引用的因素，临床医生可以确定施用的具体量或剂量，。
通常，对于预防和/或治疗本文提及的疾病和病症，并且取决于要治疗的具体疾病或病症，要用的特定的本发明的多肽的功效，具体的施用途径和使用的特定的药物制剂或组合物，本发明的多肽一般以每天每kg体重1克-0.01微克的量施用，优选地每天每kg体重0.1克-0.1微克，诸如每天每kg体重约1,10,100或1000微克，作为单一的每日剂量连续施用（例如，通过输注）或者在一天内作为多次分剂量施用。取决于本文提及的因素，临床医生通常能够确定适宜的日常剂量。还应该清楚，在具体的情形中，临床医生可以选择偏离这些量，例如，基于上文引用的因素以及他的专业判断。一般地，关于施用量的一些指导可从以基本上相同的途径通常施用的相当的针对相同施用靶标的常规抗体或抗体片段的量而获得，但是要考虑亲和力/抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期以及熟练的技术人员公知的类似因素的不同。
在一个实施方案中，将使用本发明的单个邻接的多肽。在一个实施方案中，提供组合的两个以上的本发明的多肽。
本发明的多肽还可以与一种或多种其他药物活性化合物或成分（principles）组合应用，即，作为组合治疗方案，其可以或者可以不引起增效效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断，临床医生能够选择所述的其他化合物或成分，以及适宜的组合治疗方案。
特别地，本发明的多肽可以与其他药物活性化合物或成分组合应用，所述其他药物活性化合物或成分是或者能够用于预防和/或治疗本文所引用的疾病和病症，结果它们可以或不可以获得增效效应。所述化合物和成分的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的，并且一般包括通常用于治疗待治疗的肿瘤的细胞抑制性活性成分，并且优选细胞毒性活性成分。
特别考虑的与本发明的多肽一起使用的用于肿瘤学的组合包括，但不限于，例如RON拮抗剂，CXCR4拮抗剂，诸如，例如，AMD3100，其他趋化因子受体拮抗剂，紫杉醇（taxol）；吉西他滨（gemcitabine）;顺铂（cisplatin）;cIAP抑制剂(诸如对cIAP1,cIAP2和/或XIAP的抑制剂);MEK抑制剂，包括但不限于，例如U0126,PD0325901;bRaf抑制剂，包括但不限于，例如RAF265;和mTOR抑制剂，包括但不限于，例如RAD001;VEGF抑制剂，包括但不限于，例如，贝伐珠单抗（bevacizumab）,sutinib和索拉非尼（sorafenib）;ERBB抑制剂,诸如，例如，EGFR-抑制剂,包括但不限于，特异性的小分子激酶抑制剂，例如，埃罗替尼（erlotinib）,吉非替尼（gefitinib）;抗体,例如，西妥昔单抗（cetuximab）,尼妥珠单抗（nimotuzumab）,帕尼单抗（panitumumab）,necitumumab,IMC-C225(爱必妥,Imclone),EMD72000(MerckDarmstadt),ABX-EGF(Abgenix),h-R3(theraCIM,YMBiosciences)和Humax-EGFR(Genmab);双重特异性或多特异性的小分子激酶抑制剂，例如，拉帕替尼（lapatinib）(EGFR&HER2),凡德他尼（vandetanib）(EGFR,RET,VEGFR2),neratinib(EGFR,HER2,HER4)和PF-299804(EGFR,HER2,HER4),HER2-抑制剂，包括但不限于，例如，曲妥珠单抗（trastuzumab）和拉帕替尼;HER3-抑制剂;HER4抑制剂;PDGFR,FGFR,src,JAK,STAT和/或GSK3抑制剂;选择性雌激素受体调节剂，包括但不限于，他莫昔芬（tamoxifen）;雌激素受体下调剂，包括但不限于，氟维司群（fulvestrant）。特别考虑的与本发明的多肽一起使用的例如用于炎症和其他病症的组合也包括，但不限于，例如，干扰素β1α和β，IFNα2b;那他珠单抗（natalizumab）;TNFα拮抗剂，包括但不限于，例如，英利昔单抗（infliximab）,阿达木单抗（adalimumab）,培舍珠单抗（certolizumabpegol）,伊那西普（etanercept）;减轻疾病的抗风湿药，诸如，例如，甲氨蝶呤（Methotrexate）(MTX);糖皮质激素类（glucocorticoids），包括但不限于，例如，地塞米松（dexamethasone）,氢化可的松（hydrocortisone）;非甾醇类抗炎药，包括但不限于，例如，布洛芬（ibuprofen）,舒林酸（sulindac）;IL-6或IL-6R抑制剂，包括但不限于，例如，RoActemra,ALD518。另外，与本发明的多肽一起使用的用于肿瘤学适应证的组合包括，但不限于，非靶向的化疗药，诸如细胞毒性剂和/或细胞抑制剂。本发明还包括包含本发明的多肽与其他抗体和/或化学化合物和/或化合物和/或抗癌剂或与毒素缀合的药剂组合的产品和/或组合物，及其用于预防和/或治疗特定的癌症的应用，其中所述其他抗体和/或化学化合物针对肿瘤进展或转移所涉及到其他生长因子。
当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同时间（例如，基本上同时地、连续地、或者按照交替方案）施用。当所述物质或成分通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用，这是专业技术人员所清楚的。
此外，当两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时，每一物质或成分可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或成分单独使用时相同的方案施用，并且所述组合应用可以或可以不引起增效效应。然而，当所述两种或更多种活性物质或成分的组合应用引起增效效应时，还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物质或成分的量，同时仍旧获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以它们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或成分的应用相关的任何不需要的副作用，同时仍旧获得理想的药物或治疗效果。
根据本发明所用的治疗方案的效果可以以本身已知的用于所涉及的疾病或病症的任何方式进行确定和/或遵循，这是临床医生所清楚的。在适当的并且基于病例/病例基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改进具体的治疗方案，以便获得理想的治疗效果，以避免、限制或减少不需要的副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。
通常，应该遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或只要维持所述理想的治疗效果。同样地，这可以由临床医生确定。
在另一方面中，本发明涉及本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗至少一种与c-Met相关的疾病或病症的药物组合物中的应用；和/或用于一种或多种本文所提及的方法中的应用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人。在兽医用应用中，待治疗的受试者包括出于商业目的所饲养的或作为宠物养护的任何动物。专业技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的人。
本发明涉及本发明的多肽或编码其的核苷酸在制备用于预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的多肽或编码其的核苷酸和/或其药物组合物而得到预防和/或治疗的疾病或病症的药物组合物中的应用。
更特别地，本发明涉及本发明的多肽或编码其的核苷酸在制备用于预防和/或治疗与c-Met相关的疾病和病症、且特别是用于预防和治疗本发明列出的一种或多种疾病和病症的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于预防和/或治疗与c-Met相关的疾病和病症的方法，其中施用编码的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽。本发明涉及本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽，其用于预防和/或治疗与c-Met相关的疾病和病症。
本发明还涉及本发明的多肽或编码其的核苷酸在制备用于减少和/或抑制患有多发性骨髓瘤的受试者中的骨髓瘤细胞增殖的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于减少和/或抑制患有多发性骨髓瘤的受试者中的骨髓瘤细胞增殖的方法，其中施用本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽。本发明涉及本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽，其用于减少和/或抑制患有多发性骨髓瘤的受试者中的骨髓瘤细胞增殖。在优选的方面中，骨髓瘤细胞增殖减少30%以上、40%以上、50%以上、优选地60%以上、70%以上、或者甚至80%以上、90%以上、最优选地减少100%。
本发明还涉及本发明的多肽或编码其的核苷酸在制备用于减少和/或抑制患有多发性骨髓瘤的受试者中的骨髓瘤细胞迁移的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于减少和/或抑制患有多发性骨髓瘤的受试者中的骨髓瘤细胞迁移的方法，其中施用本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽。发明涉及本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽，其用于减少和/或抑制患有多发性骨髓瘤的受试者中的骨髓瘤细胞迁移。在优选的方面中，骨髓瘤细胞迁移减少30%以上、40%以上、50%以上、优选地60%以上、70%以上、或者甚至80%以上、90%以上、最优选地减少100%。
在本发明中，本发明人首次观察到抗-c-MetISVDs，如抗-c-Met纳米抗体，能够逆转HGF-诱导的成骨细胞发生（osteoblastogenesis）。因此，本发明还专注于抗-c-MetISVDs的这种新应用，所述抗-c-MetISVDs包括本发明的多肽以及前述抗-c-MetISVDs（例如，如在WO2012/042026中所述）。因此，本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）或编码其的核苷酸在制备用于预防和/或治疗患有骨转移癌（包括多发性骨髓瘤）的受试者中的骨骼疾病的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于预防和/或治疗患有骨转移癌（包括多发性骨髓瘤）的受试者中的骨骼疾病的方法，其中施用抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）。本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）用于预防和/或治疗患有骨转移癌（包括多发性骨髓瘤）的受试者中的骨骼疾病。
本发明还涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）或编码其的核苷酸在制备用于逆转和/或完全消除患有骨转移癌（包括多发性骨髓瘤）的受试者中HGF对骨形成的抑制作用的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于逆转和/或完全消除患有骨转移癌（包括多发性骨髓瘤）的受试者中HGF对骨形成的抑制作用的方法，其中施用抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）。本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽），其用于逆转和/或完全消除患有骨转移癌（包括多发性骨髓瘤）的受试者中HGF对骨形成的抑制作用。
本发明还涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）或编码其的核苷酸在制备用于逆转和/或完全消除HGF对（骨形态生成蛋白（BMP）诱导的）成骨细胞发生的抑制作用的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于逆转和/或完全消除HGF对（骨形态生成蛋白（BMP）诱导的）成骨细胞发生的抑制作用的方法，其中施用抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）。本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽），其用于逆转和/或完全消除HGF对（骨形态生成蛋白（BMP）诱导的）成骨细胞发生的抑制作用（例如，如通过成骨细胞分化测定或ALP测定测量的，如Standal等，Blood（血液）2007年4月1日；109(7):3024-30所述）。在优选的方面中，HGF对（骨形态生成蛋白（BMP）诱导的）成骨细胞发生的抑制作用被逆转30%以上、40%以上、50%以上、优选地60%以上、70%以上、或者甚至80%以上、90%以上、最优选地被逆转100%。
本发明还涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）或编码其的核苷酸在制备用于逆转和/或完全消除HGF对碱性磷酸酶（ALP）（的BMP-诱导的表达）的抑制作用的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于逆转和/或完全消除HGF对碱性磷酸酶（ALP）（的BMP-诱导的表达）的抑制作用的方法，其中施用抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）。本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽），其用于逆转和/或完全消除HGF对碱性磷酸酶（ALP）（的BMP-诱导的表达）的抑制作用（例如，如通过ALP测定测量的，如Standal等，Blood（血液）2007年4月1日；109(7):3024-30所述）。在优选的方面中，HGF对碱性磷酸酶（ALP）（的BMP-诱导的表达）的抑制作用被逆转30%以上、40%以上、50%以上、优选地60%以上、70%以上、或者甚至80%以上、90%以上、最优选地被逆转100%。
本发明还涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）或编码其的核苷酸在制备用于逆转和/或完全消除HGF对成骨细胞矿化的抑制作用的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于逆转和/或完全消除HGF对成骨细胞矿化的抑制作用的方法，其中施用抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）。本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽），其用于逆转和/或完全消除HGF对成骨细胞矿化的抑制作用（例如，如通过成骨细胞分化测定、ALP测定或茜素红-s（ARS）的定量+显现测量的，如Standal等，Blood（血液）2007年4月1日；109(7):3024-30所述）。在优选的方面中，HGF对成骨细胞矿化的抑制作用被逆转30%以上、40%以上、50%以上、优选地60%以上、70%以上、或者甚至80%以上、90%以上、最优选地被逆转100%。
本发明还涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）或编码其的核苷酸在制备用于逆转和/或完全消除HGF对成骨细胞特异性转录因子Runx2和/或Osterix的（BMP诱导的）表达的抑制作用的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于逆转和/或完全消除HGF对成骨细胞特异性转录因子Runx2和/或Osterix的（BMP诱导的）表达的抑制作用的方法，其中施用抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）。本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽），其用于逆转和/或完全消除HGF对成骨细胞特异性转录因子Runx2和/或Osterix的（BMP诱导的）表达的抑制作用（例如，如通过在C2C12细胞中表达Runx或OsterixmRNA测量的，如Standal等，Blood（血液）2007年4月1日；109(7):3024-30所述）。在优选的方面中，HGF对成骨细胞特异性转录因子Runx2和/或Osterix的（BMP诱导的）表达的抑制作用被逆转30%以上、40%以上、50%以上、优选地60%以上、70%以上、或者甚至80%以上、90%以上、最优选地被逆转100%。
本发明还涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）或编码其的核苷酸在制备用于逆转和/或完全消除HGF对受体激活的Smads的（BMP诱导的）核易位的抑制作用的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于逆转和/或完全消除HGF对受体激活的Smads的（BMP诱导的）核易位的抑制作用的方法，其中施用抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）。本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽），其用于逆转和/或完全消除HGF对受体激活的Smads的（BMP诱导的）核易位的抑制作用（例如，如通过共聚焦显微镜或使用Smad-驱动的BMP受体构建体测量的，如Standal等，Blood（血液）2007年4月1日；109(7):3024-30所述）。在优选的方面中，HGF对受体激活的Smads的（BMP诱导的）核易位的抑制作用被逆转30%以上、40%以上、50%以上、优选地60%以上、70%以上、或者甚至80%以上、90%以上、最优选地被逆转100%。
本发明还涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）或编码其的核苷酸在制备用于逆转和/或完全消除HGF对BMP-2信号传导的抑制作用的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于逆转和/或完全消除HGF对BMP-2信号传导的抑制作用的方法，其中施用抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）。本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽），其用于逆转和/或完全消除HGF对BMP-2信号传导的抑制作用。
本发明还涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）或编码其的核苷酸在制备用于抑制HGF-诱导的成骨细胞前体或成骨细胞的趋化性、增殖和激活的药物组合物中的应用。因此，本发明涉及用于抑制HGF对成骨细胞的作用的方法，其中施用抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽）。本发明涉及抗-c-MetISVD（诸如，例如，本发明的多肽），其用于抑制HGF对成骨细胞的作用（如在Grano等，1996，ProcNatlAcadSciUSA（美国国家科学院学报）93(15):7644-8中所述）。
同样地，在这样的药物组合物中，所述一种或多种本发明的多肽、或编码其的核苷酸和/或其药物组合物还可以适当地与一种或多种其他活性成分（如本发明提及的那些）组合。
本发明还涉及组合物（诸如，不限于，本文进一步所述的药物组合物或制剂）在体外（例如，在体外或细胞测定法中）或体内（例如，在单个细胞中或在多细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人中，诸如在有危险患有或患有本发明的疾病或病症的人中）的应用。
在本发明的内容中，“调节”或“要调节”通常意指减少或抑制c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定（如本文提及的那些）测量的。特别地，与在相同的条件下而不存在本发明的多肽的条件下的相同的测定中c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的活性相比，c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的活性被减少或抑制至少1%、优选至少5%、诸如至少10%或至少25%、例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或90%以上，如使用适当的体外、细胞或体内测定（如本文提及的那些）测量的。
例如，调节可以包括减少或抑制c-Met与其底物或配体之一的结合和/或与天然配体(HGF)、底物竞争与c-Met的结合。备选地，调节可以包括抑制内在化、诱导内在化，从而减少c-Met水平，并且因此减少c-Met的信号传导、同源二聚体化和/或促进c-Met的释放（shedding），并且因此可以抑制HGF依赖性的和/或HGF不依赖性的c-Met激活。
1.7产生本发明的多肽和/或其他生物物质
本发明还涉及用于制备或产生本文所述的免疫球蛋白单可变结构域、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法。通过本文进一步的描述，所述方法的一些优选的而非限制性的实例将变得清楚。
通常，这些方法可以包括下述步骤：
a)提供免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库；和
b)从所述免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库中筛选可以结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的免疫球蛋白单可变结构域；并且
c)分离所述可以结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的氨基酸序列。
在这样的方法中，所述免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以是免疫球蛋白单可变结构域的任意适当的组、集合或文库。例如，所述免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列（如本文定义）的组、集合或文库，诸如首次用于实验的免疫球蛋白序列的组、集合或文库；合成的或半合成的免疫球蛋白序列的组、集合或文库；和/或已经进行了亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合或文库。
此外，在这样的方法中，所述免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以是重链或轻链可变结构域（诸如VL-,VH-或VHH结构域，优选VHH结构域）的组、集合或文库。例如，所述免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以是结构域抗体或单结构域抗体的组、集合或文库，或可以是能够作用为结构域抗体或单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库。
在这种方法的优选方面中，所述免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列的免疫组、集合或文库，例如，来自已经用c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)适当免疫的哺乳动物、或用基于其（诸如例如，在实验部分所述，参见人c-Met/Fc嵌合体(SEQIDNO:2)）或来源于其的适当的抗原决定簇（诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其他表位）适当免疫的哺乳动物的免疫球蛋白序列的免疫组、集合或文库。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其他细胞外表位。
在上述方法中，所述免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物（诸如酵母）上，以促进筛选。用于展示和筛选免疫球蛋白单可变结构域（的组、集合或文库）的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如，基于本文进一步的公开内容。还参考Hoogenboom在NatureBiotechnology（自然生物技术）,23:1105-1116(2005)中的综述。
在另一个方面中，所述用于产生免疫球蛋白单可变结构域的方法包括至少下列步骤：
a)提供表达免疫球蛋白单可变结构域的细胞的集合或样品；和
b)从所述细胞集合或样品中筛选表达可以结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的氨基酸序列的细胞；和
c)(i)分离所述氨基酸序列；或(ii)从所述细胞分离编码所述氨基酸序列的核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
在另一个方面中，用于产生针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的氨基酸序列的方法可以包括至少下列步骤：
a)提供编码免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列的组、集合或文库；
b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的氨基酸序列的核酸序列；和
c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
在这样的方法中，所述编码免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列的组、集合或文库可以是，例如，编码首次用于实验的免疫球蛋白序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码合成的或半合成的免疫球蛋白序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经进行了亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。
在另一个方面中，用于产生针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的氨基酸序列的方法可以包括至少下列步骤：
a)提供编码免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列的组、集合或文库；
b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码这样的氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列可以结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力，并且其被交叉阻断或交叉阻断本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽，例如，SEQIDNO:s7-12,103-111,113,188和142-150,优选SEQIDNO:s7,106,113,188,143,146和147；和
c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
在优选的方面中，用于产生针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的氨基酸序列的方法可以包括至少下列步骤：
a)提供VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库；和
b)从所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库中筛选可以结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的免疫球蛋白单可变结构域；和
c)分离所述可以结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的氨基酸序列。
在这样的方法中，所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以是任何适当的免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库。例如，所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列(如本文所述)的组、集合或文库，诸如首次用于实验的免疫球蛋白序列的组、集合或文库；合成的或半合成的免疫球蛋白序列的组、集合或文库；和/或已经进行了亲和力成熟的VHH1型免疫球蛋白序列的组、集合或文库。在优选的方面中，所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以是免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库(如本文所述)，诸如合成的VHH1型免疫球蛋白序列的组、集合或文库。在上述方法中，所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库可以展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物（诸如酵母）上，以促进筛选。用于展示和筛选免疫球蛋白单可变结构域（的组、集合或文库）的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，诸如，例如，由Knappik等，J.Mol.Biol.（分子生物学杂志）2000年2月11日,296:57-86所述。
用于展示和筛选VHH1型免疫球蛋白单可变结构域（的组、集合或文库）的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如，基于本文进一步的公开内容。还参考Hoogenboom在NatureBiotechnology（自然生物技术）,23:1105-1116(2005)中的综述。
本发明还涉及通过上述方法、或备选地通过包括上述方法之一和另外至少下列步骤的方法获得的免疫球蛋白单可变结构域，所述步骤为：确定所述免疫球蛋白序列的核苷酸序列或氨基酸序列；和以本身已知的方式，如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体内表达或通过化学合成，表达或合成所述氨基酸序列。
此外，按照上述步骤，本发明的一种或多种免疫球蛋白单可变结构域可以被适当地人源化、骆驼源化或另外序列优化（例如，为制备性、稳定性和/或溶解性进行序列优化）；和/或这样获得的氨基酸序列可以与一个或多个其他适当的免疫球蛋白单可变结构域彼此连接（任选地通过一个或多个适当的接头），以提供本发明的多肽。此外，编码本发明的氨基酸序列的核酸序列可以被适当地人源化、骆驼源化或另外序列优化（例如，为制备性、稳定性和/或溶解性进行序列优化）并且适当地表达；和/或编码本发明的氨基酸序列的一种或多种核酸序列可以与一种或多种编码其他适当的免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列彼此连接（任选地通过编码一个或多个适当的接头的核苷酸序列），然后可以适当地表达这样获得的核苷酸序列，以提供本发明的多肽。
本发明进一步涉及本文所述的免疫球蛋白单可变结构域、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用，以及涉及用于诊断、预防和/或治疗与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)相关的疾病和病症的方法。通过本文进一步的描述，一些优选的而非限制性的应用和用途将变得清楚。
本发明还涉及本文所述的免疫球蛋白单可变结构域、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物，其用于治疗。
特别地，本发明还涉及本文所述的免疫球蛋白单可变结构域、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物，其用于可以通过给有此需要的受试者施用（药物有效量的）本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体或多肽而得到预防或治疗的疾病或病症的治疗。
更具体地，本发明涉及本文所述的免疫球蛋白单可变结构域、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物，其用于癌症的治疗。
1.8本发明的多肽和其他生物材料的变体
本发明的多肽和（形成本发明的多肽的一部分的）免疫球蛋白单可变结构域可以被改变，以进一步改善效力或其他需要的特性。
通常，免疫球蛋白单可变结构域可以定义为具有式1的多肽：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3。
CDR序列的一些特别优选的而非限制性的组合，以及CDR序列和构架序列的优选的组合在下表B-2或A-2中提及，其列出了在多种优选的（但非限制性的）本发明的免疫球蛋白单可变结构域中存在的CDR序列和构架序列。技术人员应该清楚的，通常优选存在于同一克隆中的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合（即，在表B-2或A-2中同一行或同一排中提及的CDR1、CDR2和CDR3序列）（尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，并且还包括在表B-2或A-2中提及的CDR序列的其他适当的组合）。此外，通常优选存在于同一个克隆中的CDR序列和构架序列的组合（即，在表B-2或A-2中同一行或同一排所提及的CDR序列和构架序列）（尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，并且还包括在表B-2或A-2中提及的CDR序列和构架序列的其他适当的组合，以及所述CDR序列与其他适当的构架序列的组合，例如，如本文进一步所述）。
此外，在本发明的包含表B-2中提及的CDRs组合的免疫球蛋白单可变结构域中，每个CDR可以被选自由与所提及的CDRs具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性(如本文定义)的免疫球蛋白单可变结构域组成的组的CDR替换，其中：
i)与表B-2中提及的相对应的CDR序列相比，在所述CDR中的任何氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代（如本文定义）；和/或
ii)与表B-2中提及的相对应的CDR序列相比，任意所述CDR序列优选地仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸缺失或插入；和/或
iii)任意所述CDR序列是通过本身已知的亲和力成熟技术衍生的，并且特别是起始于表B-2中提及的相对应的CDR序列。
然而，如技术人员应该清楚的，表B-2中提及的CDR序列（的组合）以及CDR序列和构架序列（的组合）一般是优选的。
因此，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个适当地分别选自由表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组；或分别选自分别与表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的“序列同一性”(如本文定义)的CDR1、CDR2和CDR3序列的组；和/或分别选自由分别与表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个具有3、2或仅1个“氨基酸差异”(如本文定义)的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
在该情形中，“适当地选自”意指，适当地，分别地，CDR1序列选自适当的CDR1序列(即如本文定义),CDR2序列选自适当的CDR2序列(即如本文定义),CDR3序列选自适当的CDR3序列(即如本文定义)。更具体地，CDR序列优选地这样选择，以使本发明的免疫球蛋白单可变结构域以如本文定义的亲和力（适当地测量的和/或表示为EC50值，或者备选地作为IC50值,如本文在多种体外和/或体内效力或其他测定中进一步所述）结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。
具体地，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表B-2中列出的CDR3序列组成的组，或选自由与表B-2中列出的CDR3序列中的至少一个具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR3序列组成的组，和/或选自由与表B-2中列出的至少一个CDR3序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR3序列组成的组。
优选地，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少两个分别适当地选自由表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组，或分别选自由分别与表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一种具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组；和/或分别选自由分别与表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一种具有3、2或仅1个“氨基酸差异”的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
具体地，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表B-2中列出的CDR3序列组成的组，或选自分别与表B-2中列出的至少一个CDR3序列具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR3序列的组，并且，存在的CDR1和CDR2序列中的至少一种适当地选自分别由表B-2中列出的CDR1和CDR2序列组成的组，或分别选自分别与表B-2中列出的CDR1和CDR2序列中的至少一种具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR1和CDR2序列的组；和/或分别选自由分别与表B-2中列出的CDR1和CDR2序列中的至少一种具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
最优选地，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，存在的所有三个CDR1、CDR2和CDR3序列分别适当地选自由表B-2列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组，或分别选自分别与表B-2列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一种具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列的组；和/或分别选自由分别与表B-2列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一种具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个分别适当地选自由表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在这一方面，存在的另两个CDR序列中的至少一个或优选地两个分别适当地选自与表B-2中列出的至少一个相对应的CDR序列具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR序列；和/或分别选自由与表B-2中列出的至少一个相对应的序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
具体地，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表B-2中列出的CDR3组成的组。优选地，在这一方面，存在的CDR1和CDR2序列中的至少一个且优选地两个分别适当地选自分别与表B-2中列出的CDR1和CDR2序列具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR1和CDR2序列的组；和/或分别选自由分别与表B-2中列出的至少一个CDR1和CDR2序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少两种分别适当地选自由表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在这一方面，存在的其余的CDR序列适当地选自与表B-2中列出的至少一种相对应的CDR序列具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR序列的组；和/或选自由与表B-2中列出的至少一种相对应的序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
具体地，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，至少CDR3序列适当地选自由表B-2中列出的CDR3序列组成的组，并且所述CDR1序列或所述CDR2序列分别适当地选自由表B-2中列出的CDR1和CDR2序列组成的组。优选地，在这一方面，存在的其余的CDR序列适当地选自与表B-2中列出的至少一种相对应的CDR序列具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR序列的组；和/或选自由与表B-2中列出的相对应的序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的免疫球蛋白单可变结构域中，存在的所有三个CDR1、CDR2和CDR3序列分别适当地选自由表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。
此外，通常，表B-2中列出的CDR’s的组合（即，在表B-2中同一行或同一排上提及的那些）是优选的。因此，当本发明的免疫球蛋白单可变结构域中的CDR是表B-2中提及的CDR序列或适当地选自与表B-2中提及的CDR序列具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR序列的组；和/或选自由与表B-2中提及的CDR序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组时，通常优选其余CDR’s中的至少一个且优选两个适当地选自属于表B-2中的同一组合的CDR序列（即，在表B-2的同一行或同一排上提及的）或适当地选自与属于同一组合的CDR序列具有至少80%、优选至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列同一性的CDR序列的组，和/或选自由与属于同一组合的CDR序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。在上述段落中提及的其他优选性也适用于表B-2中提及的CDRs的组合，例如，在表B-2中同一排上提及的CDRs的组合。
因此，通过非限制性实例的方式，例如，本发明的多肽可以包含与表B-2中的提及的CDR1序列中的一种具有大于80%的序列同一性的CDR1序列，与表B-2中的提及的CDR2序列中的一种（但是属于不同的组合，例如，在表B-2中不同排上提及）具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列，和CDR3序列。
例如，本发明的一些优选的免疫球蛋白单可变结构域可以包含：(1)与表B-2中的提及的CDR1序列中的一种具有大于80%的序列同一性的CDR1序列；与表B-2中的提及的CDR2序列中的一种（但是属于不同的组合，例如，在表B-2中不同排上提及）具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表B-2中的提及的CDR3序列中的一种（但是属于不同的组合，例如，在表B-2中不同排上提及）具有大于80%的序列同一性的CDR3序列；或者(2)与表B-2中的提及的CDR1序列中的一种具有大于80%的序列同一性的CDR1序列；CDR2序列和表B-2种列出的一种CDR3序列；或者(3)CDR1序列；与表B-2中的提及的CDR2序列中的一种具有大于80%的序列同一性的CDR2序列；和与表B-2中提及的与所述CDR2序列属于同一组合的CDR3序列具有3、2或1个氨基酸差异的CDR3序列。
例如，本发明的一些特别优选的免疫球蛋白单可变结构域可以包含：(1)与表B-2中的提及的CDR1序列中的一种具有大于80%的序列同一性的CDR1序列；与表B-2中提及的属于同一组合的CDR2序列具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表B-2中提及的属于同一组合的CDR3序列具有大于80%的序列同一性的CDR3序列；(2)CDR1序列；表B-2中列出的CDR2和表B-2中列出的CDR3（其中CDR2序列和CDR3序列可以属于不同的组合）。
例如，本发明的一些甚至更优选的免疫球蛋白单可变结构域可以包含：(1)与表B-2中的提及的CDR1序列中的一种具有大于80%的序列同一性的CDR1序列；表B-1中列出的属于同一组合的CDR2序列；和表B-2中提及的属于不同一组合的（例如，在表B-2中不同排上提及的）CDR3序列；或(2)表B-2中提及的CDR1序列；与表B-2中提及的属于同一组合的CDR2序列具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表B-2中列出的属于相同或不同组合的CDR3序列具有大于80%的序列同一性的CDR3序列。
例如，本发明的特别优选的免疫球蛋白单可变结构域可以包含：表B-2中的提及的CDR1序列，与表B-2中提及的属于同一组合的CDR2序列具有大于80%的序列同一性的CDR2序列；和表B-2中提及的属于同一组合的CDR3序列。
在本发明的最优选的免疫球蛋白单可变结构域中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列分别适当地选自表B-2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合中的一种。
按照本发明的另一个优选的而非限制性的方面，(a)CDR1具有1-12个氨基酸残基的长度，并且通常2-9个氨基酸残基，诸如5,6或7个氨基酸残基的长度；和/或(b)CDR2具有13-24个氨基酸残基的长度，并且通常15-21个氨基酸残基，诸如16和17个氨基酸残基的长度；和/或(c)CDR3具有2-35个氨基酸残基的长度，并且通常3-30个氨基酸残基，诸如6-23个氨基酸残基的长度。
在另一个优选的而非限制性的方面，本发明涉及这样的免疫球蛋白单可变结构域，其中CDR序列(如本文定义)与SEQIDNO:s23-29,102和187、优选SEQIDNO:26和/或187中的至少一种免疫球蛋白单可变结构域具有大于80%、优选大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更多的序列同一性(如本文定义)。
本发明的另一个优选的而非限制性的方面涉及SEQIDNO:s23-29,102和187、优选SEQIDNO:26和/或187的免疫球蛋白单可变结构域的人源化变体，与相对应的天然VHH序列相比，其包含至少一个人源化的取代(如本文定义)，并且具体是在其至少一个构架序列(如本文定义)中的至少一个人源化取代。
本领域技术人员应该清楚，本文提及为“优选的”（或“更优选的”、“甚至更优选的”等）免疫球蛋白单可变结构域也优选的（或更优选的、或甚至更优选的等）用于本文所述的多肽。因此，包含一个或多个本发明的“优选的”免疫球蛋白单可变结构域或基本上由一个或多个本发明的“优选的”免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽通常是优选的，并且包含一个或多个“更优选的”本发明的免疫球蛋白单可变结构域或基本上由一个或多个“更优选的”本发明的免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽通常是更优选的，等等。
1.9本发明的核酸序列和宿主细胞
本发明的另一个方面涉及编码本发明的氨基酸序列（诸如本发明的免疫球蛋白单可变结构域）或包含其的本发明的多肽的核酸。同样地，如本文关于本发明的核酸一般所述，所述核酸可以是遗传构建体的形式，如本文定义。在实验部分提供了本发明的这一方面的具体的实施方案，SEQIDNO:s30-42，优选SEQIDNO:30。
在另一个优选的而非限制性的方面，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列，其中所述序列(如本文定义)与SEQIDNO:s30-42中的至少一种免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列的序列、优选SEQIDNO:30具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更多的序列同一性(如本文定义)。
在另一个方面，本发明涉及包含免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列的核酸序列，其中所述序列(如本文定义)与SEQIDNO:s30-42中的至少一种免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列的序列、优选SEQIDNO:30具有大于80%、优选地大于90%、更优选地大于95%、诸如99%或更多的序列同一性(如本文定义)。
在另一个方面，本发明涉及表达或能够表达本发明的氨基酸序列(诸如免疫球蛋白单可变结构域)和/或包含其的本发明的多肽的宿主或宿主细胞；和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本文进一步的描述，所述宿主或宿主细胞的一些优选的而非限制性的实例将变得清楚。
技术人员应该清楚的，一种特别有用的用于制备本发明的多肽的方法通常包括下述步骤：
i)在适当的宿主细胞或宿主生物体（在本文中也称为“本发明的宿主”）中或在另一种适当的表达系统中表达编码所述氨基酸序列、本发明的多肽的核酸（在本文中也称为“本发明的核酸”），任选地接着进行：
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的多肽。
具体地，所述方法可以包括下述步骤：
i)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以使所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的多肽；任选地接着进行：
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的多肽。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA（诸如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA）。
根据本发明的一个方面，本发明的核酸是基本上分离的形式，如本文所定义。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于载体中和/或是载体的一部分，诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。
基于本文给出的关于用于本发明的多肽的免疫球蛋白单可变结构域的信息，本发明的核酸可以以本身已知的方法制备或获得，和/或可以从适当的天然来源分离。为了提供类似物，例如，编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列可以进行位点定向诱变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。并且，专业技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少一种编码本发明的多肽的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，还可以以适当的方式连接在一起。
用于产生本发明的核酸的技术应该是专业技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动DNA合成；位点定向诱变；将两个或多个天然存在的和/或合成的序列（或者其两个或更多个部分）组合，引入引起剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点（例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区），和/或通过使用一个或多个“错配”引物，使用例如c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的天然存在形式的序列作为模板的PCR反应的方法引入突变。这些以及其他技术应该是专业技术人员所清楚的，并且参考也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于遗传构建体中和/或是遗传构建体的一部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的，并且如WO08/020079第131-134页所述（通过引用结合在本文中）。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与本身已知的一个或多个遗传构建体元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调节元件（诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等）和本文提到的其他遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适于意欲的宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，适于整合到要用的宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达（例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中）的载体。
在一个优选的但非限制性的方面中，本发明的遗传构建体包括：
i)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接
ii)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；
并且任选地还有
iii)本身已知的一个或多个其他遗传构建体元件；
其中术语“可操作性地连接”和“可操作性连接”具有WO08/020079第131-134页给出的意思；并且其中“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“其他元件”如WO08/020079第131-134页所述；并且其中遗传构建体可以进一步如WO08/020079第131-134页所述。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即，用于表达和/或产生本发明的多肽。适当的宿主或宿主细胞是技术人员所清楚的，并且，例如，可以是任意适当的真菌、原核或真核细胞或细胞系或可以是任意适当的真菌、原核或真核生物体，例如，WO08/020079第134和135页所述的那些，以及本身已知的用于表达和产生抗体和抗体片段（包括但不限于（单）结构域抗体和ScFv片段）的其他宿主或宿主细胞，这将是技术人员所清楚的。参考还参见本文上文中引用的一般背景，以及参见例如，WO94/29457,WO96/34103和WO99/42077。
例如，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽还可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中（对于将转基因引入哺乳动物的通用技术参见例如US-A-6,741,957,US-A-6,304,489和US-A-6,849,992），在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果实、种子、根或块茎（例如在烟草、玉米、大豆或苜蓿中），或者例如在蚕家蚕（Bombixmori）的蛹中。
此外，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽还可以在不含细胞的表达系统中表达和/或生产，并且这样的系统的适当的实例应该是专业技术人员所清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在麦芽胚系统中的表达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或者在大肠杆菌（E.coli）Zubay系统中表达。
如上文提及，应用免疫球蛋白单可变结构域的一个优点在于，基于此的多肽可以通过在适宜的细菌系统中表达而制备，并且适宜的细菌表达系统、载体、宿主细胞、调节元件等对专业技术人员是清楚的，例如参考上文引用的参考文献。然而，应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表达。
优选地，在本发明中，应用（体内或体外）表达系统，诸如细菌表达系统，其提供适于药用的形式的本发明的多肽，并且所述表达系统也是专业技术人员所清楚的。专业技术人员还应该清楚，适于药用的本发明的多肽可以使用肽合成技术制备。
对于工业规模的生产，用于免疫球蛋白单可变结构域或包含免疫球蛋白单可变结构域的蛋白治疗物的（工业）生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）、酿酒酵母（S.cerevisiae）的菌株，其适用于大规模表达/生产/发酵，并且特别适用于大规模制药（即，GMP级别）表达/生产/发酵。所述菌株的适当的实例是专业技术人员所清楚的。所述菌株以及生产/表达系统也可从公司诸如RichterHelm(Hamburg,德国)或CMCBiologics(Soeborg,丹麦)获得。
备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，并且特别用于大规模制药表达/生产/发酵。并且，所述表达/生产系统也可从上文提及的一些公司获得。
具体的表达系统的选择部分取决于特定的翻译后修饰的需要，更具体地是糖基化的需要。生产包含免疫球蛋白单可变结构域的重组蛋白（对于所述重组蛋白糖基化是理想的或者必需的）将使得应用具有将所表达的蛋白糖基化的能力的哺乳动物表达宿主成为必要。在这一方面，专业技术人员应该清楚，获得的糖基化模式（即，附着的残基的种类、数量和位置）将取决于用于表达的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系（即，形成基本上具有人糖基化模式的蛋白），或者使用另一种哺乳动物细胞系，其可以提供基本上和/或功能上与人糖基化作用相同的糖基化模式或者至少模拟人糖基化作用。一般地，原核宿主诸如大肠杆菌不具有将蛋白糖基化的能力，并且应用低等真核细胞诸如酵母通常导致与人糖基化作用不同的糖基化模式。不过，应该理解，取决于要获得的理想的多肽，所有前述宿主细胞和表达系统可以用于本发明。
因此，根据本发明的一个非限制性方面，本发明的多肽被糖基化。根据本发明的另一个非限制性方面，本发明的多肽未被糖基化。
根据本发明的一个优选的但非限制性的方面，本发明的多肽在细菌细胞中生产，特别是在适于大规模制药生产的细菌细胞，诸如上文提及的菌株的细胞中生产。
根据本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的多肽在酵母细胞中生产，特别是在适于大规模制药生产的酵母细胞，诸如上文提及的物种的细胞中生产。
根据本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的多肽在哺乳动物细胞中生产，特别是在人细胞或人细胞系的细胞中，并且更特别是在适于大规模制药生产的人细胞或人细胞系的细胞中，诸如上文提及的细胞系中生产。
如在WO08/020079第138和139页进一步所述，当应用在宿主细胞中的表达来生产本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽时，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以在细胞内产生（例如，在细胞溶质中，在周质或在内含体中），然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生（例如，在培养所述宿主细胞的培养基中），然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。因此，根据本发明的一个非限制性方面，本发明的多肽是在细胞内产生并且从宿主细胞分离，并且特别是从细菌细胞或者从细菌细胞中的内含体中分离的氨基酸序列、多肽。根据本发明的另一个非限制性的方面，本发明的氨基酸序列或多肽是在细胞外产生并且从培养宿主细胞的培养基中分离的氨基酸序列或多肽。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括在WO08/020079第139和140页提及的那些。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括在WO08/020079的第140页提及的那些。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适宜的技术对专业技术人员是清楚的，并且可以取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。参考也参见上文提及的手册和专利申请。
转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化了本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本发明的氨基酸序列的步骤，例如，使用特异的抗体进行。
转化的宿主细胞（其可以是稳定的细胞系的形式）或宿主生物体（其可以是稳定的突变系或株系的形式）形成本发明的另一方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者（至少）能够表达（例如，在适宜的条件下）本发明的多肽（并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中表达）。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其他世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
为了生产/获得本发明的免疫球蛋白单可变结构域的表达，所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物体通常可以在本发明（理想的）氨基酸序列或多肽得到表达/生产的条件下保存、维持和/或培养。适宜的条件对专业技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取决于控制本发明的（相关）核苷酸序列表达的调节元件。此外，参考参见在上文关于本发明的遗传构建体段落中提及的手册和专利申请。
一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因子或化合物（例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中）；所有这些可以由专业技术人员选择。此外，在这样的条件下，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导时表达。
专业技术人员还应该清楚，本发明的氨基酸序列或多肽可以（首先）以不成熟的形式（如上文提及）产生，其然后可以进行翻译后修饰，这取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。并且，本发明的氨基酸序列或多肽可以被糖基化，这也取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。
然后，本发明的氨基酸序列或多肽可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如（制备级）层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术（例如，使用与本发明的氨基酸序列或多肽融合的特异性的、可裂解的氨基酸序列）和/或制备级免疫学技术（即，使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体）进行。
1.10评估对治疗的响应性的方法和试剂盒
本发明涉及用于评估患有c-Met相关的疾病或病症的患者对给定治疗的响应性的方法。本发明人令人惊讶地发现定量在治疗开始之前和之后采集的患者样品中的可溶性c-Met水平是患者对所述治疗的响应性的指示。因此，本发明提供用于评估患有c-Met相关的疾病或病症的患者对治疗的响应性的体外方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供在治疗前来自所述患者的第一样品，并且测量所述第一样品中的可溶性c-Met的量，
b)提供在开始治疗后来自所述患者的第二样品，并且测量所述第二样品中可溶性c-Met的量，
c)将在所述第一样品中存在的可溶性c-Met的量与在所述第二样品中存在的可溶性c-Met的量进行比较；
其中与在所述第一样品中的可溶性c-Met的量相比，在所述第二样品中的可溶性c-Met的量的减少表示所述患者对所述治疗有响应。
本领域的技术人员应该认识到上述方法中的术语“治疗”可以包括能够调节c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)-介导的信号传导的任意c-Met拮抗剂，诸如在本文所述的疾病和现有技术中提及的那些。优选地，所述c-Met拮抗剂是抗-c-Met抗体。更优选地，所述c-Met拮抗剂是氨基酸序列，诸如，例如，本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽。具体地，所述c-Met拮抗剂是本发明的纳米抗体，例如，SEQIDNO:23-29,102和187,优选为SEQIDNO:26和/或187(表B-3),或是本发明的多肽或构建体，例如，SEQIDNO:7-12,103-111,113,188和142-150,优选为SEQIDNO:7,106,113,188,143,146和/或147(参见表B-4)。
“患者样品”意指可以测量可溶性c-Met的量的来自患者的任意的细胞、组织或体液的采样。所述患者样品的实例包括，但不限于，组织的活组织检查、血液、血清、血浆、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、粪便样品和尿样。所述样品可以通过多种技术从患者获得，例如，通过静脉穿刺获得。收集多种患者样品的方法在本领域中是公知的。在本发明的具体方面中，患者样品是血浆样品。
本发明的方法可以用来评估治疗前或所述治疗开始之前的第一患者样品，以及所述治疗开始后，例如，在所述治疗过程中和/或在所述治疗之后，来自所述患者的第二样品，以评估例如肿瘤负荷的减少。通过测量由本发明的方法提供的第一和第二患者样品中的可溶性c-Met的量，临床医生能够确定，例如，疾病（例如，癌症）是否已经消退，并且所述患者是否对所述治疗有响应。与在治疗前具有的可溶性c-Met的量相比，在开始治疗后（例如，在治疗过程中和/或在治疗后）癌症已经消退的患者具有减少的可溶性c-Met的量。类似地，在治疗过程中癌症保持稳定的患者与其在治疗前具有相似的可溶性c-Met水平，并且癌症已经进展的患者将具有增加量的可溶性c-Met。临床医生可以进一步利用这些测量来监测所述患者的状态，并且用于适当地定制治疗，从而获得需要的治疗效果，以避免、限制或减少不需要的副作用，和/或实现一方面获得需要的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不需要的副作用之间的适当的平衡。按照本发明使用的治疗方案的有效性可以本身已知的用于所涉及的疾病或病症的任何方式确定和/或跟踪，这是临床医生所清楚的。例如，本发明的方法包括向患者推荐具体的治疗疗程，诸如终止治疗，改变正在施用的药物，改变施用的药物的剂量，或进一步监测所述患者。一般地，将跟踪所述治疗方案直到获得需要的治疗效果和/或只要维持需要的治疗效果，如由临床医生确定的。
本领域可用的用于测量或定量可溶性c-Met的任意方法都可以用来实施本发明。可以在核酸水平或在蛋白水平上检测本发明所述的可溶性c-Met的量。所述方法在本领域中是公知的，并且包括，但不限于，蛋白质印迹，RNA印迹，DNA印迹，免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISAs)，放射性免疫测定，免疫细胞化学，免疫荧光，流式细胞术，化学发光测定，电化学发光测定，核酸杂交技术，核酸反转录方法和核酸扩增方法。优选地，在蛋白水平上检测可溶性c-Met的水平，例如，使用针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的抗体检测。代表性的免疫测定包括使用单克隆或多克隆抗体，所述抗体可以被适当地标记以测量所述患者样品中的可溶性c-Met的量。最优选地，使用MesoScaleDiscovery电化学发光测定或ELISA形式测量可溶性c-Met的水平，如本文所示例的（参见实施例23）。
如上文所述，本发明提供用于测量患者样品中存在的可溶性c-Met的量的诊断方法。因此，本发明还提供用于实施这些方法的试剂盒。具体地，本发明提供用于评估患有c-Met相关的疾病或病症的患者对治疗的响应性的试剂盒，所述试剂盒包括用于测量患者样品中的可溶性c-Met的量的一种或多种试剂，例如，抗体、核酸探针等。用于检测抗体与可溶性c-Met的结合的化学品也可以包括在所述试剂盒中。在ELISA免疫测定形式中用于使用抗体测量可溶性c-Met的量的其他试剂可以进一步包括在本发明的试剂盒中。
备选地，或另外，所述试剂盒还可以用来监测本文所引用的疾病，并且可以包括至少一种本发明所述的免疫球蛋白单可变结构域、多肽或药物组合物。
在本发明的另一方面，所述试剂盒可以包括至少一种本发明所述的免疫球蛋白单可变结构域、多肽或药物组合物以及用于测量患者样品中的可溶性c-Met的量的所有必需的装置和试剂。本发明所述的所有试剂盒可以包括所述项目或项目的组合以及用于其的包装材料。试剂盒还可以包括使用说明书。
在整个本申请中引用的所有参考文献（包括文献参考文献、授权的专利、公布的专利申请和同时待审的专利申请）的完整内容通过引用清楚地结合在本文中，特别是关于其中所引用的教导。
现在将通过下述非限制性的方面、附图和实施例的方式进一步描述本发明。
优选的方面:
方面A-1:免疫球蛋白单可变结构域，其针对和/或其能够特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。
方面A-2:方面A-1所述的免疫球蛋白单可变结构域，其以基本上分离的形式存在。
方面A-3:方面A-1或A-2所述的免疫球蛋白单可变结构域，其用于施用给受试者，其中所述免疫球蛋白单可变结构域不天然存在于所述受试者中。
方面A-4:免疫球蛋白单可变结构域，其能够以10-5-10-12摩尔/升或更小、且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别是前述任一方面所述的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-5:免疫球蛋白单可变结构域，其能够以102M-1s-1-约107M-1s-1、优选地103M- 1s-1-107M-1s-1、更优选地104M-1s-1-107M-1s-1、诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率（kon-速率）特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别是前述任一方面所述的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-6:免疫球蛋白单可变结构域，其能够以1s-1-10-6s-1、优选地10-2s-1-10-6s-1、更优选地10-3s-1-10-6s-1、诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率（koff速率）特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别是前述任一方面所述的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-7:免疫球蛋白单可变结构域，其能够以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM、诸如小于500pM的亲和力特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别是前述任一方面所述的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-8:免疫球蛋白单可变结构域，其能够以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM、诸如小于1nM的平均Ki和50%以上、更优选地75%以上、甚至更优选地80%以上的平均HGF置换特异性置换在c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)上的HGF、且特别是人HGF。所述平均Ki和/或平均置换值可以，例如，在如实验部分所述的测定中确定。
方面A-9:免疫球蛋白单可变结构域，其能够以小于20nM的平均Ki和70%以上的平均HGF置换特异性置换在c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)上的HGF、且特别是人HGF。所述平均Ki和/或平均置换值可以，例如，在如实验部分所述的测定中确定。
方面A-10:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成。
方面A-11:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其为免疫球蛋白序列。
方面A-12:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任意适当的物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列。
方面A-13:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其是人源化的免疫球蛋白序列、骆驼源化的免疫球蛋白序列或是已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。
方面A-14:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)组成；或基本上由重链可变结构域序列(例如，VH-序列)组成。
方面A-15:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或其基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
方面A-16:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由下述组成：结构域抗体(或适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)，"dAb"(或适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域)，纳米抗体(包括，但不限于，VHH序列)，VHH序列(包括，但不限于，VHH1型序列)，或VHH1型序列。
方面A-17:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由纳米抗体组成。
方面A-18:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由纳米抗体组成，所述纳米抗体
i)与SEQIDNO:s23-29,102和/或187中的至少一种免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选地在按照Kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基中的一个或多个选自表A-1中提及的标志残基。
方面A-19:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由免疫球蛋白单可变结构域组成，所述免疫球蛋白单可变结构域
i)与SEQIDNO:26的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选地在按照Kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基中的一个或多个选自表A-1中提及的标志残基。
方面A-20:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由VHH组成，所述VHH是这样的VHH，其与选自具有SEQIDNO:s23-29,102和187、SEQIDNO:26和/或187的免疫球蛋白单可变结构域的组的免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基。
方面A-21:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由人源化的或另外序列优化的免疫球蛋白单可变结构域组成。
方面A-22:前述任一方面中的免疫球蛋白单可变结构域，除了用于结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的至少一个结合位点之外，其还包含一个或多个其他氨基酸序列。
方面A-23:针对和/或能够特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的VHH。
方面A-24:方面A-1的VHH，其以基本上分离的形式存在。
方面A-25:方面A-1或A-2的VHH，其用于施用给受试者，其中所述VHH不天然存在于所述受试者中。
方面A-26:VHH，其能够以10-5-10-12摩尔/升或更小、且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。所述VHH可以特别是前述任一方面所述的VHH。
方面A-27:VHH，其能够以102M-1s-1-约107M-1s-1、优选地103M-1s-1-107M-1s-1、更优选地104M-1s-1-107M-1s-1、诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率（kon-速率）特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。所述VHH可以特别是前述任一方面所述的VHH。
方面A-28:VHH，其能够以1s-1-10-6s-1、优选地10-2s-1-10-6s-1、更优选地10-3s-1-10- 6s-1、诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率（koff速率）特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。所述VHH可以特别是前述任一方面所述的VHH。
方面A-29:VHH，其能够以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM、诸如小于500pM的亲和力特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。所述VHH可以特别是前述任一方面所述的VHH。
方面A-30:VHH，其能够以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM、诸如小于1nM的平均Ki和50%以上、更优选地75%以上、甚至更优选地80%以上的平均HGF置换特异性置换在c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)上的HGF、且特别是人HGF。所述平均Ki和/或平均置换值可以，例如，在如实验部分所述的测定中确定。
方面A-31:VHH，其能够以小于20nM的平均Ki和70%以上的平均HGF置换特异性置换在c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)上的HGF、且特别是人HGF。所述平均Ki和/或平均置换值可以，例如，在如实验部分所述的测定中确定。
方面A-32:前述任一方面中的VHH，其基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成。
方面A-33:前述任一方面中的VHH，其为免疫球蛋白序列。
方面A-34:前述任一方面中的VHH，其是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任意适当的物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列。
方面A-35:前述任一方面中的VHH，其是通过诸如亲和力成熟的技术获得的人源化的VHH。
方面A-36:前述任一方面中的VHH，其基本上由纳米抗体组成或基本上由VHH1型序列组成。
方面A-37:前述任一方面中的VHH，其基本上由VHH1型序列组成。
方面A-38:前述任一方面中的VHH，其基本上由VHH组成，所述VHH
i)与SEQIDNO:s23-29,102和/或187中的至少一种VHHs具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选地在按照Kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基中的一个或多个选自表A-1中提及的标志残基。
方面A-39:前述任一方面中的VHH，其基本上由VHH组成，所述VHH
i)与SEQIDNO:26和/或187的VHH具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选地在按照Kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基中的一个或多个选自表A-1中提及的标志残基。
方面A-40:前述任一方面中的VHH，其基本上由VHH组成，所述VHH是
i)与选自具有SEQIDNO:s23-29,102和187、优选地SEQIDNO:26和/或187的VHH的组的VHH具有至少80%的氨基酸同一性的VHH，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；或是
ii)与具有SEQIDNO:7的VHH具有至少80%的氨基酸同一性的VHH，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基。
方面A-41:前述任一方面中的VHH，其基本上由人源化的或另外序列优化的VHH组成。
方面A-42:前述任一方面中的VHH，除了用于结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的至少一个结合位点之外，其还包含一个或多个其他氨基酸序列，诸如例如，调节EGFR信号传导的多肽和/或调节VEGF信号传导的多肽。
基于CDR的方面
方面B-1:免疫球蛋白单可变结构域，其针对和/或其能够特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，并且其包含一个或多个(优选一个)选自由以下组成的组的氨基酸残基的片段：
a)SEQIDNO:s51-57和158-161，优选SEQIDNO:51,160；
b)与SEQIDNO:s51-57和158-161、优选SEQIDNO:51,160具有至少80%的氨基酸同一性的多肽；
c)与SEQIDNO:s51-57和158-161、优选SEQIDNO:51,160具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；
d)SEQIDNO:s67-73和168-171，优选SEQIDNO:67,170；
e)与SEQIDNO:s67-73和168-171、优选SEQIDNO:67,170具有至少80%的氨基酸同一性的多肽；
f)与SEQIDNO:s67-73和168-171、优选SEQIDNO:67,170具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；
g)SEQIDNO:s83-89和178-181，优选SEQIDNO:83,180；
h)与SEQIDNO:s83-89和178-181、优选SEQIDNO:83,180具有至少80%的氨基酸同一性的多肽；
i)与SEQIDNO:s83-89和178-181、优选SEQIDNO:83,180具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；
或其任意适当的组合。
所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别地是VHH(包括VHH1型序列)或序列优化的VHH，诸如人源化的、稳定化的和/或增溶的VHH。
方面B-2:方面B-1的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述氨基酸残基片段中的至少一个形成用于结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的抗原结合位点的一部分。
方面B-3:免疫球蛋白单可变结构域序列，其针对和/或其能够特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，并且其包含两个以上选自由以下组成的组的氨基酸残基的片段：
a)SEQIDNO:s51-57和158-161，优选SEQIDNO:51,160；
b)与SEQIDNO:s51-57和158-161、优选SEQIDNO:51,160具有至少80%的氨基酸同一性的多肽；
c)与SEQIDNO:s51-57和158-161、优选SEQIDNO:51,160具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；
d)SEQIDNO:s67-73和168-171，优选SEQIDNO:67,170；
e)与SEQIDNO:s67-73和168-171、优选SEQIDNO:67,170具有至少80%的氨基酸同一性的多肽；
f)与SEQIDNO:s67-73和168-171、优选SEQIDNO:67,170具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；
g)SEQIDNO:s83-89和178-181，优选SEQIDNO:83,180；
h)与SEQIDNO:s83-89和178-181、优选SEQIDNO:83,180具有至少80%的氨基酸同一性的多肽；
i)与SEQIDNO:s83-89和178-181、优选SEQIDNO:83,180具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；
以致，(i)当第一氨基酸残基片段对应于a),b)或c)所述的多肽中的一种时，第二氨基酸残基片段对应于d),e),f),g),h)或i)所述的多肽中的一种；(ii)当第一氨基酸残基片段对应于d),e)或f)所述的多肽中的一种时，第二氨基酸残基片段对应于a),b),c),g),h)或i)所述的多肽中的一种；或(iii)当第一氨基酸残基片段对应于g),h)或i)所述的多肽中的一种时，第二氨基酸残基片段对应于a),b),c),d),e)或f)所述的多肽中的一种。
所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别是VHH(包括VHH1型序列)或序列优化的VHH，诸如人源化的、稳定化的和/或增溶的VHH。
方面B-4:方面B-3的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述至少两个氨基酸残基片段形成用于结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的抗原结合位点的一部分。
方面B-5:免疫球蛋白单可变结构域序列，其针对和/或其能够特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，并且其包含三个以上氨基酸残基片段，其中第一氨基酸残基片段选自由以下组成的组：
a)SEQIDNO:s51-57和158-161、优选SEQIDNO:51,160的多肽；
b)与SEQIDNO:s51-57和158-161、优选SEQIDNO:51,160的多肽中的至少一种具有至少80%的氨基酸同一性的多肽；
c)与SEQIDNO:s51-57和158-161、优选SEQIDNO:51,160的多肽中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；
第二氨基酸残基片段选自由以下组成的组：
d)SEQIDNO:s67-73和168-171、优选SEQIDNO:67,170的多肽；
e)与SEQIDNO:s67-73和168-171、优选SEQIDNO:67,170的多肽中的至少一种具有至少80%的氨基酸同一性的多肽；
f)与SEQIDNO:s67-73和168-171、优选SEQIDNO:67,170的多肽中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；
并且第三氨基酸残基片段选自由以下组成的组：
g)SEQIDNO:s83-89和178-181、优选SEQIDNO:83,180的多肽；
h)与SEQIDNO:s83-89和178-181、优选SEQIDNO:83,180的多肽中的至少一种具有至少80%的氨基酸同一性的多肽；
i)与SEQIDNO:s83-89和178-181、优选SEQIDNO:83,180的多肽中的至少一种具有3、2或1个氨基酸差异的多肽。
所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别是VHH(包括VHH1型序列)或序列优化的VHH，诸如人源化的、稳定化的和/或增溶的VHH。
方面B-6:方面B-5的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述至少三个氨基酸残基片段形成用于结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的抗原结合位点的一部分。
方面B-7:免疫球蛋白单可变结构域，其针对和/或其能够特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，其中所述免疫球蛋白单可变结构域的CDR序列与SEQIDNO:s23-29,102和187、优选SEQIDNO:26和/或187中的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种的CDR序列具有至少70%的氨基酸同一性、优选至少80%的氨基酸同一性、更优选地至少90%的氨基酸同一性、诸如95%的氨基酸同一性或更多或者甚至基本上100%的氨基酸同一性。
所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别是VHH(包括VHH1型序列)或序列优化的VHH，诸如人源化的、稳定化的和/或增溶的VHH。
被交叉阻断的或交叉阻断性变体
方面C-1:免疫球蛋白单可变结构域或多肽，其针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，并且其交叉阻断SEQIDNO:s23-29,102和187、优选SEQIDNO:26和/或187中的免疫球蛋白单可变结构域或SEQIDNO:s7-12,103-111,113,188和142-150、优选SEQIDNO:7,106,113,188,143,146和/或147的多肽中的至少一种与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的结合。所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别是方面A-1至A-22和/或方面B-1至B-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域。此外，优选地，所述免疫球蛋白单可变结构域能够特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。
方面C-2:免疫球蛋白单可变结构域或多肽，其针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)，并且其与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的结合被下述中的至少一种阻断：i)SEQIDNO:s23-29,102和187、优选SEQIDNO:26和/或187的免疫球蛋白单可变结构域，或ii)SEQIDNO:s7-12,103-111,113,188和142-150、优选SEQIDNO:7,106,113,188,143,146和/或147的多肽。所述免疫球蛋白单可变结构域可以特别是方面A-1至A-22和/或方面B-1至B-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域。此外，优选地，所述免疫球蛋白单可变结构域能够特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。
方面C-3:方面C-1或C-2的免疫球蛋白单可变结构域或多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断或被交叉阻断的能力在置换测定(例如，如在下述实验部分所述)中检测。
方面C-4:方面C-1至C-3中任一项的免疫球蛋白单可变结构域或多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断或被交叉阻断的能力在实验部分所示的ELISA测定和/或α筛选测定中检测。
方面D-1:方面B-1至B-7或C-1至C-4中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其以基本上分离的形式存在。
方面D-2:方面B-1至B-7,C-1至C-4,和/或D-1中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其用于施用给受试者，其中所述免疫球蛋白单可变结构域不天然存在于所述受试者中。
方面D-3:方面B-1至B-7,C-1至C-4,和/或D-1至D-2中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其能够以10-5-10-12摩尔/升或更小、且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。
方面D-4:方面B-1至B-7,C-1至C-4,和/或D-1至D-3中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其能够以102M-1s-1-约107M-1s-1、优选地103M-1s-1-107M-1s-1、更优选地104M-1s-1-107M- 1s-1、诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率（kon-速率）特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。
方面D-5:方面B-1至B-7,C-1至C-4,和/或D-1至D-4中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其能够以1s-1-10-6s-1、优选地10-2s-1-10-6s-1、更优选地10-3s-1-10-6s-1、诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率（koff速率）特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。
方面D-6:方面B-1至B-7,C-1至C-4,和/或D-1至D-5中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其能够以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM、诸如小于500pM的亲和力特异性结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)。
方面D-1至D-6所述的免疫球蛋白单可变结构域可以特别是方面A-1至A-22所述的免疫球蛋白单可变结构域。
方面E-1:方面B-1至B-7,C-1至C-4和/或D-1至D-6中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其是天然存在的免疫球蛋白单可变结构域(来自任意适当的物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白单可变结构域。
方面E-2:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其是序列优化的。
方面E-3:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D1至D-6,和/或E-1或E-2中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其是被稳定的。
方面E-4:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-3中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任意适当的物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列。
方面E-5:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-4中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其是人源化的免疫球蛋白序列、骆驼源化的免疫球蛋白序列或是已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。
方面E-6:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D1至D-6,和/或E-1至E-5中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)组成；或基本上由重链可变结构域序列(例如，VH-序列)组成。
方面E-7:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-6中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成，或其基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
方面E-8:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-7中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由下述组成：结构域抗体(或适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)，"dAb"(或适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域)或纳米抗体(包括，但不限于，VHH序列或VHH1型序列)。
方面E-9:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-8中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由纳米抗体(包括，但不限于，VHH序列或VHH1型序列)组成。
方面E-10:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-9中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由免疫球蛋白单可变结构域组成，所述免疫球蛋白单可变结构域
i)与本文所述的至少一种免疫球蛋白单可变结构域具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选地在按照Kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基中的一个或多个选自表A-1中提及的标志残基。
方面E-11:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-10中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由免疫球蛋白单可变结构域组成，所述免疫球蛋白单可变结构域
i)与SEQIDNO:s23-29,102和/或187、优选SEQIDNO:26和/或187的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选地在按照Kabat编号的位置11,37,44,45,47,83,84,103,104和108的氨基酸残基中的一个或多个选自表A-1中提及的标志残基。
方面E-12:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-11中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由人源化的免疫球蛋白单可变结构域组成。
方面E-13:方面B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-11中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，除了由CDR序列形成的至少一个用于结合的结合位点之外，其还包含一个或多个用于结合其他抗原、蛋白或靶标的其他结合位点。方面E-1至E-13所述的免疫球蛋白单可变结构域可以特别是方面A-1至A-22中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域。
多肽
方面K-1:多肽，所述多肽包含一个或多个(优选一个)方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,和/或E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，并且任选地还包含一个或多个肽接头。
方面K-2:方面K-1的多肽，其另外包含一个或多个(优选一个)针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。
方面K-3:方面K-1或K-2任一项的多肽，其中所述针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域是针对人血清白蛋白。
方面K-4:方面K-1至K-3中任一项的多肽，其中所述一个或多个针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域是具有SEQIDNO:5或101的免疫球蛋白单可变结构域。
核酸
方面M-1:核酸或核苷酸序列，其编码方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，方面K-1至K-4中任一项的多肽。
方面M-2:具有SEQIDNO:30-42、优选SEQIDNO:30(表B-6)的核酸或核苷酸序列。
宿主细胞
方面N-1:宿主或宿主细胞，其表达或在适当的环境中能够表达方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域、方面K-1至K-4中任一项的多肽；和/或其包含方面M-1或M-2的核酸或核苷酸序列。
组合物
方面O-1:组合物，所述组合物包含至少一种方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，或至少一种方面K-1至K-4中任一项的多肽，或方面M-1或M-2的核酸或核苷酸序列。
方面O-2:方面O-1的组合物，其是药物组合物。
方面O-3:方面O-2的组合物，其是药物组合物，其进一步包含至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅剂，并且其任选地包含一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。
制备本发明的试剂和组合物
方面P-1:用于制备方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域、方面K-1至K-4中任一项的多肽的方法，所述方法至少包含下述步骤：
a)在适当的宿主细胞或宿主生物体或在另一种适当的表达系统中表达方面M-1或方面M-2的核酸或核苷酸序列；
任选地接着进行：
b)分离和/或纯化方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域、方面K-1至K-4中任一项的多肽。
方面P-2:用于制备方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域、方面K-1至K-4中任一项的多肽的方法，所述方法至少包括下述步骤：
a)在某种条件下培养和/或维持方面N-1的宿主或宿主细胞，所述条件是这样的，以使所述宿主或宿主细胞表达和/或生产方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的至少一种免疫球蛋白单可变结构域、方面K-1至K-4中任一项的多肽；
任选地接着进行：
b)分离和/或纯化方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13的免疫球蛋白单可变结构域、方面K-1至K-4中任一项的多肽。
筛选方法
方面Q-1:用于筛选针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域的方法，所述方法包括至少下述步骤：
a)提供编码免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列的组、集合或文库；并且
b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码这样的免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列，所述免疫球蛋白单可变结构域能够结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力，并且其被交叉阻断或交叉阻断本发明的纳米抗体，例如，SEQIDNO:23-29,102和187,优选SEQIDNO:26和/或187(表B-3),或本发明的多肽或构建体，例如，SEQIDNO:7-12,103-111,113,188和142-150,优选SEQIDNO:7,106,113,188,143,146和/或147(参见表B-4)；并且
c)分离所述核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白单可变结构域。
方面Q-2:用于筛选针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域的方法，所述方法包括至少下述步骤：
a)提供编码免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列的组、集合或文库；并且
b)从所述组、集合或文库筛选这样的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域能够结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力，并且其被交叉阻断或交叉阻断本发明的免疫球蛋白单可变结构域，例如，SEQIDNO:23-29,102和187，优选SEQIDNO:26和/或187(表B-3)，或本发明的多肽构建体，例如，SEQIDNO:7-12,103-111,113,188和142-150，优选SEQIDNO:7,106,113,188,143,146和/或147(参见表B-4)；并且
c)分离所述能够结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的氨基酸序列。
方面Q-3:用于筛选针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域的方法，所述方法包括至少下述步骤：
a)提供VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库；并且
b)从所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库中筛选能够结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的免疫球蛋白单可变结构域；并且
c)分离所述能够结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的氨基酸序列。
本发明的试剂的应用
方面R-1:用于预防和/或治疗癌症和/或炎性疾病（诸如，例如，本文提及的）的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的至少一种免疫球蛋白单可变结构域，方面K-1至K-4中任一项的多肽；或方面O-2或O-3的组合物。
方面R-2:用于预防和/或治疗至少一种与c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)相关的、与其生物学或药理学活性相关的和/或与涉及c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的生物学途径或信号传导相关的疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的至少一种免疫球蛋白单可变结构域，方面K-1至K-4中任一项的多肽；或方面O-2或O-3的组合物。
方面R-3:用于预防和/或治疗至少一种可以通过给有此需要的受试者施用方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的至少一种免疫球蛋白单可变结构域、方面K-1至K-4中任一项的多肽；或方面O-2或O-3的组合物而得到预防和/或治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的至少一种免疫球蛋白单可变结构域、方面K-1至K-4中任一项的多肽；或方面O-2或O-3的组合物。
方面R-4:用于免疫治疗的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的至少一种免疫球蛋白单可变结构域、方面K-1至K-4中任一项的多肽；或方面O-2或O-3的组合物。
方面R-5:用于预防和/或治疗患有骨转移癌的受试者中的骨病和/或溶骨损伤的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的至少一种针对c-Met的免疫球蛋白单可变结构域，方面K-1至K-4中任一项的多肽；或方面O-2或O-3的组合物。
方面R-6:方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6,E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，方面K-1至K-4中任一项的多肽，方面O-2或O-3的组合物，其用于方面R-1至R-5中任一项的一种或多种方法中。
方面R-7:方面K-1至K-4中任一项的多肽，其用于癌症的诊断、预防和/或治疗。
方面R-8:针对c-Met的ISVDs和/或方面K-1至K-4中任一项的多肽，其用于诊断、预防和/或治疗骨转移癌中的骨病和/或溶骨损伤，所述骨转移癌包括多发性骨髓瘤。
方面S-1多特异性构建体，其包含方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6和E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域和调节VEGF信号传导的多肽。
方面S-2多特异性构建体，其包含方面A-23至A-44中任一项的VHH和调节VEGF信号传导的多肽。
方面S-3方面S-1或S-2的多特异性构建体，其中所述调节VEGF信号传导的多肽是免疫球蛋白单可变结构域，优选是结构域抗体，更优选是dAb。
方面S-4方面S-1或S-2的多特异性构建体，其中所述调节VEGF信号传导的多肽是VHH，并且甚至更优选地是纳米抗体。
方面S-5方面S-3或S-4的多特异性构建体，其中所述调节VEGF信号传导的多肽是WO08/101985中所述的多肽，特别是SEQIDNO:s441-677中的任一种。
方面S-6方面S-1至S-5中任一项的多特异性构建体，其还包含一个或多个肽接头。
方面S-7方面S-1至S-6中任一项的多特异性构建体，其还包含一个或多个(优选一个)针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。
方面S-8方面S-7的多特异性构建体，其中所述针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域是针对人血清白蛋白。
方面S-9方面S-7至S-8中任一项的多特异性构建体，其中所述一个或多个针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域是具有SEQIDNO:5或101的免疫球蛋白单可变结构域。
方面S-10方面S-1至S-9中任一项的多特异性构建体，其用于诊断、预防或治疗癌症，优选多发性骨髓瘤或非小细胞肺癌。
方面S-11编码方面S-1至S-9中任一项的多特异性构建体的核酸或核苷酸序列。
方面S-12表达方面S-1至S-9中任一项的多特异性构建体的宿主细胞。
方面S-13包含方面S-1至S-9中任一项的多特异性构建体的组合物，优选药物组合物。
方面S-14包含方面S-11的核酸或核苷酸序列的组合物，优选药物组合物。
方面S-15包含方面S-12的宿主细胞的组合物，优选药物组合物。
方面S-16用于诊断、治疗和/或预防癌症、优选多发性骨髓瘤或非小细胞肺癌的方法，如本文所述，所述方法包括使用方面S-1至S-9中任一项的多特异性构建体的基本步骤。
方面X-1多特异性构建体，其包含方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6和E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域和调节EGFR信号传导的多肽。
方面X-2多特异性构建体，其包含方面A-23至A-44中任一项的VHH和调节EGFR信号传导的多肽。
方面X-3方面X-1或X-2的多特异性构建体，其中所述调节EGFR信号传导的多肽是免疫球蛋白单可变结构域，优选是结构域抗体，更优选是dAb。
方面X-4方面X-1或X-2的多特异性构建体，其中所述调节EGFR信号传导的多肽是VHH，并且甚至更优选地是纳米抗体。
方面X-5方面X-3或X-4的多特异性构建体，其中所述调节EGFR信号传导的多肽是WO04/041867中所述的多肽，特别是SEQIDNO:s23-44，是WO05/044858中所述的多肽，并且特别是SEQIDNO:s1-56和62-71和/或WO07/042289中所述的多肽，特别是SEQIDNO:s80-93和110-143。
方面X-6方面X-1至X-5中任一项的多特异性构建体，其还包含一个或多个肽接头。
方面X-7方面X-1至X-6中任一项的多特异性构建体，其还包含一个或多个(优选一个)针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。
方面X-8方面X-7的多特异性构建体，其中所述针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域是针对人血清白蛋白。
方面X-9方面X-7至X-8中任一项的多特异性构建体，其中所述一个或多个针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域是具有SEQIDNO:5或101的免疫球蛋白单可变结构域。
方面X-10方面X-1至X-9中任一项的多特异性构建体，其用于诊断、预防或治疗癌症，优选多发性骨髓瘤或非小细胞肺癌。
方面X-11编码方面X-1至X-9中任一项的多特异性构建体的核酸或核苷酸序列。
方面X-12表达方面X-1至X-9中任一项的多特异性构建体的宿主细胞。
方面X-13包含方面X-1至X-9中任一项的多特异性构建体的组合物，优选是药物组合物。
方面X-14包含方面X-11的核酸或核苷酸序列的组合物，优选是药物组合物。
方面X-15包含方面X-12的宿主细胞的组合物，优选是药物组合物。
方面X-16用于诊断、治疗和/或预防癌症、优选多发性骨髓瘤或非小细胞肺癌的方法，如本文所述，所述方法包括使用方面X-1至X-9中任一项的多特异性构建体的基本步骤。
方面Y-1多特异性构建体，其包含方面A-1至A-22,B-1至B-7,C-1至C-4,D-1至D-6和E-1至E-13中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，调节VEGF信号传导的多肽和调节EGFR信号传导的多肽。
方面Y-2多特异性构建体，其包含方面A-23至A-44中任一项的VHH，调节VEGF信号传导的多肽和调节EGFR信号传导的多肽。
方面Y-3方面Y-1或Y-2的多特异性构建体，其中所述调节VEGF信号传导的多肽是免疫球蛋白单可变结构域，优选是结构域抗体，更优选是dAb，并且其中所述调节EGFR信号传导的多肽是免疫球蛋白单可变结构域，优选是结构域抗体，更优选是dAb。
方面Y-4方面Y-1或Y-2的多特异性构建体，其中所述调节VEGF信号传导的多肽是VHH，并且甚至更优选地是纳米抗体，并且其中所述调节EGFR信号传导的多肽是VHH，并且甚至更优选地是纳米抗体。
方面Y-5方面Y-3或Y-4的多特异性构建体，其中所述调节VEGF信号传导的多肽是WO08/101985中所述的多肽，特别是SEQIDNO:s441-677中的任一种，并且其中所述调节EGFR信号传导的多肽是WO04/041867中所述的多肽，特别是SEQIDNO:s23-44中的任一种，是WO05/044858中所述的多肽，并且特别是SEQIDNO:s1-56和62-71中的任一种，和/或是WO07/042289中所述的多肽，特别是SEQIDNO:s80-93和110-143中的任一种。
方面Y-6方面Y-1至Y-5中任一项的多特异性构建体，其还包含一个、两个或更多个肽接头。
方面Y-7方面Y-1至Y-6中任一项的多特异性构建体，其还包含一个或或多个(优选一个)针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。
方面Y-8方面Y-7的多特异性构建体，其中所述针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域是针对人血清白蛋白。
方面Y-9方面Y-7至Y-8中任一项的多特异性构建体，其中所述一个或多个针对血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域是具有SEQIDNO:5或101的免疫球蛋白单可变结构域。
方面Y-10方面Y-1至Y-9中任一项的多特异性构建体，其用于诊断、预防或治疗癌症，优选是多发性骨髓瘤或非小细胞肺癌。
方面Y-11编码方面Y-1至Y-9中任一项的多特异性构建体的核酸或核苷酸序列。
方面Y-12表达方面Y-1至Y-9中任一项的多特异性构建体的宿主细胞。
方面Y-13包含方面Y-1至Y-9中任一项的多特异性构建体的组合物，优选是药物组合物。
方面Y-14包含方面Y-11的核酸或核苷酸序列的组合物，优选是药物组合物。
方面Y-15包含方面Y-12的宿主细胞的组合物，优选是药物组合物。
方面Y-16用于诊断、治疗和/或预防癌症、优选多发性骨髓瘤或非小细胞肺癌的方法，如本文所述，所述方法包括使用方面Y-1至Y-9中任一项的多特异性构建体的基本步骤。
其他方面：
1.能够特异性将HGF从人c-Met(SEQIDNO:1)上置换下来的免疫球蛋白单可变结构域，其IC50小于10nM,更优选地小于5nM,更优选地小于1nM,甚至更优选地小于500pM,最优选地小于100pM，并且平均HGF置换为60%-80%或以上，更优选地90%或以上(例如，在实验部分所述的条件下)。
2.方面1的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含具有式1的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；
其中FR1-FR4是指构架区1-4，并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且其中CDR1选自由以下组成的组：
a)SEQIDNO:160和51,
b)与SEQIDNO:160和51具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，
c)与SEQIDNO:160和51具有3、2或1个氨基酸差异的多肽，
并且其中CDR2选自由以下组成的组：
d)SEQIDNO:170和67;
e)与SEQIDNO:170和67具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，
f)与SEQIDNO:170和67具有3、2或1个氨基酸差异的多肽，
并且其中CDR3选自由以下组成的组：
g)SEQIDNO:180和83;
h)与SEQIDNO:180和83具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，
i)与SEQIDNO:180和83具有3、2或1个氨基酸差异的多肽。
3.方面1-2中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述构架区(FRs)与SEQIDNO:s189,59,190和/或185的FRs具有大于80%(更优选地85%,甚至更优选地90%,最优选地95%)的序列同一性。
4.方面1的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含具有式1的氨基酸序列
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；
其中FR1-FR4是指构架区1-4，并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；其中CDR1是SEQIDNO:160或51,CDR2是SEQIDNO:170或67;并且CDR3是SEQIDNO:180或83。
5.包含方面1-4中任一项的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。
6.方面5的多肽，其中所述多肽选自由具有与SEQIDNO:s23-29,102或187有大于80%(更优选地85%,甚至更优选地90%,最优选地95%)的序列同一性的氨基酸序列的多肽组成的组。
7.方面5或6的多肽，其中所述多肽选自由与SEQIDNO:26或187有大于80%的序列同一性（更优选地85%,甚至更优选地90%,最优选地95%）的氨基酸序列的多肽组成的组。
8.方面5-7中任一项的多肽，其另外包含与人血清白蛋白结合的免疫球蛋白单可变结构域，诸如，例如，Alb11(SEQIDNO:5)或Alb23(SEQIDNO:101)。
9.方面5-8中任一项的多肽，其中所述多肽选自由具有与SEQIDNO:s7-12,103-111,113,188或142-150有大于80%的序列同一性（更优选地85%,甚至更优选地90%,最优选地95%）的氨基酸序列的多肽组成的组。
10.方面5-9中任一项的多肽，其中所述多肽选自由具有与SEQIDNO:7,106,113,188,143,146或147有大于80%的序列同一性（更优选地85%,甚至更优选地90%,最优选地95%）的氨基酸序列的多肽组成的组。
11.方面1-4中任一项的免疫球蛋白单可变结构域或方面5-10中任一项的多肽，其中在α筛选测定中（诸如在实施例2.3.1中）的IC50为1.2nM以下。
12.方面1-4中任一项的免疫球蛋白单可变结构域或方面5-10中任一项的多肽，其中在α筛选测定中（诸如在实施例2.3.1中）的IC50为500pM以下。
13.核酸序列，其编码：i)方面1-4,11或12中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；或ii)方面5-10中任一项的多肽。
14.药物组合物，其包含：i)方面1-4,11或12中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；或ii)方面5-10中任一项的多肽；以及任选地药用赋形剂。
15.方面1-4,11或12中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；或ii)方面5-10中任一项的多肽，其用于癌症。
16.用于制备方面1-4,11或12中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；或ii)方面5-10中任一项的多肽的方法，所述方法至少包括下述步骤：
a)在适当的宿主细胞或宿主生物体或在另一种适当的表达系统中表达方面13的核酸或核苷酸序列；
任选地接着进行：
b)分离和/或纯化所述免疫球蛋白单可变结构域或所述多肽。
17.用于筛选针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的免疫球蛋白单可变结构域的方法，所述方法包括至少下述步骤：
a)提供VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库；和
b)从所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域的组、集合或文库中筛选能够结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的免疫球蛋白单可变结构域；和
c)分离所述能够结合c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)和/或具有针对c-Met、且特别是人c-Met(SEQIDNO:1)的亲和力的氨基酸序列。
18.用于评估患有c-Met相关的疾病或病症的患者对治疗的响应性的体外方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供在治疗前来自所述患者的第一样品，并且测量所述第一样品中的可溶性c-Met的量，
b)提供在开始治疗后来自所述患者的第二样品，并且测量所述第二样品中可溶性c-Met的量，
c)将在所述第一样品中存在的可溶性c-Met的量与在所述第二样品中存在的可溶性c-Met的量进行比较；
其中，与在所述第一样品中的可溶性c-Met的量相比，在所述第二样品中可溶性c-Met的量的减少表示所述患者对所述治疗有响应。
19.权利要求18的方法，其中所述样品是血液样品，血清样品，血浆样品，尿样，粪便样品，支气管肺泡灌洗液，脑脊液或组织的活组织检查样品。
20.权利要求18的方法，其中可溶性c-Met的量使用免疫测定、化学发光测定或电化学发光测定来测量。
21.权利要求18的方法，其中所述治疗包括施用：i)权利要求1-4，11或12中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；ii)权利要求5-10中任一项的多肽；或iii)权利要求14的药物组合物。
22.一种治疗至少一种与c-Met相关的疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用权利要求14的药物组合物。
23.用于评估患有c-Met相关的疾病或病症的患者对治疗的响应性的试剂盒，所述试剂盒包含用于按照权利要求18的方法测量受试者中可溶性c-Met的量的一种或多种试剂。
24.权利要求22的试剂盒，所述试剂盒还包括：i)权利要求1-4，11或12中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；或ii)权利要求5-10中任一项的多肽；或iii)权利要求14的药物组合物。
实验部分：
序列：
表B-1：现有技术的序列
表B-3:本发明的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列
表B-4:本发明的多肽序列
表B-5:本发明的接头序列
接头名称 SEQ ID NO： 氨基酸序列
5GS 13 GGGGS
6GS 14 SGGSGGS
9GS 15 GGGGSGGGS
10GS 16 GGGGSGGGSS
15GS 17 GGGGSGGGGSGGGGS
18GS 18 GGGGSGGGGSGGGGGGGS
20GS 19 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS 20 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS 21 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS 22 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
表B-6:本发明的核酸序列
实施例1:鉴定c-Met阻断性纳米抗体
免疫球蛋白单可变结构域（Immunoglobulinsinglevariabledomains/domain）在实验部分通常称为纳米抗体（Nanobodies/Nanobody）。1.1免疫
三头美洲驼(No.450,451和452,羊驼（llamaglama）)按照标准流程免疫，在颈部4次肌内注射(100或50μg/剂量，间隔2周)配制在完全弗氏佐剂（第0天）或不完全弗氏佐剂（后续免疫）(Difco,BD生物科学（BDBiosciences）,SanJose,CA,USA)中的人(h;hu)c-Met/Fc(hc-Met/Fc或huc-Met/Fc；遗传融合到人Fc上并且在NS0小鼠骨髓瘤细胞中表达的c-Met细胞外结构域；R&D系统（R&DSystems）,目录号358-MT/CF,Minneapolis,MN,USA,还参见SEQIDNO:2)。
在第0天和第35天，从用重组蛋白免疫的美洲驼收集血清，以通过ELISA确定针对huc-Met的抗体效价。96-孔Maxisorp平板(Nunc,Wiesbaden,德国)用huc-Met/Fc或不相关的Fc包被。在封闭和加入血清样品的连续稀释液后，使用小鼠抗-美洲驼IgG1,2和3单克隆抗体(Daley等,ClinDiagnLabImmunol.（临床诊断与实验室免疫学）2005年3月;12(3):380-6.)，然后使用HRP(辣根过氧化物酶)缀合的兔抗-小鼠IgG(Dako,Glostrup,丹麦)以及随后在底物TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)(Promega,Madison,WI,USA)的存在下的酶促反应，证实美洲驼-抗-huc-Met抗体的存在。
在第0天和第50天，从用重组蛋白免疫的美洲驼收集血清，以通过FACS确定针对表达c-Met的A549肺肿瘤细胞(ATCC号CCL-185)或c-Met阴性对照CHOK1(ATCC号CCL-61)细胞的抗体效价。将细胞培养在RPMI1640+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素中。将细胞重悬在稀释的血清样品中。洗涤后，使用山羊抗-美洲驼IgG(BethylLaboratories,Montgomery,TX,USA)和PE缀合的驴抗-山羊IgG(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA,USA)在FACSArrayTM（BD生物科学(BDBiosciences)）中检测细胞表面结合的抗-c-Met美洲驼抗体的存在。
在ELISA中，所有3头美洲驼都在针对hc-Met的IgG1,IgG2和IgG3免疫球蛋白种类中表现出良好的且特异性的反应。在FACS中，在所有3头美洲驼中，针对表达c-Met的A549肿瘤细胞的血清反应是明显可检测的。由于美洲驼用重组蛋白而不是用细胞免疫，所以可以认为所观察到的信号是特异性针对c-Met的。
1.2文库构建体
在第46和50天从免疫的美洲驼采集血液样品，并且使用Ficoll-PaquePlus(GEHealthcare,Uppsala,瑞典)按照供应商的使用说明制备外周血单核细胞。使用RneasyMidi试剂盒(Qiagen,Venlo,荷兰)按照供应商的使用说明从所述外周血单核细胞中提取总RNA。总RNA样品用作RT-PCR的起始材料以扩增编码纳米抗体的基因片段。将这些片段克隆到内部制备（housemade）的噬菌粒载体(pAX50)中，允许在感染辅助噬菌体后产生重组噬菌体颗粒，其将所述纳米抗体作为基因III融合蛋白展示在所述噬菌体颗粒的表面上。按照标准方法制备噬菌体，并且在过滤除菌后在-80℃保存在20%甘油中。
1.3选择
从美洲驼450,451和452获得的噬菌体文库用于不同的选择策略。
策略1:在第一轮选择（或针对细胞选择后第二轮）时，将1或100nM的生物素酰化的人c-Met/Fc(R&D系统;按照供应商的使用说明使用硫代(Sulfo)-NHS-LC-生物素(Pierce,Rockford,IL,USA)在内部生物素酰化)与噬菌体文库一起温育，并且随后捕获在链霉抗生物素Dynabeads(Invitrogen)上。在彻底洗涤后，用1mg/mL胰蛋白酶洗脱珠子结合的噬菌体。
策略2:在第一轮选择（或针对重组抗原选择后第二轮）时，将内源性表达c-Met的106个细胞/mL的人A549细胞与噬菌体文库一起温育。在彻底的细胞洗涤后，用1mg/mL胰蛋白酶洗脱细胞结合的噬菌体。
将来自不同策略的选择的噬菌体输出在大肠杆菌TG1细胞中拯救。挑取菌落并且在96深孔平板(体积为1mL/孔)中生长。通过向生长培养基中加入IPTG而诱导C-端c-myc和His6标记的可溶性纳米抗体的表达。按照标准方法(WO94/04678)制备周质提取物（体积：～100μl）。
1.4在流式细胞术测定中筛选c-Met结合纳米抗体
在使用表达c-Met的A549肿瘤细胞(ATCCNo.CCL-185)的FACS测定中筛选周质提取物的细胞表达的c-Met的结合。将2×105个A549细胞在1:10稀释的周质提取物中在4℃温育30min，然后彻底洗涤。接着，将细胞用2μg/ml抗c-myc抗体在4℃温育30min，再次洗涤，并且在4℃用山羊抗-小鼠PE标记的抗体(1:100)温育30min。洗涤样品，并重悬在补充了5nMTOPRO3(MolecularProbescat#T3605)的FACS缓冲液(来自Gibco的D-PBS，其中10%FBS来自Sigma，0.05%叠氮化钠来自Merck)中。然后在FACSCanto上分析细胞混悬液。使用前向/侧向散射器和TOPRO3通道荧光参数将门控设置为活的、完整的细胞。活细胞PE通道平均通道荧光值高于在省略纳米抗体的染色或包括不相关的特异性结合纳米抗体的对照实验中获得的那些值，这表明克隆结合在细胞系上。
1.5在α筛选测定中筛选HGF-阻断性纳米抗体
在α筛选测定中筛选周质提取物，以评估纳米抗体的配体阻断能力。该测定依赖于使用可以与生物分子缀合的供体和接受体珠。当分子之间的生物学相互作用使得珠子靠近时，当在680nm激光激发时，由在供体珠中的光敏剂产生的激发的单态氧分子扩散出来与接受体珠中的化学发光剂反应，其进一步激活发射520-620nm的光的荧光团。如果纳米抗体抑制HGF与c-Met/Fc的结合，则荧光信号将减少。
按照供应商的使用说明，使接受体珠(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)缀合抗-人Fc纳米抗体（内部制备）。将周质提取物与0.26nM生物素酰化的HGF在室温下预温育15min。接着，加入抗-人Fc缀合的接受体珠和c-Met/Fc(0.26nM终浓度)并且在室温温育1小时。第二，加入链霉抗生物素蛋白供体珠(PerkinElmer)并且再温育1小时。通过在EnVision多标记平板读数仪（EnVisionMultilabelPlateReader）(PerkinElmer)使用680nm的激发波长和520nm的发射波长读取平板来测量荧光。信号减少表示生物素酰化的HGF与c-Met的结合被在周质提取物中表达的纳米抗体阻断。
选择任意50%的截点将纳米抗体分类为阻断c-Met与HGF的相互作用或不阻断二者的相互作用。
将在流式细胞术筛选或α筛选中评分为正的纳米抗体测序。克隆基于其CDR3序列归类为序列家族。鉴定了46中不同的c-Met结合剂和/或HGF阻断剂家族。
1.6筛选阻断HGF-诱导的c-Met磷酸化的纳米抗体
在磷酸化测定中进一步筛选在流式细胞术或α筛选测定中为阳性的纳米抗体的周质提取物。该测定允许鉴定抑制HGF-驱动的c-Met磷酸化和下游信号传导的纳米抗体。c-Met磷酸化的抑制可以通过抑制HGF与c-Met的结合或通过抑制c-Met的二聚体化而发生。使用中规格发现试剂盒（MesoscaleDiscoverykit）(MSD,Cat#K15126A-3,MesoscaleDiscovery,Gaithersburg,MD)检测磷酸化的c-Met(Tyr1349)。这种试剂盒允许检测单孔中的总c-Met和Tyr1349-磷酸化的c-Met。
A549肿瘤细胞(ATCCNo.CCL-185)以每孔20.000个细胞的密度接种。2天后，将细胞培养基更换为不含血清的培养基，并且将细胞进行血清饥饿过夜。次日，将细胞与周质提取物的1/5稀释液（20μl，总体积100μl）一起温育30min，然后加入1nMHGF(Peprotech)，并且在37℃再温育15分钟。然后，洗涤细胞，并且在RIPA缓冲液(10xRIPA缓冲液,细胞信号传导技术（CellSignalingTechnology）)中裂解。将裂解物转移至c-MetMSD测定平板中。在洗掉未结合的裂解物物质后，用硫代-标记的抗体检测结合的磷酸化的和总的c-Met，并且在扇形成像仪2400（SectorImager2400）(MesoScaleDiscovery)上读取平板。作为阳性对照，在每个测定平板中，将抗-c-Met抗体h224G11Pierre-FabreInstitute的一些重复物(WO2009/007427,图65和图72)掺加到不相关的周质提取物中（最终1/5稀释）。
然后，按照下式计算样品中的磷酸蛋白的百分数，表示为推荐的标准化比率(normalizedratio，NR)：
抑制百分数按下述关于最大信号（使用1nMHGF+1/5稀释的不相关的周质物质的一些重复的平均值）和阴性对照（使用没有HGF刺激+1/5稀释的不相关的周质物质的一些重复的平均值）计算：
196个筛选的克隆中有88个在其在A549细胞中抑制>30%的HGF-诱导的c-Met磷酸化的能力方面至少与h224G11一样有效。
1.7格式化或突变的本发明的纳米抗体
将纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7),06B08-9GS-Alb11(SEQIDNO:8),06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9)和06F10-9GS-Alb11(SEQIDNO:10)克隆到内部构建的质粒中，允许在巴斯德毕赤酵母中表达并且分泌到培养基中。进行克隆，以使所述纳米抗体[04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7),06B08-9GS-Alb11(SEQIDNO:8),06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9),和06F10-9GS-Alb11(SEQIDNO:10)]在其C端翻译融合抗-人血清白蛋白(HSA)结合纳米抗体(ALB11，也称为Alb11)，二者由9GS-接头(氨基酸序列GGGGSGGGS)间隔。构建体具有另外的C端3×FLAG和His6-标签(SEQIDNO:6)。
纳米抗体Alb11-35GS-04E09(SEQIDNO:11)和Alb11-35GS-04E09(SEQIDNO:12)克隆在相同的表达质粒中，并且融合到相同的ALB11纳米抗体上，但是使得c-Met结合纳米抗体在其N端翻译融合ALB11，二者由35GS-接头(SEQIDNO:22)或9GS-接头(SEQIDNO:15)间隔。同上，这些构建体携带C端3×FLAG和His6-标签(SEQIDNO:6)。
纳米抗体04E09-L49S(SEQIDNO:23),04E09-C50S/C100bG(SEQIDNO:24)和04E09-C22A/C92S(SEQIDNO:25)也克隆在这一质粒中。纳米抗体04E09在Kabat位置Leu49突变为Ser(L49S),Cys50突变为Ser和Cys100b突变为Gly(C50S/C100bG),或Cys22突变为Ala和Cys92突变为Ser(C22A/C92S)，并且在其C端融合3×FLAG和His6-标签(SEQIDNO:6)。
实施例2:在增殖测定、趋化性测定、两个HGF-竞争测定和在流式细胞术测定中表征c-Met阻断性纳米抗体
2.1纳米抗体表达和纯化
如1.7中所述克隆纳米抗体(SEQIDNO:s7-10)，并且在巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）中以250mL的培养体积表达。通过加入甲醇并且允许在30℃继续48小时而诱导纳米抗体的表达。澄清的上清液用作使用HisTrapTM柱(GEHealthcare)的固定的金属离子亲和层析(IMAC)的起始物质。使用从20mM至250mM的咪唑逐级梯度将纳米抗体从柱上洗脱下来。在下一步中，使用HiPrepTM26/10脱盐柱(GEHealthcare)将纳米抗体缓冲液更换为D-PBS(Invitrogen)。
2.2MET-阻断性基准分子
2.2.1抗-c-Met抗体5D5
将鼠杂交瘤细胞系5D5.11.6(ATCCHB-11895;lotno3996831,LGCStandards,UK)在补充了10%FCS和1%青霉素/链霉素的DMEM+Glutamax-I(Gibco)中生长。将培养基更换为补充了6mML-谷氨酰胺和1×胆固醇的CD杂交瘤(Lonza)中用于抗体产生。约1周后收集条件培养基，并且用具有0.22μmExpressPLUS膜的Stericup系统(Millipore)离心并过滤，然后上样到HiTrap蛋白质G柱(GEHealthcare)上。该柱用0.1M甘氨酸-HCl,pH2.7洗脱，并且将洗脱物立即用0.2体积的1MTris-HClpH9中和。然后在PD-10脱盐柱(GEHealthcare)上将抗体溶液缓冲液更换为D-PBS。
2.2.2.来自mAb的抗-c-Met抗体片段5D5
使用Pierce小鼠IgG1Fab和F(ab′)2微量制备试剂盒(Cat#44980,ThermoScientific)通过无花果蛋白酶消化鼠IgG制备抗-c-Met抗体5D5的Fab片段。简言之，将IgG与琼脂糖固定的无花果蛋白酶在补充有25mM半胱氨酸的消化缓冲液中在37℃温育4小时。通过用抗-鼠Fc琼脂糖(EuropaBioproducts;Cat#EU-AMIgGFc-AGA-1)温育1小时而去除未消化的IgG和Fc片段。将不含珠子的上清液在膜过滤浓缩器(20,000MWCO,CAT#87750,Pierce–ThermoScientific)上浓缩至小于1mL的体积。制备物通过在Superdex7510/300GL柱(GEHealthcare)上凝胶过滤而按大小分离并且缓冲液更换。洗脱的级分同样在相同的膜过滤浓缩器上浓缩。
2.2.3产生5D5Fabv2
5D5Fabv2序列公布在Dennis等，(美国专利申请号US2007/0092520)中。由于其是人源化的和亲和力成熟的，所以5D5Fabv2不同于亲本鼠杂交瘤单克隆抗体5D5。可变重链和轻链结构域的序列(合成产生的,Geneart)已经分别遗传融合到人IgG1CH1(标记有血凝素-和6组氨酸-标签)和人κCL上。构建体由内部构建的大肠杆菌表达质粒表达。将大肠杆菌TG1细胞在2L-发酵器中在补充有0.5%葡萄糖和卡那霉素的LB培养基中生长，并且用1mMIPTG诱导表达。通过离心(3600×g,20min)收集细胞，并且产生周质提取物。5D5Fabv2捕获在Ni-NTA柱(HisTrap,GEHealthcare)上，并洗脱在250mM咪唑中。洗脱物在抗-人κ亲和力柱(KappaSelect,GEHealthcare)上进一步纯化：5D5Fabv2洗脱在100mM甘氨酸,pH2.5中，并且加入0.2体积的1MTRIS.pH7.5立即中和。
2.3在α筛选测定和在流式细胞术测定中，纳米抗体阻断c-Met-配体HGF的结合。
2.3.1在α筛选测定中，纳米抗体阻断c-Met配体HGF的结合
在HGF/c-Met竞争α筛选测定中表征纯化的纳米抗体，以评估其阻断能力和效力，并且将其与5D5Fab进行比较。从250nM起始下降至0.9pM的抗-c-Met纳米抗体和5D5Fab的稀释系列与100pM生物素酰化的hHGF(人HGF)一起在室温温育15分钟。然后，加入抗-人Fc缀合的接受体珠和c-Met/Fc(终浓度为100pM)，并且将混合物在室温再温育2小时。然后，加入链霉抗生物素蛋白供体珠，并且将混合物再温育1小时。通过使用680nm的激发波长和520nm的发射波长在EnVision多标记平板读数仪上读取平板而测量荧光。
分泌的纳米抗体以剂量依赖性方式有效地抑制HGF与c-Met受体的结合。计算的IC50值和抑制百分数显示在表1中。抑制百分数反映与最大浓度的无活性的（cold）（未生物素酰化的）配体（设定为100%的参比点）相比，对于特定化合物稀释系列的最大抑制程度。例如，纳米抗体06B08-9GS-Alb11阻断多至65%的HGF/c-Met相互作用，而其他纳米抗体和5D5Fab能够抑制约100%。
表1：通过α筛选确定的对HGF与c-Met结合的抑制（IC50值和%抑制;纳米抗体*用3xFlag-His6=SEQIDNO:6标记，如实施例1.7中所述）
在存在或不存在5μM人血清白蛋白(HSA)的条件下评估纯化的纳米抗体。
表2总结了在存在或不存在HSA的条件下纳米抗体的能力(IC50值)。在存在HSA的条件下，对于所有纳米抗体无一观察到能力的显著转换。
表2：HSA对纳米抗体阻断HGF与c-Met结合的能力的影响（纳米抗体*用3xFlag-His6=SEQIDNO:6标记，如实施例1.7中所述）
2.3.2在流式细胞术测定中，纳米抗体阻断c-MET配体HGF的结合
在基于流式细胞术测量的HGF/c-Met竞争测定中表征纯化的纳米抗体，以评估其阻断能力和效力，并且将其与5D5mAb进行比较。洗涤A549细胞，并且以2×106/mL重悬。从1μM起始下降至5.6pM的抗-c-Met纳米抗体和5D5mAb稀释系列用1nM生物素酰化的hHGF预温育。接着，A549细胞和纳米抗体/HGF混合物在4℃温育2小时。洗涤后，将细胞用链霉抗生物素蛋白/PE(BDBioscience)在4℃染色30min。然后，再次洗涤细胞，用2.5nMTOPRO3(Invitrogen)染色，并且在FACSArray仪器(BDBioscience)上分析。
数据显示纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7),06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9)和06F10-9GS-Alb11(SEQIDNO:10)表现出与HGF的完全的竞争。纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)和06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9)具有显著低于5D5mAb的IC50值的IC50值。在该测定中，5D5Fab片段的IC50值确定为11.3nM。
表3：通过竞争性流式细胞术确定的对HGF与细胞结合的c-Met的结合的抑制（IC50值和%抑制;纳米抗体*用3xFlag-His6=SEQIDNO:6标记，如实施例1.7中所述）
2.3.3在α筛选测定中c-MET-配体HGF的结合
在HGF/c-MET竞争性α筛选测定中表征抗-c-MET/抗-血清白蛋白纳米抗体构建体，以评估其阻断能力和效力，并且将其与基准抗体片段(5D5Fabv2)进行比较。从250nM起始下降至0.9pM的抗-c-MET纳米抗体和基准5D5Fabv2的稀释系列与100pM生物素酰化的hHGF一起在室温预温育15分钟。向该混合物中加入抗-人Fc缀合的接受体珠和c-MET/Fc(终浓度为100pM)，并且在室温温育2小时。接着，加入链霉抗生物素蛋白供体珠，并且将混合物再温育1小时。通过使用680nm的激发波长和520nm的发射波长在EnVision多标记平板读数仪上读取平板而测量荧光。
这两种构建体以剂量依赖性方式有效地抑制HGF与c-MET受体的结合。计算的IC50值和相对应的95%置信区间显示在表3A中。A007900171与两个批次的A007901219具有相似的IC50值；它们的95%CI是重合的，这表明差异统计学不显著。与基准5D5Fabv2相比较，所述纳米抗体表现出>5-倍提高的功效。
综上，所述纳米抗体构建体优于基准，与具体的抗-血清白蛋白结构部分无关。
表3A：通过α筛选确定的对HGF与c-MET的结合的抑制（IC50值和95%置信区间）
ID IC50[pM] 95%CI[pM]
5D5Fab v2 380 330-440
A007900171(Alb11)(SEQ ID NO:113) 58 50-66
A007901219(Alb23)(SEQ ID NO:106) 66 57-78
2.4纳米抗体阻断A549癌细胞系中HGF-诱导的c-Met磷酸化
在如实施例1.6所述的HGF-依赖性磷酸化测定中表征纯化的纳米抗体。
2.4.1纳米抗体阻断A549癌细胞系中HGF-诱导的c-Met磷酸化
在第一系列的实验中，从1μM下降至0.23nM的格式化抗-c-Met纳米抗体或5D5Fab的稀释系列与A549细胞上的1nMHGF在37℃共同温育15min。然后将1/3的细胞裂解物应用到MSD磷酸化的c-Met测定平板上。至测量之前汇集来自一式两份样品的裂解物。在洗掉未结合的裂解物后，加入检测磷酸化的和未磷酸化的c-Met二者的硫代标记的抗体，并且使用扇形成像仪2400(SectorImager2400，MSD)读取平板。
显示纯化的纳米抗体几乎完全阻断HGF-依赖性c-Met-磷酸化。结果总结在表4中；也参见图1。
综上，标记的(SEQIDNO:6)纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)优于5D5Fab基准。纳米抗体06B08-9GS-Alb11(SEQIDNO:8)和06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9)具有相当的IC50（在95%置信区间内），而06F10-9GS-Alb11(SEQIDNO:10)效力较低。
表4：抑制A549肿瘤细胞中的HGF-依赖性c-Met磷酸化（纳米抗体*用3xFlag-His6=SEQIDNO:6标记，如实施例1.7中所述）
**5D5Fab具有10.4nM(实验1)和9.09nM(实验2)的IC50。
基于A549细胞中c-Met磷酸化测定的结果，纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)鉴定为最有效的纳米抗体。
2.4.2Alb23衍生的纳米抗体阻断A549癌细胞系中的HGF-诱导的c-Met磷酸化
在第二系列的实验中，在HGF-依赖性磷酸测定中表征纯化的抗-c-MET/抗-血清白蛋白Alb11和Alb23纳米抗体构建体。从1μM起始直至0.23nM的抗-cMET构建体或抗-cMET基准5D5Fabv2的稀释系列与A549细胞上的1nMHGF在37℃共同温育15min。然后，将1/3的裂解的细胞溶液应用到磷酸c-METMSD测定平板上。在MSD水平上汇集细胞培养水平上的一式两份。在洗掉未结合的物质后，硫代标记的检测c-Met抗体检测磷酸化的和未磷酸化的受体二者。使用扇形成像仪2400(SectorImager2400)进行读取。
这两种抗-c-MET/抗-血清白蛋白纳米抗体构建体以剂量依赖性方式有效地抑制HGF-依赖性c-MET受体磷酸化。计算的IC50值和相对应的95%置信区间显示在表4A中。A007900171(SEQIDNO:113)和两个批次的A007901219(SEQIDNO:106)具有相似的IC50值；它们的95%CI是重合的，这表明差异统计学不显著。与基准5D5Fabv2相比较，所述纳米抗体显示出约2倍提高的效力。另外，在95%置信区间内，向刺激的细胞中加入人血清白蛋白没有改变测试的纳米抗体的IC50值。
综上，所述纳米抗体构建体优于所述基准，与具体的抗-血清白蛋白结构部分无关。
表4A:通过cMET磷酸化测定确定的对HGF与cMET结合的抑制(IC50值和95%置信区间)
2.5纳米抗体阻断HGF-诱导的BxPC-3细胞增殖
针对其阻断HGF-诱导的BxPC-3细胞(胰腺癌细胞,ATCCNoCRL-1687)增殖的能力来评估纳米抗体。在该测定中，在E-平板(ACEA/RocheAppliedScience)上每孔接种1×104个细胞，并且使用XcelligenceRTCA分析仪(RocheAppliedScience)通过测量每个孔的阻抗值并提供计算的‘标准化细胞指数’(NormalizedCellIndex，NCI)监测其动力学。过夜培养和4小时血清饥饿后，向BxPC3细胞中加入从0.8μM降至0.05nM的格式化抗-c-Met纳米抗体或抗-c-Met5D5Fab基准的稀释系列。记录NCI值3天。
3天后，所有纳米抗体都几乎能够完全阻断HGF-介导的NCI增加，这表明它们有效的阻断HGF-诱导的细胞增殖(表5)。标记(SEQIDNO:6)的纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)具有优于5D5Fab的功效(参见图3)。其他纳米抗体具有与5D5Fab相当的IC50值（数据未显示）。
表5：抑制HGF-依赖性BxPC3细胞增殖（纳米抗体*用3xFlag-His6=SEQIDNO:6标记，如实施例1.7中所述）
**5D5Fab具有34.3nM的IC50。
2.6纳米抗体阻断A549细胞的HGF-依赖性的趋化性
在趋化性测定中检测抗-c-Met纳米抗体阻断A549细胞针对HGF浓度梯度迁移的能力。
该测定是基于FluoroBlokTM平板(BDFalconTM)，所述平板由黑色多孔插板组成，该插板具有封固在透明的96孔接收板上的荧光-阻断的、多孔PET（聚对苯二甲酸乙二酯）膜插件（孔尺寸为8μm）。将分汇合(sub-confluent)的A549细胞血清饥饿过夜，并用荧光染料DiIC12(BDBiosciences)染色。然后，向膜插件上接种75.000个细胞/孔，并且用从0.4μM起始降至0.01nM的抗-c-Met纳米抗体或抗-c-Met鼠5D5Fab的稀释系列温育。还向下部区室中加入相同浓度的纳米抗体/抗体以及2.5nM的HGF。24小时后，在底部读取荧光平板读数仪(Envision,PerkinElmer)上量化已经迁移到底板中的细胞的量。
在趋化性测定中，所有测试的纳米抗体能够以与5D5Fab基准(完全阻断)相似的程度抑制HGF-驱动的A549细胞迁移。纳米抗体06B08-9GS-Alb11(SEQIDNO:8)似乎甚至将迁移减少至背景水平以下。在该测定中，纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)和06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9)比5D5Fab更有效。结果总结在表6中，还参见图4。
表6：抑制HGF-依赖性的A549细胞迁移(纳米抗体*用3xFlag-His6=SEQIDNO:6标记，如实施例1.7中所述)
**5D5Fab具有5.48nM的IC50
2.7A007901222抑制HGF与c-MET的结合
在巴斯德酵母菌株X33中在2L规格的复合培养基pH6.0中，95hai（诱导后的小时数）并且在发酵罐中在30℃产生抗-c-Met纳米抗体A007901222(SEQIDNO:188)。培养液首先通过高速离心步骤(7000rpm,4℃,20min,Sigma8K10转子)澄清，然后通过用TFF微孔过滤使上清不含颗粒。随后将物质上样到MEPHyperCel柱(PALL)上。纳米抗体用乙酸钠pH3.5洗脱，并且用1/10v/v1MTRISpH8.8中和洗脱物。将所述纳米抗体在SephadexG25上进一步缓冲液交换至净化步骤缓冲液中，随后在Poros50HQ上通过阴离子交换层析净化步骤进行纯化。在OGP-处理去除LPS后，将物质在Superdex75上缓冲液交换至D-PBS中。
在三个不同的测定中检测纯化的纳米抗体，并且与5D5Fabv2基准进行比较：(i)在HGF-竞争性α筛选中分析体外功效，(ii)基于细胞的c-Met磷酸化测定，(iii)基于细胞的增殖测定。
HGF-竞争性α筛选如实施例2(2.3.1)所述进行。基于细胞的c-Met磷酸化测定按照实施例1.6所述进行。基于细胞的增殖测定按照实施例2.5所述进行。
计算的IC50值和相应的95%置信区间显示在表7中。
表7：通过α筛选、c-MET磷酸化测定和增殖测定确定的对HGF与c-MET结合的抑制
实施例3：c-Met阻断性纳米抗体的结合特异性
3.1c-Met阻断性纳米抗体特异性结合细胞膜表达的人和食蟹猴c-Met
A549细胞(ATCCNo.CCL-185,LGCStandards,UK)用作内源性人细胞膜表达的c-Met的来源。食蟹猴c-Met在BAF3细胞上表达为全长、膜结合的蛋白。BAF3细胞(ABL157,DMSZ,德国)转染表达质粒DNA，并且通过FACS分选(FACSAria,BDBiosciences)分离具有高c-Met表达水平的群体。如下述，通过FACS分析测定纳米抗体分别与内源性且异位性（ectopically）细胞表面表达的人和食蟹猴c-Met的结合。
从1μM降至0.5pM的抗-c-Met纳米抗体的稀释系列与105A549,BAF3,或食蟹猴c-Met转染的BAF3细胞在4℃温育30min。在洗涤细胞后，在FACSArrayTM中使用小鼠抗-FLAG和PE缀合的山羊抗-小鼠IgG检测细胞表面结合的纳米抗体。
所有纳米抗体均表现出针对细胞表达的人c-Met和食蟹猴c-Met的相当的剂量依赖性的结合。没有观察到与BAF3细胞的结合，这表明与转染的BAF3细胞的结合是对食蟹猴c-Met转基因特异的。与人c-Met的结合相对于与食蟹猴c-Met的结合的EC50值的比率均在2.5倍以内。
3.2c-Met阻断性纳米抗体结合重组的人和食蟹猴c-Met/Fc嵌合体
3.2.1制备食蟹猴c-Met/Fc
通过对预先由肝组织制备的cDNA的PCR（均购自BioChainInstituteInc.,Cat#C1534149-CY,和Zyagen,Cat#KD-314）确定食蟹猴(M.fascicularis)c-Met序列。基于公众可获得的恒河猴（M.mulatta）c-Met序列(NCBIrefNM_001168629.1)设计引物。测序的产物与恒河猴序列的比对表明在氨基酸水平上没有偏差。
食蟹猴c-Met的细胞外结构域（从E25到T932的成熟蛋白）与人Fc(IgG1亚型)融合，其包括在c-Met细胞外结构域与Fc部分之间的因子Xa裂解位点和C端His6标签(SEQIDNO:4)。将两个片段通过3点连接法克隆到内部构建的、附加型复制的哺乳动物表达载体中。含有埃巴（Epstein-Barr）核抗原的人胚肾细胞(HEK293-EBNA;LGCStandards,UK)在补充有4mM谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素和0.25mg/mL遗传霉素的Pro293a培养基(Lonza,Cat#12-764Q)中生长。使用FuGeneHD转染试剂(Roche,Cat#04709713001)和Pro293a培养基按照供应商的指示用表达食蟹猴c-Met/Fc的质粒瞬时转染HEK293-EBNA细胞。每2-3天收集条件培养基五次，同时在湿润的CO2培养箱(Binder,Cat#9140-0012CB150)中在37℃温育。将培养基离心，用具有0.22μmExpressPLUS膜(Millipore)的Stericup系统过滤，并且在POROSMabCaptureA基质柱(AppliedBiosystems,Cat#4374730)上纯化上清液，用50mM柠檬三钠pH3.0洗脱，并且立即用0.2×体积的1MTRIS-HClpH9中和。将蛋白溶液通过用D-PBS连续稀释缓冲液交换至D-PBS中，并且使用膜过滤浓缩器(Vivaspin2,50,000MWCO,SartoriusStediumCat#VS2031)浓缩。
3.2.2通过竞争性ELISA进行交叉反应性检测
在竞争性ELISA中检测抗-c-Met纳米抗体与食蟹猴c-Met/Fc的结合。
人重组c-Met/Fc(R&D系统)以2μg/mL的浓度包被在Maxisorp平板上。将固定浓度为0.17nM的纳米抗体（与在针对包被的人重组c-Met/Fc的结合ELISA中确定的EC50浓度相对应）用可溶性人c-Met/Fc（以120倍摩尔过量起始）、食蟹猴c-Met/Fc（以120倍摩尔过量起始）或人CTLA-4/Fc（作为对照）的稀释系列在室温预先温育1小时，然后将其加入到c-Met/Fc包被的ELISA平板中。使用小鼠抗-FLAG单克隆抗体(Sigma-Aldrich)和HRP缀合的兔抗-小鼠IgG(Dako)检测纳米抗体与人源化的人c-Met/Fc的结合。检测使用TMBOne溶液(Promega)进行。反应用2NH2SO4终止，并且在620nm校正条件下确定450nm处的吸光度。
纳米抗体与直接包被的人c-Met/Fc的结合受到人c-Met/Fc的抑制而不是CTLA-4/Fc的抑制。对于所有选择的纳米抗体先导物（leads），结合受到外源添加的食蟹猴c-Met/Fc的类似地抑制，这表示与人c-Met/Fc相当的亲和性。
在另外的实验中，还使用相同的竞争性ELISA设置针对小鼠c-Met/Fc(R&D系统)和犬科c-Met(R&D系统)检测物种交叉反应性。同样地，固定浓度为0.17nM的纳米抗体用鼠c-Met/Fc(120倍摩尔过量)或犬科诱饵（decoy）c-Met(240倍摩尔过量)的浓度系列在室温预先温育1小时。对于纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7),06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9)和06F10-9GS-Alb11(SEQIDNO:10)，仅能够在非常高浓度的鼠c-Met/Fc或(至甚至更低程度的)犬科c-Met观察到一些抑制。不能进行人和鼠或犬科c-Met之间的定量比较，但是清楚的是，鼠和犬科c-Met之间的交叉反应性非常低。
3.3c-Met阻断性纳米抗体结合c-Met的SEMA结构域
3.3.1制备重组人SEMA/Fc
为了确定纳米抗体亚结构域结合，将SEMA结构域（从E25至G519的成熟蛋白；UniprotrefP08581(MET_HUMAN)）融合到人Fc(IgG1亚型)上，其包括C端His6标签和在SEMA与Fc(SEQIDNO:100)之间的因子Xa切割位点。通过延伸PCR并且亚克隆到内部构建的、附加型复制的哺乳动物表达载体中而产生嵌合体。
转染HEK-EBNA细胞、产生和纯化重组蛋白如3.2.1所述进行。
3.3.2通过竞争性ELISA绘制表位
在竞争性ELISA中检测抗-c-Met纳米抗体与细胞外SEMA亚结构域的结合。
人重组c-Met/Fc(R&D系统)以2μg/mL的浓度包被在Maxisorp平板上。将固定浓度为0.17nM的c-Met纳米抗体（与在针对固定的人重组c-Met/Fc的结合ELISA中确定的EC50浓度相对应）用固定浓度的人c-Met/Fc（120倍摩尔过量）、人SEMA/Fc（180倍摩尔过量）或人CTLA-4/Fc（作为对照）在室温预先温育1小时，然后将其加入到c-Met/Fc包被的ELISA平板中。使用小鼠抗-FLAG单克隆抗体(Sigma-Aldrich)和HRP缀合的兔抗-小鼠IgG(Dako)检测纳米抗体与平板固定的人c-Met/Fc的结合。检测使用TMBOne溶液(Promega)进行。反应用2NH2SO4终止，并且在620nm校正条件下确定450nm处的吸光度。
纳米抗体与直接包被的人c-Met/Fc的结合受到人c-Met/Fc的抑制而不是CTLA-4/Fc的抑制。对于所有选择的纳米抗体先导物，与c-Met/Fc的结合受到外源添加的SEMA/Fc的抑制，这表示其与c-Met的SEMA结构域结合。
3.4c-Met阻断性纳米抗体不结合c-Met人同源物RON或PlexinD1
在竞争性ELISA中检测标记的(SEQIDNO:6)抗-c-Met纳米抗体(SEQIDNO:s7-10)与c-Met的两种紧密同源物的交叉反应性。RON(MSP-R,GenBank:X70040.1)与c-Met的细胞外结构域共有29%的氨基酸序列同一性，PlexinD1(GenBank:AY116661.1)共有16%的同源性。
人重组c-Met/Fc(R&D系统)以2μg/mL的浓度包被在Maxisorp平板上。将固定浓度为0.17nM的c-Met纳米抗体（与在针对包被的人重组c-Met/Fc的结合ELISA中确定的EC50浓度相对应）用人c-Met/Fc（以230倍摩尔过量起始）、RON（以990倍摩尔过量起始）或PlexinD1（以440倍摩尔过量起始）的稀释系列在室温预先温育1小时，然后将其加入到c-Met/Fc包被的ELISA平板中。使用小鼠抗-FLAG单克隆抗体(Sigma-Aldrich)和HRP缀合的兔抗-小鼠IgG(Dako)检测纳米抗体与固定的人c-Met/Fc的结合。检测使用TMBOne溶液(Promega)进行。反应用2NH2SO4终止，并且在620nm校正条件下确定450nm处的吸光度。
对于抗-c-Met纳米抗体，没有检测到与RON或PlexinD1的交叉反应性。
实施例4:c-Met阻断纳米抗体在c-Met磷酸化测定中的激动剂活性
在如实施例1.6所述的磷酸化测定中表征两种纯化的标记(SEQIDNO:6)的纳米抗体(04E09-9GS-Alb-11(SEQIDNO:7)和06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9))的独立于HGF的c-Met激活能力。将由1μM降至0.23nM的抗-c-Met纳米抗体或5D5单克隆抗体的稀释系列在37℃应用至A549细胞上30min。将1/3的细胞裂解物应用到MSD磷酸化的c-Met测定平板上。汇集来自一式两份样品的裂解物。在洗掉未结合的物质后，加入硫代标记的c-Met检测抗体，并且使用扇形成像仪2400（SectorImager2400，MSD）读取平板。
从图2可以看出，04E09-9GS-Alb-11(SEQIDNO:7)和06C12-9GS-Alb11(SEQIDNO:9)直至1μM的浓度都没有表现出任何激动剂活性。相反，5D5mAb诱导c-Met磷酸化，最大值为约37nM。如预测的，HGF诱导c-Met磷酸化，最大效率在2nM-6nM之间。
实施例5:使用表面等离子体共振进行亲和力确定
在ProteOn(BioRad)上使用表面等离子体共振进行抗-c-Met纳米抗体-Alb11融合构建体04E09-9GS-Alb-11(SEQIDNO:7)的动力学分析。实验在ProteOnPBS/吐温缓冲液(磷酸缓冲的盐水,pH7.4,0.005%吐温20,cat.176-2720,BioRad)中在25℃进行。抗-人IgG(Fc)抗体(GEHealthcare)通过在两个配体通道上的胺偶联以约5300RU和2700RU的密度固定在ProteOnGLC传感器芯片(BioRad)上。在动力学分析过程中，将50nM重组人c-Met/Fc嵌合体(R&D系统)和150nM重组人CTLA4/Fc嵌合体(R&D系统)在3分钟的过程内以25μl/min注射到2个独立的通道中，然后在2分钟内以45μl/min注射04E09-9GS-Alb-11(SEQIDNO:7)。使用100nM,25nM,6.25nM,1.56nM和0.39nM的纳米抗体浓度进行动力学分析。通过以25μl/min注射3M氯化镁（试剂盒BR-1008-39的成分,GEHealthcare）80秒进行表面的再生。
纳米抗体04E09-9GS-Alb-11(SEQIDNO:7)以13.5pM的KD结合c-Met/Fc。没有观察到与重组人CTLA4/Fc对照嵌合体的结合。表8中比较4E9-9GS-Alb11结合的动力学常数和亲和力成熟的5D5Fabv2的公布的亲和力。
表8.通过表面等离子体共振(SPR)确定纳米抗体的亲和力
ka ka kd kd KD97 -->
ID 1/Ms Ka误差 1/s kd误差 M
04E09-9GS-Alb11 2.89E+06 283.3 3.89E-05 10.7 1.35E-11
5D5Fab v2 2.36E+05 1.47E-04 6.25E-10
5D5Fabv2亲和力数据获自公布的专利申请US2007/0092520A1,图4,5D5变体#78
实施例6:鉴定与04E09-9GS-Alb11结合相似表位的纳米抗体
为了增加与04E09-9GS-Alb11结合相似的表位的纳米抗体的全体成员，进行新一组的选择。
将由美洲驼450,451和452获得的噬菌体文库用于针对细胞（A549细胞和过表达食蟹猴c-Met的BAF3细胞）的2轮选择，如实施例1.3所述，修改之处在于结合的噬菌体的洗脱用1μM04E09纳米抗体(SEQIDNO:26)替代胰蛋白酶进行。设计这种洗脱方法产生相对于与c-Met抗原上其他（不重合的）表位结合的噬菌体对结合04E09表位的噬菌体的特异性富集。
将选择的输出结果在大肠杆菌TG1细胞中拯救。挑取菌落并且在96深孔平板（体积为1mL）中生长。通过加入IPTG诱导纳米抗体产生。纳米抗体包含C端c-myc和His6标签。按照标准方法制备周质提取物（体积：～100μl）。
在α筛选测定中筛选周质提取物，以确定这些纳米抗体是否抑制纳米抗体04E09与c-Met/Fc的结合。该测定主要如实施例1.5所述进行，但是用生物素酰化的04E09纳米抗体（内部制备、纯化并生物素酰化）替代生物素酰化的HGF。
鉴定了363个抑制纳米抗体04E09与人c-Met结合的克隆。测序后，能够将这些克隆分成26个不同的家族，其中14个是之前尚未鉴定的。因此，使用胰蛋白酶或04E09洗脱总共鉴定了60个与c-Met结合的家族。
再对所述363个克隆进行筛选，筛选其在α筛选测定中抑制HGF与c-Met/Fc结合的能力（参见实施例1.5）。该筛选证实与纳米抗体04E09的类似的所有纳米抗体结合表位也能够抑制HGF与c-Met/Fc的结合。
在26个与04E09的表位结合的纳米抗体家族中，25个(96%)来源于VHH1种系。使用胰蛋白酶洗脱鉴定的、发现不与同04E09重合的表位结合的34个家族中，只有3个(9%)是VHH1型。这表明，对于VHH1型纳米抗体或VHH1型免疫球蛋白单可变结构域，与纳米抗体04E09靶向的表位区的结合是特别有利的。
实施例7:评估04E09的不同变体
构建纳米抗体04E09的突变体，其中Leu49被体积较小的Ser残基替代(L49S,SEQIDNO:23)。另外，构建克隆04E09的两个变体，以研究VHH1-特异性二硫键(C50S/C100bG,SEQIDNO:24)和规范的二硫键(C22A/C92S,SEQIDNO:25)对效力的重要性。如实施例1.7所述制备具有SEQIDNO:s23-25的纳米抗体。
7.1竞争性FACS
标记(SEQIDNO:6)的具有SEQIDNO:s23-25的抗-c-Met纳米抗体的从1μM降至0.5pM的稀释物系列与0.5nM生物素酰化的HGF混合，并且与2×105个稳定转染食蟹猴c-Met的BAF3细胞一起在4℃温育2小时（参见实施例3.1）。将细胞彻底洗涤，然后通过链霉抗生物素蛋白-PE检测与细胞表面表达的c-Met结合的生物素酰化的HGF。如之前的实施例所述，在FACSarray流式细胞仪上分析细胞。
SEQIDNO:23和SEQIDNO:25具有与亲本纳米抗体SEQIDNO:7(=04E09-9GS-Alb11)相似的IC50。这表明Kabat位置Leu49突变为Ser(L49S,SEQIDNO:23)或Cys22突变为Ala和Cys92突变为Ser(C22A/C92S,SEQIDNO:25)对配体结合阻断功效没有影响。然而，Kabat位置Cys50突变为Ser和Cys100b突变为Gly(SEQIDNO:24)降低功效～35倍。
表9.通过竞争性FACS确定的04E09突变体的阻断活性
ID IC50[M] %抑制
5D5mAb 6.7E-09(n=3) 100(参比)
04E09-9GS-Alb11(SEQ ID NO:7) 5.7E-10 100
04E09(L49S)-(SEQ ID NO:23)* 6.1E-10 100
04E09(C50S/C100bG)-(SEQ ID NO:24)* 2.0E-08 100
04E09(C22A/C92S)-(SEQ ID NO:25)* 4.9E-10 101
*用3xFlag-His6(SEQIDNO:6)标记，如实施例1.7所述。
7.2磷酸化测定
在如实施例1.6所述的HGF-依赖性磷酸化测定中表征纯化的标记(SEQIDNO:6)的具有SEQIDNO:23-25的抗-c-Met纳米抗体。从1μM降至0.23nM的抗-c-Met纳米抗体的稀释系列与A549细胞上的1nMHGF在37℃共同温育15min。然后将1/3的细胞裂解物应用到MSD磷酸化的c-Met测定平板上。汇集来自一式两份样品的裂解物。洗掉未结合的物质后，加入硫代标记的c-Met检测抗体，并且使用扇形成像仪2400(SectorImager2400，MSD)读取平板。
Kabat位置Leu49突变为Ser(L49S,SEQIDNO:23),或Cys22突变为Ala和Cys92突变为Ser(C22A/C92S,SEQIDNO:25)不影响纳米抗体04E09的功效。Kabat位置Cys50突变为Ser和Cys100b突变为Gly(SEQIDNO:24)降低功效，使得几乎没有保留任何抑制作用(表10)。
表10.抑制A549肿瘤细胞中的HGF-依赖性c-Met磷酸化
ID IC50[M]
04E09-9GS-Alb11(SEQ ID NO:7) 2.3E-09
04E09(L49S)-(SEQ ID NO:23)* 3.1E-09
04E09(C50S/C100bG)-(SEQ ID NO:24)* 没有曲线拟合
04E09(C22A/C92S)-(SEQ ID NO:25)* 3.8E-09
*用3xFlag-His6(SEQIDNO:6)标记，如实施例1.7所述。
7.3使用表面等离子体共振确定04E09突变体的亲和力
在ProteOn(BioRad)上使用表面等离子体共振进行04E09突变体04E09(C50S/C100bG,SEQIDNO:24)和04E09(C22A/C92S,SEQIDNO:25)的动力学分析。实验如实施例5中所述进行。
纳米抗体04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)和04E09(C22A/C92S,SEQIDNO:25)对重组人c-Met/Fc的亲和力、on-和off-速率是相当的。04E09(C50S/C100bG,SEQIDNO:24)具有低10倍的on-速率和off-速率，这导致与04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)或04E09(C22A/C92S,SEQIDNO:25)相比，显著更低的针对重组人c-Met/Fc的亲和力。没有分析物表现出与对照重组人CTLA4/Fc嵌合体的结合(参见表11)。
表11.通过表面等离子体共振确定纳米抗体的亲和力
实施例8:抗-c-Met纳米抗体的序列优化
通常，在序列优化过程中，突变亲本野生型序列，以产生更类似于人VH3-JH种系共有序列的序列。以保持蛋白结构、抗体亲抗原性和稳定性不变的方式，将在与人VH3-JH种系共有序列之间不同的构架区中的特定氨基酸改变为人对应物。为了研究此，在三种不同的测定中比较所有序列优化的变体和亲本纳米抗体：(i)在热转换测定（ThermalShiftAssay，TSA）中确定解链温度(Tm)，(ii)在HGF-竞争性α筛选中分析体外功效，(iii)在c-Met磷酸化测定中分析体外功效，和(iv)分析性大小排阻(SEC)分析。
在TSA测定中，将纳米抗体稀释为0.2mg/ml的浓度，并且使用Lightcycler(Roche)进行检测，在SyproOrange（一种与在蛋白解折叠时暴露的Trp残基结合的染料）的存在下，通过逐渐升高温度在不同pH确定解链温度(Tm)。HGF-竞争性α筛选如实施例2(2.3.1)所述进行。c-Met磷酸化测定如实施例2(2.4)所述进行。在SEC分析中，在Phenomenex基质上分析纳米抗体以允许检测多聚体或聚集体。
8.104E09的序列优化
对于序列优化，研究下述突变：E1D,A74S,K83R和G88A。在重新克隆过程中引入另一个突变：Q108L，该突变对功效或Tm没有影响。产生3个独立的突变体，如表12所示：
表12
克隆编号 依据的SEQ ID NO 引入的突变**
A00790067* 114 Q108L
A00790068* 115 A74S,K83R,Q108L
A00790069* 116 A74S,K83R,G88A,Q108L
A00790105* 102 E1D,A74S,K83R,G88A,Q108L
*用3xFlag-His6(SEQIDNO:6)标记，如实施例1.7所述。
**相对于04E09-9GS-Alb11(SEQIDNO:7)
所有构建体均克隆在大肠杆菌表达载体中，并且在大肠杆菌中在0.5L-1.5LTB培养基的培养体积中表达为3×FLAG-His6-标记的蛋白(如实施例1.7所述)。加入1mMIPTG诱导表达并且允许在37℃和250rpm继续4小时。沉淀细胞，并且通过冻融和重悬在dPBS中制备周质提取物。这些提取物用作起始物质用于使用HistrapFF粗提柱(GEhealthcare)进行的固定的金属亲和层析(IMAC)。用250mM咪唑将纳米抗体从柱上洗脱下来，并且随后针对dPBS脱盐。通过还原SDS-PAGE和使用抗-His6和抗-VHH检测的蛋白质印迹证实纳米抗体的纯度和完整性。
如表13总结的，A74S,K83R和Q108L突变对功效或热稳定性没有明显作用。G88A突变导致Tm下降约1℃，但是功效却保持不变。类似地，另外的突变E1D不影响Tm或功效。
表13
此外，A00790068(参见SEQIDNO:115)和A00790069(参见SEQIDNO:116)在Phenomenex基质上的分析SEC中的表现与A00790067(参见SEQIDNO:114)的表现相似。纳米抗体在预计的分子量处洗脱下来，并且没有观察到显著的聚集。A00790105(参见SEQIDNO:102)显示一个小的后峰（post-peak），这可能表示低程度的降解。
总之，序列优化产生蛋白结构、活性和稳定性保持与野生型克隆的蛋白结构、活性和稳定性相似的纳米抗体。
实施例9:纳米抗体04E09-9GS-Alb11在U87MG异种移植模型中的体内功效
在异种移植在免疫缺陷小鼠中的人U87MG（HTB-14,美国典型培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection））胶质母细胞瘤肿瘤的模型中评估04E09-9GS-Alb11纳米抗体(SEQIDNO:7)的抗肿瘤效果。U87MG表达c-Met以及配体HGF(自分泌环)。雌性瑞士裸鼠（SWISSNudemice）在右侧腹皮下注射一千万(107)个U87MG细胞以诱导肿瘤生长。当达到195mm3的平均肿瘤体积时，将小鼠随机分成3个治疗组，如表14所述，并且开始治疗。小鼠总共治疗3周，之后停止治疗，并且再持续5周进一步监测肿瘤复发。在研究过程中，每周监测并记录体重和肿瘤体积(mm3)(=(长x宽2)/2)。在研究结束时，处死所有小鼠，或者如果肿瘤体积大于2000mm3，则更早地处死小鼠。
表14.高剂量U87MG异种移植研究中治疗组、每组的动物数目、剂量、给药途径和治疗时间表的总结
如图5所示，04E09-9GS-Alb11纳米抗体（在该图中表示为A00790035）在HGF-依赖性U87MG异种移植模型中表现出肿瘤生长抑制。这种肿瘤抑制在治疗组与赋形剂组之间表现得显著不同（纵向分析肿瘤体积，LS意指在最后治疗日的差异；p<0.0001）。分析T(治疗的)/C(对照)%比率，该比率是肿瘤生长抑制的测量并且定义为治疗组的中值肿瘤体积与赋形剂治疗组的比率。在治疗结束（第19天）时，A00790035纳米抗体与参比化合物替莫唑胺的%T/C比率分别为7.3%和15.2%。替莫唑胺是胶质母细胞瘤的标准护理物，并且用作阳性对照以在早些时候验证U87MG异种移植模型。
总之，与替莫唑胺相比，纳米抗体更有效地抑制HGF-依赖性肿瘤，并且特别是胶质母细胞瘤。
实施例10:纳米抗体04E09-9GS-Alb11在KP4异种移植模型中的体内功效
在第二HGF-和c-Met-依赖性异种移植模型中进一步评估04E09-9GS-Alb11纳米抗体(SEQIDNO:7)的体内功效，在该模型中，雌性nu/nu小鼠皮下接种一千万(107)个KP4胰腺瘤细胞（RCB1005,Riken生物资源中心细胞库(RikenBiosourceCenterCellBank)）。KP4细胞也具有针对HGF和c-Met的自分泌环。达到125mm3的平均肿瘤体积后，将小鼠随机分成3个治疗组，如表15所述，并且开始治疗，总共持续15天。在研究过程中，每周监测并记录体重和肿瘤体积(mm3)(=(长x宽2)/2)三次。直到研究终止时所有小鼠保持存活。
表15.高剂量KP4异种移植研究中治疗组、每组的动物数目、剂量、给药途径和治疗时间表的总结
图6表明，在该异种移植模型中，04E09-9GS-Alb11纳米抗体（在该图中表示为A00790035）能够抑制肿瘤生长并且引起肿瘤消退。在最后一次给药后一天，04E09-9GS-Alb11和吉西他滨治疗的小鼠分别达到6.3%和23.7%的T/C比率。吉西他滨是胰腺瘤的标准护理物，并且用作阳性对照以在早些时候验证KP4异种移植模型。
总之，与吉西他滨相比，纳米抗体更有效地抑制HGF-依赖性肿瘤，并且特别是胰腺瘤。并且，纳米抗体促进肿瘤消退。
实施例11:纳米抗体A00790171的体内功效
考虑实施例10中提供的结果，基于A00790105(参见表12)，构建04E09-9GS-Alb11纳米抗体(SEQIDNO:7)的序列优化的变体。该序列优化的变体表示为A00790171(A00790105-9GS-Alb11;SEQIDNO:113)。
在另外两个HGF自分泌异种移植研究中进一步评估该序列优化的变体A00790171的体内功效。
人HGF转基因C3H-SCID小鼠皮下接种非小细胞肺癌细胞(NSCLC)。A00790171纳米抗体以10mg/kg的高剂量给药。在癌症发作后，将小鼠随机分成3个治疗组：(i)赋形剂；(ii)A00790171；和(iii)阳性对照。开始治疗，总共持续15天。在研究过程中，每周监测并记录体重和肿瘤进展三次。直至研究结束时所有小鼠保持存活。
为了确定A00790171的有效剂量，如实施例10所述，在KP4胰腺异种移植模型中进行PK/PD研究。以从0.1至100mg/kg范围内的剂量开始实验，以确定有效剂量。
实施例12:A00790171针对多发性骨髓瘤细胞系中HGF-驱动的增殖和迁移的体外功效
在c-Met阳性人多发性骨髓瘤细胞中评估A00790171对HGF诱导的增殖和迁移的体外功效。增殖实验按照Hov等(Hov等，2004;ClinCancerRes（临床癌症研究）10,6686-6694;和Hov等,2009;EurJHaematology（欧洲血液学杂志）82,277-287)使用HGF自分泌(ANBL-6)以及旁分泌(INA-6和OH-2)多发性骨髓瘤细胞系进行。简言之，培养细胞（RPMI1640，其具有10%胎牛血清(ANBL-6和INA-6)或10%人血清(OH-2),2mmol/LL-谷氨酰胺和40μg/ml庆大霉素;2ng/mlIL-6作为维持因子），并且接种在96孔细胞培养板中（10.000-30.000个细胞/孔）。在不含Il-6的培养基中洗涤细胞后，将细胞与剂量范围系列或恒定浓度的A00790171纳米抗体或作为阳性对照的PHA-665752一起温育30分钟，然后加入HGF(200ng/ml)(仅对于HGF旁分泌细胞)。PHA-665752(TocrisBioscience)是c-Met和其他相关家族成员的小分子抑制剂。48小时后，细胞用每孔1微居的甲基-[3H]胸苷脉冲，并且18小时后收集，以在Matrix96β计数器(Packard)上测量β辐射。如图7所示，用A00790171（在该图中表示为抗-c-Met纳米抗体）治疗观察到对增殖的完全抑制，IC50值约为3nM，并且完全抑制约1μM的A00790171。此外，在HGF旁分泌细胞系INA-6中，用10nM的A00790171治疗时，观察到对HGF-诱导的增殖基线水平的特异性且完全的抑制(图8)。A00790171特异性针对HGF-诱导的增殖，并且在所用的最大浓度(1μM)没有表现出非特异性的抑制作用。在HGF旁分泌OH-2细胞系中类似的实验也导致更中度的HGF诱导的增殖的抑制（数据未显示）。
使用INA-6细胞并且按照Holt等，(2008;Haematologica93,619-622)进行迁移实验。简言之，将INA-6细胞接种（4x105个细胞）在聚碳酸酯膜Transwell(Corning;孔尺寸)的上部区室中，并且用1μMA00790171(在该图中表示为抗-c-Met纳米抗体)或200nMPHA-665752（小分子c-Met抑制剂PHA-665752）温育。30分钟后，加入150ng/mLHGF或75ng/mLSDF-1α作为阳性促迁移细胞因子。在37℃和5%CO2温育22–24小时后，通过Coulter计数器Z1（CoulterCounterZ1，BeckmanCoulter,Fullerton,CA）确定通过膜迁移到下部区室中的细胞数目。如图9所示，A00790171完全阻断HGF-诱导的INA-6细胞迁移。由于SDF-1α-诱导的INA-6细胞迁移不被抑制，因此该作用是对HGF特异性的。
总之，A00790171能够在体外阻断人HGF自分泌和旁分泌多发性骨髓瘤细胞的增殖和迁移。
实施例13:分析二特异性c-Met/EGFR纳米抗体对PI3K信号传导的功效
c-Met以及EGFR可以通过传送促有丝分裂信号的PI3K途径进行信号传导。为了证明EGFR和c-Met受体的同时靶向，可以监测AKT的磷酸化，其为PI3K途径中的下游靶标。为了这一目的，基本上如实施例1.6所述，将未刺激的细胞、用EGF或HGF处理的细胞或用两种细胞因子处理的细胞平行地用非特异性的亲本对照或二特异性纳米抗体温育。备选地，人们还可以评估过表达EGFR和/或具有自分泌HGF环（其激活c-Met信号传导）的细胞。AKT是PI3K途径的主要下游信号传导成分，并且该蛋白的磷酸化是通过该途径信号传导的关键指示。
实施例14:分析二特异性c-Met/EGFR纳米抗体对MAPK信号传导的功效
EGFR和c-Met受体可以通过MAPK途径信号传导。为了证明EGFR和c-Met受体的靶向，可以监测ERK1/2的磷酸化，其为MAPK途径的主要下游靶标。为了这一目的，基本上如实施例1.6所述，将未刺激的细胞、用EGF或HGF处理的细胞或用两种细胞因子处理的细胞平行地用非特异性的、单特异性的或二特异性纳米抗体温育。备选地，人们还可以评估过表达EGFR和/或具有自分泌HGF环（其激活c-Met信号传导）的细胞。
实施例15:分析二特异性c-Met/EGFR纳米抗体抑制增殖的功效
A431细胞展示高细胞表面水平的EGFR和c-Met的中等高细胞表面表达，这在其他研究中独立地得到证实。
通过二特异性c-Met/EGFR纳米抗体抑制A431增殖可以在48小时后在CellTiterGlow(TM)测定中测量或基本上如实施例2.6所述测量。
实施例16:体外分析用二特异性纳米抗体处理后细胞的迁移
活性c-Met信号传导参与细胞迁移和侵入。二特异性纳米抗体可以通过测量对HGF-诱导的迁移的抑制而确定。为了这一目的，在存在或不存在所述二特异性纳米抗体、针对c-Met的单特异性纳米抗体和EGFR抑制剂的条件下，用HGF处理HGF-可诱导的细胞系A549，基本上如实施例2.6所述。备选地，使用CIM-平板作为读出，在Acea实时分析仪（AceaRealTimeanalyzer）上以时间依赖性方式测量通过8μm孔的细胞迁移。
实施例17:分析二特异性c-Met/VEGF纳米抗体在KP4胰腺异种移植肿瘤模型中的功效
在由RPMI1640培养基(Invitrogen),2mML-谷氨酰胺和10%胎牛血清组成的生长培养基中培养KP4细胞。为了制备用于接种到小鼠中的细胞，胰蛋白酶消化细胞并且随后用10毫升无菌IX磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。通过锥虫蓝排除法计数细胞子集，并且将其余的细胞重悬在100μl无菌IXPBS中至每毫升5x107个细胞的浓度。小鼠在右肩胛下区域皮下接种5x106个KP4细胞。监测肿瘤，直至其达到230mm的平均体积。
将小鼠随机分成5组，每组十只小鼠，并且开始治疗。组1中小鼠用单特异性c-Met纳米抗体治疗。组2中小鼠用单特异性VEGF纳米抗体治疗。组3中小鼠用二特异性c-Met/VEGF纳米抗体治疗。组4中小鼠用单特异性VEGF纳米抗体以及单特异性c-Met纳米抗体治疗。组5中小鼠用阴性对照（不相关的纳米抗体）治疗。肿瘤体积每周测量两次，并且监测动物25天。
实施例18:分析二特异性c-Met/VEGF纳米抗体在NSCLC异种移植肿瘤模型中的功效
在由RPMI1640培养基(Invitrogen),2mML-谷氨酰胺和10%胎牛血清组成的生长培养基中培养人NSCLC细胞(A549,DSMZ,Braunschweig,德国)。为了制备用于接种到小鼠中的细胞，胰蛋白酶消化细胞并且随后用10毫升无菌IX磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。通过锥虫蓝排除法计数细胞子集，并且将其余的细胞重悬在100μl无菌IXPBS中至每毫升5x107个细胞的浓度。小鼠在右肩胛下区域皮下接种5x106个人A549细胞。监测肿瘤，直至其达到200mm的平均体积。
将小鼠随机分成5组，每组十只小鼠，并且开始治疗。组1中小鼠用单特异性c-Met纳米抗体治疗。组2中小鼠用单特异性VEGF纳米抗体治疗。组3中小鼠用二特异性c-Met/VEGF纳米抗体治疗。组4中小鼠用单特异性VEGF纳米抗体以及单特异性c-Met纳米抗体治疗。组5中小鼠用阴性对照（不相关的纳米抗体）治疗。肿瘤体积每周测量两次，并且监测动物25天。
实施例19:分析三特异性c-Met/VEGF/EGFR纳米抗体在NSCLC异种移植肿瘤模型中的功效
在由RPMI1640培养基(Invitrogen),2mML-谷氨酰胺和10%胎牛血清组成的生长培养基中培养人NSCLC细胞(A549,DSMZ,Braunschweig,德国)。为了制备用于接种到小鼠中的细胞，胰蛋白酶消化细胞并且随后用10毫升无菌IX磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。通过锥虫蓝排除法计数细胞子集，并且将其余的细胞重悬在100μl无菌IXPBS中至每毫升5x107个细胞的浓度。小鼠在右肩胛下区域皮下接种5x106个人A549细胞。监测肿瘤，直至其达到200mm的平均体积。
将小鼠随机分成6组，每组十只小鼠，并且开始治疗。组1中小鼠用单特异性c-Met纳米抗体治疗。组2中小鼠用单特异性VEGF纳米抗体治疗。组3中小鼠用单特异性EGFR纳米抗体治疗。组4中小鼠用单特异性VEGF纳米抗体、单特异性EGFR纳米抗体以及单特异性c-Met纳米抗体治疗。组5中小鼠用三特异性c-Met/VEGF/EGFR纳米抗体治疗。组6中小鼠用阴性对照（不相关的纳米抗体）治疗。肿瘤体积每周测量两次，并且监测动物25天。
实施例20:所选的VHH的亲和力成熟
20.133H10进行两个循环的亲和力成熟。
在第一循环中，使用易错PCR法向构架(FW)和互补决定区(CDR)二者中随机引入氨基酸取代。使用1ng33H10cDNA模板以两轮基于PCR的方法（GenemorphII随机诱变试剂盒(GenemorphIIRandomMutagenesiskit)，获自Stratagene,LaJolla,CA,USA）进行诱变，然后使用0.1ng第1轮的产物进行第二易错PCR。在纯化步骤后，将PCR产物通过独特的限制性位点插入到载体中，该载体设计用于促进VHH文库的噬菌体展示。使用减少浓度的生物素酰化的重组食蟹猴cMet(biot-rcycMet)和胰蛋白酶洗脱进行连续几轮的溶液中选择。还在第三和第四轮中进行使用冷(cold)rcycMet(与biot-rcycMet相比，至少100x过量)的亲和力驱动的选择。使用来源于pUC19的表达载体将单个突变体制备为重组蛋白，所述pUC19包含LacZ启动子、青霉素抗性基因、多克隆位点和ompA前导序列(pAX50)。用表达载体文库转化大肠杆菌TG1细胞，并且涂布在琼脂板（LB+Amp+2%琼脂糖）上。从琼脂板上挑取单个菌落，并且在1mL96-深孔平板中生长。通过加入IPTG(1mM)诱导VHH表达。按照标准方法制备周质提取物（体积为～80μL），并且在纳米抗体-竞争性α筛选测定（如2.3.1所述）中和在ProteOn(BioRad,Hercules,CA,USA)off-速率测定中筛选其与重组人cMet/Fc的结合。简言之，GLCProteOn传感器芯片在一个“配体通道”（另一个“配体通道”作为参比通道）上用重组人cMet/Fc包被。将亲和力成熟克隆的周质提取物1/10稀释，并且注射到“分析物通道”A1-A6中。计算平板中存在的亲本克隆的平均off-速率，并且用作参比来计算off-速率的改善。
在第二循环中，通过同时随机化处理在第一循环中鉴定的敏感位置产生组合文库。为此，使用在随机化位置简并的寡核苷酸(NNS)通过重叠PCR合成全长33H10cDNA，并且进行拯救PCR。如上述，使用特异性限制性位点将随机化的VHH基因插入到噬菌体展示载体(pAX212)中。如前述进行单个VHH克隆的周质提取物的制备。
在TSA测定中，将纳米抗体稀释至0.2mg/ml的浓度，并且使用Lightcycler(Roche)进行检测，在SyproOrange（一种与在蛋白解折叠时暴露的Trp残基结合的染料）的存在下，通过逐渐升高温度在不同pH确定解链温度(Tm)。HGF-竞争性α筛选如实施例2(2.3.1)所述进行。在SEC分析中，在Phenomenex基质上分析纳米抗体以允许检测多聚体或聚集体。
实施例21:33H10的序列优化
对于序列优化，研究下述突变：E1D,A14P,E43K,S71R,S72D,A74S,N82bS和Q108L。产生16个单个突变体，如表16所述(SEQIDNO:s117-132)。
所有构建体克隆在大肠杆菌表达载体中，并且在大肠杆菌中在0.5L-1.5LTB培养基的培养体积中表达为3×FLAG-His6-标记的蛋白。加入1mMIPTG诱导表达并且允许在37℃和250rpm继续4小时。沉淀细胞，并且通过冻融和重悬在dPBS中制备周质提取物。这些提取物用作起始物质用于使用HistrapFF粗提柱(GEhealthcare)进行的固定的金属亲和层析(IMAC)。用250mM咪唑将纳米抗体从柱上洗脱下来，并且随后针对D-PBS脱盐。通过还原SDS-PAGE和使用抗-His6和抗-VHH检测的蛋白质印迹证实纳米抗体的纯度和完整性。
表16
克隆号 引入的突变* SEQ ID NO106 -->
A007900737 A14P，A74S 117
A007900739 A14P，A74S，N82bS 118
A007900740 A14P，S72D，A74S 119
A007900741 A14P，S72D，A74S，N82bS 120
A007900742 A14P，S71R，A74S 121
A007900743 A14P，S72D，A74S 122
A007900744 A14P，S71R，A74S，N82bS 123
A007900745 A14P，S71R，S72D，S74S，N82bS 124
A007900746 A14P，E43K，A74S 125
A007900747 A14P，E43K，A74S，N82bS 126
A007900748 A14P，E43K，S72D，A74S 127
A007900749 A14P，E43K，S72DMA74S，N82bS 128
A007900750 A14P，E43K，S71R，A74S 129
A007900751 A14P，E43K，S71R，S72D，A74S 130
A007900752 A14P，E43K，S71R，A74S，N82bS 131
A007900753 A14P，E43K，S71R，S72D，A74S，N82bS 132
*相对于A007900184(SEQIDNO:151)。
在三个不同的测定中检测纯化的纳米抗体：(i)在热转换测定（ThermalShiftAssay，TSA）中确定解链温度(Tm)，(ii)在HGF-竞争性α筛选中分析体外功效，和(iii)分析性大小排阻(SEC)分析。
在TSA测定中，将纳米抗体稀释为0.2mg/ml的浓度，并且使用Lightcycler(Roche)进行检测，在SyproOrange（一种与在蛋白解折叠时暴露的Trp残基结合的染料）的存在下，通过逐渐升高温度在不同pH确定解链温度(Tm)。HGF-竞争性α筛选如实施例2(2.3.1)所述进行。在SEC分析中，在Phenomenex基质上分析纳米抗体以允许检测多聚体或聚集体。
如表17总结的，S71R突变对效力有损害作用，并且将从最终序列优化的克隆中排除；Tm略微增加约0.5℃。E43K突变对效力有微小的损害作用；Tm略微增加3-4℃，指示克隆增加的稳定性；该突变将与亲和力成熟突变组合重新检测。所有其他突变均不影响效力，并且将包括在序列优化中。
表17
此外，克隆A007900738至A007900753在Phenomenex基质上的分析性SEC中的移动性与亲本克隆A007900184的移动性相似。所述纳米抗体在预测的分子量处洗脱下来并且没有观察到显著的聚集。
总之，序列优化产生蛋白结构、活性和稳定性保持与野生型克隆的蛋白结构、活性和稳定性相似的纳米抗体。
实施例22:序列优化与亲和力成熟突变的组合
将在实施例20和21中鉴定的突变组合为表18中总结的一组9个单个的克隆。
表18
*相对于A007900184(SEQIDNO:151)。
构建体A007901245至A007901253(SEQIDNO:s133-141)克隆在大肠杆菌表达载体中，并且在大肠杆菌中在0.5L-1.5LTB培养基的培养体积中表达为3×FLAG-His6-标记的蛋白。加入1mMIPTG诱导表达并且允许在37℃和250rpm继续4小时。沉淀细胞，并且通过冻融和重悬在dPBS中制备周质提取物。这些提取物用作起始物质用于使用HistrapFF粗提柱(GEhealthcare)进行的固定的金属亲和层析(IMAC)。用250mM咪唑将纳米抗体从柱上洗脱下来，并且随后针对D-PBS脱盐。通过还原SDS-PAGE和使用抗-His6和抗-VHH检测的蛋白质印迹证实纳米抗体的纯度和完整性。
在三种不同的测定中检测纯化的纳米抗体：(i)在热转换测定（ThermalShiftAssay，TSA）中确定解链温度(Tm)，(ii)在HGF-竞争性α筛选中分析体外功效，(iii)基于细胞的c-Met磷酸化测定，(iv)基于细胞的增殖测定，和(v)分析性大小排阻(SEC)分析。
TSA测定如上述进行。HGF-竞争性α筛选如实施例2(2.3.1)所述进行。基于细胞的c-Met磷酸化测定如实施例1.6所述进行。基于细胞的增殖测定如实施例2.5所述进行。在SEC分析中，在Phenomenex基质上分析所述纳米抗体，以允许检测多聚体或聚集物。
表19
*由于缺少足量的顶部平台水平数据点，IC50不是正确确定的。
A,B分别来自平行进行的平板1或2的数据点
亚选择的纳米抗体在其C端融合抗-人血清白蛋白(HSA)结合纳米抗体(ALB11)，二者由9GS-接头分隔。构建体具有另外的C端丙氨酸残基。
在巴斯德酵母菌中在5mL的培养体积中表达纳米抗体。通过加入甲醇诱导纳米抗体表达，并且允许在30℃继续48小时。澄清的上清液用作起始物质用于通过蛋白质A亲和层析(MabCapAPOROS,AppliedBiosystems)进行纯化。
在热转换测定中、通过分析大小和在HGF-竞争性α筛选中检测纳米抗体；后者进行了修改（与初始描述的设置相比）以有更高的灵敏性：将生物素酰化的HGF浓度由0.1nM增加至0.4nM，并且将cMet/Fc的浓度由0.1nM降至0.016nM(参见表20)。
克隆A007901255至A007901260在Phenomenex基质上的分析性SEC中的移动相相似：所述纳米抗体在预测的分子量处洗脱下来，并且没有观察到显著的聚集。
表20
实施例23:在KP4异种移植模型中，可溶性c-Met对纳米抗体04E09-9GS-Alb11的响应
在HGF-和c-Met-依赖性异种移植模型中进一步评估可溶性c-Met对用04E09-9GS-Alb11纳米抗体(克隆A00790035,SEQIDNO:7)治疗的响应，在所述模型中，雌性nu/nu小鼠皮下接种一千万(107)个KP4胰腺瘤细胞(RCB1005,Riken生物资源中心细胞库(RikenBiosourceCenterCellBank))。KP4细胞也具有针对HGF和c-Met的自分泌环。达到125mm3的平均肿瘤体积后，小鼠随机用04E09-9GS-Alb11纳米抗体(10mg/kgi.p.Q2Dx3)或赋形剂(PBS,10ml/kgi.p.)治疗。小鼠治疗15天。在最后一次剂量后24小时（即，肿瘤植入后第22天），将用A00790035或赋形剂治疗的所有小鼠通过过暴露于二氧化碳处死以收集血液。通过末端心脏穿刺收集全血。为了确保血液和EDTA彻底混合，将EDTA管颠倒几次。然后将样品在4℃离心(9300rcf)5分钟，以产生血浆。将血浆倒出并且置于标记的微量离心管中。在分析之前将所有血浆样品冷冻并保存在-80℃。使用商购ELISA试剂盒(R&D系统)（验证适合目的）分析样品的可溶性c-Met水平。对每只动物显示可溶性c-Met水平，对两个治疗组显示平均值±平均值的标准误差。
如图10所述，与赋形剂治疗的小鼠(5.348ng/ml)相比，在04E09-9GS-Alb11纳米抗体治疗的小鼠(0.507ng/ml)中，中值可溶性c-Met水平极大减少。
总之，纳米抗体有效减少可溶性c-Met水平。此外，可以推论出样品中存在的可溶性c-Met的量提供了整体肿瘤负荷的清楚指示，并且突出了该生物标记用于监测疾病状态和施加的治疗的有效性的应用。
实施例24:在INA-6多发性骨髓瘤细胞系中，A00790171阻断HGF介导的c-Met磷酸化和MARK与Akt的下游信号
为了研究抗-c-Met纳米抗体A00790171通过其受体c-Met抑制HGF介导的信号传导的能力，在HGF-诱导的INA-6多发性骨髓瘤细胞系中研究c-Met上c-Met酪氨酸表位Tyr1234/1235,Tyr1346和Tyr1003的磷酸化水平。此外，评估下游蛋白p44/42MARK和Akt(Ser473)的磷酸化。平行地，确定总c-MET,总Akt和GADPH水平。c-Met酪氨酸激酶抑制剂PHA-665752(200nM)用作阳性对照(Hov等，2004;ClinCancerRes（临床癌症研究）10,6686-6694)。简言之，通过用Hanks'平衡的盐溶液(HBSS)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)洗涤四次使INA-6细胞耗尽人血清和IL-6，然后在不含血清的环境中饥饿3小时，并且接种在24孔平板中（在具有0,1%BSA的1000μLRPMI中的1,0x106个细胞）。细胞用A00790171(在c-MetTyr磷酸化实验中，0.1,0.25,0.5,1和1,5,10和50nM；在MARK和Akt磷酸化实验中，0.5,1和1nM)或PHA-665752(200nM)预温育20分钟，随后用或不用150-200ng/mLHGF处理5-7分钟。收集并离心后，将细胞重悬在裂解缓冲液（l%NP40,150mmol/LNaCl,50mmol/LTrisHCl7,5,10%甘油,1mmol/LNaF,2mmol/LNa3VO4和蛋白酶-磷酸酶抑制剂混合物((Completeminitablets,Roche,Basel,瑞士)）中。在冰上30分钟后，通过在4℃以12,000xg离心20分钟沉淀细胞核。样品与具有10mmol/L二硫苏糖醇的十二烷基硫酸锂样品缓冲液(Invitrogen,Carslbad,CA)混合，在98℃加热2分钟，并且在4-12%或10%Bis-tris凝胶（Invitrogen）上分离。然后，用干印迹系统（Invitrogen）将蛋白转移到硝基纤维素膜上。膜用在具有0,05%吐温20的Tris-缓冲盐水中的5%BSA或5%脱脂干奶粉封闭，并且用针对磷酸化的蛋白的抗体4℃温育过夜。检测使用辣根过氧化物酶-缀合的抗体(DAKOCytomation,Copenhagen,丹麦)和WestFemto最大灵敏性底物（WestFemtoMaxiumumSensitivitySubstrate，Thermoscientific,Rockford,IL,USA）进行。通过在含有62,5mmol/LTrisHCl(pH6.6),2%SDS和10mmol/L2-巯基乙醇的剥离缓冲液中轻轻旋转，在60℃剥离膜30分钟，然后在具有0,05%吐温20的Tris缓冲盐水中洗涤，用在具有0,05%吐温20的Tris缓冲盐水中的5%脱脂干奶粉或BSA封闭，并用针对非-磷酸-表位的抗体探测。针对磷酸化的p44/42MAP、总p44/42、磷酸化的Akt、总Akt、磷酸化的c-Met(Tyr1234/1235)、磷酸化的C-Met(Tyr1349)和总c-Met的抗体来源于信号传导技术（CellSignalingTechnology，Beverly,MA）。识别磷酸化的c-Met(Tyr1003)的抗体来源于Invitrogen(Camarillo,CA)。针对GAPDH的抗体来源于Abeam(Cambridge,英国)。
由图11可见，在HGF刺激(200ng/ml)INA-6细胞后，加入A00790171以剂量依赖性方式(0.1-1nM)减少c-Met在Tyr1349(A)、Tyr1234/1235(B)和Tyr1003(C)的磷酸化。高于1nM的纳米抗体浓度完全阻断c-Met磷酸化。还已知HGF与c-Met的结合介导p44/42MAPK和Akt的磷酸化。如图12所示，A00790171能够阻断HGF(150ng/ml)介导的p44/42MAPK(图12A)和Akt(图12B)的磷酸化。总之，A00790171阻断c-Met酪氨酸残基Tyr1349,Tyr1234/1235和Tyr1003的磷酸化以及下游蛋白p44/42MAPK和Akt(Ser473)的磷酸化。
实施例25：抗-c-Met纳米抗体A00790171阻断HGF介导的人骨髓瘤细胞系INA-6与纤连蛋白的粘附
骨髓中的多发性骨髓瘤细胞的粘附对骨髓瘤细胞的生长和存活是重要的。骨髓瘤细胞与骨髓基质蛋白的粘附表现为促进耐药性(DaitonWS,CancerTreatRev（癌症治疗综述）2003;29增刊1:11-9.)。先前表明HGF刺激骨髓瘤细胞与纤连蛋白的粘附(HoltRU等,2005,Haematologica,90(4):479-88)。目的是研究A00790171对HGF介导的INA-6细胞与纤连蛋白的粘附起什么作用。简言之，将96孔圆底微量平板(Sarstedt,Newston,NC)用人血浆纤连蛋白(在PBS中20μg/mL，80μL/孔)在4℃包被过夜，并用BSA(1mg/mL,100μL/孔)在室温封闭1小时，最后在HBSS中洗涤3次。INA-6细胞用HBSS洗涤三次，重悬在具有0,1%BSA的5mLRPMI中，并且用乙氧基甲酯-2',7二-(2-羧基乙基)-5-(和6)-羧基荧光素(BCECF-AM)（其为一种荧光染料）在37℃在偶尔的搅拌下温育1小时。用HBSS洗涤三次后，每孔接种3-5x104个细胞（取决于细胞的可用性），总体积为100μL，并且在37℃在5%CO2中温育2小时。用作为对照的BSA、HGF(150ng/ml)或作为阳性对照促迁移细胞因子的SDF-1α(75ng/ml)温育细胞。c-Met酪氨酸激酶抑制剂PHA-665752用作阳性对照。然后，将平板在HBSS中仔细洗涤4次，以去除不贴壁的细胞。将剩余的细胞溶解在50μL/孔的1%TritonX-100中。用VICTOR(PerkinElmer,Waltham,MA)荧光读数仪确定538nm处的荧光水平。当INA-6细胞与100nMA00790171预温育时，消除了HGF(150ng/ml)诱导的与纤连蛋白的粘附（图13）。SDF-1α-诱导的与纤连蛋白的粘附没有被所述纳米抗体显著影响，这表明纳米抗体的c-Met特异性作用。总之，A00790171阻断HGF诱导的INA-6细胞与纤连蛋白的粘附。
实施例26：A00790171消除成骨细胞发生的HGF-抑制
成骨细胞和破骨细胞是负责骨形成和再吸收的专门的细胞。在骨髓瘤骨病中，在骨稳态中存在异常调节，有助于破骨细胞发生（osteoclastogenesis）并且抑制骨形成。骨特异性碱性磷酸酶(bALP)由成骨细胞产生。在骨形成过程中，bALP的产量高，并且，因此，bALP是总骨形成活性的良好的指示剂(vanStraalenJP等,1991ClinChimActa;201(1-2):27-33)。组织形态测定研究已经表明bALP与骨形成的动力学参数之间的显著的相关性(Abildgaard等,2000,EurJHaematol（欧洲血液学杂志）2000;64(2):121-9)。已知HGF在体外对成骨细胞发生有抑制作用。添加HGF抑制通常用于早期成骨细胞分化的标记的bALP活性(Standal等,2007Blood（血液）;109(7):3024-30)。此外，已知HGF对人间充质干细胞(hMSCs)的体外矿化作用具有抑制作用。hMSCs的矿化可以通过茜素红-S(ARS)染色定量并显现。在本实验中，按照Standal等,2007(Blood（血液）;109(7):3024-30)所述的步骤评估A00790171对bALP活性和hMSCs的矿化作用的影响。
抗-c-Met纳米抗体A00790171以剂量依赖性方式消除了HGF(100ng/ml)对BMP_2诱导的bALP活性的抑制作用，并且在20nM以上的浓度，完全消除HGF对bALP活性的抑制作用（图14A）。A00790171(5nM)完全逆转HGF(100ng/ml)对hMSCs矿化作用的抑制作用，如在治疗21天后所定量或显现的（图14B-C）。这支持之前的发现。总之，A00790171消除了成骨细胞发生的HGF-抑制。

Claims (19)

1.能够将HGF从氨基酸序列为SEQIDNO:1的人c-Met上置换下来的免疫球蛋白单可变结构域，其IC50小于10nM，并且最大HGF置换水平为60％-80％或以上，其中所述免疫球蛋白单可变结构域是VHH结构域并且包含具有式(1)的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；
其中FR1-FR4是指构架区1-4，并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；
并且其中CDR1是SEQIDNO:51，CDR2是SEQIDNO:67，并且CDR3是SEQIDNO:83。
2.权利要求1的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述构架区(FRs)与SEQIDNO:102的FRs具有大于80％的序列同一性。
3.权利要求1的免疫球蛋白单可变结构域，其选自由以下组成的组：SEQIDNO:23，25，26，102，114，115或116。
4.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中在α筛选测定中的IC50为1.2nM以下。
5.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中在α筛选测定中的IC50为500pM以下。
6.包含权利要求1-5中任一项的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。
7.权利要求6的多肽，其另外包含与人血清白蛋白结合的免疫球蛋白单可变结构域。
8.权利要求7的多肽，其中所述与人血清白蛋白结合的免疫球蛋白单可变结构域是氨基酸序列为SEQIDNO:5的Alb11或氨基酸序列为SEQIDNO:101的Alb23。
9.权利要求6的多肽，其中所述多肽选自由以下组成的组：SEQIDNO:7，11，12，103-111,113,或188。
10.权利要求6-9中任一项的多肽，其中在α筛选测定中的IC50为1.2nM以下。
11.权利要求6-9中任一项的多肽，其中在α筛选测定中的IC50为500pM以下。
12.核酸序列，所述核酸序列编码：i)权利要求1-5中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；或ii)权利要求6-11中任一项的多肽。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含：i)权利要求1-5中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；或ii)权利要求6-11中任一项的多肽。
14.权利要求13的药物组合物，其中所述药物组合物还包含药用赋形剂。
15.权利要求1-5中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；或权利要求6-11中任一项的多肽在制备用于癌症的药物中的用途。
16.用于制备权利要求1-5中任一项的免疫球蛋白单可变结构域或权利要求6-11中任一项的多肽的方法，所述方法至少包含下述步骤：
a)在适当的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适当的表达系统中表达权利要求12的核酸序列。
17.权利要求16的方法，其中在步骤a)后还接着进行：
b)分离和/或纯化所述免疫球蛋白单可变结构域或所述多肽。
18.权利要求13的药物组合物在制备用于治疗受试者中至少一种与c-Met相关的疾病或病症的药物中的应用。
19.用于评估患有c-Met相关的疾病或病症的患者对治疗的响应性的试剂盒，所述试剂盒包含用于测量患者中可溶性c-Met的量的一种或多种试剂，所述试剂盒还包含：i)权利要求1-5中任一项的免疫球蛋白单可变结构域；或ii)权利要求6-11中任一项的多肽；或iii)权利要求13的药物组合物。
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