JP6219287B2 - ｃ−Ｍｅｔに関連する生物学的物質 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、ｃ−Ｍｅｔに関連する生物学的物質、より具体的にはポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする核酸；このようなポリペプチドを調製するための方法；このようなポリペプチドを発現するか又は発現することができる宿主細胞；予防目的、治療目的又は診断目的のための、このようなポリペプチドを含む組成物、特に医薬組成物に関する。患者のｃ−Ｍｅｔ治療に対する反応性を評価するための方法及びキットもまた記載及び提供される。
発明の背景
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、細胞成長、分化、新血管形成及び組織修復などの重要な細胞過程の主要制御因子である。正常な生理機能におけるそれらの重要性に加えて、ある種のＲＴＫの異常発現が、多くの種類のガンの発症及び進行に関係している。これらのＲＴＫは、ガン治療の有望な薬物標的として浮かび上がっている。
ＲＴＫ ｃ−Ｍｅｔは、分散因子としても公知の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の細胞表面レセプターである（Cooper et al. Nature 1984; 311:29-33; Bottaro et al. Science 1991;251:802-4）。ＨＧＦは９０ｋＤのマルチドメイン糖タンパク質であり、プラスミノーゲンセリンプロテアーゼファミリーのメンバーと非常に近縁である。それは、間葉細胞によって一本鎖の不活性ポリペプチドとして分泌され、多数のプロテアーゼによってその活性α／βヘテロダイマー細胞外型に切断される（Birchmeier et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2003;4:915-25）。α鎖ＮＨ２末端部分は、高親和性ｃ−Ｍｅｔレセプター結合ドメインを含有するが、β鎖は、レセプター活性化のためにはｃ−Ｍｅｔレセプターと相互作用する必要がある（Matsumoto & Nakamura Cancer Sci 2003;94:321-7）。ｃ−Ｍｅｔレセプターは、そのリガンドと同様に、細胞外α及びβ鎖からなるジスルフィド結合ヘテロダイマーである。β鎖のアミノ末端部分とヘテロダイマー化したα鎖は、細胞外ドメインに主なリガンド結合部位を形成する。ｃ−Ｍｅｔのカルボキシ末端尾部はチロシンＹ１３４９及びＹ１３５６を含み、これらがリン酸化されると、細胞内アダプタータンパク質のドッキング部位として機能して、下流のシグナル伝達につながる（Ponzetto et al. Mol Cell Biol 1993;13:4600-8）。ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ経路は、浸潤性成長プログラム、すなわち、細胞増殖、分散、遊走、生存及び組織浸潤を含む一連のイベントの主な原動力である。正常な状況下では、浸潤性成長プログラムは、胚形成における正確な器官形成及び成人ではホメオスタシスに必須である。重要なことに、それは、腫瘍形成、腫瘍血管新生及び転移にも関与する。
リガンド／レセプター結合を防止するＨＧＦ−又はｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の使用は、増殖を阻害し、アポトーシスを増強することによって、成長阻害及び腫瘍退縮をもたらす。３つのモノクローナル抗体の組み合わせは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて高いＨＧＦ中和活性を示し、自己分泌性ＨＧＦ−Ｍｅｔを発現する神経膠腫異種移植腫瘍に対して有意な腫瘍成長阻害を示した（Cao et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98:7443-8）。モノクローナル抗体を使用する戦略は、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔに対する排他的特異性、小分子キナーゼ阻害剤と比較して比較的長い半減期、及び腫瘍細胞に対する宿主の免疫反応を誘導する可能性を可能にする（Liu et al. Expert Opin Investig Drugs 2008; 17:997-1011）。
AMG102 (Amgen, Inc.)は完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であり、ＨＧＦに選択的に結合して中和し、それにより、ｃ−Ｍｅｔに対するその結合及びそれに続く活性化を防止する（Kakkar et al. Pharm Res 2007;24:1910-8; Burgess et al. Cancer Res 2006; 66:1721-9）。
One-armed 5D5 (OA5D5, MetMAb; Genentech)は、ヒト化された一価のアンタゴニストの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であり、アゴニストモノクローナル抗体５Ｄ５由来のものである（Nguyen et al. Cancer Gene Ther 2003;10:840-9）。ＭｅｔＭＡｂは、高い親和性でｃ−Ｍｅｔに結合して、ｃ−Ｍｅｔと共に細胞表面上に留まり、ＨＧＦの結合及びそれに続くｃ−Ｍｅｔのリン酸化、並びに下流のシグナル伝達及び細胞応答を防止する。
残念なことに、大きなモノクローナル抗体及び／又は大きく人為操作した抗体を使用するのにも高い製造費用がかかり、腫瘍浸潤は他の戦略と比較して準最適である。
現時点での生物医学的な理解によれば、薬物耐性は、細胞の増殖、アポトーシス、遊走及び浸潤のレギュレーションに関わるタンパク質の複雑なネットワークによって引き起こされる。現在のところ、成長因子レセプター依存性シグナル伝達経路についての利用可能な系統的記述はない。実際、ｃ−Ｍｅｔの異常がガンの発症を誘起する分子経路は非常に複雑であり、両方のシグナル伝達分子（例えば、Ｒａｓ及びＰＩ３Ｋ）、レセプター（例えば、ＥＧＦＲ）及び成長因子（例えば、ＶＥＧＦ）を含む多くの相互接続されたシグナル伝達経路が関与している。
血清アルブミンを標的として生体分子（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）の半減期を延ばすことは、例えば、WO2008/028977、WO04/041865及びWO08/122787、並びに２０１１年６月２３日付けの非公開米国仮出願第61/500,464号に記載されている。
発明の概要
当技術分野では、小分子薬物よりも優れた選択性及び特異性、半減期を調節する能力、及び／又は優れた腫瘍ターゲティングを有する（すなわち、従来の抗体よりも小さく、アルブミンベースの腫瘍ターゲティング戦略を有する）より強力なｃ−Ｍｅｔ（又は、本明細書ではｃ−ＭＥＴとも称される）アンタゴニストが必要とされている。さらに、当技術分野では、診断上、予防上及び／又は治療上適切なｃ−Ｍｅｔアンタゴニスト（例えば、本明細書で提供されるもの）が必要とされている。
抗体及びそれに由来する抗原結合部フラグメント（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）などの免疫グロブリン配列は、研究用途及び治療用途において、それらの各抗原を特異的に標的とするのに使用される。例えば、ＶＨＨなどの免疫グロブリン単一可変ドメインの作製は、ラマなどの実験動物を免疫感作すること、免疫組織からファージライブラリを構築すること、抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインをディスプレイするファージを選択すること、並びに所望の特異性について前記ドメイン及びその人工構築物をスクリーニングすることを含み得る（WO 94/04678）。あるいは、例えば、ｄＡｂなどの類似の免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインをディスプレイするファージを、ナイーブな又は合成のライブラリから直接選択し、続いて、所望の特異性について前記ドメイン及びその人工構築物をスクリーニングすることによって作製することができる（Ward et al., Nature, 1989, 341: 544-6); Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490；並びに例えば、WO 06/030220、WO 06/003388及びDomantis Ltd.による他の公開特許出願）。
本発明は、（ｉ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔに指向性を有する１つ以上（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる第１のビルディングブロック；（ｉｉ）場合により、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンに指向性を有する（さらにより好ましくは、Ａｌｂ１１又はＡｌｂ２３（本明細書で定義される）である）１つ以上（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる第２のビルディングブロック；（ｉｉｉ）場合により、ＥＧＦＲ、特にヒトＥＧＦＲに指向性を有し、及び／又はＶＥＧＦ、特にヒトＶＥＧＦに指向性を有する１つ以上（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる第３及び／又は第４のビルディングブロックを含むか、又はより好ましくはこれらから本質的になる特定のポリペプチド（「本発明のポリペプチド」又は「本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「本発明のＩＳＶＤ」とも称される）に関する。さらに、本発明はまた、このようなポリペプチドをコードする核酸；このようなポリペプチドを調製するための方法；このようなポリペプチドを発現するか又は発現することができる宿主細胞；このようなポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に医薬組成物；並びに、予防目的、治療目的又は診断目的のための、このようなポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用に関する。患者のｃ−Ｍｅｔ治療に対する反応性を評価するための方法及びキットもまた記載及び提供される。本発明の他の態様、実施態様、利点及び用途は、本明細書のさらなる記載から明らかになるであろう。
既に述べたように、具体的だが非限定的ないくつかの態様（本明細書により詳細に記載される）では、本発明は、（本明細書で定義されるように）ｃ−Ｍｅｔに指向性を有し、及びリガンド結合を（本明細書にさらに記載されるように、完全に又は部分的に）阻害又は遮断、特にｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合（本明細書にさらに記載される）を（本明細書にさらに記載されるように、完全に又は部分的に）阻害又は遮断することができるアミノ酸配列を提供する。これらのアミノ酸配列は、本明細書では「ｃ−Ｍｅｔ遮断アミノ酸配列」又は「ｃ−Ｍｅｔ遮断ビルディングブロック」とも称される。好ましくは、これらのｃ−Ｍｅｔ遮断アミノ酸配列は、ＩＳＶＤ（本明細書に記載される）であり、この場合、それらは「ｃ−Ｍｅｔ遮断ＩＳＶＤ」とも称される。好ましくは、任意のｃ−Ｍｅｔ遮断アミノ酸配列、ｃ−Ｍｅｔ遮断ビルディングブロック又はｃ−Ｍｅｔ遮断ＩＳＶＤは、当業者に公知の任意の適切なアッセイ、例えば、アルファスクリーンアッセイ又はＦＡＣＳ競合アッセイ（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば実施例２．３．２のフローサイトメトリーアッセイベースのＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ競合アッセイ）などによって決定することができる遮断活性を有する（すなわち、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を部分的に又は完全に遮断する）ものである。好ましくは、遮断活性は、実施例２．３．２に記載されるように、ＦＡＣＳ競合アッセイによって決定される。好ましくは、ＩＳＶＤは、Ａ５４９細胞において、６００nM未満、しかし好ましくは５００nM、４００nM、３００nM、２００nM、１００nM又はさらにそれ未満のＩＣ５０で、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断するか又はこれと競合する遮断活性又は競合能を有する。例えば、０４Ｅ０９様ＩＳＶＤは、このアッセイにおいて、１００nM未満、より好ましくは７５nM未満、５０nM又はさらにそれ未満、例えば２０nM未満若しくは１５nM、１０nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、又はさらにより好ましくは０．７５nM未満若しくはさらに０．５nM未満のＩＣ５０で、遮断活性又は競合能を有する。
例えば、３３Ｈ１０様ＩＳＶＤは、このアッセイにおいて、１００nM未満、より好ましくは７５nM未満、５０nM又はさらにそれ未満、例えば２０nM未満若しくは１５nM、１０nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、又はさらにより好ましくは０．７５nM未満、０．５nM、０．２５nM若しくはさらに０．１nM未満のＩＣ５０で、遮断活性又は競合能を有する。具体的だが非限定的な一態様では、「ｃ−Ｍｅｔ遮断アミノ酸配列」又は「ｃ−Ｍｅｔ遮断ビルディングブロック」（のいくつか）は、例えば、実施例２．４で使用したリン酸化アッセイ、実施例２．５の増殖アッセイ及び／又は実施例２．６のケモタキシスアッセイにおいて、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を阻害又は遮断することができる（例えば、実施例２．４〜２．６及び２２を参照のこと）ようなものであり得る（また好ましくは、このようなものである）。好ましくは、任意のｃ−Ｍｅｔ遮断アミノ酸配列、ｃ−Ｍｅｔ遮断ビルディングブロック又はｃ−Ｍｅｔ遮断ＩＳＶＤは、当業者に公知の任意の適切なアッセイ、例えば、任意の適切なリン酸化アッセイ（例えば、本明細書に記載されるＨＧＦ誘導性ｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイなど）などによって決定することができる遮断活性を有する（すなわち、ＨＧＦ媒介性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を部分的に又は完全に遮断又は阻害する）ようなものである。好ましくは、リン酸化の遮断活性又は阻害能は、実施例１．６、２．４及び２２に記載されるように、ＨＧＦ媒介性ｃ−Ｍｅｔリン酸化によって決定される。好ましくは、ＩＳＶＤは、Ａ５４９腫瘍細胞において、６００nM未満、しかし好ましくは５００nM、４００nM、３００nM、２００nM、１００nM又はさらにそれ未満のＩＣ５０で、リガンド（例えば、ＨＧＦ）誘導性Ｔｙｒ１３４９リン酸化ｃ−Ｍｅｔの遮断活性又は阻害能を有する。例えば、０４Ｅ０９様ＩＳＶＤは、このアッセイにおいて、１００nM未満、より好ましくは７５nM未満、５０nM又はさらにそれ未満、例えば４０nM未満若しくは３０nM、２５nM、２０nM、１５nM、１４nM、１３nM若しくは１２nM、又はさらにより好ましくは１１、１０、９、８若しくは７nM未満のＩＣ５０で、遮断活性又は競合能を有する。例えば、３３Ｈ１０様ＩＳＶＤは、このアッセイにおいて、１００nM未満、より好ましくは７５nM未満、５０nM又はさらにそれ未満、例えば４０nM未満若しくは３０nM、２５nM、２０nM、１５nM、１４nM、１３nM若しくは１２nM、又はさらにより好ましくは１１、１０、９、８、７、６、５、４若しくは３nM未満のＩＣ５０で、遮断活性又は競合能を有する。
好ましくは、シグナル伝達の遮断活性又は阻害能は、実施例２．５及び２２に記載されるようにＨＧＦ誘導性増殖アッセイによって決定される。好ましくは、ＩＳＶＤは、６００nM未満、しかし好ましくは５００nM、４００nM、３００nM、２００nM、１００nM又はさらにそれ未満のＩＣ５０で、ＢｘＰＣ−３細胞のリガンド（例えば、ＨＧＦ）誘導性増殖の遮断活性又は阻害能を有する。例えば、０４Ｅ０９様ＩＳＶＤは、このアッセイにおいて、１００nM未満、より好ましくは８０nM未満、７０nM又はさらにそれ未満、例えば６０nM未満若しくは５０nM、４５nM、４０nM、３５nM、３０nM又はさらにより好ましくは２０nM未満、例えば１５、１２、１０、８、７、６、５、４、３又はさらに２nM未満のＩＣ５０で、遮断活性又は競合能を有する。例えば、３３Ｈ１０様ＩＳＶＤは、このアッセイにおいて、１００nM未満、より好ましくは８０nM未満、７０nM又はさらにそれ未満、例えば６０nM未満若しくは又は５０nM、４５nM、４０nM、３５nM、３０nM又はさらにより好ましくは２０nM未満、例えば１５、１２、１０、８、７、６、５、４、３又はさらに２nM未満のＩＣ５０で、遮断活性又は競合能を有する。
好ましくは、シグナル伝達の遮断活性又は阻害能は、実施例２．６に記載されるようにＨＧＦ依存性ケモタキシスアッセイによって決定される。好ましくは、ＩＳＶＤは、６００nM未満、しかし好ましくは５００nM、４００nM、３００nM、２００nM、１５０nM又はさらにそれ未満のＩＣ５０で、Ａ５４９細胞のリガンド（例えば、ＨＧＦ）誘導性ケモタキシスの遮断活性又は阻害能を有する。例えば、０４Ｅ０９様ＩＳＶＤは、このアッセイにおいて、１５０nM未満、より好ましくは１００nM未満、９０nM、８０nM若しくはさらにそれ未満、例えば８０nM未満、７０nM若しくは６０nM、５５nM若しくは５０nM若しくはさらにそれ未満、例えば６０nM未満若しくは５０nM、４５nM、４０nM、３５nM、３０nM、又はさらにより好ましくは２０nM未満、例えば１５、１２、１０、８、７、６、５、４、３若しくはさらに２nM未満のＩＣ５０で、遮断活性又は競合能を有する。
図１は、ＨＧＦ依存性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害する本発明のナノボディを示す。標準化比（実施例１の見出し１．６に記載される）は、ナノボディ又は５Ｄ５ Ｆａｂ（三角）の濃度に対してプロットしている。タグ付ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）は、黒丸としてプロットした（黒丸）。ナノボディを５Ｄ５ Ｆａｂと共にアッセイし、グラフでは実線（配列番号７）及び点線（５Ｄ５ Ｆａｂ）でプロットした。 図２は、ナノボディフォーマット０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）及び０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９）のアゴニスト活性の分析、並びに５Ｄ５ｍＡｂ及びＨＧＦとの比較を示す。標準化比（実施例１の見出し１．６に記載される）は、ｃ−Ｍｅｔをリン酸化する能力を分析した化合物の濃度に対してプロットしている。ポジティブコントロールのＨＧＦはひし形で、５Ｄ５ｍＡｂは黒丸で、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１は上三角で、０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１は逆三角でプロットしている。 図３は、本発明のナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）が、ＢｘＰＣ３細胞のＨＧＦ依存性増殖を阻害することを示す。細胞増殖を示す「標準化細胞指数」（ＮＣＩ）を計算するために、各ウェルのインピーダンス値を使用した。このグラフでは、２つの試料のＮＣＩを３日間の成長後に記録している。ナノボディは、黒丸としてプロットした。ナノボディを５Ｄ５ Ｆａｂ（三角）と共にアッセイし、グラフでは点線でプロットした。 図４は、ｃ−Ｍｅｔ遮断ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１が、Ａ５４９細胞のＨＧＦ依存性遊走を阻害することを示す。アッセイリードアウト「相対蛍光単位」は、膜からＨＧＦ含有下部区画に移動するＡ５４９細胞を示す。ＲＦＵは、選択したナノボディの濃度に対してプロットしている。ナノボディは、黒丸としてプロットした。ナノボディを５Ｄ５ Ｆａｂ（三角）と共にアッセイし、グラフでは実線（配列番号７）及び点線（５Ｄ５ Ｆａｂ）でプロットした。 ＨＧＦ依存性Ｕ８７ＭＧ膠芽腫異種移植モデルにおける腫瘍成長に対するＡ００７９００３５ナノボディ処置（１０mg/kg；３回／週間、腹腔内（ＩＰ））の効果。テモゾロマイドは、ポジティブコントロール群で参照化合物として使用している。ビヒクル群は、ネガティブコントロール群として含めている。矢印は、異なるＡ００７９００３５投与を表す。腫瘍容積は、平均腫瘍容積±ＳＥ（mm3）として表している。湾曲部の先端にある数字は、異なる時点における１群あたりの残存マウス数を示す。（Ａ００７９００３５又はナノボディ４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１；配列番号７） ＨＧＦ依存性ＫＰ４膵臓異種移植モデルにおける腫瘍成長に対するＡ００７９００３５ナノボディ処置（１０mg/kg；３回／週間、腹腔内（ＩＰ））の効果。ゲムシタビンは、ポジティブコントロール群で参照化合物として使用している。ビヒクル群は、ネガティブコントロール群として含めている。矢印は、異なるＡ００７９００３５投与を表す。腫瘍容積は、平均腫瘍容積±ＳＥ（mm3）として表している。（Ａ００７９００３５又はナノボディ４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１；配列番号７） 一連の用量範囲のＡ００７９０１７１と共にインキュベーションした後のＡＮＢＬ−６ ＨＧＦ自己分泌ヒト多発性骨髄腫細胞の増殖の完全阻害。（抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ、Ａ００７９０１７１；配列番号１１３；ｃｐｍ ａｖｇ、カウント毎分平均）。 １０nMのＡ００７９０１７１と共にインキュベーションした後のＩＮＡ−６ ＨＧＦ傍分泌ヒト多発性骨髄腫細胞のＨＧＦ誘導性増殖の完全かつ特異的な阻害。小分子ｃ−Ｍｅｔ阻害剤PHA-665752は、ポジティブコントロールとして含めた（４０nM）。（抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ、Ａ００７９０１７１；配列番号１１３；ｃｐｍ ａｖｇ、カウント毎分平均；ｐ＝有意な値；ＮＳ、非有意）。 １μMのＡ００７９０１７１と共にインキュベーションした後のＩＮＡ−６ ＨＧＦ傍分泌ヒト多発性骨髄腫細胞のＨＧＦ誘導性遊走の完全かつ特異的な阻害。小分子ｃ−Ｍｅｔ阻害剤PHA-665752は、ポジティブコントロールとして含めた（１００nM）。遊走促進性サイトカインＳＤＦ−１αは、遊走誘導のポジティブコントロールとして含めた。（抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ、Ａ００７９０１７１；配列番号１１３；ＮＳ、非有意） ＫＰ４異種移植モデルにおけるナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（Ａ００７９００３５、配列番号７）に対する可溶性ｃ−Ｍｅｔの反応。各動物の可溶性ｃ−ＭＥＴレベル、及び両処置群についての平均±平均の標準誤差を示す。０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１ナノボディ（ＮＢ）で処置したマウス（０．５０７ng/ml）では、平均可溶性ｃ−Ｍｅｔレベルは、ビヒクル（ＰＢＳ、１０ml/kg、腹腔内（ｉ．ｐ．））で処置したマウス（５．３４８ng/ml）と比較して大きく減少していた。 Ａ００７９０１７１は、ＩＮＡ−６細胞において２００ng/mlのＨＧＦによる刺激後に、ｃ−Ｍｅｔのチロシン残基Ｔｙｒ１３４９（Ａ）、Ｔｙｒ１２３４／３５（Ｂ）及びＴｙｒ１００３（Ｃ）のリン酸化を減少させる。PHA-665752は、ポジティブコントロールとして含めた（２００nM）。細胞をＨＧＦで５分間処置してから溶解させ、タンパク質ゲル電気泳動のために全溶解物として加工した。 Ａ００７９０１７１は、ＩＮＡ−６細胞において１５０ng/mlのＨＧＦによる刺激後に、Ａｋｔ（Ａ）及びＭＡＰＫ（Ｂ）のリン酸化を減少させる。細胞をＨＧＦで７分間処置してから溶解させ、タンパク質ゲル電気泳動のために全溶解物として加工した。 Ａ００７９０１７１（１００nM）は、フィブロネクチンに対するＩＮＡ−６細胞のＨＧＦ誘導性接着を遮断する。ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（蛍光色素）と共にプレインキュベーションした後、５ｘ１０４個の細胞を、サイトカインＨＧＦ（１５０ng/ml）若しくはＳＤＦ−１α（７５ng/ml）と共に、又はこれらを加えずに１時間インキュベーションした。バーは、３回の独立した実験の代表的な１回からの４個の試料の平均（＋ＳＤ）を表す。 Ａ００７９０１７１は、ＢＭＰ−２誘導性のＡＬＰ活性及びｈＭＳＣの石灰化に対するＨＧＦ（１００ng/ml）の阻害効果を無効化する（Ａ）。Alizarin Red-S (ARS)染色によって、処置（５nMのＡ００７９０１７１）２１日後のＭＳＣの石灰化を定量（Ｂ）又は可視化（Ｃ）した。
発明の説明
定義：
ａ）特に指示又は定義がない限り、使用されるすべての用語は当技術分野におけるその通常の意味を有し、これは、当業者には明らかである。例えば、WO 08/020079の４６頁の段落ａ）で言及されている標準的なハンドブックを参照のこと。
ｂ）特に指示がない限り、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＩＳＶＤ」という用語は、限定されないが、抗原結合ドメイン又はフラグメント（例えば、それぞれ、ＶＨＨドメイン又はＶＨ若しくはＶＬドメイン）を含むために一般用語として使用される。抗原結合分子又は抗原結合タンパク質という用語は互換的に使用され、ナノボディという用語も含む。免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）でもよいし、又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）でもよい；より具体的には、それらは、従来の四本鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列でもよいし、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列でもよい。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体若しくはドメイン抗体として使用するのに適切な免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体として使用するのに適切な免疫グロブリン配列、「ｄＡｂ」若しくはｄＡｂとして使用するのに適切な免疫グロブリン配列、又はナノボディ（限定されないが、ＶＨＨ配列を含む）であり得る。本発明は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト及びラクダの免疫グロブリン配列を含む様々な起源の免疫グロブリン配列を含む。免疫グロブリン単一可変ドメインは、完全ヒト免疫グロブリン配列、ヒト化免疫グロブリン配列、別の方法で配列最適化された免疫グロブリン配列又はキメラ免疫グロブリン配列を含む。免疫グロブリン単一可変ドメイン及び免疫グロブリン単一可変ドメインの構造は、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」（これらは、当技術分野及び本明細書ではそれぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と称される）から構成されると考えることができる（しかしながら、これらに限定されない）；これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」（これらは、当技術分野においてはそれぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と称される）によって分断される。ナノボディ（Nanobody）又はナノボディ（Nanobodies）という用語は、Ablynx N.V.の登録商標であるので、それぞれNanobody（登録商標）又はNanobodies（登録商標）とも称され得ることに留意する。
ｃ）特に指示がない限り、「免疫グロブリン配列」、「配列」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、WO 08/020079の４６頁の段落ｂ）に記載されているとおりである。
ｄ）特に指示がない限り、詳細に明記されていないすべての方法、工程、技術及び操作は、当業者には明らかであるように、それ自体が公知の方法で実施することができ、実施されたものである。例えば、先と同様に、標準的なハンドブック及び本明細書で言及される一般的な背景、並びに本明細書で引用されるさらなる参考文献；並びに、例えば、以下の総説Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43（これらには、タンパク質工学の技術、例えば親和性成熟、並びにタンパク質（例えば、免疫グロブリン）の特異性及び所望の特性を改善するための他の技術が記載されている）を参照のこと。
ｅ）アミノ酸残基は、標準的な３文字又は１文字のアミノ酸コードにしたがって示される。「Immunoglobulin single variable domains directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with Il-6 mediated signalling」という標題の、Ablynx N.V.の国際出願WO 08/020079の４８頁の表Ａ−２を参照のこと。
ｆ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較する目的のために、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセンテージを、WO 08/020079の４９頁の段落ｅ）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように計算又は決定することができ、例えば、［第２のヌクレオチド配列中の対応する位置のヌクレオチドと同一の第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数］で割り、［１００％］を乗じることによって（この場合、−第１のヌクレオチド配列と比較した−第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換又は付加を、単一ヌクレオチド（位置）での相違と考える）；又は、先と同様にWO 08/020079の４９頁の段落ｅ）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように適切なコンピュータアルゴリズム若しくは技術を使用して計算又は決定することができる。
ｇ）２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン又は他のアミノ酸配列、例えば本発明のポリペプチドなどを比較する目的のために、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書では「アミノ酸同一性」とも称れる）のパーセンテージを、WO 08/020079の４９頁及び５０頁の段落ｆ）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように計算又は決定することができ、例えば、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置のアミノ酸残基と同一の第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］を乗じることによって（この場合、−第１のアミノ酸配列と比較した−第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換又は付加を、単一アミノ酸残基（位置）での相違（すなわち、本明細書で定義される「アミノ酸差異」）と考える）；又は、先と同様にWO 08/020079の４９頁及び５０頁の段落ｆ）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように適切なコンピュータアルゴリズム若しくは技術を使用して計算又は決定することができる。
また、２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン間の配列同一性の程度を決定する際は、WO 08/020079の５０頁に記載されているように、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮することができる。
本明細書に記載されるポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978によって開発された、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の分析、Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149, 1978によって開発された構造形成能の分析、並びにEisenberg et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1及びGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発されたタンパク質中の疎水性パターンの分析に基づくものでもよい（これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ナノボディの一次、二次及び三次構造についての情報は、本明細書の記載及び上に引用した一般的な背景技術に示されている。また、この目的のために、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造が、例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757;及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)によって示されている。従来のＶＨドメインにおいてＶＨ／ＶＬインターフェースを形成するアミノ酸残基のいくつか及びこれら位置のラクダ化置換候補についてのさらなる情報は、上に引用した従来技術において見ることができる。
ｈ）免疫グロブリン単一可変ドメイン及び核酸配列は、それらの全長にわたって１００％の配列同一性（本明細書で定義される）を有する場合に、「全く同じものである」と言われる。
ｉ）２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを比較する場合、「アミノ酸差異」という用語は、第２の配列と比較した、第１の配列の位置における単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を指す；２つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、１個、２個又はそれ以上のこのようなアミノ酸差異を含有することができると理解されている。
ｊ）ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を「含む」か、又は別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列「から本質的になる」と言われる場合、これは、WO 08/020079の５１〜５２頁の段落ｉ）に示されている意味を有する。
ｋ）「本質的に単離された形態である」という用語は、WO 08/020079の５２頁及び５３頁の段落ｊ）に示されている意味を有する。
ｌ）「ドメイン」及び「結合ドメイン」という用語は、WO 08/020079の５３頁の段落ｋ）に示されている意味を有する。
ｍ）本明細書で互換的に使用することができる「抗原決定基」及び「エピトープ」という用語は、WO 08/020079の５３頁の段落ｌ）に示されている意味を有する。
ｎ）WO 08/020079の５３頁の段落ｍ）にさらに記載されているように、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質（又は、それらの少なくとも一部、フラグメント又はエピトープ）に（特異的に）結合でき、これらに対する親和性を有し、及び／又はこれらに対する特異性を有するアミノ酸配列（例えば、本発明の抗体、ポリペプチド、又は一般には抗原結合タンパク質若しくはポリペプチド又はそれらのフラグメント）は、前記抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質「に対する」又は「に指向性を有する」と言われる。
ｏ）「特異性」という用語は、WO 08/020079の５３〜５６頁の段落ｎ）に示されている意味を有し、そこで言及されているように、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば、本発明のポリペプチド）分子が結合することができる異なる種類の抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、WO 08/020079の５３〜５６頁（参照により本明細書に組み込まれる）（これには、抗原結合分子（例えば、本発明のポリペプチド）と関連抗原との間の結合を測定するためのいくつか好ましい技術も記載されている）に記載されているように、親和性及び／又はアビディティに基づいて決定することができる。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド）は、１０−５〜１０−１２モル／リットル又はそれ未満、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル又はそれ未満、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）（すなわち、１０５〜１０１２リットル／モル又はそれ以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル又はそれ以上、より好ましくは１０８〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ））で、それらの抗原に結合するであろう。１０−４モル／リットルより大きい任意のＫＤ値（又は、１０４モル／リットルより小さい任意のＫＡ値）は、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価免疫グロブリン単一可変ドメインは、５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満の親和性で、所望の抗原に結合するであろう。抗原又は抗原決定基に対する抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）及びサンドウィッチ競合アッセイ、及び当技術分野におけるそれ自体が公知のそれらの様々な変法；並びに、本明細書で言及される他の技術を含むそれ自体が公知の任意の適切な方法で決定することができる。当業者には明らかであるように、及びWO 08/020079の５３〜５６頁に記載されているように、解離定数は、実際の解離定数でもよいし、又は見掛けの解離定数でもよい。解離定数を決定するための方法は当業者には明らかであり、例えばWO 08/020079の５３〜５６頁で言及されている技術が挙げられる。
ｐ）本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの半減期は、一般に、WO 08/020079の５７頁の段落ｏ）に記載されているように定義することができ、そこで言及されているように、例えば、自然機構による配列若しくは化合物の分解、及び／又は配列若しくは化合物の排出若しくは隔離により、アミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの血清濃度がｉｎ ｖｉｖｏで５０％減少するのに要する時間を指す。本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、それ自体が公知の任意の適切な方法、例えば、薬物動態分析によって決定することができる。適切な技術は当業者には明らかであり、例えば、一般に、WO 08/020079の５７頁の段落ｏ）に記載されているようなものでもよい。また、WO 08/020079の５７頁の段落ｏ）で言及されているように、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−β及び曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表すことができる。例えば、以下の実験部分、並びに標準的なハンドブック、例えば、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists及びPeters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)を参照のこと。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)も参照のこと。「半減期の増加」又は「増加した半減期」という用語もWO 08/020079の５７頁の段落ｏ）で定義されているとおりであり、ｔ１／２−α及び／若しくはＡＵＣ又はその両方の増加の有無にかかわらず、特にｔ１／２−βの増加を指す。
ｑ）標的又は抗原に関して、標的又は抗原上の「相互作用部位」という用語は、標的又は抗原上のアミノ酸残基の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はストレッチであって、リガンド、レセプター又は他の結合パートナーに結合するための部位、触媒部位、開裂部位、アロステリック相互作用のための部位、標的又は抗原の多量化（例えば、ホモマー化（ｈｏｍｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）又はヘテロ二量体化）に関与する部位；又は、標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の他の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はストレッチであって標的又は抗原の生物学的作用又は機構に関与するものを意味する。より一般には、「相互作用部位」は、標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はストレッチであって、標的又は抗原（及び／又は、標的又は抗原が関与する任意の経路、相互作用、シグナル伝達、生物学的機構又は生物学的効果）が調節（本明細書で定義される）されるように、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが結合することができるものであり得る。
ｒ）免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドは、前記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドに結合する親和性と比較して少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、最大１００００倍以上良好な（上記の、並びにＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度及び／又はＫｏｎ速度として適切に表される）親和性／アビディティで第１の抗原に結合する場合、第２の標的又は抗原と比較して、第１の標的又は抗原「に対して特異的」であると言われる。例えば、第１の抗原は、前記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドに結合するＫＤよりも少なくとも１０倍小さい、例えば少なくとも１００倍小さい、好ましくは少なくとも１０００倍小さい、例えば１０．０００倍小さい又はさらにそれ未満のＫＤ値で、標的又は抗原に結合してもよい。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドは、第２の標的又は抗原と比較して、第１の標的又は抗原「に対して特異的」である場合、前記第１の標的又は抗原に指向性を有する（本明細書で定義される）が、前記第２の標的又は抗原に指向性を有しない。
ｓ）「交差遮断する」、「交差遮断される」及び「交差遮断」という用語は、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドが、それぞれ、ｃ−Ｍｅｔに対する天然リガンドＨＧＦの結合、又はＥＧＦＲに対する天然リガンドＥＧＦの結合、又はＶＥＧＦレセプター（例えば、ＶＥＧＦＲ−１Ｒ（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）及び／又はＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４））に対する天然リガンドＶＥＧＦの結合を妨げる能力を意味するために本明細書で互換的に使用される。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドが別の化合物（例えば、天然リガンド）のその標的（例えば、ｃ−Ｍｅｔ、ＶＥＧＦ又はＥＧＦＲ）に対する結合を妨げることができる程度、そしてしたがって、これを本発明の交差遮断と言うことができるかは、競合結合アッセイを使用して決定することができる。特に適切な定量的交差遮断アッセイの１つは、標的に対する結合の観点から、ラベルされた（例えば、ヒスタグ付又はビオチン化）本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドと、他の結合剤との間の競合を測定するために、ＦＡＣＳ−若しくはＥＬＩＳＡベースアプローチ又はアルファスクリーンを使用する。実験部分では、一般に、結合分子が、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドを交差遮断するか、又はこれらを交差遮断することができるを決定するのに適切なＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ又はアルファスクリーン置換ベースアッセイを説明する。このアッセイは、本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメイン又は他の結合剤のいずれかと共に使用することができると認識されよう。したがって、一般に、本発明の交差遮断アミノ酸配列又は他の結合剤は、例えば、上記交差遮断アッセイにおいて、アッセイ中に本発明の第２のアミノ酸配列又は他の結合剤の存在下で、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドの記録された置換が、０．０１mM以下の量で存在する試験されるべき交差遮断剤候補（交差遮断剤は、別の従来のモノクローナル抗体、例えばＩｇＧ、古典的な一価抗体フラグメント（Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）及び人工変異体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ）であり得る）による最大理論置換（例えば、交差遮断されることを必要とするコールド（例えば、ラベルされていない）免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドによる置換）の（例えば、ＥＬＩＳＡ／アルファスクリーンベースアッセイでは）６０％〜１００％又は（例えば、ＦＡＣＳベース競合アッセイでは）８０％〜１００％であるように、標的に結合するものである。
ｔ）例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドなどのアミノ酸配列は、（ＶＨＨ１コンセンサス配列をクエリ配列として使用し、標準的な設定（すなわち、ｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックス）のｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）ＶＨＨ１コンセンサス配列（配列番号９９：ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ）と８５％の同一性を有し、場合により（Kabatナンバリングを使用して）システインを５０位に有する（すなわち、Ｃ５０）場合、「ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ１型配列」であると言われる。
ｕ）例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドなどのアミノ酸配列は、２つの異なる抗原又は抗原決定基（例えば、２つの異なる哺乳両方種由来の血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン及びカニクイザル血清アルブミン）に対して特異的（本明細書で定義される）である場合、これら両方の異なる抗原又は抗原決定基に対して「交差反応性」と言われる。
ｖ）WO 08/020079の５８頁及び５９頁の段落ｑ）（参照により本明細書に組み込まれる）にさらに記載されているように、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195の論文でラクダ由来のＶＨＨドメインに適用されているように（例えば、この刊行物の図２を参照のこと）、Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)によって示されているＶＨドメインについての一般的なナンバリングにしたがってナンバリングされ、それに応じて、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ１は１位〜３０位のアミノ酸残基をを含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１は３１位〜３５位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ２は３６位〜４９位のアミノ酸を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ２は５０位〜６５位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ３は６６位〜９４位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ３は９５位〜１０２位のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインにＦＲ４は１０３位〜１１３位のアミノ酸残基を含む。
ｗ）図面、配列表及び実験部分／実施例は、本発明をさらに例証するために示すものに過ぎず、本明細書で特に明確な指示がない限り、本発明及び／又は添付の特許請求の範囲の範囲を何ら限定すると判断又は解釈されるべきではない。
１．本発明のポリペプチド及びその使用
１．１ 抗ｃ−Ｍｅｔビルディングブロック
本発明のポリペプチドは、一般に、ＨＧＦ、特にヒトＨＧＦ（Swiss Protデータベース：Ｐ１４２１０）に対するｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の結合を調節、特に阻害及び／又は防止するのに使用することができ、したがって、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）及び／若しくはＨＧＦ、特にヒトＨＧＦ（Swiss Protデータベース：Ｐ１４２１０）によって媒介されるシグナル伝達を調節、特に阻害又は防止するのに使用することができ、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）及び／若しくはＨＧＦ、特にヒトＨＧＦが関与する生物学的経路を調節するのに使用することができ、並びに／又はこのようなシグナル伝達又はこれらの経路に関連する生物学的機構、反応及び効果を調節するのに使用することができる。
このようなものとして、本発明のポリペプチド及び組成物は、限定されないが、ガン、例えばガン腫、神経膠腫、中皮腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、腺ガン：乳ガン、卵巣ガン、子宮頸ガン、膠芽腫、多発性骨髄腫（意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症、無症候性骨髄腫及び症候性骨髄腫を含む）、前立腺ガン、及びバーキットリンパ腫、頭頸部ガン、結腸ガン、直腸結腸ガン、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、食道のガン、胃ガン、膵臓ガン、肝胆道ガン、胆嚢のガン、小腸のガン、直腸ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、前立腺ガン、陰茎ガン、尿道ガン、精巣ガン、膣ガン、子宮ガン、甲状腺ガン、副甲状腺ガン、副腎ガン、膵内分泌ガン、カルチノイドガン、骨ガン、皮膚ガン、網膜芽腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病又はＡＩＤＳ関連原発性滲出液リンパ腫、神経外胚葉性腫瘍、横紋筋肉腫（例えば、さらなるガンについては、Cancer, Principles and practice (DeVita, V.T. et al. eds 1997)を参照のこと）；並びに上記ガンのいずれかの任意の転移、並びに鼻ポリープなどの非ガン兆候；並びに本明細書に記載される他の障害及び疾患を含む本発明の疾患及び障害（本明細書では「本発明の疾患及び障害」とも）を診断、予防及び処置するのに使用することができる。特に、本発明のポリペプチド及び組成物は、ｃ−Ｍｅｔ媒介性の転移、ケモタキシス、細胞接着、経内皮遊走、細胞の増殖及び／又は生存、特に非小細胞肺ガン及び多発性骨髄腫を伴う疾患を診断、予防及び処置するのに使用することができる。本発明のポリペプチド及び組成物はまた、多発性骨髄腫を含む骨転移ガンにおける骨疾患を診断、予防及び／又は処置するのに使用することができる。本発明のポリペプチド及び組成物はまた、多発性骨髄腫を含む骨転移ガンにおける溶骨性病変を診断、予防及び／又は処置するのに使用することができる。
一般に、「本発明の疾患及び障害」は、本発明のポリペプチド又は組成物のいずれか（特に、その薬学的活性量）、及び／又はｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対して、若しくはｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）が関与する生物学的な経路若しくは機構に対して活性な公知の活性成分（特に、その薬学的活性量）を、それを必要とする（すなわち、疾患若しくは障害又はそれらの少なくとも１つの症候を有し、及び／又は疾患若しくは障害を誘発又は発症するリスクを有する）被験体に適切に投与することによって、それぞれ診断、予防及び／又は処置することができる疾患及び障害と定義することができる。
特に、本発明のポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）によって媒介される過剰な及び／若しくは望ましくないＨＧＦ、特にヒトＨＧＦシグナル伝達、又はｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）が関与する経路（例えば、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ軸）を特徴とする本発明の疾患及び障害を診断、予防及び処置するのに使用することができる。このような本発明の疾患及び障害の例は、先と同様に、本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであろう。
したがって限定されないが、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）媒介性シグナル伝達を調節することができる活性成分で現在診断、予防又は処置されているすべての疾患及び障害、例えば疾患及び上に引用した従来技術で言及されているものを診断、予防及び／又は処置するのに使用することができる。本発明のポリペプチドは、このような活性成分による処置が現在開発されているか、提案されたか、又は将来提案若しくは開発されるであろうすべての疾患及び障害を診断、予防及び／又は処置するのに使用することができることも想定される。加えて、本明細書にさらに記載されるそれらの有利な特性により、本発明のポリペプチドは、これらの公知の活性成分が使用されているか、又は提案若しくは開発されるであろう疾患及び障害以外の他の疾患及び障害を診断、予防及び処置するのに使用してもよいこと；及び／又は、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載される疾患及び障害を処置するための新規の方法及びレジメンを提供し得ることが想定される。
したがって、本発明は、治療における使用のための本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに関する。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドの他の用途及び使用は、本明細書のさらなる開示から当業者には明らかになるであろう。
一般に、本発明の目的は、本発明の疾患及び／又は障害を診断、予防及び／又は処置するのに使用することができる、薬理学的に活性な薬剤及びこれを含む組成物を提供すること；並びに、このような薬剤及び組成物を投与及び／又は使用することを含む、このような疾患及び障害を診断、予防及び／又は処置するための方法を提供することである。
特に、本発明の目的は、当技術分野において現在使用されており、及び／又は当技術分野において公知の薬剤、組成物及び／又は方法と比較してある特定の利点を有するこのような薬理学的に活性な薬剤、組成物及び／又は方法を提供することである。これらの利点は、以下のさらなる記載から明らかになるであろう。
より具体的には、本発明の目的は、本発明の疾患及び／又は障害、並びに本明細書で言及されるさらなる疾患及び障害を診断、予防及び／又は処置するために、薬理学的に活性な薬剤及びこれを含む組成物として使用することができる治療用タンパク質を提供すること；並びに、このような治療用タンパク質及び組成物を投与及び／又は使用することを含む、このような疾患及び障害を診断、予防及び／又は処置するための方法を提供することである。
したがって、本発明の具体的な目的は、ｃ−Ｍｅｔ、特に温血動物由来のｃ−Ｍｅｔ、より具体的には哺乳動物（例えば、マウスなど）由来のｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを提供すること；並びに、少なくとも１つのこのような免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又はこれらから本質的になるタンパク質及びポリペプチドを提供することである。
特に、本発明の具体的な目的は、温血動物、特に哺乳動物、より具体的にヒトにおける予防的使用、治療的使用及び／又は診断的使用に適切であるこのような免疫グロブリン単一可変ドメイン並びにこのようなタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することである。
より具体的には、本発明の具体的な目的は、温血動物、特に哺乳動物、より具体的にヒトにおけるｃ−Ｍｅｔに関連し、及び／又はｃ−Ｍｅｔによって媒介される１つ以上の疾患、障害又は症状（例えば、本明細書で言及される疾患、障害及び症状）を予防、処置、緩和及び／又は診断するのに使用することができるこのような免疫グロブリン単一可変ドメイン並びにこのようなタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することである。
本発明の具体的な目的はまた、温血動物、特に哺乳動物、より具体的にヒトにおけるｃ−Ｍｅｔに関連し、及び／又はｃ−Ｍｅｔによって媒介される１つ以上の疾患、障害又は症状（例えば、本明細書で言及される疾患、障害及び症状）を予防及び／又は処置するための医薬組成物又は獣医学的組成物の調製に使用することができるこのような免疫グロブリン単一可変ドメイン並びにこのようなタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することでもある。
本発明では、一般に、これらの目的は、本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド及び組成物の使用によって達成される。
一般に、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し（本明細書で定義される）、及び／又はこれらに特異的に結合する（本明細書で定義される）ことができる免疫グロブリン単一可変ドメイン；並びに、少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。
より具体的には、本発明は、本明細書で定義される親和性（これは、本明細書にさらに記載されるように、適切に測定され、並びに／又は（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／若しくはｋｏｆｆ速度、又はあるいはＩＣ５０値として表される）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチド；並びに、少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。
特定の態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、以下のようなものである：
−例えば、実験部分に記載されているようにアルファスクリーンアッセイ（実施例２．３．１を参照のこと）において、１．２nM以下、より好ましくは５００pM以下、さらにより好ましくは２００pM以下、最も好ましくは１５０pM以下のＩＣ５０で、ヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し（この場合、ポリペプチドは、１つのヒトｃ−Ｍｅｔ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン単位のみを含み、完全な置換は、（例えば、実施例２．３．１のリガンド置換アッセイにしたがって測定した場合に）約６０％〜８０％及びそれ以上、好ましくは９５％以上の平均ＨＧＦ置換を意味する）；
及び／又は
−例えば、実験部分に記載されているアッセイ（実施例２．３）において、２．５nM以下の平均ＩＣ５０値、より好ましくは２nM以下の平均ＩＣ５０値、さらにより好ましくは１．５nM以下の平均ＩＣ５０値で、ヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）からヒトＨＧＦを完全に置換する（この場合、ポリペプチドは、１つのヒトｃ−Ｍｅｔ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン単位のみを含み、完全な置換は、（例えば、実施例２．３．２のリガンド置換アッセイにしたがって測定した場合に）約６０％〜８０％及びそれ以上、好ましくは９５％以上の平均ＨＧＦ置換を意味する）；
ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドの結合、置換、遊走又は他のｉｎ ｖｉｖｏ及び／若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ効力についてのいくつかの好ましい技術的な値は、本明細書のさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）との結合のために、本発明のアミノ酸配列は、通常、そのアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸残基又は１つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含有し（すなわち、各「ストレッチ」は、すなわちアミノ酸配列の一次構造又は三次構造で互いに隣接しているか、又は互いに密接している２つ以上のアミノ酸残基を含む）、これを介して本発明のアミノ酸配列は、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合することができ、このようにしてこのアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチは、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合するための「部位」（本明細書では「抗原結合部位」とも称される）を形成する。
本発明によって提供される免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは、本質的に単離された形態（本明細書で定義される）であるか、又は本発明のタンパク質又はポリペプチドであって、１つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか、又はこれらから本質的になり得、場合により１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン（これらはすべて、場合により１つ以上の適切なリンカーを介して連結されていてもよい）をさらに含み得る本発明のタンパク質又はポリペプチドの一部を形成する（本明細書で定義される）。例えば限定されないが、本発明の好ましい態様は、本発明の二重特異性ポリペプチドを提供するためには、ヒトｃ−Ｍｅｔに指向性を有する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインと、ヒト血清アルブミンに指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインとがペプチドリンカー（本明細書で定義される）によってそれぞれ連結されたもの、及び／又は本発明のさらなる二重特異性若しくは三重特異性ポリペプチドを提供するためには、ヒトｃ−Ｍｅｔに指向性を有する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインと、ヒト血清アルブミンに指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインと、及び／又はヒトＥＧＦＲに指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインとがペプチドリンカー（本明細書で定義される）によってさらに連結されたものから本質的になるポリペプチドを提供する（すべて本明細書に記載される）。このようなタンパク質又はポリペプチドはまた、本質的に単離された形態（本明細書で定義される）でもよい。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドそれ自体は、好ましくは、ジスルフィド架橋を介して任意の他のアミノ酸配列又はアミノ酸鎖に連結されていない（しかし、１つ以上の分子内ジスルフィド架橋を含有してもよいし、又は含有しなくてもよい。例えば、本発明の薬剤は、本明細書に記載されるように、ＣＤＲ３とＣＤＲ１又はＦＲ２との間にジスルフィド架橋を場合により含有し得ることが公知である）単一のアミノ酸鎖から本質的になる。しかしながら、１つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを（例えば、ジスルフィド架橋を介して）互いに及び／又は他の免疫グロブリン単一可変ドメインに連結して、本発明でも有用であり得るペプチド構築物（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＳｃＦｖ構築物、「ダイアボディ」及び他の多重特異性構築物）を提供してもよいことに留意するべきである。例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005; 23:1126-36（参照により組み込まれる）による総説を参照のこと。
一般に、本発明のアミノ酸配列（又は、これを含む化合物、構築物若しくはポリペプチド）は、（例えば、本明細書に記載される治療目的及び／又は診断目的で）被験体に投与することを目的とするものである場合、好ましくは、前記被験体中に天然に存在しないアミノ酸配列であるか、又は前記被験体中に天然に存在する場合には本質的に単離された形態（本明細書で定義される）である。
薬学的用途の場合、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン（並びに、これを含む化合物、構築物及びポリペプチド）は、好ましくは、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有するのに対して、獣医学目的の場合、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、好ましくは、処置するべき種由来のｃ−Ｍｅｔに指向性を有するか、又は処置するべき種由来のｃ−Ｍｅｔと少なくとも交差反応性を有することも当業者には明らかである。
さらに、本発明のアミノ酸配列は、場合によりかつｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対して結合するための少なくとも１つの結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質又は標的に対して結合するための１つ以上のさらなる結合部位を含有してもよい。
関与する具体的な疾患又は障害に応じて、それ自体が公知の任意の適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び／又は動物モデル、又はそれらの任意の組み合わせを使用して、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチド、並びにこれらを含む組成物の有効性を試験することができる。適切なアッセイ及び動物モデルは当業者には明らかであり、例えば、リガンド置換アッセイ（Burgess et al., Cancer Res 2006 66:1721-9）、二量体化アッセイ（WO2009/007427A2, Goetsch, 2009）、シグナル伝達アッセイ（Burgess et al., Mol Cancer Ther 9:400-9）、増殖／生存アッセイ（Pacchiana et al., J Biol Chem 2010 Sep M110.134031）、細胞接着アッセイ（Holt et al, Haematologica 2005 90:479-88）及び遊走アッセイ（Kong-Beltran et al, Cancer Cell 6:75-84）、内皮細胞発芽アッセイ（Wang et al, J Immunol. 2009; 183:3204-11）、骨芽細胞分化アッセイ、ＡＬＰアッセイ（Standal et al., Blood 2007 Apr 1; 109(7): 3024-30）及びｉｎ ｖｉｖｏ異種移植モデル（Jin et al, Cancer Res. 2008 68:4360-8）、並びに以下の実験部分、及び本明細書で引用される従来技術で使用されているアッセイ及び動物モデルが挙げられる。
また、本発明によれば、第１の種の温血動物由来のｃ−Ｍｅｔに指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、１つ以上の他の種の温血動物由来のｃ−Ｍｅｔと交差反応性を示してもよいし、又は示さなくてもよい。例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、１つ以上の他の種の霊長類（例えば限定されないが、マカク属のサル（例えば、特にカニクイザル（Macaca fascicularis）及び／又はアカゲザル（Macaca mulatta））及びヒヒ（Papio ursinus）由来のｃ−Ｍｅｔ、及び／又は疾患のための動物モデル（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ又はイヌ）、特にｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に関連する疾患及び障害のための動物モデルで使用されることが多い１つ以上の種の動物（例えば、本明細書で言及される種及び動物モデル）由来のｃ−Ｍｅｔと交差反応性を示してもよいし、又は示さなくてもよい。この態様では、このような交差反応性は、存在する場合には、ヒトｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドをこのような疾患モデルで試験することが可能であるので、薬物開発の観点から有利であり得ることは当業者に明らかである。
より一般には、複数種の哺乳動物由来のｃ−Ｍｅｔと交差反応性を有する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、通常、同じアミノ酸配列又はポリペプチドを複数種にわたって使用することが可能であるので、獣医学用途に使用するのに有利である。したがって、ある種の動物由来のｃ−Ｍｅｔに指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチド（例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチド）は、その免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを使用することにより、処置されるべき種において所望の効果が提供される限り、別の種の動物を処置するのに使用することができることも本発明の範囲内に包含される。
本発明はまた、その最も広い意味では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドが指向性を有するｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の具体的な抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーション（適用可能な場合）によって特に限定されず、又はこれらによって定義されない。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ相互作用部位、ｃ−Ｍｅｔの細胞インターナリゼーション部位、ｃ−Ｍｅｔの排出部位及び／又はｃ−Ｍｅｔ／ｃ−Ｍｅｔホモ二量体化部位に指向性を有してもよいし、又はこれらに指向性を有しなくてもよく、本明細書でさらに定義されるとおりである。
さらに、ｃ−Ｍｅｔ及びＲＯＮ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）及びヒトＲＯＮ((Ming-Hai Wang et al., Acta Pharmacologica Sinica (2010) 31: 1181-1188)に対する二特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明の範囲内である。
本明細書にさらに記載されるように、本発明のポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する２つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを（好ましくはないが）含有してもよい。一般に、このようなポリペプチドは、本発明の単一アミノ酸配列と比較して増加したアビディティで、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合するであろう。このようなポリペプチドは、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の同じ抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーション（適用可能な場合）（これらは、相互作用部位でもよいし、又は相互作用部位ではなくてもよい）に指向性を有する２つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよいし；又は、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーション（適用可能な場合）（これらは、相互作用部位でもよいし、又は相互作用部位ではなくてもよい）に指向性を有する少なくとも１つの「第１の」本発明のアミノ酸配列と；第１のものと異なる第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーション（適用可能な場合）（これらは先と同様に、相互作用部位でもよいし、又は相互作用部位ではなくてもよい）に指向性を有する少なくとも１つの「第２の」本発明のアミノ酸配列とを含んでもよい。好ましくは、このような本発明の「二パラトープ性」ポリペプチドでは、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列は、相互作用部位（本明細書で定義される）に指向性を有するが、本発明は、その最も広い意味ではそれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドは、例えば、実験部分で特性決定した様々なエピトープに指向性を有する一価ビルディングブロックを組み合わせるような二パラトープ的な方法でフォーマットされてもよい。
また、標的が結合ペア（例えば、レセプター−リガンド結合ペア）の一部である場合、免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに対する結合について同種の結合パートナー（例えば、ＨＧＦ）と競合するようなもの、及び／又は標的に対する結合パートナーの結合を（完全に又は部分的に）中和するようなものでもよい。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、一般に、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の天然に存在する又は合成の類似体、変異体、突然変異体、アレル、部分及びフラグメントすべてに；又は少なくとも、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドがｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合する抗原決定基又はエピトープと本質的に同じ１つ以上の抗原決定基又はエピトープを含有する、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の類似体、変異体、突然変異体、アレル、部分及びフラグメントに結合することも期待される。先と同様に、このような場合、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが（野生型）ｃ−Ｍｅｔに結合する親和性及び特異性と同じか、又はこれと異なる（すなわち、これよりも高いか又は低い）親和性及び／又は特異性で、このような類似体、変異体、突然変異体、アレル、部分及びフラグメントに結合してもよい。
ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）は単量体形態及び１つ以上の多量体形態（例えば、ホモ二量体形態）で存在するので、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドが、ｉ）単量体形態のｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）のみに結合するか、ｉｉ）多量体／二量体（ホモ二量体及び／又はヘテロ二量体）形態のｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）のみに結合するか、又はｉｉｉ）単量体形態及び多量体形態の両方に結合することは本発明の範囲内である。本発明の好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、ホモ二量体ヒトｃ−Ｍｅｔ複合体の形成を防止する。本発明の別の好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、（１０nM以下、５０nM以下、１００nM以下、又は５００nM以下などのより高い濃度においても）ホモ二量体ヒトｃ−Ｍｅｔ複合体の形成を誘導しない。先と同様に、このような場合、本発明のポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが多量体形態に結合する親和性及び特異性と同じか、又はこれと異なる（すなわち、これよりも高いか又は低い）親和性及び／又は特異性で、単量体形態に結合してもよい。
また、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）が、他のタンパク質又はポリペプチド（例えば、ＨＧＦだけではなく、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、プレキシン、インテグリン、ＣＤ４４、ＲＯＮなどの他のレセプター）と会合して、タンパク質複合体を形成することができる場合、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドが、非会合状態のｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合する（及び例えば、リガンド結合を防止し、及び／又はシグナル伝達を抑制する）か、会合状態のｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合するか、又はその両方（好ましくは、非会合状態のもの）に結合することは本発明の範囲内である。これらすべての場合において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドが、非会合状態のｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合する親和性及び／又は特異性と同じでもよいし、又はこれと異なってもよい（すなわち、これよりも高いか又は低い）親和性及び／又は特異性で、このような会合しているタンパク質複合体に結合してもよい。
また、当業者には明らかであるように、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含有するタンパク質又はポリペプチド、例えば本発明の「二パラトープ性」ポリペプチドは、対応する単量体アミノ酸配列よりも高いアビディティで、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合してもよい。例えば限定されないが、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の異なるエピトープに指向性を有する２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含有するタンパク質又はポリペプチドは、異なる単量体それぞれよりも高いアビディティで結合してもよく（通常結合し）、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含有するタンパク質又はポリペプチドは、より高いアビディティで、ｃ−Ｍｅｔの多量体（例えば、ホモ二量体）、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の多量体（例えば、ホモ二量体）に結合してもよい（通常結合するであろう）。
一般に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、当業者には明らかであるように、生物学的及び／又は治療的観点から最も関連がある形態のｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）（単量体形態、多量体形態、会合形態、及び様々なコンフォメーション形態を含む）に少なくとも結合するであろう。
本明細書で想定される使用に適切である限り、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドの部分、フラグメント、類似体、突然変異体、変異体、アレル及び／又は誘導体を使用すること、及び／又はこのような部分、フラグメント、類似体、突然変異体、変異体、アレル及び／又は誘導体の１つ以上を含むか、又はこれらから本質的になるタンパク質又はポリペプチドを使用することも本発明の範囲内である。このような部分、フラグメント、類似体、突然変異体、変異体、アレル及び／又は誘導体は、通常、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対して結合するための機能的な抗原結合部位（の少なくとも一部）を含有し、より好ましくは、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができ、さらにより好ましくは、本明細書（例えば、実験部分）にさらに記載されるように、結合、遊走、排除及び／若しくは増殖遮断に関するＥＣ５０値、平均Ｋｉ、ＩＣ５０値並びに／又は他の効力尺度（これらは、本明細書で定義されるとおりである）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合することができ、このような部分、フラグメント、類似体、突然変異体、変異体、アレル及び／又は誘導体は、より強力、より安定、より可溶性でもよいし、同じエピトープを有してもよい。このような部分、フラグメント、類似体、突然変異体、変異体、アレル、誘導体、タンパク質及び／又はポリペプチドのいくつかの非限定的な例は、本明細書のさらなる記載から明らかになるであろう。本発明のさらなるフラグメント又はポリペプチドもまた、本明細書に記載される１つ以上の（より小さい）部分又はフラグメントを適切に組み合わせることによって（すなわち、連結又は遺伝子融合することによって）提供することができる。
免疫グロブリン単一可変ドメインの一般的な説明については、以下のさらなる記載、及び本明細書で引用される従来技術を参照のこと。しかしながら、これに関して、本明細書及び従来技術には、いわゆる「ＶＨ３クラス」の免疫グロブリン単一可変ドメイン（すなわち、ＤＰ−４７、ＤＰ−５１又はＤＰ−２９などのＶＨ３クラスのヒト生殖系列配列と高度の配列相同性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン）が主に記載されており、これらは本発明の好ましい態様を形成することに留意するべきである。しかしながら、一般に、本発明は、その最も広い意味では、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する任意の種類の免疫グロブリン単一可変ドメインを包含し、例えばWO 07/118670に記載されているように、例えばいわゆる「ＶＨ４クラス」に属する免疫グロブリン単一可変ドメイン（すなわち、ＤＰ−７８などのＶＨ４クラスのヒト生殖細胞配列と高度の配列相同性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン）も包含することに留意するべきである。
一般に、免疫グロブリン単一可変ドメイン（特に、ＶＨＨ配列及び配列最適化免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、特に、フレームワーク配列（先と同様に、本明細書にさらに記載される）の１つ以上における１つ以上の「ホールマーク残基」（本明細書に記載される）の存在を特徴とすることができる。
したがって、一般に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３を指す）を有するアミノ酸配列と定義することができる。
好ましい態様では、本発明は、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３を表し、
ｉ）Kabatナンバリングの１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の少なくとも１つは、以下の表Ａ−１で言及されているホールマーク残基から選択され；そして
ｉｉ）前記アミノ酸配列は、WO 2009/138519（WO 2009/138519の配列番号１〜１２５を参照のこと）に示されている免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基（配列中、Ｘで示される）は無視される）；そして
ｉｉｉ）ＣＤＲ配列は、一般に、本明細書でさらに定義されるとおりである（例えば、表（Ｂ−２）に示されている組み合わせのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、ＣＤＲの定義がKabatナンバリングシステムにしたがって計算されていることに留意する））を有するアミノ酸配列である免疫グロブリン単一可変ドメインを少なくとも含むポリペプチドを提供する。
先と同様に、このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、任意の適切な形で任意の適切な供給源に由来するものでもよく、例えば、（すなわち、適切な種のラクダ、例えばラマ由来の）天然に存在するＶＨＨ配列でもよいし、又は（例えば、ヒト由来の）合成若しくは半合成のＶＨ又はＶＬでもよい。このような免疫グロブリン単一可変ドメインとしては、「ヒト化」又は別の方法で「配列最適化された」ＶＨＨ、「ラクダ化」免疫グロブリン配列（特に、ラクダ化重鎖可変ドメイン配列、すなわちラクダ化ＶＨ）、並びに本明細書にさらに記載されるように、（例えば、合成、ランダム又は天然に存在する免疫グロブリン配列から開始する）親和性成熟、ＣＤＲ移植、ベニアリング、異なる免疫グロブリン配列由来のフラグメントの組み合わせ、オーバーラッププライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、及び当業者に周知の免疫グロブリン配列を人為操作するための類似技術；又は、上記のいずれかの任意の適切な組み合わせなどの技術によって変化させたヒトＶＨ、ヒトＶＬ、ラクダ化ＶＨＨを挙げることができる。
さらに好ましい態様では、本発明は、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（実験部分を参照のこと）を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び半減期の増加（以下を参照のこと）を提供する部分からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供する。
さらに好ましい態様では、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列のＣＤＲ配列が、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（実験部分を参照のこと）の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ配列（表Ｂ−２を参照のこと）と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性又はさらに本質的には１００％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを提供する。このアミノ酸同一性の程度は、例えば、前記アミノ酸配列と、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（実験部分を参照のこと）の配列の１つ以上との間のアミノ酸同一性の程度を（本明細書に記載されるように）決定することによって決定することができる（この場合、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視される）。このような本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、以下のものをさらに提供してもよい：
（ｉ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し（本明細書で定義される）、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（実験部分を参照のこと）の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、例えば９０％又は９５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つ（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド；及び／又は
（ｉｉ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し（本明細書で定義される）、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対する配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（実験部分を参照のこと）の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つの結合を交差遮断し（本明細書で定義される）、及び／又はｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対する結合について配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（実験部分を参照のこと）の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと競合する少なくとも１つ（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド（これの免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書にさらに記載されるようなものでもよい）；及び／又は
（ｉｉｉ）このような免疫グロブリン単一可変ドメイン（これは、本明細書にさらに記載されるようなものでもよく、例えば、本明細書に記載される二重特異性（例えば、血清アルブミンにも結合する）及び／又は二パラトープ性のポリペプチドでもよい）の１つ以上（好ましくは、１つ）を含む本発明のポリペプチド、並びにこのような免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドをコードする核酸配列。このような免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、あらゆる天然に存在するリガンドを含まない。
本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、又はこれらから本質的になる。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの好ましいが非限定的ないくつかの例を、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（実験部分を参照のこと）に示す。
１．２ 抗ＥＧＦＲビルディングブロック
ＥＧＦＲは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインからなる（Yarden et al. 2001, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2:127-137）。ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達の異常活性化は、腫瘍細胞増殖、血管新生、転移、アポトーシスの阻害、及び放射線療又は化学療法に対する耐性を含む腫瘍の成長及び進行に関与する過程に関係している（Grunwald, Hidalgo 2003 J. Natl. Cancer Inst. 95:851-867; and references therein）。ＥＧＦＲは、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺ガン）の＞４０％、頭頸部ガンの＞９５％、膵臓ガンの＞３０％、腎臓ガン腫の＞９０％、卵巣ガンの＞３５％、神経膠腫の＞４０％及び膀胱ガンの＞３１％を含む多種多様な上皮由来腫瘍で発現している（Salomon et al. 1995. Crit. Review Oncol. Hematol, 19:183-232）。高レベルのＥＧＦＲ発現は疾患の進行、転移の増加及び予後不良と相関しているので、これは、種々の固形腫瘍を処置するために、有効なＥＧＦＲターゲティング抗体を開発することについて強い論理的根拠を提供する。
ＥＧＦＲを阻害するＭＡｂの同定は、悪性新生物における異常なＥＧＦＲシグナル伝達を標的とするために臨床開発で使用されるアプローチである。このようなＥＧＦＲターゲティング抗体の例は、IMC-C225 (Erbitux, Imclone)、EMD72000 (Merck Darmstadt)、ABX-EGF (Abgenix)、h-R3 (theraCIM, YM Biosciences)及びHumax-EGFR (Genmab)である。これらの抗体の作用機構は、レセプターに対するリガンド結合を阻害し、続いてリン酸移転反応及び下流のシグナル伝達カスケードを阻害することに依拠する。２２５由来Ｆ（ａｂ’）２フラグメントであるMab 225（Erbituxは、これのキメラ誘導体である）は、ＥＧＦＲを発現する細胞と共に持続的にインキュベーションした後にのみ、ＥＧＦＲインターナリゼーション及び適度なレセプター隔離を誘導することができる。しかしながら、一価２２５由来Ｆａｂ’フラグメントは、ウサギ抗マウス抗体と共にプレインキュベーションした後に、レセプターのダウンレギュレーションを誘導するに過ぎない（Fan et al 1993 J. Biol. Chem. 268:21073-21079; Fan et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:27595-27602）。これらの抗体は、広範なヒト腫瘍異種移植片パネルに対して抗腫瘍活性を示す（Grunwald & Hidalgo 2003 J. Natl. Cancer Inst. 95:851-867で概説されている）。
しかしながら、ＥＧＦレセプターに結合する公知の抗体系治療薬は、細胞毒性ではなく細胞増殖抑制性である。実際、これらの抗体又は現在利用可能な小分子薬物はいずれも、ガンの処置に完全に有効ではない。また、一部の患者では、ＥＧＦＲ阻害剤の治療用途は、重度の毒性によって制限されている。
WO 05/044858、WO 04/041867及びWO07/042289には、標準的な抗体よりも改善された特性を有する抗ＥＧＦＲナノボディ及びポリペプチドが既に記載されている。
しかしながら、本発明のポリペプチドを含む多重特異性構築物は、シグナル伝達の調節において、本発明の個々のポリペプチドの組み合わせよりも改善された有効性を有する。特に、（ａ）本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を調節する１つ以上のポリペプチド、及び（ｂ）ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を調節する１つ以上のポリペプチドを含む多重特異性構築物は、上に示した疾患及び障害を診断、予防及び処置するのに並外れて有用である。多重特異性構築物は、ガン、特に非小細胞肺ガンを診断、予防及び処置するのに特に有用である。
WO 05/044858、WO 04/041867及び／又はWO07/042289に記載されているポリペプチド及びナノボディは、本発明の多重特異性構築物中の、ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を調節するポリペプチドとして特に好ましい。したがって、本発明は、ＥＧＦＲに対する少なくとも１つのＩＳＶＤ、及びｃ−Ｍｅｔ及び場合によりＶＥＧＦに対する少なくとも１つのＩＳＶＤを含む多重特異性（例えば、二重特異性又は三重特異性など）構築物に関する。このような多重特異性（例えば、二重特異性又は三重特異性）ポリペプチド構築物では、本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔに対するナノボディ及びポリペプチドは、WO 05/044858、WO 04/041867及びWO07/042289（これらはすべて、その全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている抗ＥＧＦＲナノボディ及びポリペプチドの１つ以上と組み合わせることができる。
したがって、本発明は、上に示した疾患及び障害、特に非小細胞肺ガンを診断、予防及び処置における使用のための、（ａ）ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を調節する１つ以上のポリペプチド、及び（ｂ）ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達、特にＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を調節する１つ以上のポリペプチドを含む多重特異性構築物に関する。
１．３ 抗ＶＥＧＦビルディングブロック
血管系の発生は、多くの生理学的及び病理学的プロセスに基本的な必要事項である。血管新生は、固形腫瘍及び転移を含む様々な障害の病因に関係していることが現在では十分に立証されている。腫瘍成長の場合、血管新生は、過形成から新形成に移行するために、並びに腫瘍の成長及び転移に栄養を提供するために重要であると思われる。Folkman et al., Nature 339:58 (1989)。血管発生のプロセスは厳重にレギュレーションされており、前記プロセスにおいて、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生の刺激及び血管透過性の誘導に関与する重要な因子として同定されている。Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)。「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ−Ａ」という用語は、Leung et al. Science, 246:1306 (1989)及びHouck et al. MoI. Endocrin., 5:1806 (1991)によって記載されているように、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子、並びに関連する１２１−、１８９−及び２０６アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子と、それらの天然に存在するアレル型及びプロセシング型とを指すのに使用される。「ＶＥＧＦ生物学的活性」としては、任意のＶＥＧＦレセプターに対する結合、又は任意のＶＥＧＦシグナル伝達活性、例えば正常及び異常な血管新生及び脈管形成の両方のレギュレーションが挙げられる（Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. MoI. Med. 77:527-543）。
ほとんどの臨床経験は、ベバシズマブ（Avastin（登録商標）；Genentech, San Francisco, CA）とも称されるＡ４．６．１を用いて得られたものである。しかしながら、化学療法と組み合わせたAvastinは、副作用（出血、動脈血栓塞栓症、高血圧、胃腸穿孔、創傷治癒の問題、タンパク尿及び鬱血性心不全）によって悩まされており、これらは、抗ＶＥＧＦ活性が腫瘍部位に限定されておらず、長期間にわたって循環血液中で持続するという事実に起因するものである。この結果、末梢内皮細胞の生理学的活性が病態生理学的活性に変化する。しかしながら、慢性疾患を処置するためにリコンビナントヒト化抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ（ｒｈｕＦａｂ ＶＥＧＦ、ラニビズマブ又はLucentis（商標））を使用する抗ＶＥＧＦ戦略は、眼内炎、硝子体出血及び網膜剥離のリスクがあるので理想的ではない。
WO 08/101985には、標準的な抗体よりも改善された特性を有する抗ＶＥＧＦナノボディ及びポリペプチドが既に記載されている。
しかしながら、本発明のポリペプチドを含む多重特異性構築物は、シグナル伝達の調節において、本発明の個々のポリペプチドの組み合わせよりも改善された有効性を有する。特に、（ａ）本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を調節する１つ以上のポリペプチド、及び（ｂ）ＶＥＧＦ媒介性シグナル伝達及び場合によりＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を調節する１つ以上のポリペプチドを含む多重特異性構築物は、上に示した疾患及び障害を診断、予防及び処置するのに並外れて有用である。多重特異性構築物は、ガン、特に非小細胞肺ガンを診断、予防及び処置するのに特に有用である。
WO 08/101985に記載されているポリペプチド及びナノボディは、本発明の多重特異性構築物中の、ＶＥＧＦ媒介性シグナル伝達を調節するポリペプチドとして特に好ましい。したがって、本発明は、ｃ−Ｍｅｔに対する少なくとも１つのＩＳＶＤ、及びＶＥＧＦ及び場合によりＥＧＦＲに対する少なくとも１つのＩＳＶＤを含む多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性又は四重特異性など）構築物に関する。このような多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性又は四重特異性）ポリペプチド構築物では、本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔに対するナノボディ及びポリペプチドは、WO 08/101985（これは、その全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている抗ＶＥＧＦナノボディ及びポリペプチドの１つ以上と組み合わせることができる。
したがって、本発明は、上に示した疾患及び障害、特に非小細胞肺ガンを診断、予防及び処置における使用のための、（ａ）ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を調節する１つ以上のポリペプチドと、（ｂ）ＶＥＧＦ媒介性シグナル伝達、特にヒトＶＥＧＦ媒介性シグナル伝達を調節する１つ以上のポリペプチドと、場合により（ｃ）ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達、特にヒトＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を調節する１つ以上のポリペプチドとの多重特異性構築物に関する。特定の態様では、本発明は、ガンなどの病的症状を処置するための併用療法であって、ｃ−ＭｅｔアンタゴニストをＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせるか、又はｃ−ＭｅｔアンタゴニストをＶＥＧＦアンタゴニスト及びＥＧＦＲアンタゴニストと組み合わせ、それにより有意な抗腫瘍活性を提供する併用療法を提供する。
１．４ 結合価
一般に、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、又は免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になるタンパク質又はポリペプチドは、本明細書では「一価」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「一価構築物」と称される。２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、少なくとも２つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び少なくとも１つの他の免疫グロブリン単一可変ドメイン）を含むか、又はこれらから本質的になるタンパク質又はポリペプチドは、本明細書では「多価」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「多価構築物」と称され、これらは、対応する本発明の一価免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して、一定の利点を提供できる。このような多価構築物のいくつかの非限定的な例は、本明細書のさらなる記載から明らかになるであろう。
例えば、本発明の「二価」ポリペプチドは、場合によりリンカー配列を介して連結された２つのＩＳＶＤを含み、本発明の「三価」ポリペプチドは、場合により２つリンカー配列を介して連結された３つのＩＳＶＤを含み、本発明の「四価」ポリペプチドは、場合により３つリンカー配列を介して連結された４つのＩＳＶＤを含む；など；ポリペプチド又は構築物中に存在するＩＳＶＤの少なくとも１つ、ポリペプチド又は構築物中に存在する最大ですべてのＩＳＶＤは、ＩＳＶＤである。
本発明の多価ポリペプチドでは、２つ以上のＩＳＶＤが同じものでもよいし異なるものでもよく、同じ抗原又は抗原決定基（例えば、同じ部分若しくはエピトープ又は異なる部分若しくはエピトープ）に指向性を有してもよし、あるいは異なる抗原又は抗原決定基に指向性を有してもよく、又はそれらの任意の適切な組み合わせでもよい。例えば、本発明の二価ポリペプチドは、（ａ）２つの同一のＩＳＶＤ；（ｂ）タンパク質又は抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のＩＳＶＤ、及び前記タンパク質又は抗原の同じ抗原決定基に指向性を有する第２のＩＳＶＤであって、第１のＩＳＶＤと異なる第２のＩＳＶＤ；（ｃ）タンパク質又は抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のＩＳＶＤ、及び前記タンパク質又は抗原の別の抗原決定基に指向性を有する第２のＩＳＶＤ；又は、（ｄ）第１のタンパク質又は抗原に指向性を有する第１のＩＳＶＤ、及び（すなわち、前記第１の抗原と異なる）第２のタンパク質又は抗原に指向性を有する第２のＩＳＶＤを含んでもよい。同様に、本発明の三価ポリペプチドは、例えば限定されないが、（ａ）３つの同一のＩＳＶＤ；（ｂ）抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する２つの同一のＩＳＶＤ、及び同じ抗原の異なる抗原決定基に指向性を有する第３のＩＳＶＤ；（ｃ）抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する２つの同一のＩＳＶＤ、及び前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のＩＳＶＤ；（ｄ）第１の抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のＩＳＶＤ、前記第１の抗原の第２の抗原決定基に指向性を有する第２のＩＳＶＤ、及び前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のＩＳＶＤ；又は、（ｅ）第１の抗原に指向性を有する第１のＩＳＶＤ、前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第２のＩＳＶＤ、及び前記第１及び第２の抗原と異なる第３の抗原に指向性を有する第３のＩＳＶＤを含んでもよい。同様に、本発明の四価ポリペプチドは、例えば限定されないが、（ａ）４つの同一のＩＳＶＤ；（ｂ）第１の抗原の第１の抗原決定基に対する３つの同一のＩＳＶＤ、及び同じ抗原の異なる抗原決定基に指向性を有する１つのＩＳＶＤ；（ｃ）第１の抗原の第１の抗原決定基に対する３つの同一のＩＳＶＤ、及び前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する１つのＩＳＶＤ；（ｄ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のＩＳＶＤ、及び同じ抗原の異なる抗原決定基に指向性を有する２つのＩＳＶＤ；（ｅ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のＩＳＶＤ、同じ抗原の異なる抗原決定基に指向性を有する１つのＩＳＶＤ、及び前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する１つのＩＳＶＤ；（ｆ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のＩＳＶＤ、前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する２つのＩＳＶＤ；（ｇ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のＩＳＶＤ、前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する１つのＩＳＶＤ、及び前記第１及び第２の抗原と異なる第３の抗原に指向性を有する１つのＩＳＶＤ；（ｈ）第１の抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のＩＳＶＤ、前記第１の抗原の第２の抗原決定基に指向性を有する第２のＩＳＶＤ、前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３及び第４のＩＳＶＤ；（ｉ）第１の抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のＩＳＶＤ、前記第１の抗原の第２の抗原決定基に指向性を有する第２のＩＳＶＤ、前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のＩＳＶＤ、及び前記第１の抗原及び前記第２の抗原と異なる第３の抗原に指向性を有する第４のＩＳＶＤ；又は、（ｊ）第１の抗原に指向性を有する第１のＩＳＶＤ、前記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第２のＩＳＶＤ、前記第１及び第２の抗原と異なる第３の抗原に指向性を有する第３のＩＳＶＤ、及び前記第１、前記第２及び前記第３の抗原と異なる第４の抗原に指向性を有する第４のＩＳＶＤを含んでもよい。
少なくとも２つのＩＳＶＤを含有する本発明のポリペプチドであって、少なくとも１つのＩＳＶＤが第１の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔ）に指向性を有し、少なくとも１つのＩＳＶＤが第２の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔと異なるもの、例えばＥＧＦＲ又はＶＥＧＦ）に指向性を有する本発明のポリペプチドは、本発明の「多重特異性」ポリペプチドと称され、このようなポリペプチド中に存在するＩＳＶＤは、本明細書では「多価フォーマット」であるとも称される。したがって、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔ）に指向性を有する少なくとも１つのＩＳＶＤ、及び第２の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔと異なるもの、例えばＥＧＦＲ又はＶＥＧＦなど）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤを含むポリペプチドであり、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔ）に指向性を有する少なくとも１つのＩＳＶＤ、第２の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔと異なるもの、例えばＥＧＦＲ又はＶＥＧＦなど）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤ、及び第３の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔ及び第２の抗原の両方と異なるもの、例えばＥＧＦＲ又はＶＥＧＦ）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤを含むポリペプチドであり、本発明の「四重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔ）に指向性を有する少なくとも１つのＩＳＶＤ、第２の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔと異なるもの、例えばＥＧＦＲなど）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤ、第３の抗原（すなわち、ｃ−Ｍｅｔ及び第２の抗原ＥＧＦＲの両方と異なるもの、例えばＶＥＧＦなど）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤ、及び第４の抗原（すなわち、抗原ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦと異なるもの、例えば血清アルブミンなど）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤを含むポリペプチドである；など。
したがって、その最も単純な形態では、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有する第１のＩＳＶＤ、及び第２の抗原（例えば、ＥＧＦＲ又はＶＥＧＦ）に指向性を有する第２のＩＳＶＤを含む本発明の二価ポリペプチドであって、前記第１及び第２のＩＳＶＤが、場合によりリンカー配列（本明細書で定義される）を介して連結されていてもよい本発明の二価ポリペプチド（本明細書で定義される）であり；その最も単純な形態の本発明の三重特異性ポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有する第１のＩＳＶＤ、第２の抗原（例えば、ＥＧＦＲ又はＶＥＧＦなど）に指向性を有する第２のＩＳＶＤ、及び第３の抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔ及び前記第２の抗原（例えば、ＥＧＦＲ又はＶＥＧＦ）と異なるもの）に指向性を有する第３のＩＳＶＤを含む本発明の三価ポリペプチドであって、前記第１、第２及び第３のＩＳＶＤが、場合により１つ以上、特に１つ、より具体的には２つのリンカー配列を介して連結されていてもよい本発明の三価ポリペプチド（本明細書で定義される）であり；その最も単純な形態の本発明の四重特異性ポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有する第１のＩＳＶＤ、第２の抗原（例えば、ＥＧＦＲなど）に指向性を有する第２のＩＳＶＤ、第３の抗原（例えば、ＶＥＧＦなど）に指向性を有する第３のＩＳＶＤ、及びｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦと異なる第４の抗原に指向性を有する第４のＩＳＶＤを含む本発明の四価ポリペプチドであって、前記第１、第２、第３及び第４のＩＳＶＤが、場合により１つ以上、特に１つ以上、特に３つのリンカー配列を介して連結されていてもよい本発明の四価ポリペプチド（本明細書で定義される）である。
しかしながら、本説明から明らかであるように、本発明の多重特異性ポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに対する少なくとも１つのＩＳＶＤ、及びｃ−Ｍｅｔと異なる１つ以上の抗原に指向性を有する任意の数のＩＳＶＤをそれぞれ含んでもよいという意味において、本発明はそれらに限定されない。
具体的だが非限定的な実施態様によれば、本明細書に記載されるポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに対する少なくとも１つのＩＳＶＤ、及びＥＧＦＲ及び／又はＶＥＧＦに対する少なくとも１つのＩＳＶＤを含み、これらは、場合により１つ以上の適切なリンカーを使用して連結されていてもよい。このような二重特異性ポリペプチド構築物では、本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔに対するナノボディ及びポリペプチドは、WO 05/044858、WO 04/041867及び／若しくはWO07/042289に記載されている抗ＥＧＦＲナノボディ及びポリペプチドの１つ以上、並びに／又はWO08/101985に記載されている抗ＶＥＧＦナノボディ及びポリペプチドの１つ以上と組み合わせることができる。
２つの結合部分（例えば、２つのＩＳＶＤなど）を含む二重特異性ポリペプチドであって、各結合部分が腫瘍関連抗原（すなわち、腫瘍細胞上で発現している抗原、「腫瘍マーカー」とも称される）に対して特異的である二重特異性ポリペプチドは、腫瘍ターゲティングにおいて非常に有利である。このような二重特異性ポリペプチドは、２つの腫瘍関連抗原を同時に標的として、腫瘍特異性の増強をもたらすことができる。ほとんどの腫瘍マーカーが真に腫瘍特異的ではなく、正常な組織又は細胞上にも（大部分はより低いレベルで）存在していることが公知である。したがって、１つの腫瘍マーカーのみに対する単一特異的な結合部分、ＩＳＶＤ又はポリペプチドは、その正常な組織又は細胞も認識して、非特異的な細胞の停止又は殺傷をもたらすであろう。１つ以上の腫瘍細胞上の２つ以上のマーカーに対して特異的なポリペプチドはより一層腫瘍特異的であり、より良好な特異的結合を提供するであろう。したがって、それらは、複数のレセプターの活性化及び下流のシグナル伝達経路を同時に遮断し、より良好な腫瘍増殖阻害及び腫瘍細胞の停止又は殺傷を提供することができる。
したがって、本発明はまた、少なくとも２つの結合部分（例えば、２つのＩＳＶＤ）を含むか、又はこれらから本質的になる二重特異性又は多重特異性ポリペプチドであって、前記少なくとも２つの結合部分の少なくとも１つがｃ−Ｍｅｔに指向性を有し、他の結合部分がＥＧＦＲ又はＶＥＧＦに指向性を有する二重特異性又は多重特異性ポリペプチドに関する。特定の実施態様では、前記少なくとも２つの結合部分は、それらの個々の腫瘍関連抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲ又はＶＥＧＦなど）に対して中程度の又は低い親和性をもつので、腫瘍関連抗原の１つを発現する正常な組織又は細胞上では少し保持されるに過ぎない。しかしながら、それら少なくとも２つの結合部分は、二重特異性又は多重特異性ポリペプチドによって認識される両方の抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲ又はＶＥＧＦなど）を発現する腫瘍細胞を優先的に標的とする（高いアビディティを有する）。
したがって、本発明はまた、少なくとも３つの結合部分（例えば、３つのＩＳＶＤ）を含むか、又はこれらから本質的になる三重特異性又は多重特異性ポリペプチドであって、前記少なくとも３つの結合部分の少なくとも１つがｃ−Ｍｅｔに指向性を有し、１つの結合部分がＥＧＦＲに指向性を有し、１つの結合部分がＶＥＧＦに指向性を有する三重特異性又は多重特異性ポリペプチドに関する。特定の実施態様では、前記少なくとも３つの結合部分の２つは、それらの個々の腫瘍関連抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲなど）に対して中程度の又は低い親和性をもつので、腫瘍関連抗原の１つを発現する正常な組織又は細胞上では少し保持されるに過ぎない。しかしながら、それら少なくとも２つの結合部分は、二重特異性、三重特異性又は多重特異性ポリペプチドによって認識される両方の抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲなど）を発現する腫瘍細胞を優先的に標的とする（高いアビディティを有する）。
ＥＧＦＲは、例えば、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、肺ガン及び頭頸部ガンの腫瘍上で過剰発現している。
これらの腫瘍関連抗原の２つ、又はこれらの腫瘍関連抗原の１つの上の異なるエピトープを同時に標的とすることによって、より一層選択的な及び／又は増強された腫瘍ターゲティングが得られる。
したがって、好ましい実施態様では、本発明はまた、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有するナノボディ、及びＥＧＦＲ及び場合によりＶＥＧＦに指向性を有するナノボディを含むか、又はこれらから本質的になる二重特異性又は三重特異性ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有するナノボディ、及びＥＧＦＲに指向性を有するナノボディを含み得るか、又はこれらから本質的になり得る。本発明のポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有するナノボディ、及びＶＥＧＦに指向性を有するナノボディを含み得るか、又はこれらから本質的になり得る。また、本発明のポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有するナノボディと、ＥＧＦＲに指向性を有するナノボディ、及びＶＥＧＦに指向性を有するナノボディを含み得るか、又はこれらから本質的になり得る。
少なくとも２つのナノボディを含むか、又はこれらから本質的になる二重特異性又多重特異性ポリペプチドであって、他のナノボディがその抗原に結合すると、前記少なくとも２つのナノボディの１つが有するその抗原に対する親和性が減少又は増加する二重特異性又多重特異性ポリペプチドも本発明の範囲内に包含される。このような結合は、「条件的な二重特異的又多重特異的結合」と称される。このような二重特異性又多重特異性ポリペプチドは、「本発明の条件的結合二重特異性又多重特異性ポリペプチド」とも称される。
前記少なくとも２つのナノボディの第１のものによる抗原結合は、前記少なくとも２つのナノボディの第２のものによる抗原結合を調節（例えば、増強、減少又は阻害）してもよい。一実施態様では、前記少なくとも２つのナノボディの第１のものによる結合は、前記少なくとも２つのナノボディの第２のものによる結合を刺激する。別の実施態様では、前記少なくとも２つのナノボディの第１のものによる結合は、前記少なくとも２つのナノボディの第２のものによる結合を少なくとも部分的に阻害する。このような実施態様では、本発明のポリペプチドは、例えば、ポリペプチドの半減期を増加させるタンパク質に結合することによって、それがその第２の標的抗原に結合した状態になり、半減期を増加させるタンパク質から解離するような時間まで、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて被験体生物の体内で維持されてもよい。
上記文脈における結合の調節は、ナノボディの抗原結合部位が互いに構造上接近した結果として達成される。このような構造的接近は、２つ以上の抗原結合部位を連結する構造成分の性質によって（例えば、比較的強固な構造を有するリンカーであって、抗原結合部位を極めて接近して保持するリンカーを提供することによって）達成することができる。有利には、２つ以上の抗原結合部位は、一方の部位が、ポリペプチド内の立体障害及び／又はコンフォメーション変化を伴うプロセスによって別の部位における抗原結合を調節するように、互いに物理的に極めて接近している。
１．５ 血清アルブミンに結合するビルディングブロック又は半減期を増加させる他のビルディングブロック
別の態様では、本発明は、化合物又は構築物、特にタンパク質又はポリペプチド（本明細書ではそれぞれ「本発明の化合物」又は「本発明のポリペプチド」とも称される）であって、ヒトｃ−Ｍｅｔに指向性を有する１つ以上（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメイン（又はその適切なフラグメント）を含むか又はこれらから本質的になり、場合により、１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含む化合物又は構築物、特にタンパク質又はポリペプチドに関する。本明細書のさらなる開示から当業者には明らかになるように、このようなさらなる基、残基、部分、結合単位又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明のアミノ酸配列（及び／又は、これが存在する化合物又は構築物）にさらなる機能性を提供してもよいし、又は提供しなくてもよく、本発明のアミノ酸配列の特性を改変してもよいし、又は改変しなくてもよい。
上記の及び本明細書のさらなる記載から明らかであるように、このことは、本発明のポリペプチドを形成するために、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを「ビルディングブロック」として使用することができること、すなわち、１分子内に１つ以上の所望の特性又は生物学的機能を組み合わせた本明細書に記載される化合物又は構築物（例えば限定されないが、本明細書に記載される本発明の二パラトープ性、三パラトープ性、四パラトープ性、二価／三価／四価／多価及び二重特異性／三重特異性／四重特異性／多重特異性のポリペプチド）を形成するために、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを他の基、残基、部分又は結合単位と適切に組み合わせることを意味する。
１つ以上のナノボディを含有する多価及び多重特異性ポリペプチド及びそれらの調製の一般的な説明については、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302；及び例えば、WO 98/34103、WO 99/23221、WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164又はWO 2009/068627も参照のこと。
本発明の化合物又はポリペプチドは、一般に、本発明の化合物又はポリペプチドを提供するように、場合により１つ以上の適切なリンカーを介して、１つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと、１つ以上のさらなる基、残基、部分又は結合単位とを適切に連結する少なくとも１つの工程を含む方法によって調製することができる。本発明のポリペプチドは、一般に、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する工程、適切な方法で前記核酸を発現させる工程、及び発現させた本発明のポリペプチドを回収する工程を少なくとも含む方法によって調製することもできる。このような方法は、例えば、本明細書にさらに記載される方法及び技術に基づいて、当業者には明らかなそれ自体が公知の方法で実施することができる。
本発明のアミノ酸配列から開始して本発明の化合物又はポリペプチドを設計／選択、及び／又は調製する方法は、本明細書では前記本発明のアミノ酸配列を「フォーマットする」とも称される；本発明の化合物又はポリペプチドの一部を構成する本発明のアミノ酸は、「フォーマットされた」前記本発明の化合物若しくはポリペプチド、又は前記本発明の化合物若しくはポリペプチド「のフォーマット」であると言われる。本発明のアミノ酸配列をフォーマットすることができる方法の例及びこのようなフォーマットの例は、本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであり、このようなフォーマットされた免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明のさらなる態様を形成する。
例えば、このようなさらなる基、残基、部分又は結合単位は、化合物又は構築物が（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドであるような、１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。好ましいが非限定的な態様では、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位は、免疫グロブリン配列である。さらにより好ましくは、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体として使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はナノボディからなる群より選択される。あるいは、このような基、残基、部分又は結合単位は、例えば、化学基、残基、部分でもよく、これらはそれ自体が生物学的及び／若しくは薬理学的に活性でもよいし、又は生物学的及び／若しくは薬理学的に活性ではなくてもよい。例えば限定されないが、このような基は、本明細書にさらに記載されるように、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドの「誘導体」を提供するために、１つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインに連結されていてもよい。
本明細書に記載される１つ以上の誘導体を含むか又はこれらから本質的になり、場合により、１つ以上のリンカーを介して場合により連結された１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含む化合物又は構築物もまた本発明の範囲内である。好ましくは、前記１つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位は、免疫グロブリン単一可変ドメインである。上記化合物又は構築物では、１つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び１つ以上の基、残基、部分又は結合単位は、互いに直接連結されていてもよいし、及び／又は１つ以上の適切なリンカー若しくはスペーサーを介して連結されていてもよい。例えば、１つ以上の基、残基、部分又は結合単位が免疫グロブリン単一可変ドメインである場合、得られる化合物又は構築物が融合（タンパク質）又は融合（ポリペプチド）になるように、リンカーもまた免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。
本明細書のさらなる記載から明らかである本発明の具体的だが非限定的な態様では、本発明のポリペプチドは、それらが由来する免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して増加した血清半減期（本明細書にさらに記載される）を有する。例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、増加した半減期を有する本発明のアミノ酸配列の誘導体を提供するために、半減期を延長する１つ以上の基又は部分（例えば、ＰＥＧ）に（化学的に又は別の方法で）連結されていてもよい。
本発明の具体的な一態様では、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列と比較して増加した半減期を有してもよい。このような化合物及びポリペプチドの好ましいが非限定的な例のいくつかは、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者には明らかになり、例えば半減期が増加するように（例えば、ペグ化によって）化学的に改変された本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド；血清タンパク質（例えば、血清アルブミン）に結合するための少なくとも１つのさらなる結合部位を含む本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又は、本発明のアミノ酸配列の半減期を増加させる少なくとも１つの部分（特に、少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結された少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドを含む。このような半減期を延長する部分又は免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者には明らかになり、例えば限定されないが、１つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが、１つ以上の血清タンパク質若しくはそのフラグメント（例えば、（ヒト）血清アルブミン又はその適切なフラグメント）、又は血清タンパク質に結合することができる１つ以上の結合単位（例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体として使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、血清免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）若しくはトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合することができるナノボディなど；さらなる記載及び本明細書で言及される参考文献を参照のこと）に適切に連結されたポリペプチド；本発明のアミノ酸配列がＦｃ部分（例えば、ヒトＦｃ）又はその適切な部分若しくはフラグメントに連結されたポリペプチド；又は、１つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが、血清タンパク質に結合することができる１つ以上の小タンパク質又はペプチド（例えば限定されないが、WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489、WO2008/068280、WO2009/127691及びPCT/EP2011/051559に記載されているタンパク質及びペプチド）に適切に連結されたポリペプチドが挙げられる。
一般に、増加した半減期を有する本発明の化合物又はポリペプチドは、好ましくは、対応する本発明のアミノ酸配列それ自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍（例えば、少なくとも５倍）、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍超長い半減期を有する。例えば、増加した半減期を有する本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列それ自体と比較して１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超（例えば、１２時間超）、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間超増加した（例えば、ヒトにおける）半減期を有してもよい。
本発明の好ましいが非限定的な態様では、このような本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列それ自体と比較して１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超（例えば、１２時間超）、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間超増加した（例えば、ヒトにおける）血清半減期を有する。
本発明の好ましいが非限定的な別の態様では、このような本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば、本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば、約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば、約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０日〜１５日）、若しくは少なくとも約１１日（例えば、約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２日〜１８日又はそれ以上）、又は１４日超（例えば、約１４日〜１９日）の半減期を有してもよい。
別の態様では、本発明は、Ａｌｂ１１（配列番号５）又はＡｌｂ２３［配列番号１０１］）と、少なくとも１つの他のＩＳＶＤ（例えば、ナノボディ）（例えば、同じものでもよいし又は異なるものでもよい１つ又は２つの他のＩＳＶＤ、例えばナノボディ）であって、好ましくは所望の標的（これは、好ましくは、治療標的である）に指向性を有する少なくとも１つの他のＩＳＶＤ（例えば、ナノボディ）、並びに／又は治療目的、予防目的及び／若しくは診断目的に有用若しくは適切な別のＩＳＶＤ（例えば、ナノボディ）を含むナノボディ構築物などの多重特異性（特に、二重特異性）ＩＳＶＤに関する。先と同様に、Ａｌｂ１１（配列番号５）又はＡｌｂ２３［配列番号１０１］及び他のナノボディは、直接的に、又は場合により１つ以上の適切なリンカー若しくはスペーサーを介して互いに適切に連結されていてもよく、具体的だが非限定的な一態様によれば、他のナノボディの少なくとも１つ（最大ですべて）は、ＶＨＨ−１クラスのものでもよい。
本発明のいくつかの具体的な多重特異性及び／又は多価ポリペプチドのいくつかの他の例は、本明細書で言及されるAblynx N.V.による出願に見ることができる。特に、半減期を増加させるための血清タンパク質に対する少なくとも１つのナノボディを含む多価及び多重特異性構築物、これをコードする核酸、これを含む組成物、前述のものの調製、並びに前述のものの使用の一般的な説明については、上述の国際出願WO 04/041865及びWO 08/122787（本明細書に記載されるＡｌｂ−２３［配列番号１０１］及びＡｌｂ−２３変異体は、一般に、これらに記載されている半減期延長ナノボディ（例えば、Ａｌｂ−８）と同様に使用することができる）、並びにWO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164又はWO 2009/068627に示されているこのような構築物の一般的な説明及び具体例を参照のこと。
非限定的な一実施態様では、このようなポリペプチド又はタンパク質構築物中に存在する１つ以上の他のナノボディは、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有してもよく、特に、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有するＩ型ナノボディでもよい。
ｃ−Ｍｅｔに対する特に好ましいＩ型ナノボディであって、このような多価及び／又は多重特異性ポリペプチド中で（Ａｌｂ−２３［配列番号１０１］又はＡｌｂ−２３変異体の隣に）存在してもよいｃ−Ｍｅｔに対する特に好ましいＩ型ナノボディの１つは、０４Ｅ０９（配列番号２６）又はその変異体、例えば０４Ｅ０９様ＩＳＶＤである。
このような０４Ｅ０９変異体は、一般に、０４Ｅ０９と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有し、好ましくは、（ｉ）（適切なアッセイ、例えば、実施例７で使用したＨＧＦに代えて０４Ｅ０９を使用する以外は実施例７に記載のアルファスクリーンアッセイで）ｃ−Ｍｅｔに対する結合について０４Ｅ０９と競合し；及び／又は（ｉｉ）０４Ｅ０９と同じｃ−Ｍｅｔ上のエピトープに結合し；及び／又は（ｉｉｉ）ｃ−Ｍｅｔに対する０４Ｅ０９の結合を交差遮断（WO 2009/068627で定義されている）するようなものである。このような０４Ｅ０９変異体は、例えば、ヒト化及び／又は配列最適化０４Ｅ０９変異体（本明細書にさらに記載される）でもよい。このようなタンパク質又はポリペプチド中に存在し得る０４Ｅ０９変異体についての好ましいが非限定的ないくつかの例は、以下：０４Ｅ０９（Ｌ４９Ｓ）（配列番号２３）；０４Ｅ０９（Ｃ５０Ｓ／Ｃ１００ｂＧ）（配列番号２４）；０４Ｅ０９（Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ）（配列番号２５）；Ａ００７９００６７＝０４Ｅ０９（Ｑ１０８Ｌ）（配列番号１１４）；Ａ００７９００６８＝０４Ｅ０９（Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｑ１０８Ｌ）（配列番号１１５）；Ａ００７９００６９＝０４Ｅ０９（Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｇ８８Ａ、Ｑ１０８Ｌ）（配列番号１１６）及びＡ００７９０１０５＝０４Ｅ０９（Ｅ１Ｄ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｇ８８Ａ、Ｑ１０８Ｌ）（配列番号１０２）であり、これらの中では、より後のものが特に好ましい。
したがって、具体的だが非限定的な一態様では、本発明は、ｃ−Ｍｅｔに対する１つ又は２つのナノボディに（直接的に、又は１つ以上の適切なリンカーを介して）適切に連結されたＡｌｂ−２３［配列番号１０１］（好ましい）又はＡｌｂ−２３変異体（本明細書に記載される）を含むか、又はこれらから本質的になるポリペプチド又はタンパク質構築物に関する。述べたように、具体的だが非限定的な態様によれば、前記ｃ−Ｍｅｔに対する１つ又は２つのナノボディは、２つのジスルフィド架橋を含む（すなわち、「クラスＩ」のものである）。
特に、本発明は、ｃ−Ｍｅｔに対する１つ又は２つ（好ましくは、１つのみ）のナノボディであって、０４Ｅ０９（配列番号２６）又は０４Ｅ０９変異体（本明細書に記載される）、好ましくはヒト化又は配列最適化０４Ｅ０９変異体、より好ましくはＡ００７９０１０５（配列番号１０２）であるナノボディに（直接的に、又は１つ以上の適切なリンカーを介して）適切に連結されたＡｌｂ−２３［配列番号１０１］（好ましい）又はＡｌｂ−２３変異体（本明細書に記載される）を含むか、又はこれらから本質的になるポリペプチド又はタンパク質構築物に関する。
このようなタンパク質及びポリペプチドの具体的だが非限定的ないくつかの例は、構築物Ａｌｂ２３−９ＧＳ−４Ｅ０９（配列番号１０３）、４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ２３（配列番号１０４）、Ａｌｂ２３−９ＧＳ−Ａ００７９０１０５（配列番号１０５）、Ａ００７９０１０５−９ＧＳ−Ａｌｂ２３（配列番号１０６）、Ａｌｂ２３−３５ＧＳ−０４Ｅ０９（配列番号１０７）、４Ｅ０９−３５ＧＳ−Ａｌｂ２３（配列番号１０８）、Ａｌｂ２３−３５ＧＳ−Ａ００７９０１０５（配列番号１０９）、Ａ００７９０１０５−３５ＧＳ−Ａｌｂ２３（配列番号１１０）、Ａ００７９０１０５−３５ＧＳ−Ａ００７９０１０５−３５ＧＳ−Ａｌｂ２３（配列番号１１１）、及びＡ００７９０１０５−９ＧＳ−Ａｌｂ２３−Ａ（配列番号１８８）である。これらの中で、構築物Ａ００７９０１０５−９ＧＳ−Ａｌｂ２３（配列番号１０６）及びＡ００７９０１０５−９ＧＳ−Ａｌｂ２３−Ａ（配列番号１８８）が特に好ましいので、本発明の一態様はまた、配列番号１０６及び１８８のポリペプチドと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドに関する。
ｃ−Ｍｅｔに対するさらに特に好ましいＩ型ナノボディであって、多価及び／又は多重特異性ポリペプチド中で（Ａｌｂ−１１［配列番号５］又はＡｌｂ−１１変異体の隣に）存在してもよいｃ−Ｍｅｔに対するさらに特に好ましいＩ型ナノボディは、３３Ｈ１０（配列番号１８７）又はその変異体、例えば３３Ｈ１０様ＩＳＶＤであり、これは、全く予想外のことに、異なる宿主で都合良く産生された。このような３３Ｈ１０変異体は、一般に、３３Ｈ１０と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有し、好ましくは、（ｉ）（適切なアッセイ、例えば、実施例１．５で使用したＨＧＦに代えて３３Ｈ１０を使用する以外は実施例２１又は２２に記載のアルファスクリーンアッセイで）ｃ−Ｍｅｔに対する結合について３３Ｈ１０と競合し；及び／又は（ｉｉ）３３Ｈ１０と同じｃ−Ｍｅｔ上のエピトープに結合し；及び／又は（ｉｉｉ）ｃ−Ｍｅｔに対する３３Ｈ１０の結合を交差遮断（WO 2009/068627で定義されている）するようなものである。このような３３Ｈ１０変異体は、例えば、ヒト化及び／又は配列最適化３３Ｈ１０変異体（本明細書にさらに記載される）でもよい。このようなタンパク質又はポリペプチド中に存在し得る３３Ｈ１０変異体についての好ましいが非限定的ないくつかの例は、以下：クローンＡ００７９００１８４（野生型（ｗｔ）；配列番号１５１）、Ａ００７９００７３８〜Ａ００７９００７５３、Ａ００７９０１２４５〜Ａ００７９０１２５３及びＡ００７９０１２５５〜Ａ００７９０１２６３（それぞれ配列番号１１７〜１５０）であり、これらの中では、Ａ００７９０１２５６（配列番号１４３）、Ａ００７９０１２５９（配列番号１４６）及びＡ００７９０１２６０（配列番号１４７）が特に好ましい。
また特に、本発明は、ｃ−Ｍｅｔに対する１つ又は２つ（好ましくは、１つのみ）のナノボディであって、３３Ｈ１０（配列番号１８７）又は３３Ｈ１０変異体（本明細書に記載される）、好ましくはヒト化又は配列最適化３３Ｈ１０変異体、より好ましくはＡ００７９０１２５６（配列番号１４３）、Ａ００７９０１２５９（配列番号１４６）及びＡ００７９０１２６０（配列番号１４７）であるナノボディに（直接的に、又は１つ以上の適切なリンカーを介して）適切に連結されたＡｌｂ−１１［配列番号５］（好ましい）又はＡｌｂ−１１変異体（本明細書に記載される）を含むか、又はこれらから本質的になるポリペプチド又はタンパク質構築物に関する。
このようなタンパク質及びポリペプチドの具体的だが非限定的ないくつかの例は、構築物Ａ００７９０１２５５（配列番号１４２）；Ａ００７９０１２５６（配列番号１４３）；Ａ００７９０１２５７（配列番号１４４）；Ａ００７９０１２５８（配列番号１４５）；Ａ００７９０１２５９（配列番号１４６）；Ａ００７９０１２６０（配列番号１４７）；Ａ００７９０１２６１（配列番号１４８）；Ａ００７９０１２６２（配列番号１４９）；Ａ００７９０１２６３（配列番号１５０）である。これらの中で、構築物Ａ００７９０１２５６（配列番号１４３）、Ａ００７９０１２５９（配列番号１４６）及びＡ００７９０１２６０（配列番号１４７）が特に好ましいので、本発明の一態様はまた、配列番号１４３、１４６及び１４７のポリペプチドと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドに関する。
本発明の特に好ましいが非限定的な態様では、本発明は、ｉ）１つの本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン；及びｉｉ）１つ以上（好ましくは、１つ）の本明細書に記載される血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチドを提供する。
さらに好ましい態様では、本発明は、ｉ）１つの本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン；及びｉｉ）１つ以上（好ましくは、１つ）の配列番号５又は配列番号１０１の血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（表Ａ−２及びＢ−１を参照のこと）を含む本発明のポリペプチドを提供する。
さらに好ましい態様では、本発明は、ｉ）１つの本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔ結合免疫グロブリン単一可変ドメイン；及びｉｉ）配列番号５又は配列番号１０１のＣＤＲ（Kabatナンバリングにしたがって定義される）を有する１つ以上（好ましくは、１つ）の血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（表Ａ−２及びＢ−１を参照のこと）を含む本発明のポリペプチドを提供する。
したがって、例えば、特に、実験部分及びWO2008/068280のさらなる記載（ここでは、配列番号５又は配列番号１０１についてさらに詳述されており、例えば、前記配列を含有する免疫グロブリン単一可変ドメイン構築物のアカゲザルにおける半減期が開示されている）をさらに参照のこと（したがって、参照により組み込まれる）。
これらは、２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及び血清アルブミンに対する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインから構成され得る。このような多重特異性構築物は、本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであろう；このような多重特異性免疫グロブリン単一可変ドメインの好ましいが非限定的ないくつかの例は、配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８及び１４２〜１５０、好ましくは配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６及び１４７の構築物である（実験部分を参照のこと）。
具体的だが非限定的な別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び少なくとも１つの他の結合単位（すなわち、別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質又はポリペプチドに指向性を有する）（これもまた、好ましくは免疫グロブリン単一可変ドメインである）を含むか、又はこれらから本質的になる。このようなタンパク質又はポリペプチドは、本明細書では「多重特異性」タンパク質若しくはポリペプチド又は「多重特異性構築物」とも称され、これらは、２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有する１つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び血清アルブミンに対する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか、又はこれらから本質的になり得る。このような多重特異性構築物は、本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであろう；このような多重特異性免疫グロブリン単一可変ドメインの好ましいが非限定的ないくつかの例は、配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８及び１４２〜１５０、好ましくは配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６及び１４７の構築物である（実験部分を参照のこと）。
具体的だが非限定的なさらに別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び場合により１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインと、少なくとも１つの所望の特性を本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は得られる融合タンパク質に付与する少なくとも１つの他のアミノ酸配列（例えば、タンパク質又はポリペプチド）を含むか又はこれらから本質的になる。先と同様に、このような融合タンパク質は、対応する本発明の一価免疫グロブリン単一可変ドメインと比較してある特定の利点を提供してもよく、例えば、増加した半減期を提供してもよい。
上記構築物では、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は他の免疫グロブリン単一可変ドメインは、互いに直接連結されていてもよいし、及び／又は１つ以上のリンカー配列を介して互いに適切に連結されていてもよい。このようなリンカーの適切だが非限定的ないくつかの例は、本明細書のさらなる記載から明らかになるであろう。
一実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインを連結するリンカー配列は、配列番号１３〜２２、好ましくは配列番号１５又は２２から選択されるか、又は当技術分野において公知のものである。
別の好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むか、又はこれらから本質的になる三重特異性又は多重特異性ポリペプチドであって、前記少なくとも３つのＩＳＶＤの２つが、腫瘍関連抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲ又はＶＥＧＦなど）に指向性を有し、他の結合部分が、別の標的又は抗原に指向性を有する三重特異性又は多重特異性ポリペプチドに関する。好ましくは、この標的又は抗原は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期（本明細書にさらに記載される）を増加させることができる分子、又はエフェクター機能を有する分子（例えば、ＣＤ３、Ｆｃレセプター又は補体タンパク質）である。
一実施態様では、本発明は、ＥＧＦＲに対するナノボディ又はＶＥＧＦに対するナノボディ、及びｃ−Ｍｅｔに対するナノボディと、ヒト血清アルブミンに対するナノボディを含むか、又はこれらから本質的になる三重特異性ポリペプチドを提供する。
別の好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか、又はこれらから本質的になる四重特異性又は多重特異性ポリペプチドであって、前記少なくとも４つのＩＳＶＤの３つが、腫瘍関連抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦなど）に指向性を有し、他の結合部分が、別の標的又は抗原に指向性を有する四重特異性又は多重特異性ポリペプチドに関する。好ましくは、この標的又は抗原は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期（本明細書にさらに記載される）を増加させることができる分子、又はエフェクター機能を有する分子（例えば、ＣＤ３、Ｆｃレセプター又は補体タンパク質）である。
一実施態様では、本発明は、ＥＧＦＲに対するナノボディ、及びＶＥＧＦに対するナノボディと、ｃ−Ｍｅｔに対するナノボディと、ヒト血清アルブミンに対するナノボディを含むか、又はこれらから本質的になる四重特異性ポリペプチドを提供する。
さらに、本発明のポリペプチド中の種々のナノボディの具体的な順序又は配置が、本発明の最終ポリペプチドの特性（限定されないが、それぞれＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔ、又は１つ以上の他の抗原に対する親和性、特異性又はアビディティを含む）にいくらかの影響を及ぼし得ることが本発明の範囲内に包含されるが、前記順序又は配置は通常は重要ではなく、当業者であれば、場合により本明細書の開示に基づくいくつかの限定されたルーチン実験後に適切に選択し得る。したがって、本発明の具体的な多重特異性ポリペプチドを参照する場合、特に明確な指示がない限り、これは、関連するナノボディの任意の順序又は配列を包含することに留意するべきである。
具体的だが非限定的なさらに別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び１８７（実験部分を参照のこと）の免疫グロブリン単一可変ドメインの１つ以上と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の「配列同一性」（本明細書で定義される）を有する免疫グロブリン単一可変ドメインからなる群より選択され得、この場合の該ポリペプチドは、好ましくは、本明細書でさらに定義されるとおりである（すなわち、ｃ−Ｍｅｔに指向性を有する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインと、血清アルブミンに指向性を有する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインとからなる好ましいフォーマットである）。
具体的だが非限定的なさらに別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８及び１４２〜１５０、好ましくは配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６及び１４７のポリペプチドの１つ以上と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の「配列同一性」（本明細書で定義される）を有するポリペプチドからなる群より選択され得る。
１．６ 本発明の組成物及び医薬組成物
一般に、医薬用途の場合、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤及び／又はアジュバントと、並びに場合により１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む医薬調製物又は組成物として製剤化してもよい。非限定的な例として、このような製剤は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈、筋肉内又は皮下注射又は静脈輸液による）、局所投与、吸入による投与、スキンパッチ、インプラント、坐剤などに適切な形態でもよく、非経口投与が好ましい。このような適切な投与形態（これは、投与様式に応じて、固体、半固体形又は液体であり得る）並びにその調製における使用のための方法及び担体は当業者には明らかであり、本明細書にさらに記載される。このような医薬調製物又は組成物は、一般に、本明細書では「医薬組成物」と称される。非ヒト生物における使用のための医薬調製物又は組成物は、一般に、本明細書では「獣医学的組成物」と称される。
したがって、さらなる一態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸、少なくとも１つの本発明のポリペプチド又は少なくとも１つの本発明のポリペプチド、少なくとも１つの適切な担体、希釈剤又は賦形剤（すなわち、医薬用途に適切なもの）、及び場合により１つ以上のさらなる活性物質を含有する医薬組成物に関する。
一般に、本発明のポリペプチドは、それ自体が公知の任意の適切な方法で製剤化及び投与することができる。例えば、上で引用した一般的な背景技術（特に、WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867及びWO 08/020079）、及び標準的なハンドブック、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)；又はthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば、２５２〜２５５頁を参照のこと）を参照のこと。
本発明のポリペプチドは、従来の抗体及び抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及びダイアボディを含む）及び他の薬学的に活性なタンパク質についてのそれ自体が公知の任意の方法で製剤化及び投与してもよい。このような製剤及びこれを調製するための方法は当業者には明らかであり、例えば、非経口投与（例えば、静脈、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内又は髄腔内投与）又は局所（すなわち、経皮又は皮内）投与に適切な調製物が挙げられる。
非経口投与のための調製物は、例えば、輸液又は注射に適切な滅菌溶液、懸濁液、分散液又はエマルションでもよい。このような調製物のための適切な担体又は希釈剤としては、例えば限定されないが、WO 08/020079の１４３頁で言及されているものが挙げられる。一実施態様では、調製物は、水性溶液又は水性懸濁液である。
本発明のポリペプチドは、遺伝子治療で公知の送達方法を使用して投与することができる（例えば、米国特許第5,399,346号（これは、その遺伝子治療送達方法について、参照により組み込まれる）を参照のこと）。遺伝子治療送達方法を使用して、本発明のアミノ酸配列、ポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクションしたプライマリー細胞を、特定の器官、組織、グラフト、腫瘍、又は細胞を標的とする組織特異的プロモーターでさらにトランスフェクションすることもできるし、細胞内局所発現用のシグナル配列及び安定化配列でさらにトランスフェクションすることもできる。
したがって、本発明のポリペプチドは、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体などの薬学的に許容しうるビヒクルと組み合わせて、全身投与（例えば、経口投与）してもよい。これらは、ハード又はソフトなシェルゼラチンカプセル内に封入してもよいし、錠剤に圧縮してもよいし、又は患者の食事療法の食品に直接組み込んでもよい。経口療法的投与の場合、本発明のポリペプチドを１つ以上の賦形剤と組み合わせ、消化可能な錠剤、バッカルタブレット、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用してもよい。このような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の本発明のポリペプチドを含有するべきである。当然のことながら、組成物及び調製物中のそのパーセンテージは変化してもよく、有利には、所定の単位剤形の重量の約２〜約６０％でもよい。このような治療上有用な組成物中の本発明のポリペプチドの量は、有効投与量レベルが得られるようなものである。
腫瘍切除部位における局所投与の場合、本発明のポリペプチドは、生体分解性ポリマー薬物送達システム、徐放ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）製剤などで使用してもよい（Hart et al., Cochrane Database Syst Rev. 2008 Jul 16; (3): CD007294）。
本発明のさらに好ましい態様では、１つの一価抗ヒトｃ−Ｍｅｔ免疫グロブリン単一可変ドメイン及び１つの一価抗ヒト血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインがＧＳリンカーによって連結されたものから本質的になるポリペプチドなどの本発明のポリペプチドは、例えば、ＩｇＧなどの従来の抗体と比較して、固形腫瘍において有益な分布及び動態プロファイルを有してもよい。
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤及び甘味料又は香味剤、例えば、WO 08/020079の１４３〜１４４頁で言及されているものを含有してもよい。単位剤形がカプセルである場合、これは、上記種類の材料に加えて、液体担体、例えば植物油又はポリエチレングリコールを含有してもよい。種々の他の材料が、コーティングとして存在してもよいし、又は固体単位剤形の物理的形状を別の方法で改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラック又は糖などでコーティングしてもよい。シロップ又はエリキシル剤は、本発明のポリペプチド、甘味剤としてスクロース又はフルクトース、保存料としてメチル及びプロピルパラベン、染料及び香味剤、例えばチェリー又はオレンジフレーバーを含有してもよい。当然のことながら、任意の単位剤形を調製するのに使用される任意の材料は、薬学的に許容しうるものであり、用いられる量で実質的に非毒性であるべきである。加えて、本発明のポリペプチドは、持続放出調製物及びデバイス中に組み込んでもよい。
経口投与のための調製物及び製剤はまた、本発明の構築物が胃環境に耐え、腸を通過することを可能にする腸溶性コーティング剤と共に提供してもよい。より一般には、経口投与のための調製物及び製剤は、胃腸管の任意の所望の部分に送達するために適切に製剤化してもよい。加えて、適切な坐剤を、胃腸管に送達するのに使用してもよい。
本発明のポリペプチドはまた、輸液又は注射によって静脈内投与又は腹腔内投与してもよい。特定の例は、WO 08/020079の１４４頁及び１４５頁又はPCT/EP2010/062975（文書全体）にさらに記載されている。
局所的投与の場合、本発明のポリペプチドは、（すなわち、それらが液体である場合には）純粋な形態で適用してもよい。しかしながら、皮膚科学的に許容しうる担体（これは、固体でもよいし、又は液体でもよい）と組み合わせて、それらを組成物又は製剤として皮膚に投与することが一般には望ましいであろう。特定の例は、WO 08/020079の１４５頁にさらに記載されているとおりである。
一般に、ローションなどの液体組成物中の本発明のポリペプチドの濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％であろう。ゲル又は粉末などの半固体又は固体組成物中の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは０．５〜２．５重量％であろう。
処置に使用するのに必要な本発明のポリペプチドの量は、選択された特定のポリペプチドだけではなく、投与経路、処置される症状の性質並びに患者の年齢及び症状によっても変化し、最終的には、主治医又は臨床医の判断によるであろう。また、本発明のポリペプチドの投与量は、標的細胞、腫瘍、組織、グラフト又は器官に応じて変化する。
所望の用量は、有利には、単回用量で提示してもよいし、又は適切な間隔で投与される分割用量（例えば、１日あたり２回、３回、４回以上の分割用量）として提示してもよい。分割用量それ自体を、例えば、離散的に散漫に間隔をおいた投与の数に分割してもよい。
投与レジメンは、長期の毎日処置を含んでもよい。「長期」は、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数カ月間又は数年間の期間を意味する。当業者であれば、本明細書の教示に示されているルーチン実験のみを使用して、投与量範囲の必要な改変を決定し得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed 4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照のこと。投与量はまた、任意の合併症現象では個々の医師によっても調整され得る。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのｃ−Ｍｅｔに関連する疾患又は障害を予防及び／又は処置するための方法であって、本発明のポリペプチド及び／又はこれを含む医薬組成物の薬学的活性量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
本発明の文脈では、「予防及び／又は処置」という用語は、疾患を予防及び／又は処置することを含むだけではなく、一般には、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を遅延若しくは低減すること、疾患に関連する１つ以上の症候の発症を予防若しくは遅延すること、疾患に関連する１つ以上の症候を軽減及び／若しくは緩和すること、疾患及び／若しくはそれに関連する任意の症候の重症度及び／若しくは持続期間を減少させること、並びに／又は疾患及び／若しくはそれに関連する任意の症候の重症度のさらなる増加を予防すること、疾患によって引き起こされる任意の生理学的損傷を予防、軽減又は低減すること、並びに一般には、処置されている患者に有益な任意の薬理学的作用も含む。
処置されるべき被験体は、任意の温血動物でもよいが、特に哺乳動物、より具体的にはヒトである。当業者には明らかであるように、処置されるべき被験体は、特に、本明細書で言及される疾患及び障害に罹患しているか、又はこれらのリスクを有する者である。
本発明は、ｃ−Ｍｅｔ、その生物学的若しくは薬理学的活性、及び／又はｃ−Ｍｅｔが関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達に関連する少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は処置するための方法であって、本発明のアミノ酸配列、本発明のポリペプチド及び／又はこれらを含む医薬組成物の薬学的活性量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。一実施態様では、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ、その生物学的若しくは薬理学的活性、及び／又はｃ−Ｍｅｔが関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達を調節することによって処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は処置するための方法であって、本発明のポリペプチド及び／又はこれを含む医薬組成物の薬学的活性量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。一実施態様では、前記薬学的有効量は、ｃ−Ｍｅｔ、その生物学的若しくは薬理学的活性、及び／又はｃ−Ｍｅｔが関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達を調節するのに十分な量；並びに／又は、ｃ−Ｍｅｔ、その生物学的若しくは薬理学的活性、及び／又はｃ−Ｍｅｔが関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達を調節するのに十分な循環レベルの本発明のポリペプチドを提供する量でもよい。
一実施態様では、本発明は、本発明のポリペプチド若しくはこれをコードする本発明のヌクレオチド構築物及び／又はこれらを含む医薬組成物を患者に投与することによって予防及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は処置するための方法に関する。一実施態様では、前記方法は、本発明のポリペプチド若しくはこれをコードする本発明のヌクレオチド構築物及び／又はこれらを含む医薬組成物の薬学的活性量を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
一実施態様では、本発明は、処置されるべき被験体の特定細胞又は特定組織におけるｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を阻害することによって（特に、処置されるべき被験体中に存在するガン細胞、腫瘍又は腫瘍微小環境におけるｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を阻害することによって）予防及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は処置するための方法であって、本発明のポリペプチド若しくはこれをコードする本発明のヌクレオチド構築物及び／又はこれらを含む医薬組成物の薬学的活性量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
一実施態様では、本発明は、本明細書に列挙されている疾患及び障害からなる群より選択される少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は処置するための方法であって、本発明のポリペプチド若しくはこれをコードする本発明のヌクレオチド構築物及び／又はこれらを含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
一実施態様では、本発明は、本発明のポリペプチド若しくはこれをコードする本発明のヌクレオチド構築物及び／又はこれらを含む医薬組成物の薬学的活性量を、本明細書で言及される疾患及び障害に罹患しているか又はこれらのリスクを有する被験体に投与することを含む免疫治療法（特に、受動免疫治療法）に関する。
上記方法では、本発明のアミノ酸配列、本発明のポリペプチド及び／又はこれらを含む組成物は、使用されるべき具体的な医薬製剤又は組成物に応じて、任意の適切な方法で投与することができる。したがって、本発明のポリペプチド及び／又はこれを含む組成物は、先と同様に、使用されるべき具体的な医薬製剤又は組成物に応じて、例えば、経口投与、腹腔内投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、又は胃腸管を回避する任意の他の投与経路による）、鼻腔内投与、経皮投与、局所投与、坐剤投与、吸入投与することができる。臨床医は、予防又は処置されるべき疾患又は障害、及び臨床医に周知の他の要因に応じて、適切な投与経路及びこのような投与に使用されるべき適切な医薬製剤又は組成物を選択することができるであろう。
本発明のポリペプチド及び／又はこれを含む組成物は、予防又は処置されるべき疾患又は障害を予防及び／又は処置するのに適切な処置レジメンにしたがって投与される。臨床医は、一般に、予防又は処置されるべき疾患又は障害、処置されるべき疾患の重症度及び／又はその症候の重症度、使用されるべき本発明のポリペプチド、使用されるべき具体的な投与経路及び医薬製剤又は組成物、患者の年齢、性別、体重、食事療法、一般的状態、並びに臨床医に周知の類似要因などの要因に応じて、適切な処置レジメンを決定することができるであろう。
一般に、処置レジメンは、１つ以上の本発明のポリペプチド又はこれを含む１つ以上の組成物を、１つ以上の薬学的有効量又は用量で投与することを含むであろう。投与されるべき具体的な量又は用量は、先と同様に、上記要因に基づいて、臨床医によって決定され得る。
一般に、本明細書で言及される疾患及び障害の予防及び／又は処置では、処置されるべき具体的な疾患又は障害、使用されるべき具体的な本発明のポリペプチドの効力、使用される具体的な投与経路及び具体的な医薬製剤又は組成物に応じて、本発明のポリペプチドは、一般に、１グラム〜０．０１マイクログラム／体重kg／日、好ましくは０．１グラム〜０．１マイクログラム／体重kg／日、例えば、約１、１０、１００又は１０００マイクログラム／体重kg／日の量で、単回１日用量として連続的に（例えば、輸液によって）、又は複数分割用量として１日にわたって投与されるであろう。臨床医は、一般に、本明細書で言及される要因に応じて、適切な１日用量を決定することができるであろう。特定の場合、臨床医は、例えば上記要因及びその専門的判断に基づいて、これらの量から逸脱することを選択してもよいことも明らかである。一般に、投与されるべき量についてのいくつかの指針は、同じ標的に対する同程度の従来の抗体又は抗体フラグメントの通常の投与量であって、本質的に同じ経路を介して投与される投与量から得ることができるが、しかしながら、親和性／アビディティ、有効性、生体内分布、半減期及び当業者に周知の類似要因の相違について考慮する。
一実施態様では、本発明の単一連続ポリペプチドが使用される。一実施態様では、２つ以上の本発明のポリペプチドを組み合わせて提供する。
本発明のポリペプチドは、１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物又は成分と組み合わせて（すなわち、併用処置レジメンとして）使用してもよく、相乗効果をもたらしてもよいし、又はもたらさなくてもよい。先と同様に、臨床医は、上記要因及びその専門的判断に基づいて、このようなさらなる化合物又は成分、及び適切な併用処置レジメンを選択することができるであろう。
特に、本発明のポリペプチドは、本明細書で引用される疾患及び障害を予防及び／又は処置するのに使用することができる他の薬学的に活性な化合物又は成分と組み合わせて使用してもよく、その結果として、相乗効果が得られてもよいし、又は得られなくてもよい。このような化合物及び成分、並びにこれらを投与するための経路、方法及び医薬製剤又は組成物の例は臨床医には明らかであり、一般に、処置されるべき腫瘍を処置するのに通常適用される細胞増殖抑制性（好ましくは、細胞毒性）の活性成分が挙げられる。
腫瘍学のために本発明のポリペプチドと併用するための具体的に意図される組み合わせとしては、限定されないが、例えばＲＯＮアンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、例えばＡＭＤ３１００など、他のケモカインレセプターアンタゴニスト、タクソール；ゲムシタビン；シスプラチン；ｃＩＡＰ阻害剤（例えば、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２及び／又はＸＩＡＰに対する阻害剤）；ＭＥＫ阻害剤（限定されないが、例えばＵ０１２６、ＰＤ０３２５９０１を含む）；ｂＲａｆ阻害剤（限定されないが、例えばＲＡＦ２６５を含む）；及びｍＴＯＲ阻害剤（限定されないが、例えばＲＡＤ００１を含む）；ＶＥＧＦ阻害剤（限定されないが例えばベバシズマブ、スニチニブ（ｓｕｔｉｎｉｂ）及びソラフェニブを含む）；ＥＲＢＢ阻害剤、例えばＥＧＦＲ阻害剤（限定されないが、特異的小分子キナーゼ阻害剤、例えばエルロチニブ、ゲフィチニブを含む）など；抗体、例えばセツキシマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、ネシツムマブ、ＩＭＣ−Ｃ２２５（Erbitux, Imclone）、ＥＭＤ７２０００（Merck Darmstadt）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Abgenix）、ｈ−Ｒ３（theraCIM, YM Biosciences）及びＨｕｍａｘ−ＥＧＦＲ（Genmab）；二重特異性又は多重特異性小分子キナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ（ＥＧＦＲ＆ＨＥＲ２）、バンデタニブ（ＥＧＦＲ、ＲＥＴ、ＶＥＧＦＲ２）、ネラチニブ（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４）及びＰＦ−２９９８０４（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４）、ＨＥＲ２阻害剤（限定されないが、例えばトラスツズマブ及びラパチニブを含む）；ＨＥＲ３阻害剤；ＨＥＲ４阻害剤；ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ｓｒｃ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ及び／又はＧＳＫ３阻害剤；選択的エストロゲンレセプターモデュレーター（限定されないが、タモキシフェンを含む）；エストロゲンレセプターダウンレギュレーター（限定されないが、フルベストラントを含む）が挙げられる。例えば、炎症及び他の症状のために本発明のポリペプチドと併用するための具体的に意図される組み合わせとしては、限定されないが、例えばインターフェロンβ１α及びβ、ＩＦＮα２ｂ；ナタリズマブ；ＴＮＦαアンタゴニスト（限定されないが、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、エタネルセプトを含む）；疾患改変抗リウマチ薬、例えばメトトレキサート（ＭＴＸ）など；グルココルチコイド（限定されないが、例えばデキサメタゾン、ヒドロコルチゾンを含む）；非ステロイド系抗炎症薬（限定されないが、例えばイブプロフェン、スリンダク；ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒ阻害剤（限定されないが、例えばＲｏＡｃｔｅｍｒａ、ＡＬＤ５１８を含む）も挙げられる。加えて、腫瘍学適応のために本発明のポリペプチドと併用するための組み合わせとしては、限定されないが、非標的化学療法薬、例えば細胞毒性薬及び／又は細胞増殖抑制薬が挙げられる。本発明はまた、腫瘍の進行若しくは転移に関与する他の成長因子に対して指向性を有する他の抗体及び／若しくは化合物、及び／又は毒素とコンジュゲーションした化合物及び／若しくは抗ガン剤若しくは薬剤と組み合わせて本発明のポリペプチドを含む製品及び／又は組成物、並びに特定のガンを予防及び／又は処置するためのそれらの使用を含む。
２つ以上の物質又は成分が併用処置レジメンの一部として使用されるべき場合、それらは、同じ投与経路又は異なる投与経路を介して、本質的に同じ時間又は異なる時間で（例えば、本質的に同時に、連続的に又は交代するレジメンにしたがって）投与することができる。物質又は成分が同じ投与経路を介して同時に投与されるべき場合、当業者には明らかであるように、それらは、異なる医薬製剤若しくは組成物として、又は複合医薬製剤若しくは組成物の一部として投与してもよい。
また、２つ以上の活性物質又は成分が併用処置レジメンの一部として使用されるべき場合、各物質又は成分は、化合物又は成分をそれ自体で使用する場合に使用される同じレジメンにしたがって同じ量で投与してもよく、このような併用は、相乗効果をもたらしてもよいし、又はもたらさなくてもよい。しかしながら、２つ以上の活性物質又は成分の併用が相乗効果をもたらす場合、所望の治療的作用を依然として達成しながら、１つ以上又はすべての投与されるべき物質又は成分の量を減少させることも可能であり得る。これは、例えば、所望の薬学的又は治療的作用を依然として達成しながら、通常量で使用される場合の１つ以上の物質又は成分の使用に伴う任意の望ましくない副作用を回避、限定又は軽減するのに有用であり得る。
本発明にしたがって使用される処置レジメンの有効性は、臨床医には明らかであるように、関連する疾患又は障害についてのそれ自体が公知である任意の方法で決定及び／又は観察してもよい。臨床医は、適切な場合には個々の事例に応じて、特定の処置レジメンを変更又は改変して、所望の治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、限定若しくは軽減し、及び／又は一方では所望の治療効果を達成し、他方では望ましくない副作用を回避、限定若しくは軽減する適切なバランスを達成することができるであろう。
一般に、処置レジメンは、所望の治療効果が達成されるまで、及び／又は所望の治療効果を維持するべき間にわたって継続されるであろう。先と同様に、これは、臨床医によって決定され得る。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのｃ−Ｍｅｔに関連する疾患及び障害を予防及び／又は処置するための医薬組成物の調製における；及び／又は本明細書で言及される処置方法の１つ以上における使用のための、本発明のポリペプチドの使用に関する。
処置されるべき被験体は、任意の温血動物でもよいが、特に哺乳動物、より具体的にはヒトである。獣医学的用途では、処置されるべき被験体としては、商業目的で飼育されているか又はペットとして飼われている任意の動物が挙げられる。当業者には明らかであるように、処置されるべき被験体は、特に、本明細書で言及される疾患及び障害に罹患しているか、又はこれらのリスクを有する者である。
本発明は、本発明のポリペプチド若しくはこれをコードするヌクレオチド及び／又はこれらの医薬組成物を患者に投与することによって予防及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は処置するための医薬組成物の調製における本発明のポリペプチド又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。
より具体的には、本発明は、ｃ−Ｍｅｔに関連する疾患及び障害を予防及び／又は処置するための（特に、本明細書に列挙されている疾患及び障害の１つ以上を予防及び処置するための）医薬組成物の調製における本発明のポリペプチド又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、ｃ−Ｍｅｔに関連する疾患及び障害を予防及び／又は処置するための方法であって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを投与する方法に関する。本発明は、ｃ−Ｍｅｔに関連する疾患及び障害の予防及び／又は処置における使用のための本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに関する。
本発明はまた、多発性骨髄腫に罹患している被験体における骨髄腫細胞の増殖を減少させ、及び／又は阻害するための医薬組成物の調製における本発明のポリペプチド又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、多発性骨髄腫に罹患している被験体における骨髄腫細胞の増殖を減少させ、及び／又は阻害するための方法であって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを投与する方法に関する。本発明は、多発性骨髄腫に罹患している被験体における骨髄腫細胞の増殖を減少させ、及び／又は阻害するための本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに関する。好ましい態様では、骨髄腫細胞の増殖は、３０％以上、４０％以上、５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、又はさらに８０％以上、９０％以上、最も好ましくは１００％減少される。
本発明はまた、多発性骨髄腫に罹患している被験体における骨髄腫細胞の遊走を減少させ、及び／又は阻害するための医薬組成物の調製における本発明のポリペプチド又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、多発性骨髄腫に罹患している被験体における骨髄腫細胞の遊走を減少させ、及び／又は阻害するための方法であって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを投与する方法に関する。本発明は、多発性骨髄腫に罹患している被験体における骨髄腫細胞の遊走を減少させ、及び／又は阻害するための本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに関する。好ましい態様では、骨髄腫細胞の遊走は、３０％以上、４０％以上、５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、又はさらに８０％以上、９０％以上、最も好ましくは１００％減少される。
本発明において、本発明者らは、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ）がＨＧＦ誘導性破骨細胞形成を回復することができたことを初めて観察した。したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチド及び以前に記載されている抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、WO 2012/042026に記載されているもの）を含む抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤのこの新規な使用を対象とする。したがって、本発明は、多発性骨髄腫を含む骨転移ガンに罹患している被験体における骨疾患を予防及び／又は処置するための医薬組成物の調製における抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、多発性骨髄腫を含む骨転移ガンに罹患している被験体における骨疾患を予防及び／又は処置するための方法であって、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）を投与する方法に関する。本発明は、多発性骨髄腫を含む骨転移ガンに罹患している被験体における骨疾患を予防及び／又は処置するための抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）に関する。
本発明はまた、多発性骨髄腫を含む骨転移ガンに罹患している被験体における骨形成に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための医薬組成物の調製における抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、多発性骨髄腫を含む骨転移ガンに罹患している被験体における骨形成に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための方法であって、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）を投与する方法に関する。本発明は、多発性骨髄腫を含む骨転移ガンに罹患している被験体における骨形成に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）に関する。
本発明はまた、（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）誘導性）骨芽細胞形成に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための医薬組成物の調製における抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）誘導性）骨芽細胞形成に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための方法であって、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）を投与する方法に関する。本発明は、（例えば、Standal et al., Blood 2007 Apr 1; 109(7): 3024-30に記載されているように、骨芽細胞分化アッセイ又はＡＬＰアッセイによって測定した場合に）（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）誘導性）骨芽細胞形成に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）に関する。好ましい態様では、（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）誘導性）骨芽細胞形成に対するＨＧＦの阻害効果は、３０％以上、４０％以上、５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、又はさらに８０％以上、９０％以上、最も好ましくは１００％低減される。
本発明はまた、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（のＢＭＰ誘導性発現）に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための医薬組成物の調製における抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（のＢＭＰ誘導性発現）に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための方法であって、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）を投与する方法に関する。本発明は、（例えば、Standal et al., Blood 2007 Apr 1; 109(7): 3024-30に記載されているように、ＡＬＰアッセイによって測定した場合に）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（のＢＭＰ誘導性発現）に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）に関する。好ましい態様では、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（のＢＭＰ誘導性発現）に対するＨＧＦの阻害効果は、３０％以上、４０％以上、５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、又はさらに８０％以上、９０％以上、最も好ましくは１００％低減される。
本発明はまた、骨芽細胞の石灰化に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための医薬組成物の調製における抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、骨芽細胞の石灰化に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための方法であって、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）を投与する方法に関する。本発明は、（例えば、Standal et al., Blood 2007 Apr 1; 109(7): 3024-30に記載されているように、骨芽細胞分化アッセイ、ＡＬＰアッセイ、又はAlzarin Red-s (ARS)による定量化＋可視化によって測定した場合に）骨芽細胞の石灰化に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）に関する。好ましい態様では、骨芽細胞の石灰化に対するＨＧＦの阻害効果は、３０％以上、４０％以上、５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、又はさらに８０％以上、９０％以上、最も好ましくは１００％低減される。
本発明はまた、骨芽細胞特異的転写因子Ｒｕｎｘ２及び／又はＯｓｔｅｒｉｘの（ＢＭＰ誘導性）発現に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための医薬組成物の調製における抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、骨芽細胞特異的転写因子Ｒｕｎｘ２及び／又はＯｓｔｅｒｉｘの（ＢＭＰ誘導性）発現に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための方法であって、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）を投与する方法に関する。本発明は、（例えば、Standal et al., Blood 2007 Apr 1; 109(7): 3024-30に記載されているように、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＲｕｎＸ又はＯｓｔｅｒｉｘ ｍＲＮＡの発現によって測定した場合に）骨芽細胞特異的転写因子Ｒｕｎｘ２及び／又はＯｓｔｅｒｉｘの（ＢＭＰ誘導性）発現に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）に関する。好ましい態様では、骨芽細胞特異的転写因子Ｒｕｎｘ２及び／又はＯｓｔｅｒｉｘの（ＢＭＰ誘導性）発現に対するＨＧＦの阻害効果は、３０％以上、４０％以上、５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、又はさらに８０％以上、９０％以上、最も好ましくは１００％低減される。
本発明はまた、レセプター活性化Ｓｍａｄの（ＢＭＰ誘導性）核移行に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための医薬組成物の調製における抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、レセプター活性化Ｓｍａｄの（ＢＭＰ誘導性）核移行に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための方法であって、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）を投与する方法に関する。本発明は、（例えば、Standal et al., Blood 2007 Apr 1; 109(7): 3024-30に記載されているように、共焦点顕微鏡法、又はＳｍａｄ駆動性ＢＭＰレセプター構築物の使用によって測定した場合に）レセプター活性化Ｓｍａｄの（ＢＭＰ誘導性）核移行に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）に関する。好ましい態様では、レセプター活性化Ｓｍａｄの（ＢＭＰ誘導性）核移行に対するＨＧＦの阻害効果は、３０％以上、４０％以上、５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、又はさらに８０％以上、９０％以上、最も好ましくは１００％低減される。
本発明はまた、ＢＭＰ−２シグナル伝達に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための医薬組成物の調製における抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、ＢＭＰ−２シグナル伝達に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための方法であって、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）を投与する方法に関する。本発明は、ＢＭＰ−２シグナル伝達に対するＨＧＦの阻害効果を低減及び／又は完全に無効化するための抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）に関する。
本発明はまた、破骨細胞前駆体又は破骨細胞のＨＧＦ誘導性ケモタキシス、増殖及び活性化を阻害するための医薬組成物の調製における抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）又はこれをコードするヌクレオチドの使用に関する。したがって、本発明は、破骨細胞に対するＨＧＦの効果を阻害するための方法であって、抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）を投与する方法に関する。本発明は、（Grano et al. 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93(15): 7644-8に記載されているように）破骨細胞に対するＨＧＦの効果を阻害するための抗ｃ−Ｍｅｔ ＩＳＶＤ（例えば、本発明のポリペプチドなど）に関する。
先と同様に、このような医薬組成物では、１つ以上の本発明のポリペプチド若しくはこれをコードするヌクレオチド及び／又はこれらを含む医薬組成物はまた、１つ以上の他の活性成分、例えば本明細書で言及されるものと適切に組み合わせてもよい。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ又は細胞アッセイ）又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、単細胞又は多細胞生物、特に哺乳動物、より具体的にはヒト、例えば本発明の疾患又は障害のリスクを有するか、又はこれらに罹患しているヒト）のいずれかにおける使用のための組成物（例えば限定されないが、本明細書にさらに記載される医薬組成物又は調製物）に関する。
本発明の文脈では、「調節すること」又は「調節する」は、一般に、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば、本明細書で言及されるもの）を使用して測定した場合に、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の活性を減少させるか又は阻害することを意味する。特に、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば、本明細書で言及されるもの）を使用して測定した場合の、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の活性の減少又は阻害は、本発明のポリペプチドが存在しない以外は同じ条件下での同じアッセイにおけるｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の活性と比較して少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上である。
調節は、例えば、ｃ−Ｍｅｔのその基質又はリガンドの１つに対する結合を減少させるか若しくは阻害すること、及び／又は天然のリガンド（ＨＧＦ）（これは、ｃ−Ｍｅｔに対する結合の基質である）と競合することを含むことができる。あるいは、調節は、ｃ−Ｍｅｔレベルを減少させるためにインターナリゼーションを阻害すること、インターナリゼーションを誘導すること、例えば、ｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達、ホモ二量体化を減少させること、及び／又はｃ−Ｍｅｔの排出を促進することを含んでもよいので、ＨＧＦ依存性及び／又はＨＧＦ非依存性のｃ−Ｍｅｔ活性化を阻害してもよい。
１．７ 本発明のポリペプチド及び／又は他の生物学的物質の作製
本発明はさらに、本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物を調製又は作製するための方法に関する。このような方法の好ましいが非限定的ないくつか例は、本明細書のさらなる記載から明らかになるであろう。
一般に、これらの方法は、
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリを提供する工程；及び
ｂ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができる免疫グロブリン単一可変ドメインについて、前記免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程；及び
ｃ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができるアミノ酸配列を単離する工程
を含んでもよい。
このような方法では、免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、任意の適切な免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリでもよい。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、（本明細書に記載される）免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリ（例えば、免疫グロブリン配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリ；免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリ；及び／又は親和性成熟を受けている免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリ）でもよい。
また、このような方法では、免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ−、ＶＨ−又はＶＨＨドメイン、好ましくはＶＨＨドメイン）のセット、コレクション又はライブラリでもよい。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、ドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体のセット、コレクション若しくはライブラリでもよいし、又はドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体として機能することができる免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション若しくはライブラリでもよい。
この方法の好ましい態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）、又はこれに基づく（例えば、実験部分に記載されているものなど。ヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃキメラ（配列番号２）を参照のこと）若しくはこれに由来する適切な抗原決定基、例えばその抗原性の部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープで適切に免疫感作した哺乳動物由来の免疫グロブリン配列の免疫セット、免疫コレクション又は免疫ライブラリでもよい。特定の一態様では、前記抗原決定基は、細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープでもよい。
上記の方法では、免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は適切な微生物（例えば、酵母）上にディスプレイしてもよい。免疫グロブリン単一可変ドメイン（のセット、コレクション又はライブラリ）をディスプレイ及びスクリーニングするのに適切な方法、技術及び宿主生物は、例えば、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者には明らかである。Nature Biotechnology, 23:1105-1116 (2005)のHoogenboomによる総説も参照のこと。
別の態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインを作製するための方法は、
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインを発現する細胞のコレクション又はサンプルを提供する工程；
ｂ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができるアミノ酸配列を発現する細胞について、前記細胞のコレクション又はサンプルをスクリーニングする工程；及び
ｃ）（ｉ）前記アミノ酸配列を単離する工程；又は（ｉｉ）前記細胞から、前記アミノ酸配列をコードする核酸配列を単離し、続いて前記アミノ酸配列を発現させる工程
を少なくとも含む。
別の態様では、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有するアミノ酸配列を作製するための方法は、
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを提供する工程；
ｂ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合することができ、及び／又はこれらに対する親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列について、前記核酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程；及び
ｃ）前記核酸配列を単離し、続いて前記アミノ酸配列を発現させる工程
を少なくとも含んでもよい。
このような方法では、免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えば、免疫グロブリン配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ；免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ；及び／又は親和性成熟を受けている免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリでもよい。
別の態様では、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有するアミノ酸配列を作製するための方法は、
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを提供する工程；
ｂ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合することができ、及び／又はこれらに対する親和性を有し、並びに本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド、例えば配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８及び１４２〜１５０、好ましくは配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６及び１４７によって交差遮断されるか、又はこれらを交差遮断するアミノ酸配列をコードする核酸配列について、前記核酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程；及び
ｃ）前記核酸配列を単離し、続いて前記アミノ酸配列を発現させる工程
を少なくとも含んでもよい。
好ましい態様では、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有するアミノ酸配列を作製するための方法は、
ａ）ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリを提供する工程；及び
ｂ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができる免疫グロブリン単一可変ドメインについて、前記ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程；及び
ｃ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができるアミノ酸配列を単離する工程
を少なくとも含んでもよい。
このような方法では、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、任意の適切な免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリでもよい。例えば、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、（本明細書に記載される）免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリ（例えば、免疫グロブリン配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリ；免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリ；及び／又は親和性成熟を受けているＶＨＨ１型免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリ）でもよい。好ましい態様では、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、（本明細書に記載される）免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリ（例えば、ＶＨＨ１型免疫グロブリン配列の合成のセット、コレクション又はライブラリ）でもよい。上記の方法では、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は適切な微生物（例えば、酵母）上にディスプレイしてもよい。免疫グロブリン単一可変ドメイン（のセット、コレクション又はライブラリ）をディスプレイ及びスクリーニングするのに適切な方法、技術及び宿主生物は当業者には明らかであり、例えば、Knappik, et al., J. Mol. Biol. 2000 Feb 11, 296:57-86によって記載されている。
ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン（のセット、コレクション又はライブラリ）をディスプレイ及びスクリーニングするのに適切な方法、技術及び宿主生物は、例えば、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者には明らかである。Nature Biotechnology, 23:1105-1116 (2005)のHoogenboomによる総説も参照のこと。
本発明はまた、上記方法によって、又はあるいは上記方法の１つに加えて少なくとも、前記免疫グロブリン配列のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を決定する工程；及び、それ自体が公知の方法で（例えば、適切な宿主細胞若しくは宿主生物で発現させるか又は化学合成することによって）前記アミノ酸配列を発現させるか又は合成する工程を含む方法によって得られる免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
また、上記工程の後に、１つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを適切にヒト化、ラクダ化、又は別の方法で配列最適化（例えば、製造性、安定性及び／又は溶解性について配列最適化）してもよい；及び／又は、本発明のポリペプチドを提供するために、このようにして得られた免疫グロブリン単一可変ドメインを、（場合により１つ以上の適切なリンカーを介して）互いに連結してもよいし、又は１つ以上の他の適切なアミノ酸配列に連結してもよい。また、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切にヒト化、ラクダ化、又は別の方法で配列最適化（例えば、製造性、安定性及び／又は溶解性について配列最適化）し、適切に発現させてもよい；及び／又は、本発明のアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸配列を（場合により１つ以上の適切なリンカーをコードするヌクレオチド配列を介して）互いに連結してもよいし、又は他の適切な免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする１つ以上の核酸配列に連結してもよく、この後、本発明のポリペプチドを提供するために、このようにして得られたヌクレオチド配列を適切に発現させてもよい。
本発明はさらに、本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメイン、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物の用途及び使用、並びにｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に関連する疾患及び障害を診断、予防及び／又は処置するための方法に関する。好ましいが非限定的ないくつかの用途及び使用は、本明細書のさらなる記載から明らかになるであろう。
本発明はまた、治療における使用のための、本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメイン、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物に関する。
特に、本発明はまた、本明細書に記載されるアミノ酸配列、化合物、構築物又はポリペプチド（の薬学的有効量）を、それを必要とする被験体に投与することによって予防又は処置することができる疾患又は障害の治療における使用のための、本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメイン、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物に関する。
より具体例には、本発明は、ガンの治療における使用のための、本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメイン、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物に関する。
１．８ 本発明のポリペプチド及び他の生物学的物質の変異体
効力又は他の所望の特性をさらに改善するために、本発明のポリペプチド及び（本発明のポリペプチドの一部を形成する）免疫グロブリン単一可変ドメインを変化させてもよい。
一般に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３を指す）を有するポリペプチドと定義することができる。
ＣＤＲ配列についての特に好ましいが非限定的ないくつかの組み合わせ、並びにＣＤＲ配列及びフレームワーク配列についての好ましい組み合わせが以下の表Ｂ−２又はＡ−２で言及されされており、多数の好ましい（が非限定的な）本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン中に存在するＣＤＲ配列及びフレームワーク配列が列挙されている。当業者には明らかであるように、同じクローン中に存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の組み合わせ（すなわち、表Ｂ−２又はＡ−２の同じ行又は列で言及されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列）が通常好ましいであろう（しかし、本発明は、その最も広い意味ではそれらに限定されず、表Ｂ−２又はＡ−２で言及されているＣＤＲ配列の他の適切な組み合わせも含む）。また、同じクローン中に存在するＣＤＲ配列及びフレームワーク配列の組み合わせ（すなわち、表Ｂ−２又はＡ−２の同じ行又は列で言及されているＣＤＲ配列及びフレームワーク配列）が通常好ましいであろう（しかし、本発明は、その最も広い意味ではそれらに限定されず、表Ｂ−２又はＡ−２で言及されているＣＤＲ配列及びフレームワーク配列の他の適切な組み合わせ、並びに例えば本明細書でさらに記載されるこのようなＣＤＲ配列及び他の適切なフレームワーク配列の組み合わせも含む）。
また、表Ｂ−２で言及されているＣＤＲの組み合わせを含む本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、各ＣＤＲを、言及されているＣＤＲと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で定義される）を有する免疫グロブリン単一可変ドメインからなる群より選択されるＣＤＲで置換することができ、この場合：
ｉ）このようなＣＤＲにおける任意のアミノ酸置換は、好ましくは、表Ｂ−２で言及されている対応するＣＤＲ配列と比較して、保存的アミノ酸置換（本明細書で定義される）であり；及び／又は
ｉｉ）任意のこのようなＣＤＲ配列は、好ましくは、表Ｂ−２で言及されている対応するＣＤＲ配列と比較して、アミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又は挿入を含有せず；及び／又は
ｉｉｉ）任意のこのようなＣＤＲ配列は、特に、表Ｂ−２で言及されている対応するＣＤＲ配列から開始して、それ自体が公知の親和性成熟技術によって誘導されるＣＤＲである。
しかしながら、当業者には明らかであるように、表Ｂ−２で言及されている、ＣＤＲ配列（の組み合わせ）、並びにＣＤＲ配列及びフレームワーク配列（の組み合わせ）が一般に好ましい。
したがって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群より；又は、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の「配列同一性」（本明細書で定義される）を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群より；及び／又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと３個、２個若しくはわずか１個の「アミノ酸差異」（本明細書で定義される）を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群より適切に選択される。
この文脈では、「適切に選択される」は、それぞれ、規定通りに、ＣＤＲ１配列が適切なＣＤＲ１配列（すなわち、本明細書で定義される）から選択され、ＣＤＲ２配列が適切なＣＤＲ２配列（すなわち、本明細書で定義される）から選択され、ＣＤＲ３配列が適切なＣＤＲ３配列（すなわち、本明細書で定義される）から選択されることを意味する。より具体的には、ＣＤＲ配列は、好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書で定義される親和性（これは、本明細書にさらに記載されるように、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ効力アッセイ又は他のアッセイで適切に測定され、及び／又はＥＣ５０値あるいはＩＣ５０値として表される）でｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合するように選択される。
特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ３配列が少なくとも、表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ３配列からなる群より、又は表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ３配列からなる群より；及び／又は表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ３配列の少なくとも１つと３個、２個若しくはわずか１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ３配列からなる群より適切に選択される。
好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも２つが、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群より、又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群より；及び／又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと３個、２個若しくはわずか１個の「アミノ酸差異」を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群より適切に選択される。
特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ３配列が少なくとも、表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ３配列からなる群より、又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ３配列からなる群より適切に選択され；存在するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つが、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列からなる群より、又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれからなる群より；及び／又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つと３個、２個若しくはわずか１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれからなる群より適切に選択される。
最も好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の３つすべてが、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群より、又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群より；及び／又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと３個、２個若しくはわずか１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群より適切に選択される。
さらにより好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つが、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群より適切に選択される。好ましくは、この態様では、存在する他の２つのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、又は好ましくは両方が、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されている対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列より；及び／又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されている対応する配列の少なくとも１つと３個、２個若しくはわずか１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選択される。
特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ３配列が少なくとも、表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ３からなる群より適切に選択される。好ましくは、この態様では、存在するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つ、及び好ましくは両方が、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれからなる群より；及び／又は表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つと３個、２個若しくはわずか１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれからなる群より適切に選択される。
さらにより好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも２つが、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群より適切に選択される。好ましくは、この態様では、存在する残りのＣＤＲ配列が、表Ｂ−２に列挙されている対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列からなる群より；及び／又は表Ｂ−２に列挙されている対応する配列の少なくとも１つと３個、２個若しくはわずか１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選択される。
特に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、ＣＤＲ３配列が少なくとも、表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ３配列からなる群より適切に選択され、ＣＤＲ１配列又はＣＤＲ２配列のいずれかが、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列からなる群より適切に選択される。好ましくは、この態様では、存在する残りのＣＤＲ配列が、表Ｂ−２に列挙されている対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列からなる群より；及び／又は表Ｂ−２に列挙されている対応するＣＤＲ配列と３個、２個若しくはわずか１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選択される。
さらにより好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の３つすべてが、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群より適切に選択される。
また、一般に、表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲの組み合わせ（すなわち、表Ｂ−２の同じ行又は列で言及されているもの）が好ましい。したがって、一般に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインにおけるＣＤＲが、表Ｂ−２で言及されているＣＤＲ配列であるか、又は表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列からなる群より；及び／又は表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ配列と３個、２個若しくはわずか１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選択される場合、他のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは両方が、表Ｂ−２の同じ組み合わせに属する（すなわち、表Ｂ−２の同じ行又は列で言及されている）ＣＤＲ配列から適切に選択されるか、又は同じ組み合わせに属するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列からなる群より；及び／又は同じ組み合わせに属するＣＤＲ配列と３個、２個若しくはわずか１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選択されることが好ましい。上記段落で示される他の好ましい実施態様（preferences）はまた、表Ｂ−２で言及されている（例えば、表Ｂ−２の同じ列で言及されている）ＣＤＲ配列の組み合わせに適用される。
したがって、非限定的な例によって、本発明のポリペプチドは、例えば、表Ｂ−２で言及されているＣＤＲ１配列の１つと８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、表Ｂ−２で言及されている（しかし、異なる組み合わせに属する、例えば、表Ｂ−２の異なる列で言及されている）ＣＤＲ２配列の１つと３個、２個若しくは１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むことができる。
いくつかの好ましい本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、（１）表Ｂ−２で言及されているＣＤＲ１配列の１つと８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、表Ｂ−２で言及されている（しかし、異なる組み合わせに属する、例えば、表Ｂ−２の異なる列で言及されている）ＣＤＲ２配列の１つと３個、２個若しくは１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列、及び表Ｂ−２で言及されている（しかし、異なる組み合わせに属する、例えば、表Ｂ−２の異なる列で言及されている）ＣＤＲ３配列の１つと８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ３配列を含んでもよいし；又は（２）表Ｂ−２で言及されているＣＤＲ１配列の１つと８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ１配列と、ＣＤＲ２配列と、表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ３配列の１つを含んでもよいし；又は（３）ＣＤＲ１配列と、表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ２配列の１つと８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ２配列と、表Ｂ−２で言及されておりＣＤＲ２配列と同じ組み合わせに属する（例えば、表Ｂ−２の同じ列で言及されている）ＣＤＲ３配列と３個、２個若しくは１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ３配列を含んでもよい。
いくつかの特に好ましい本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、（１）表Ｂ−２で言及されているＣＤＲ１配列の１つと８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、表Ｂ−２で言及されており同じ組み合わせに属するＣＤＲ２配列と３個、２個若しくは１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列、及び表Ｂ−２で言及されており同じ組み合わせに属するＣＤＲ３配列と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ３配列を含んでもよいし；又は（２）ＣＤＲ１配列と、表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ２、及び表Ｂ−２に列挙されているＣＤＲ３配列を含んでもよい（これらの場合、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列は、異なる組み合わせに属していてもよい）。
いくつかのさらにより好ましい本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、（１）表Ｂ−２で言及されているＣＤＲ１配列の１つと８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、表Ｂ−１に列挙されており同じ組み合わせに属するＣＤＲ２配列、及び表Ｂ−２で言及されており異なる組み合わせに属する（例えば、表Ｂ−２の異なる列で言及されている）ＣＤＲ３配列とを含んでもよいし；又は（２）表Ｂ−２で言及されているＣＤＲ１配列、表Ｂ−２で言及されており同じ組み合わせに属するＣＤＲ２配列と３個、２個若しくは１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列、及び表Ｂ−２に列挙されており同じ若しくは異なる組み合わせに属するＣＤＲ３配列と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ３配列を含んでもよい。
特に好ましい本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、表Ｂ−２で言及されているＣＤＲ１配列、表Ｂ−２で言及されており同じ組み合わせに属するＣＤＲ２配列と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ２配列、及び表Ｂ−２で言及されており同じ組み合わせに属するＣＤＲ３配列を含んでもよい。
最も好ましい本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインでは、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列が、表Ｂ−２にそれぞれ列挙されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の組み合わせの１つから適切に選択される。
本発明の好ましいが非限定的な別の態様によれば、（ａ）ＣＤＲ１は、１個〜１２個のアミノ酸残基、通常は２個〜９個のアミノ酸残基、例えば５個、６個又は７個のアミノ酸残基の長さを有し、及び／又は（ｂ）ＣＤＲ２は、１３個〜２４個のアミノ酸残基、通常は１５個〜２１個のアミノ酸残基、例えば１６個及び１７個のアミノ酸残基の長さを有し、及び／又は（ｃ）ＣＤＲ３は、２個〜３５個のアミノ酸残基、通常は３個〜３０個のアミノ酸残基、例えば６個〜２３個のアミノ酸残基の長さを有する。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＣＤＲ配列（本明細書で定義される）が、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ配列と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で定義される）を有する免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
本発明の好ましいが非限定的な別の態様は、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７の免疫グロブリン単一可変ドメインのヒト化変異体であって、対応するネイティブなＶＨＨ配列と比較して、少なくとも１つのヒト化置換（本明細書で定義される）、特にそのフレームワーク配列（本明細書で定義される）の少なくとも１つに少なくとも１つのヒト化置換を含むヒト化変異体に関する。
「好ましい」（又は「より好ましい」、「さらにより好ましい」など）と本明細書で言及される免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、本明細書に記載されるポリペプチドに使用するのに好ましい（又はより好ましい、又はさらにより好ましいなど）ことは当業者には明らかである。したがって、１つ以上の「好ましい」本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又はこれらから本質的になるポリペプチドが一般には好ましく、１つ以上の「より好ましい」本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又はこれらから本質的になるポリペプチドが一般にはより好ましい、など。
１．９ 本発明の核酸配列及び宿主細胞
本発明の別の態様は、本発明のアミノ酸配列（例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン）又はこれを含む本発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。先と同様に、本発明の核酸について本明細書に一般に記載されるように、このような核酸は、本明細書で定義される遺伝子構築物でもよい。本発明のこの態様の具体例な実施態様は、実験部分、配列番号３０〜４２、好ましくは配列番号３０で提供される。
好ましいが非限定的な別の態様では、本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインの核酸配列であって、配列番号３０〜４２、好ましくは配列番号３０の免疫グロブリン単一可変ドメインの核酸配列の少なくとも１つの配列と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で定義される）を有する配列（本明細書で定義される）に関する。
別の態様では、本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインの核酸配列を含む核酸配列であって、配列番号３０〜４２、好ましくは配列番号３０の免疫グロブリン単一可変ドメインの核酸配列の少なくとも１つの配列と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で定義される）を有する配列（本明細書で定義される）に関する。
別の態様では、本発明は、本発明のアミノ酸配列（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）及び／若しくはこれを含む本発明のポリペプチドを発現するか、若しくはこれらを発現することができ；並びに／又は本発明の核酸を含有する宿主又は宿主細胞に関する。このような宿主又は宿主細胞の好ましいが非限定的ないくつかの例は、本明細書のさらなる記載から明らかになるであろう。
当業者には明らかであるように、本発明のポリペプチドを調製するための特に有用な方法の１つは、一般に、
ｉ）適切な宿主細胞若しくは宿主生物（本明細書では「本発明の宿主」とも称される）又は別の適切な発現系で、前記アミノ酸配列、本発明のポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」とも称される）を発現させる工程、場合により続いて：
ｉｉ）このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含む。
特に、このような方法は、
ｉ）本発明の宿主を、前記本発明の宿主が少なくとも１つの本発明のポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で培養及び／又は維持する工程；
場合により続いて：
ｉｉ）このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含んでもよい。
本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの形態であり得、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ（例えば、目的とする宿主細胞又は宿主生物における発現に特異的に適合されたコドン出現頻度を有するＤＮＡ）でもよい。
本発明の一態様によれば、本発明の核酸は、本明細書で定義されるように、本質的に単離された形態である。
本発明の核酸はまた、例えば、プラスミド、コスミド又はＹＡＣなどのベクターの形態でもよいし、これらの中に存在してもよいし、及び／又はこれの一部でもよく、これらは先と同様に本質的に単離された形態でもよい。
本発明の核酸は、本明細書に示される本発明のポリペプチドの免疫グロブリン単一可変ドメインについての情報に基づいて、それ自体が公知の方法で調製若しくは取得することができ、及び／又は適切な天然資源から単離することができる。類似体を得るために、天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を、例えば、部位特異的突然変異誘発に供して、前記類似体をコードする本発明の核酸を提供することができる。また、当業者には明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、例えば１つ以上のリンカーをコードする核酸とを適切な方法で連結することもできる。
本発明の核酸を作製するための技術は当業者には明らかであり、例えば限定されないが、自動ＤＮＡ合成；部位特異的突然変異誘発；２つ以上の天然に存在する配列及び／又は合成配列（又はそれらの２つ以上の部分）の組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎｉng）、切断発現産物の発現をもたらす突然変異の導入；（例えば、適切な制限酵素を使用して容易に消化及び／又はライゲーションすることができるカセット及び／又は領域を作るための）１つ以上の制限部位の導入、及び／又は例えば、天然に存在する形態のｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）の配列を鋳型として使用し１つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による突然変異の導入を挙げることができる。これらの及び他の技術は当業者には明らかであり、先と同様に、上述のSambrook et al.及びAusubel et al.などの標準的なハンドブック、並びに以下の実施例を参照のこと。
本発明の核酸はまた、当業者には明らかであるように、及びWO 08/020079（参照により本明細書に組み込まれる）の１３１〜１３４頁に記載されているように、遺伝子構築物の形態でもよいし、この中に存在してもよいし、及び／又はこの一部でもよい。このような遺伝子構築物は、一般に、それ自体が公知の遺伝子構築物の１つ以上の要素、例えば、１つ以上の適切なレギュレーション要素（例えば、適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）及び本明細書で言及される遺伝子構築物のさらなる要素などに場合により連結された少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は、本明細書では「本発明の遺伝子構築物」とも称される。
本発明の遺伝子構築物はＤＮＡでもよいし、又はＲＮＡでもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物はまた、目的とする宿主細胞又は宿主生物のトランスフォーメーションに適切な形態、目的とする宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むのに適切な形態、又は目的とする宿主生物における単独での複製、維持及び／又は継代に適切な形態でもよい。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾンなどのベクターの形態でもよい。特に、ベクターは、発現ベクター（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、適切な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系）での発現を提供することができるベクター）でもよい。
好ましいが非限定的な態様では、本発明の遺伝子構築物は、
ｉ）以下のものに機能的に結合された少なくとも１つの本発明の核酸；
ｉｉ）１つ以上のレギュレーション要素（例えば、プロモーター）及び適切なターミネーター；及び場合によりさらに
ｉｉｉ）それ自体が公知の遺伝子構築物の１つ以上のさらなる要素
を含み、「機能的に結合された」及び「機能的に連結された」という用語は、WO 08/020079の１３１〜１３４頁に示されている意味を有し；「レギュレーション要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」及び「さらなる要素」は、WO 08/020079の１３１〜１３４頁に記載されているようなものであり；遺伝子構築物はさらに、WO 08/020079の１３１〜１３４頁に記載されているようなものでもよい。
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞又は宿主生物をトランスフォーメーションするのに（すなわち、本発明のポリペプチドを発現及び／又は産生させるのに）使用することができる。適切な宿主又は宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、任意の適切な真菌、原核若しくは真核細胞若しくは細胞株、又は任意の適切な真菌、原核若しくは真核生物、例えば、WO 08/020079の１３４頁及び１３５頁に記載されているもの、並びに抗体及び抗体フラグメント（限定されないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメン含む）を発現及び生産するためのそれ自体が公知の他の宿主又は宿主細胞すべてでもよく、これらは当業者には明らかであろう。上に引用した一般的な背景技術並びに例えば、WO 94/29457、WO 96/34103及びWO 99/42077も参照のこと。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドはまた、例えば、トランスジェニック哺乳動物の乳中、例えばウサギ、ウシ、ヤギ又はヒツジの乳中（トランス遺伝子を哺乳動物に導入するための一般的な技術については、例えば、米国特許第6,741,957号、米国特許第6,304,489号及び米国特許第6,849,992号を参照のこと）、植物又は植物の部分中（限定されないが、葉、花、果実、種、根、塊茎を含む）（例えば、タバコ、トウモロコシ、大豆、又はアルファルファ）、又は例えばカイコBombyx moriの蛹中で生産することができる。
さらに、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドはまた、無細胞発現系で発現させ、及び／又は生産することができ、このような系の適切な例は当業者には明らかであろう。好ましいが非限定的ないくつかの例としては、小麦麦芽系；ウサギ網状赤血球溶解物；又はE. coli Zubay系での発現が挙げられる。
上述のように、免疫グロブリン単一可変ドメインを使用する利点の１つは、これに基づくポリペプチドは、適切な細菌系での発現によって調製することができることであり、適切な細菌発現系、ベクター、宿主細胞、レギュレーション要素などは、例えば上に引用した参考文献から当業者には明らかであろう。しかしながら、本発明は、その最も広い意味では細菌系での発現に限定されないことに留意するべきである。
好ましくは、本発明では、本発明のポリペプチドを医薬用途に適切な形態で提供する細菌発現系などの（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）発現系が使用され、先と同様に、このような発現系は当業者には明らかであろう。また当業者には明らかであるように、医薬用途に適切な本発明のポリペプチドは、ペプチド合成技術を使用して調製することができる。
工業規模の生産の場合、免疫グロブリン単一可変ドメイン又は免疫グロブリン単一可変ドメインを含有するタンパク質治療剤を（工業的に）生産するのに好ましい異種宿主としては、大規模な発現／生産／発酵、特に大規模な医薬的（すなわち、ＧＭＰグレード）発現／生産／発酵に適切なE. coli、Pichia pastoris、S. cerevisiaeの菌株が挙げられる。このような菌株の適切な例は、当業者には明らかであろう。このような菌株及び生産／発現系はまた、Richter Helm (Hamburg, Germany)又はCMC Biologics (Soeborg, Denmark)などの企業から入手可能である。
あるいは、哺乳動物細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、大規模な発現／生産／発酵、特に大規模な医薬的発現／生産／発酵に使用することができる。先と同様に、このような発現／生産系はまた、上述の企業のいくつかから入手可能である。
具体的な発現系の選択は、ある特定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化の要件に部分的には依存するであろう。グリコシル化が望ましいか又は必要な免疫グロブリン単一可変ドメインを含有するリコンビナントタンパク質の生産は、発現したタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物発現用宿主の使用を必要とする。これに関連して、得られるグリコシル化パターン（すなわち、結合する残基の種類、数、及び位置）が、発現に使用される細胞又は細胞株に依存するであろうことは当業者には明らかであろう。好ましくは、ヒト細胞若しくは細胞株が使用される（すなわち、ヒトのグリコシル化パターンを本質的に有するタンパク質を与える）か、又はヒトのグリコシル化と本質的に及び／若しくは機能的に同一であるか、又はヒトのグリコシル化を少なくとも模倣するグリコシル化パターンを提供することができる別の哺乳動物細胞株が使用される。一般に、E. coliなどの原核生物宿主はタンパク質をグリコシル化する能力を有さず、酵母などの下等真核生物を使用することにより、通常、ヒトのグリコシル化と異なるグリコシル化パターンがもたらされる。それにもかかわらず、上述の宿主細胞及び発現系はすべて、得ようとする所望のポリペプチドに応じて、本発明に使用することができるこ理解するべきである。
したがって、本発明の非限定的な一態様によれば、本発明のポリペプチドは、グリコシル化される。本発明の非限定的な別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されない。
本発明の好ましいが非限定的な一態様によれば、本発明のポリペプチドは、細菌細胞、特に大規模な医薬生産に適切な細菌細胞、例えば、上述の菌株の細胞中で産生される。
本発明の好ましいが非限定的な別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、酵母細胞、特に大規模な医薬生産に適切な酵母細胞、例えば、上述の種の細胞中で産生される。
本発明の好ましいが非限定的なさらに別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞又はヒト細胞株の細胞、より具体的には大規模な医薬生産に適切なヒト細胞又はヒト細胞株の細胞、例えば、上述の細胞株中で産生される。
WO 08/020079の１３８頁及び１３９頁にさらに記載されているように、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドを生産するために、宿主細胞での発現が使用される場合、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドを細胞内（例えば、細胞質中、ペリプラズム中、又は封入体中）で生産し、次いで宿主細胞から単離し、場合によりさらに精製することもできるし；又は細胞外（例えば、宿主細胞を培養する培地中）で生産し、次いで培養培地から単離し、場合によりさらに精製することもできる。したがって、本発明の非限定的な態様によれば、本発明のポリペプチドは、細胞内で生産され、宿主細胞（特に、細菌細胞又は細菌細胞中の封入体）から単離されたアミノ酸配列、ポリペプチドである。本発明の非限定的な別の態様によれば、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドは、細胞外で生産され、宿主細胞を培養する培地から単離されたアミノ酸配列又はポリペプチドである。
これらの宿主細胞と共に使用するための好ましいが非限定的ないくつかのプロモーターとしては、WO 08/020079の１３９頁及び１４０頁で言及されているものが挙げられる。
これらの宿主細胞と共に使用するための好ましいが非限定的ないくつかの分泌配列としては、WO 08/020079の１４０頁で言及されているものが挙げられる。
本発明の宿主又は宿主細胞をトランスフォーメーションするのに適切な技術は、当業者には明らかであり、目的とする宿主細胞／宿主生物及び使用される遺伝子構築物に依存し得る。先と同様に、上述のハンドブック及び特許出願を参照のこと。
トランスフォーメーション後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物によるトランスフォーメーションが成功した宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択するための工程を実施してもよい。これは、例えば、本発明の遺伝子構築物中に存在する選択可能なマーカーに基づく選択工程でもよいし、又は例えば、特異的抗体を使用して本発明のアミノ酸配列を検出するこ含む工程でもよい。
トランスフォーメーションされた宿主細胞（これは、安定細胞株の形態でもよい）又は宿主生物（これは、安定突然変異体株又は菌株の形態でもよい）は、本発明のさらなる態様を形成する。
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、（宿主生物の場合：その少なくとも１つの細胞、部分、組織又は器官中に）本発明のポリペプチドを発現するか、又は（少なくとも）（例えば、適切な条件下で）発現することができるようなものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代及び／又は子孫を含み、これらは、例えば、細胞分裂又は有性若しくは無性生殖によって得られるものでもよい。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを生産する／その発現を得るために、トランスフォーメーションされた宿主細胞又はトランスフォーメーションされた宿主生物は、一般に、（所望の）本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが発現／産生されるような条件下で保持、維持及び／又は培養してもよい。適切な条件は当業者には明らかであり、通常、使用される宿主細胞／宿主生物、及び（関連する）本発明のヌクレオチド配列の発現をコントロールするレギュレーション要素に依存するであろう。先と同様に、本発明の遺伝子構築物についての段落で上述したハンドブック及び特許出願を参照のこと。
一般に、適切な条件は、適切な培地の使用、適切な食料源及び／又は適切な栄養の存在、適切な温度の使用、並びに場合により適切な誘導因子又は化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターのコントロール下にある場合）を含んでもよい；これらはすべて、当業者によって選択され得る。先と同様に、このような条件下で、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、構成的に発現してもよいし、一時的に発現してもよいし、又は適切に誘導される場合にのみ発現してもよい。
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドは、（最初に）未成熟型（上述）で生成され、次いで、使用される宿主細胞／宿主生物に応じて翻訳後修飾を受けてもよいことも当業者には明らかであろう。また、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドは、先と同様に、使用される宿主細胞／宿主生物に応じてグリコシル化されてもよい。
次いで、（分取）クロマトグラフィ法、及び／又は電気泳動技術、分画沈殿技術、アフィニティー技術（例えば、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドと融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を使用する）、及び／又は分取免疫学的技術（すなわち、単離されるべきアミノ酸配列に対する抗体を使用する）などのそれ自体が公知のタンパク質の単離技術及び／又は精製技術を使用して、宿主細胞／宿主生物、及び／又は前記宿主細胞若しくは宿主生物を培養した培地から、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドを単離してもよい。
１．１０ 治療に対する反応性を評価するための方法及びキット
本発明はさらに、ｃ−Ｍｅｔに関連する疾患又は障害に罹患している患者の所定治療に対する反応性を評価するための方法に関する。本発明者らは、驚くべきことに、治療開始前後に採取した患者試料における可溶性ｃ−Ｍｅｔレベルの定量が、患者の前記治療に対する反応性の指標であるこ見出した。したがって、本発明は、ｃ−Ｍｅｔに関連する疾患又は障害に罹患している患者の治療に対する反応性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）治療前に前記患者から第１の試料を提供し、前記第１の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程、
ｂ）治療開始後に前記患者から第２の試料を提供し、前記第２の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程、
ｃ）第１の試料中に存在する可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を、第２の試料中に見られる可溶性ｃ−Ｍｅｔの量と比較する工程
を含み、
第２の試料中に見られる可溶性ｃ−Ｍｅｔの量が第１の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量と比較して減少していることが、患者が前記治療に対して反応性であるこ示す方法を提供する。
当業者であれば、上記方法における「治療」という用語は、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）媒介性シグナル伝達、例えば、本明細書に記載される疾患及び従来技術で言及されるものを調節することができる任意のｃ−Ｍｅｔアンタゴニス含み得るこ認識するであろう。好ましくは、ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストは、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体である。より好ましくは、ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストは、例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドなどのアミノ酸配列である。特に、ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストは、本発明のナノボディ、例えば配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（表Ｂ−３）、又は本発明のポリペプチド若しくは構築物、例えば配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８及び１４２〜１５０、好ましくは配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６及び／又は１４７（表Ｂ−４を参照のこと）である。
「患者試料」は、可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定することができる患者由来の細胞、組織又は体液の任意の試料標本を意図する。このような患者試料の例としては、限定されないが、組織生検、血液、血清、血漿、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、糞便試料及び尿試料が挙げられる。このような試料は、例えば、静脈穿刺を含む様々な技術によって患者から得ることができる。種々の患者試料を採取するための方法は、当技術分野において周知である。本発明の特定の態様では、患者試料は、血漿試料である。
本発明の方法は、治療前又はこのような治療の開始前の第１の患者試料、及びこのような治療の開始後（例えば、前記治療中及び／又は前記治療後）に採取した前記患者由来の第２の試料を評価して、例えば、腫瘍量の減少を評価するのに使用することができる。本発明の方法によって提供されるように、患者の第１及び第２の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定することによって、臨床医は、疾患（例えば、ガン）が、例えば退行したか、及び患者が治療に対して反応性があるかを決定することができるであろう。ガンが治療開始後（例えば、治療中及び／又は治療後）に退縮した患者は、処置前に前記患者が有していた可溶性ｃ−Ｍｅｔの量と比較して減少した量の可溶性ｃ−Ｍｅｔを有するであろう。同様に、ガンが治療中に依然として安定している患者は、治療前に前記患者が有していたのと類似レベルの可溶性ｃ−Ｍｅｔを有し、ガンが進行した患者は、増加した量の可溶性ｃ−Ｍｅｔを有するであろう。臨床医は、患者の状態をモニタリングするために、及び処置を適切に個別化するためにこれらの測定結果をさらに利用して、所望の治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、限定若しくは軽減し、及び／又は一方では所望の治療効果を達成し、他方では望ましくない副作用を回避、限定若しくは軽減する適切なバランスを達成することができる。臨床医には明らかであるように、本発明にしたがって使用される処置レジメンの有効性は、関与する疾患又は障害について、それ自体が公知の任意の方法で決定及び／又は観察してもよい。本発明の方法は、例えば、治療の中止、投与薬物の変更、投与薬物の投与量の変更、又は患者のさらなるモニタリングなどの具体的な処置方針を患者に推奨するこ含むことができる。一般に、処置レジメンは、臨床医が決定したところにより、所望の治療効果が達成されるまで、及び／又は所望の治療効果を維持するべき間にわたって継続されるであろう。
可溶性ｃ−Ｍｅｔを測定又は定量するための当技術分野において利用可能な任意の方法は、本発明の実施するのに使用することができる。本発明の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量は、核酸レベル又はタンパク質レベルで検出することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、限定されないが、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、免疫アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、免疫細胞化学、免疫蛍光検査、フローサイトメトリー、化学発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写法、及び核酸増幅法が挙げられる。好ましくは、可溶性ｃ−Ｍｅｔレベルは、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する抗体を使用して、タンパク質レベルで検出される。代表的な免疫アッセイは、適切にラベルすることができるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用して、前記患者試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定するこ伴う。最も好ましくは、可溶性ｃ−Ｍｅｔレベルは、本明細書で説明されるように、Meso Scale Discovery電気化学発光アッセイ又はＥＬＩＳＡフォーマットを使用して測定される（実施例２３を参照のこと）。
上記のように、本発明は、患者試料中に存在する可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定するための診断方法を提供する。したがって、本発明はまた、これらの方法を実施するためのキットを提供する。特に、本発明は、ｃ−Ｍｅｔに関連する疾患又は障害に罹患している患者の治療に対する反応性を評価するためのキットであって、患者試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定するための１つ以上の試薬（例えば、抗体、核酸プローブなど）を含むキットを提供する。可溶性ｃ−Ｍｅｔに結合する抗体を検出するための化学物質もキットに含めてもよい。ＥＬＩＳＡ免疫アッセイフォーマットで抗体を使用して可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定するための他の試薬を、本発明のキットに含めてもよい。
あるいは、又は加えて、キットはまた、本明細書に記載される疾患をモニタリングするのに使用してもよく、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド又は医薬組成物を含んでもよい。
本発明のさらなる態様では、キットは、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド又は医薬組成物、及び患者試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定するのに必要なすべての手段及び試薬を含んでもよい。本発明のすべてのキットは、所定のアイテム又はアイテムの組み合わせ、及びその包装材料を含んでもよい。キットはまた、使用説明書を含んでもよい。
本出願全体を通して引用されるすべての参考文献（論文の参考文献、発行特許、公開特許及び係属中の特許出願を含む）の全内容は、特に本明細書で参照している教示について、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の非限定的な好ましい態様、図面及び実施例によって、本発明をこれからさらに説明する：
好ましい態様：
態様Ａ−１：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し、及び／又はこれらに特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−２：本質的に単離された形態である、態様Ａ−１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−３：被験体に投与するための、前記被験体中に天然に存在しない、態様Ａ−１又はＡ−２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−４：１０−５〜１０−１２モル／リットル又はそれ未満、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル又はそれ未満、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。
態様Ａ−５：１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の会合速度（ｋｏｎ速度）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。
態様Ａ−６：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。
態様Ａ−７：５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満の親和性で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。
態様Ａ−８：５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば１nM未満の平均Ｋｉ及び５０％以上、より好ましくは７５％以上、さらにより好ましくは８０％以上の平均ＨＧＦ置換で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）上のＨＧＦ、特にヒトＨＧＦを特異的に置換することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。このような平均Ｋｉ及び／又は平均置換の値は、例えば、実験部分に記載されているアッセイで決定してもよい。
態様Ａ−９：２０nM未満の平均Ｋｉ及び７０％以上の平均ＨＧＦ置換で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）上のＨＧＦ、特にヒトＨＧＦを特異的に置換することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。このような平均Ｋｉ及び／又は平均置換の値は、例えば、実験部分に記載されているアッセイで決定してもよい。
態様Ａ−１０：４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−１１：免疫グロブリン配列である、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−１２：（任意の適切な種由来の）天然に存在する免疫グロブリン配列であるか、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−１３：ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は親和性成熟などの技術によって得られた免疫グロブリン配列である、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−１４：軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）から本質的になる、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−１５：従来の四本鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になるか、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−１６：ドメイン抗体（又はドメイン抗体として使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメインとして使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとして使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン）、ナノボディ（限定されないが、ＶＨＨ配列を含む）、ＶＨＨ配列（限定されないが、ＶＨＨ１型配列を含む）、又はＶＨＨ１型配列から本質的になる、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−１７：ナノボディから本質的になる、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−１８：
ｉ）配列番号２３〜２９、１０２及び／又は１８７の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される）
そしてここで、
ｉｉ）好ましくは、Kabatナンバリングの１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ以上が、表Ａ−１で言及されているホールマーク残基から選択されるナノボディから本質的になる、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−１９：
ｉ）配列番号２６の免疫グロブリン単一可変ドメインと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される）
そしてここで、
ｉｉ）好ましくは、Kabatナンバリングの１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ以上が、表Ａ−１で言及されているホールマーク残基から選択される免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−２０：配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７を有する免疫グロブリン単一可変ドメインからなる群より選択される免疫グロブリン単一可変ドメインと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される）ＶＨＨであるＶＨＨから本質的になる、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−２１：ヒト化又は別の方法で配列最適化された免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−２２：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対して結合するための少なくとも１つの結合部位に加えて、１つ以上のさらなるアミノ酸配列を含有する、前記態様のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ａ−２３：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し、及び／又はこれらに特異的に結合することができるＶＨＨ。
態様Ａ−２４：本質的に単離された形態である、態様Ａ−１に記載のＶＨＨ。
態様Ａ−２５：被験体に投与するための、前記被験体中に天然に存在しない、態様Ａ−１又はＡ−２に記載のＶＨＨ。
態様Ａ−２６：１０−５〜１０−１２モル／リットル又はそれ未満、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル又はそれ未満、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができるＶＨＨ。このようなＶＨＨは、特に、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨでもよい。
態様Ａ−２７：１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の会合速度（ｋｏｎ速度）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができるＶＨＨ。このようなＶＨＨは、特に、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨでもよい。
態様Ａ−２８：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができるＶＨＨ。このようなＶＨＨは、特に、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨでもよい。
態様Ａ−２９：５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満の親和性で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができるＶＨＨ。このようなＶＨＨは、特に、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨでもよい。
態様Ａ−３０：５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば１nM未満の平均Ｋｉ及び５０％以上、より好ましくは７５％以上、さらにより好ましくは８０％以上の平均ＨＧＦ置換で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）上のＨＧＦ、特にヒトＨＧＦを特異的に置換することができるＶＨＨ。このような平均Ｋｉ及び／又は平均置換の値は、例えば、実験部分に記載されているアッセイで決定してもよい。
態様Ａ−３１：２０nM未満の平均Ｋｉ及び７０％以上の平均ＨＧＦ置換で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）上のＨＧＦ、特にヒトＨＧＦを特異的に置換することができるＶＨＨ。このような平均Ｋｉ及び／又は平均置換の値は、例えば、実験部分に記載されているアッセイで決定してもよい。
態様Ａ−３２：４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−３３：免疫グロブリン配列である、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−３４：（任意の適切な種由来の）天然に存在する免疫グロブリン配列であるか、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−３５：親和性成熟などの技術によって得られたヒト化ＶＨＨである、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−３６：ナノボディ又はＶＨＨ１型配列から本質的になる、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−３７：ＶＨＨ１型配列から本質的になる、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−３８：
ｉ）配列番号２３〜２９、１０２及び／又は１８７のＶＨＨの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される）
そしてここで、
ｉｉ）好ましくは、Kabatナンバリングの１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ以上が、表Ａ−１で言及されているホールマーク残基から選択されるＶＨＨから本質的になる、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−３９：
ｉ）配列番号２６及び／又は１８７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される）
そしてここで、
ｉｉ）好ましくは、Kabatナンバリングの１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ以上が、表Ａ−１で言及されているホールマーク残基から選択されるＶＨＨから本質的になる、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−４０：
ｉ）配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７を有するＶＨＨの群より選択されるＶＨＨと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＶＨＨ（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される）；又は
ｉｉ）配列番号７を有するＶＨＨと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するＶＨＨ（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される）
のいずれかであるＶＨＨから本質的になる、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−４１：ヒト化又は別の方法で配列最適化されたＶＨＨから本質的になる、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
態様Ａ−４２：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対して結合するための少なくとも１つの結合部位に加えて、例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチド及び／又はＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチドなどの１つ以上のさらなるアミノ酸配列を含有する、前記態様のいずれかに記載のＶＨＨ。
ＣＤＲに基づく態様
態様Ｂ−１：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し、及び／又はこれらに特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、そして
ａ）配列番号５１〜５７及び１５８〜１６１、好ましくは配列番号５１、１６０；
ｂ）配列番号５１〜５７及び１５８〜１６１、好ましくは配列番号５１、１６０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号５１〜５７及び１５８〜１６１、好ましくは配列番号５１、１６０と３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号６７〜７３及び１６８〜１７１、好ましくは配列番号６７、１７０；
ｅ）配列番号６７〜７３及び１６８〜１７１、好ましくは配列番号６７、１７０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｆ）配列番号６７〜７３及び１６８〜１７１、好ましくは配列番号６７、１７０と３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド；
ｇ）配列番号８３〜８９及び１７８〜１８１、好ましくは配列番号８３、１８０；
ｈ）配列番号８３〜８９及び１７８〜１８１、好ましくは配列番号８３、１８０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｉ）配列番号８３〜８９及び１７８〜１８１、好ましくは配列番号８３、１８０と３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド；
からなる群より選択される１つ以上（好ましくは、１つ）のアミノ酸残基のストレッチ
又はそれらの任意の適切な組み合わせを含む、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、ＶＨＨ（ＶＨＨ１型配列を含む）又は配列最適化ＶＨＨ、例えばヒト化、安定化及び／又は可溶化ＶＨＨでもよい。
態様Ｂ−２：前記アミノ酸残基のストレッチの少なくとも１つが、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対して結合するための抗原結合部位の一部を形成する、態様Ｂ−１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｂ−３：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し、及び／又はこれらに特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、そして
（ｉ）第１のアミノ酸残基のストレッチがａ）、ｂ）又はｃ）のポリペプチドの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基のストレッチはｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）のポリペプチドの１つに対応し；（ｉｉ）第１のアミノ酸残基のストレッチがｄ）、ｅ）又はｆ）のポリペプチドの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基のストレッチはａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）のポリペプチドの１つに対応し；（ｉｉｉ）第１のアミノ酸残基のストレッチがｇ）、ｈ）又はｉ）のポリペプチドの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基のストレッチはａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）のポリペプチドの１つに対応するように、
ａ）配列番号５１〜５７及び１５８〜１６１、好ましくは配列番号５１、１６０；
ｂ）配列番号５１〜５７及び１５８〜１６１、好ましくは配列番号５１、１６０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号５１〜５７及び１５８〜１６１、好ましくは配列番号５１、１６０と３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号６７〜７３及び１６８〜１７１、好ましくは配列番号６７、１７０；
ｅ）配列番号６７〜７３及び１６８〜１７１、好ましくは配列番号６７、１７０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｆ）配列番号６７〜７３及び１６８〜１７１、好ましくは配列番号６７、１７０と３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド；
ｇ）配列番号８３〜８９及び１７８〜１８１、好ましくは配列番号８３、１８０；
ｈ）配列番号８３〜８９及び１７８〜１８１、好ましくは配列番号８３、１８０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｉ）配列番号８３〜８９及び１７８〜１８１、好ましくは配列番号８３、１８０と３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド；
からなる群より選択される２つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含む、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、ＶＨＨ（ＶＨＨ１型配列を含む）又は配列最適化ＶＨＨ、例えばヒト化、安定化及び／又は可溶化ＶＨＨでもよい。
態様Ｂ−４：少なくとも２つのアミノ酸残基のストレッチが、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対して結合するための抗原結合部位の一部を形成する、態様Ｂ−３に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｂ−５：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し、及び／又はこれらに特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、そして３つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含み、第１のアミノ酸残基のストレッチが、
ａ）配列番号５１〜５７及び１５８〜１６１、好ましくは配列番号５１、１６０のポリペプチド；
ｂ）配列番号５１〜５７及び１５８〜１６１、好ましくは配列番号５１、１６０のポリペプチドの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号５１〜５７及び１５８〜１６１、好ましくは配列番号５１、１６０のポリペプチドの少なくとも１つと３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群より選択され；
第２のアミノ酸残基のストレッチが、
ｄ）配列番号６７〜７３及び１６８〜１７１、好ましくは配列番号６７、１７０のポリペプチド；
ｅ）配列番号６７〜７３及び１６８〜１７１、好ましくは配列番号６７、１７０のポリペプチドの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｆ）配列番号６７〜７３及び１６８〜１７１、好ましくは配列番号６７、１７０のポリペプチドの少なくとも１つと３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群より選択され；そして
第３のアミノ酸残基のストレッチが、
ｇ）配列番号８３〜８９及び１７８〜１８１、好ましくは配列番号８３、１８０のポリペプチド；
ｈ）配列番号８３〜８９及び１７８〜１８１、好ましくは配列番号８３、１８０のポリペプチドの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｉ）配列番号８３〜８９及び１７８〜１８１、好ましくは配列番号８３、１８０のポリペプチドの少なくとも１つと３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群より選択される、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、ＶＨＨ（ＶＨＨ１型配列を含む）又は配列最適化ＶＨＨ、例えばヒト化、安定化及び／又は可溶化ＶＨＨでもよい。
態様Ｂ−６：少なくとも３つのアミノ酸残基のストレッチが、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に対して結合するための抗原結合部位の一部を形成する、態様Ｂ−５に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｂ−７：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し、及び／又はこれらに特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ配列が、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性又はさらに本質的には１００％のアミノ酸同一性を有する、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、ＶＨＨ（ＶＨＨ１型配列を含む）又は配列最適化ＶＨＨ、例えばヒト化、安定化及び／又は可溶化ＶＨＨでもよい。
交差遮断又は交差遮断変異体
態様Ｃ−１：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し、そしてｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）への、配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７の免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８及び１４２〜１５０、好ましくは配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６及び／又は１４７のポリペプチドの結合を交差遮断する、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、態様Ａ−１〜Ａ−２２及び／又は態様Ｂ−１〜Ｂ−７のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。また、好ましくは、このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる。
態様Ｃ−２：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有し、そしてｉ）配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７の免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はｉｉ）配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８及び１４２〜１５０、好ましくは配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６及び／又は１４７のポリペプチドの少なくとも１つによって、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）への結合を交差遮断される、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、態様Ａ−１〜Ａ−２２及び／又は態様Ｂ−１〜Ｂ−７のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。また、好ましくは、このような免疫グロブリン単一可変ドメインは、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる。
態様Ｃ−３：前記免疫グロブリン単一可変ドメインが交差遮断する能力又は交差遮断される能力が、（例えば、以下の実施例部分に記載されている）置換アッセイで検出される、態様Ｃ−１又はＣ−２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド。
態様Ｃ−４：前記免疫グロブリン単一可変ドメインが交差遮断する能力又は交差遮断される能力が、実施例部分に示されているＥＬＩＳＡアッセイ及び／又はアルファスクリーンアッセイで検出される、態様Ｃ−１〜Ｃ−３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド。
態様Ｄ−１：本質的に単離された形態である、態様Ｂ−１〜Ｂ−７又はＣ−１〜Ｃ−４のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｄ−２：被験体に投与するための、前記被験体中に天然に存在しない、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、及び／又はＤ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｄ−３：１０−５〜１０−１２モル／リットル又はそれ未満、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル又はそれ未満、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、及び／又はＤ−１〜Ｄ−２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｄ−４：１０２Ｍ１ｓ１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ１ｓ１の会合速度（ｋｏｎ速度）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、及び／又はＤ−１〜Ｄ−３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｄ−５：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、及び／又はＤ−１〜Ｄ−４のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｄ−６：５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満の親和性で、ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に特異的に結合することができる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、及び／又はＤ−１〜Ｄ−５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｄ−１〜Ｄ−６に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、態様Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。
態様Ｅ−１：（任意の適切な種由来の）天然に存在する免疫グロブリン単一可変ドメインであるか、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン単一可変ドメインである、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４及び／又はＤ−１〜Ｄ−６のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−２：配列最適化されている、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−３：可溶化されている、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１又はＥ−２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−４：（任意の適切な種由来の）天然に存在する免疫グロブリン配列であるか、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−５：ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は親和性成熟などの技術によって得られた免疫グロブリン配列である、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−４のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−６：軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）から本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−７：従来の四本鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になるか、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−６のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−８：ドメイン抗体（又はドメイン抗体として使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメインとして使用するのに適切なもの）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとして使用するのに適切な免疫グロブリン単一可変ドメイン）、又はナノボディ（限定されないが、ＶＨＨ配列又はＶＨＨ１型配列を含む）から本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−７のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−９：ナノボディ（限定されないが、ＶＨＨ配列又はＶＨＨ１型配列を含む）から本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−８のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−１０：
ｉ）本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される）
そしてここで、
ｉｉ）好ましくは、Kabatナンバリングの１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ以上が、表Ａ−１で言及されているホールマーク残基から選択される免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−９のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−１１：
ｉ）配列番号２３〜２９、１０２及び／又は１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（この場合、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される）
そしてここで、
ｉｉ）好ましくは、Kabatナンバリングの１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ以上が、表Ａ−１で言及されているホールマーク残基から選択される免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１０のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−１２：ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１１のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−１３：ＣＤＲ配列によって形成される、結合のための少なくとも１つの結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質又は標的に対して結合するための１つ以上のさらなる結合部位を含有する、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１１のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
態様Ｅ−１〜Ｅ−１３に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、態様Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインでもよい。
ポリペプチド
態様Ｋ−１：１つ以上（好ましくは、１つ）の態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１３に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、場合により１つ以上のペプチドリンカーをさらに含む、ポリペプチド。
態様Ｋ−２：血清アルブミンに指向性を有する１つ以上（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む、態様Ｋ−１に記載のポリペプチド。
態様Ｋ−３：血清アルブミンに指向性を有する前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、ヒト血清アルブミンに指向性を有する、態様Ｋ−１又はＫ−２のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−４：血清アルブミンに指向性を有する前記１つ以上（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号５又は１０１を有する免疫グロブリン単一可変ドメインである、態様Ｋ−１〜Ｋ−３のいずれかに記載のポリペプチド。
核酸
態様Ｍ−１：態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
態様Ｍ−２：配列番号３０〜４２、好ましくは配列番号３０（表Ｂ−６）を有する、核酸又はヌクレオチド配列。
宿主細胞
態様Ｎ−１：態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチドを発現するか若しくは適切な環境下で発現することができ；及び／又は態様Ｍ−１又はＭ−２に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、宿主又は宿主細胞。
組成物
態様Ｏ−１：少なくとも１つの態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は少なくとも１つの態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド、又は態様Ｍ−１又はＭ−２に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、組成物。
態様Ｏ−２：医薬組成物である、態様Ｏ−１に記載の組成物。
態様Ｏ−３：少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、場合により１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む医薬組成物である、態様Ｏ−２に記載の組成物。
本発明の薬剤及び／又は組成物の作製
態様Ｐ−１：態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチドを生産するための方法であって、該方法が、少なくとも
ａ）適切な宿主細胞若しくは宿主生物又は別の適切な発現系で、態様Ｍ−１、又は態様Ｍ−２に記載の核酸又はヌクレオチド配列を発現させる工程；
場合により続いて：
ｂ）態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含む、方法。
態様Ｐ−２：態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチドを生産するための方法であって、該方法が、少なくとも
ａ）態様Ｎ−１に記載の宿主又は宿主細胞を、前記宿主又は宿主細胞が、少なくとも１つの態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で培養及び／又は維持する工程；
場合により続いて：
ｂ）態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含む、方法。
スクリーニング方法
態様Ｑ−１：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングするための方法であって、
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを提供する工程；及び
ｂ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合することができ、及び／又はこれらに対する親和性を有し、並びに本発明のナノボディ、例えば配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（表Ｂ−３）、又は本発明のポリペプチド若しくは構築物、例えば配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８及び１４２〜１５０、好ましくは配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６及び／又は１４７（表Ｂ−４を参照のこと）によって交差遮断されるか、又はこれらを交差遮断する免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸配列について、前記核酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程；及び
ｃ）前記核酸配列を単離し、続いて前記免疫グロブリン単一可変ドメインを発現させる工程
を少なくとも含む、方法。
態様Ｑ−２：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングするための方法であって、
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリを提供する工程；及び
ｂ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合することができ、及び／又はこれらに対する親和性を有し、並びに本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号２３〜２９、１０２及び１８７、好ましくは配列番号２６及び／又は１８７（表Ｂ−３）、又は本発明のポリペプチド若しくは構築物、例えば配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８及び１４２〜１５０、好ましくは配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６及び／又は１４７（表Ｂ−４を参照のこと）によって交差遮断されるか、又はこれらを交差遮断する前記免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程；及び
ｃ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができる前記アミノ酸配列を単離する工程
を少なくとも含む、方法。
態様Ｑ−３：ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングするための方法であって、
ａ）ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリを提供する工程；及び
ｂ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができる免疫グロブリン単一可変ドメインについて、前記ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程；及び
ｃ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができるアミノ酸配列を単離する工程
を少なくとも含む、方法。
本発明の薬剤の使用
態様Ｒ−１：ガン及び／又は炎症性疾患（例えば、本明細書で言及されるものなど）を予防及び／又は処置するための方法であって、該方法が、少なくとも１つの態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド；又は態様Ｏ−２又はＯ−３に記載の組成物の薬学的活性量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様Ｒ−２：その生物学的若しくは薬理学活性により、及び／又はｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）が関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達によりｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に関連する少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は処置するための方法であって、該方法が、少なくとも１つの態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド；又は態様Ｏ−２又はＯ−３に記載の組成物の薬学的活性量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様Ｒ−３：態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド；又は態様Ｏ−２又はＯ−３に記載の組成物の少なくとも１つを、それを必要とする被験体に投与することによって予防及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は処置するための方法であって、該方法が、少なくとも１つの少なくとも１つの態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド；又は態様Ｏ−２又はＯ−３に記載の組成物の薬学的活性量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様Ｒ−４：免疫治療のための方法であって、該方法が、少なくとも１つの態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド；又は態様Ｏ−２又はＯ−３に記載の組成物の薬学的活性量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様Ｒ−５：多発性骨髄腫を含む骨転移ガンに罹患している被験体における骨疾患及び／又は溶骨性病変を予防及び／又は処置するための方法であって、該方法が、少なくとも１つの態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド；又は態様Ｏ−２又はＯ−３に記載の組成物の薬学的活性量を、該被験体に投与することを含む、方法。
態様Ｒ−６：態様Ｒ−１〜Ｒ−３に記載の方法の１つ以上における使用のための、態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド；又は態様Ｏ−２又はＯ−３に記載の医薬組成物。
態様Ｒ−７：ガンを診断、予防及び／又は処置するための、態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｒ−８：多発性骨髄腫を含む骨転移ガンにおける骨疾患及び／又は溶骨性病変を診断、予防及び／又は処置するための、ｃ−Ｍｅｔに対するＩＳＶＤ及び／又は態様Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｓ−１ 態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれか１つに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及びＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチドを含む、多重特異性構築物。
態様Ｓ−２ 態様Ａ−２３〜Ａ−４４のいずれか１つに記載のＶＨＨ、及びＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチドを含む、多重特異性構築物。
態様Ｓ−３ 前記ＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン、好ましくはドメイン抗体、より好ましくはｄＡｂである、態様Ｓ−１又はＳ−２に記載の多重特異性構築物。
態様Ｓ−４ 前記ＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチドが、ＶＨＨ、さらにより好ましくはナノボディである、態様Ｓ−１又はＳ−２に記載の多重特異性構築物。
態様Ｓ−５ 前記ＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチドが、WO 08/101985に記載されているポリペプチド、特に配列番号４４１〜６７７のいずれか１つである、態様Ｓ−３又はＳ−４に記載の多重特異性構築物。
態様Ｓ−６ １つ以上のペプチドリンカーをさらに含む、態様Ｓ−１〜Ｓ−５のいずれかに記載の多重特異性構築物。
態様Ｓ−７ 血清アルブミンに指向性を有する１つ以上（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む、態様Ｓ−１〜Ｓ−６のいずれかに記載の多重特異性構築物。
態様Ｓ−８ 前記血清アルブミンに指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインが、ヒト血清アルブミンに指向性を有する、態様Ｓ−７に記載の多重特異性構築物。
態様Ｓ−９ 前記血清アルブミンに指向性を有する１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号５又は１０１を有する免疫グロブリン単一可変ドメインである、態様Ｓ−７〜Ｓ−８のいずれかに記載の多重特異性構築物。
態様Ｓ−１０ ガン、好ましくは多発性骨髄腫又は非小細胞肺ガンの診断、予防又は処置における使用のための、態様Ｓ−１〜Ｓ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物。
態様Ｓ−１１ 態様Ｓ−１〜Ｓ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物をコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
態様Ｓ−１２ 態様Ｓ−１〜Ｓ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物を発現する、宿主細胞。
態様Ｓ−１３ 態様Ｓ−１〜Ｓ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物を含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
態様Ｓ−１４ 態様Ｓ−１１に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
態様Ｓ−１５ 態様Ｓ−１２に記載の宿主細胞を含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
態様Ｓ−１６ 本明細書に記載されるガン、好ましくは多発性骨髄腫又は非小細胞肺ガンを診断、処置及び／又は予防するための方法であって、態様Ｓ−１〜Ｓ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物を使用することを必須工程として含む、方法。
態様Ｘ−１ 態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれか１つに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及びＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドを含む、多重特異性構築物。
態様Ｘ−２ 態様Ａ−２３〜Ａ−４４のいずれか１つに記載のＶＨＨ、及びＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドを含む、多重特異性構築物。
態様Ｘ−３ 前記ＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン、好ましくはドメイン抗体、より好ましくはｄＡｂである、態様Ｘ−１又はＸ−２に記載の多重特異性構築物。
態様Ｘ−４ 前記ＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドが、ＶＨＨ、さらにより好ましくはナノボディである、態様Ｘ−１又はＸ−２に記載の多重特異性構築物。
態様Ｘ−５ 前記ＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドが、WO 04/041867に記載されているポリペプチド、特に配列番号２３〜４４、WO 05/044858に記載されているポリペプチド、特に配列番号１〜５６及び６２〜７１、及び／又はWO 07/042289に記載されているポリペプチド、特に配列番号８０〜９３及び１１０〜１４３である、態様Ｘ−３又はＸ−４に記載の多重特異性構築物。
態様Ｘ−６ １つ以上のペプチドリンカーをさらに含む、態様Ｘ−１〜Ｘ−５のいずれかに記載の多重特異性構築物。
態様Ｘ−７ 血清アルブミンに指向性を有する１つ以上（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む、態様Ｘ−１〜Ｘ−６のいずれかに記載の多重特異性構築物。
態様Ｘ−８ 前記血清アルブミンに指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインが、ヒト血清アルブミンに指向性を有する、態様Ｘ−７に記載の多重特異性構築物。
態様Ｘ−９ 前記血清アルブミンに指向性を有する１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号５又は１０１を有する免疫グロブリン単一可変ドメインである、態様Ｘ−７〜Ｘ−８のいずれかに記載の多重特異性構築物。
態様Ｘ−１０ ガン、好ましくは多発性骨髄腫又は非小細胞肺ガンの診断、予防又は処置における使用のための、態様Ｘ−１〜Ｘ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物。
態様Ｘ−１１ 態様Ｘ−１〜Ｘ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物をコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
態様Ｘ−１２ 態様Ｘ−１〜Ｘ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物を発現する、宿主細胞。
態様Ｘ−１３ 態様Ｘ−１〜Ｘ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物を含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
態様Ｘ−１４ 態様Ｘ−１１に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
態様Ｘ−１５ 態様Ｘ−１２に記載の宿主細胞を含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
態様Ｘ−１６ 本明細書に記載されるガン、好ましくは多発性骨髄腫又は非小細胞肺ガンを診断、処置及び／又は予防するための方法であって、態様Ｘ−１〜Ｘ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物を使用することを必須工程として含む、方法。
態様Ｙ−１ 態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれか１つに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインと、ＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチド、及びＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドを含む、多重特異性構築物。
態様Ｙ−２ 態様Ａ−２３〜Ａ−４４のいずれか１つに記載のＶＨＨと、ＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチド、及びＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドを含む、多重特異性構築物。
態様Ｙ−３ 前記ＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン、好ましくはドメイン抗体、より好ましくはｄＡｂであり、前記ＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン、好ましくはドメイン抗体、より好ましくはｄＡｂである、態様Ｙ−１又はＹ−２に記載の多重特異性構築物。
態様Ｙ−４ 前記ＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチドが、ＶＨＨ、さらにより好ましくはナノボディであり、前記ＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドが、ＶＨＨ、さらにより好ましくはナノボディである、態様Ｙ−１又はＹ−２に記載の多重特異性構築物。
態様Ｙ−５ 前記ＶＥＧＦシグナル伝達を調節するポリペプチドが、WO 08/101985に記載されているポリペプチド、特に配列番号４４１〜６７７のいずれか１つであり、前記ＥＧＦＲシグナル伝達を調節するポリペプチドが、WO 04/041867に記載されているポリペプチド、特に配列番号２３〜４４のいずれか１つ、WO 05/044858に記載されているポリペプチド、特に配列番号１〜５６及び６２〜７１のいずれか１つ、及び／又はWO 07/042289に記載されているポリペプチド、特に配列番号８０〜９３及び１１０〜１４３のいずれか１つである、態様Ｙ−３又はＹ−４に記載の多重特異性構築物。
態様Ｙ−６ １つ、２つ又はそれ以上のペプチドリンカーをさらに含む、態様Ｙ−１〜Ｙ−５のいずれかに記載の多重特異性構築物。
態様Ｙ−７ 血清アルブミンに指向性を有する１つ以上（好ましくは、１つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む、態様Ｙ−１〜Ｙ−６のいずれかに記載の多重特異性構築物。
態様Ｙ−８ 前記血清アルブミンに指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインが、ヒト血清アルブミンに指向性を有する、態様Ｙ−７に記載の多重特異性構築物。
態様Ｙ−９ 前記血清アルブミンに指向性を有する１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号５又は１０１を有する免疫グロブリン単一可変ドメインである、態様Ｙ−７〜Ｙ−８のいずれかに記載の多重特異性構築物。
態様Ｙ−１０ ガン、好ましくは多発性骨髄腫又は非小細胞肺ガンの診断、予防又は処置における使用のための、態様Ｙ−１〜Ｙ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物。
態様Ｙ−１１ 態様Ｙ−１〜Ｙ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物をコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
態様Ｙ−１２ 態様Ｙ−１〜Ｙ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物を発現する、宿主細胞。
態様Ｙ−１３ 態様Ｙ−１〜Ｙ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物を含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
態様Ｙ−１４ 態様Ｙ−１１に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
態様Ｙ−１５ 態様Ｙ−１２に記載の宿主細胞を含む、組成物、好ましくは医薬組成物。
態様Ｙ−１６ 本明細書に記載されるガン、好ましくは多発性骨髄腫又は非小細胞肺ガンを診断、処置及び／又は予防するための方法であって、態様Ｙ−１〜Ｙ−９のいずれか１つに記載の多重特異性構築物を使用することを必須工程として含む、方法。
さらなる態様：
１．（例えば、実施例部分で概説した条件下において）１０nM未満、より好ましくは５nM未満、より好ましくは１nM未満、さらにより好ましくは５００pM未満、最も好ましくは１００pM未満のＩＣ５０及び６０％〜８０％又はそれ以上、より好ましくは９０％以上の平均ＨＧＦ置換で、ヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）からＨＧＦを特異的に置換することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。
２．式１
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）；
（式中、ＦＲ１〜ＦＲ４は、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；そして
ここでＣＤＲ１は、
ａ）配列番号１６０及び５１、
ｂ）配列番号１６０及び５１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号１６０及び５１と３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群より選択され、そして
ここでＣＤＲ２は、
ｄ）配列番号１７０及び６７；
ｅ）配列番号１７０及び６７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｆ）配列番号１７０及び６７と３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群より選択され；そして
ここでＣＤＲ３は、
ｇ）配列番号１８０及び８３；
ｈ）配列番号１８０及び８３と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｉ）配列番号１８０及び８３と３個、２個又は１個のアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群より選択される）を有するアミノ酸配列を含む、態様１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
３．フレームワーク領域（ＦＲ）が、配列番号１８９、５９、１９０及び／又は１８５のＦＲと８０％超（より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％）の配列同一性を有する、態様１〜２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
４．式１
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）；
（式中、ＦＲ１〜ＦＲ４は、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；ここでＣＤＲ１は、配列番号１６０又は５１であり、ＣＤＲ２は、配列番号１７０又は６７であり；そしてＣＤＲ３は、配列番号１８０又は８３である）を有するアミノ酸配列を含む、態様１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
５．態様１〜４のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ポリペプチド。
６．配列番号２３〜２９、１０２又は１８７と８０％超（より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、態様５に記載のポリペプチド。
７．配列番号２６又は１８７と８０％超（より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、態様５又は６のいずれかに記載のポリペプチド。
８．例えば、Ａｌｂ１１（配列番号５）、又はＡｌｂ２３（配列番号１０１）などのヒト血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む、態様５〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
９．配列番号７〜１２、１０３〜１１１、１１３、１８８又は１４２〜１５０と８０％超（より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、態様５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
１０．配列番号７、１０６、１１３、１８８、１４３、１４６又は１４７と８０％超（より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、態様５〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
１１．（例えば、実施例２．３．１の）アルファスクリーンアッセイにおけるＩＣ５０が１．２nM以下である、態様１〜４のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は態様５〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
１２．（例えば、実施例２．３．１の）アルファスクリーンアッセイにおけるＩＣ５０が５００pM以下である、態様１〜４のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は態様５〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
１３．ｉ）態様１〜４、１１、又は１２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又はｉｉ）態様５〜１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、核酸配列。
１４．ｉ）態様１〜４、１１、又は１２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又はｉｉ）態様５〜１０のいずれかに記載のポリペプチド、及び場合により薬学的に許容しうる賦形剤を含む、医薬組成物。
１５．ガンにおける使用のための、態様１〜４、１１、又は１２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又はｉｉ）態様５〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
１６．態様１〜４、１１、又は１２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又はｉｉ）態様５〜１０のいずれかに記載のポリペプチドを生産するための方法であって、該方法が、
ａ）適切な宿主細胞若しくは宿主生物又は別の適切な発現系で、態様１３に記載の核酸又はヌクレオチド配列を発現させる工程；
場合により続いて：
ｂ）前記免疫グロブリン単一可変ドメイン又は前記ポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を少なくとも含む、方法。
１７．ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に指向性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングするための方法であって、
ａ）ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリを提供する工程；及び
ｂ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができる免疫グロブリン単一可変ドメインについて、前記ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程；及び
ｃ）ｃ−Ｍｅｔ、特にヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）に結合し、及び／又はこれらに対する親和性を有することができるアミノ酸配列を単離する工程
を少なくとも含む、方法。
１８．ｃ−Ｍｅｔに関連する疾患又は障害に罹患している患者の治療に対する反応性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）治療前に前記患者から第１の試料を提供し、前記第１の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程、
ｂ）治療開始後に前記患者から第２の試料を提供し、前記第２の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程、
ｃ）第１の試料中に存在する可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を、第２の試料中に見られる可溶性ｃ−Ｍｅｔの量と比較する工程
を含み、
第２の試料中に見られる可溶性ｃ−Ｍｅｔの量が第１の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量と比較して減少していることが、患者が前記治療に対して反応性であることを示す、方法。
１９．前記試料が、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、糞便試料、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液又は組織生検である、態様１８に記載の方法。
２０．免疫アッセイ、化学発光アッセイ又は電気化学発光アッセイを使用して可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定する、態様１８に記載の方法。
２１．治療が、ｉ）態様１〜４、１１、又は１２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；ｉｉ）態様５〜１０のいずれかに記載のポリペプチド；又はｉｉｉ）態様１４に記載の医薬組成物を投与することを含む、態様１８に記載の方法。
２２．少なくとも１つのｃ−Ｍｅｔに関連する疾患又は障害を処置するための方法であって、態様１４に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
２３．ｃ−Ｍｅｔに関連する疾患又は障害に罹患している患者の治療に対する反応性を評価するためのキットであって、態様１８に記載の方法にしたがって、患者における可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定するための１つ以上の試薬を含む、キット。
２４．ｉ）態様１〜４、１１、又は１２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又はｉｉ）態様５〜１０のいずれかに記載のポリペプチド；又はｉｉｉ）態様１４に記載の医薬組成物をさらに含む、態様２２に記載のキット。
実験部分：
配列：













実施例１：ｃ−Ｍｅｔ遮断ナノボディの同定
免疫グロブリン単一可変ドメイン／ドメイン（domains/domain）は、実験部分では主にナノボディ／ナノボディ（Nanobodies/Nanobody）と称される。
１．１ 免疫感作
標準的なプロトコールにしたがって、完全フロイントアジュバント（０日目）又は不完全フロイントアジュバント（免疫感作後）（Difco, BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で製剤化したヒト（ｈ；ｈｕ）ｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（ｈｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ又はｈｕ ｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ；ｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインをヒトＦｃに遺伝子融合し、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞で発現させたもの；R&D Systems, Catalogue number 358-MT/CF, Minneapolis, MN, USA、配列番号２も参照のこと）を頸部に４回筋肉内注射（２週間間隔で１００又は５０μg／用量）することによって、３匹のラマ（Ｎｏ．４５０、４５１及び４５２、llama glama）を免疫感作した。
０日目及び３５日目に、ｈｕ ｃ−Ｍｅｔに対する抗体力価をＥＬＩＳＡによって定義するために、リコンビナントタンパク質で免疫感作したラマから血清を採取した。96-well Maxisorp plates (Nunc, Wiesbaden, Germany)をｈｕ ｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ又は無関係なＦｃでコーティングした。ブロッキングし、血清試料の連続希釈物を追加した後、マウス抗ラマＩｇＧ１、２及び３モノクローナル抗体（Daley et al., Clin Diagn Lab Immunol. 2005 Mar;12(3):380-6.）、続いてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲーションウサギ抗マウスＩｇＧ（Dako, Glostrup, Denmark）を使用し、続いて基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｎｔｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ））（Promega, Madison, WI, USA）の存在下で酵素反応を行って、ラマ抗ｈｕ ｃ−Ｍｅｔ抗体の存在を実証した。
０日目及び５０日目に、ｃ−Ｍｅｔを発現するＡ５４９肺腫瘍細胞（ＡＴＣＣナンバーＣＣＬ−１８５）又はｃ−ＭｅｔネガティブコントロールＣＨＯ Ｋ１（ＡＴＣＣナンバーＣＣＬ−６１）細胞に対する抗体力価をＦＡＣＳによって定義するために、リコンビナントタンパク質で免疫感作したラマから血清を採取した。ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎仔血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンで、細胞を培養した。希釈した血清試料に細胞を再懸濁した。洗浄後、ヤギ抗ラマＩｇＧ（Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA）及びＰＥコンジュゲーションロバ抗ヤギＩｇＧ（Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA）を使用して、FACSArray（商標）（BD Biosciences）で、細胞表面に結合した抗ｃ−Ｍｅｔラマ抗体の存在を検出した。
ＥＬＩＳＡでは、３匹のラマすべてが、ｈｃ−Ｍｅｔに対するＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３免疫グロブリンクラスで、優れた特異的反応を示した。ＦＡＣＳでは、ｃ−Ｍｅｔを発現するＡ５４９腫瘍細胞に対する血清反応は、３匹のラマすべてで明らかに検出可能であった。細胞ではなくリコンビナントタンパク質でラマを免疫感作したので、観察されたシグナルは、ｃ−Ｍｅｔに対して特異的であると考えることができる。
１．２ ライブラリの構築
免疫感作したラマ由来の血液試料を４６日目及び５０日目に採取し、製造業者の説明書にしたがってFicoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)を使用して、末梢血単核細胞を調製した。製造業者の説明書にしたがってRneasy Midi Kit (Qiagen, Venlo, The Netherlands)を使用して、末梢血単核細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲの出発材料として全ＲＮＡ試料を使用して、ナノボディをコードする遺伝子フラグメントを増幅した。ヘルパーファージによる感染後に、ナノボディを遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質としてファージ粒子表面上にディスプレイするリコンビナントファージ粒子の生産を可能にする自作のファージミドベクター（ｐＡＸ５０）に、これらのフラグメントをクローニングした。標準的な方法にしたがってファージを調製し、滅菌ろ過した後、２０％グリセロール中に−８０℃で保存した。
１．３ 選択
ラマ４５０、４５１及び４５２から得られたファージライブラリを異なる選択戦略に使用した。
選択戦略１：１回目の選択ラウンド（又は、細胞での選択後の２回目のラウンド）では、１又は１００nMのビオチン化ヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（R&D Systems；製造業者の説明書にしたがってSulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce, Rockford, IL, USA)を使用して、ｉｎ ｈｏｕｓｅでビオチン化したもの）を、ファージライブラリと共にインキュベーションし、続いてStreptavidin Dynabeads (Invitrogen)で捕捉した。広範囲に洗浄した後、ビーズに結合したファージを１mg/mLのトリプシンで溶出させた。
選択戦略２：１回目の選択ラウンド（又は、リコンビナント抗原での選択後の２回目のラウンド）では、ｃ−Ｍｅｔを内因的に発現する細胞１０６個／mLのヒトＡ５４９細胞を、ファージライブラリと共にインキュベーションした。広範囲に細胞を洗浄した後、細胞に結合したファージを１mg/mLのトリプシンで溶出させた。
異なる戦略の選択からのファージアウトプットをE. coli TG1細胞でレスキューした。コロニーを剥がし、９６ディープウェルプレート（容量１mL／ウェル）で成長させた。ＩＰＴＧを成長培地に追加することによって、Ｃ末端にｃ−ｍｙｃ及びＨｉｓ６がタグ付けされた可溶性ナノボディの発現を誘導した。標準的な方法（WO 94/04678）にしたがって、ペリプラズム抽出物（容量：約１００μl）を調製した。
１．４ フローサイトメトリーアッセイにおけるｃ−Ｍｅｔ結合ナノボディのスクリーニング
ｃ−Ｍｅｔを発現するＡ５４９腫瘍細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１８５）を使用してＦＡＣＳアッセイで、細胞によって発現されたｃ−Ｍｅｔの結合について、ペリプラズム抽出物をスクリーニングした。１：１０希釈したペリプラズム抽出物中で２×１０５個のＡ５４９細胞を４℃で３０分間インキュベーションし、次いで十分に洗浄した。次に、細胞を、２μg/mlの抗ｃ−ｍｙｃ抗体と共に４℃で３０分間インキュベーションし、再度洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥラベル抗体（１：１００）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。試料を洗浄し、５nMのTOPRO3 (Molecular Probes cat# T3605)を補充したＦＡＣＳ緩衝液（１０％ＦＢＳ（Sigma製）及び０．０５％アジ化ナトリウム（Merck製）を含むＤ−ＰＢＳ（Gibco製））に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液をFACS Cantoで分析した。前方散乱／側方散乱及びTOPRO3チャネル蛍光パラメータを使用して、ゲーティングをインタクトな生細胞に設定した。生細胞のＰＥチャネル手段のチャネル蛍光値が、コントロール実験（ナノボディ染色を省略するか、又は無関係な特異的結合ナノボディを含む）で得られたものよりも高いことは、クローンが細胞株に結合したことを示す。
１．５ アルファスクリーンアッセイにおけるＨＧＦ遮断ナノボディのスクリーニング
ナノボディのリガンド遮断能を評価するために、ペリプラズム抽出物をアルファスクリーンアッセイでスクリーニングした。このアッセイは、生体分子にコンジュゲーションすることができるドナービーズ及びアクセプタービーズの使用に依拠する。分子間の生物学的な相互作用がビーズを接近させると、６８０nmのレーザー励起によりドナービーズ中の光感作物質によって生成された励起一重項酸素分子が拡散して、アクセプタービーズ中の化学発光物質と反応し、これが、５２０〜６２０nmで発光するフルオロフォアをさらに活性化する。ナノボディがｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するＨＧＦの結合を阻害する場合、蛍光シグナルが減少するであろう。
製造業者の説明書にしたがって、アクセプタービーズ（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）を抗ヒトＦｃナノボディ（ｉｎ ｈｏｕｓｅで調製したもの）とコンジュゲーションした。ペリプラズム抽出物を０．２６nMのビオチン化ＨＧＦと共に室温で１５分間プレインキュベーションした。次に、抗ヒトＦｃコンジュゲーションアクセプタービーズ及びｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（最終濃度０．２６nM）を追加し、室温で１時間インキュベーションした。第２に、ストレプトアビジンドナービーズ（Perkin Elmer）を追加し、さらに１時間インキュベーションした。励起波長６８０nm及び発光波長５２０nmを使用してEnVision Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer)でプレートを読み取ることによって、蛍光を測定した。シグナルの減少は、ｃ−Ｍｅｔに対するビオチン化ＨＧＦの結合が、ペリプラズム抽出物中で発現しているナノボディによって遮断されることを示す。
ナノボディがｃ−ＭｅｔとＨＧＦとの相互作用を遮断するか否かを分類するために、任意５０％カットオフを選択した。
フローサイトメトリースクリーニング又はアルファスクリーンアッセイのいずれかでポジティブとスコア化したナノボディを配列決定した。それらのＣＤＲ３配列に基づいて、クローンを配列ファミリーにクラスタ化した。４６種の異なるファミリーのｃ−Ｍｅｔバインダー及び／又はＨＧＦブロッカーを同定した。
１．６ ＨＧＦ誘導性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を遮断するナノボディのスクリーニング
フローサイトメトリーアッセイ又はアルファスクリーンアッセイのいずれかでポジティブであったナノボディのペリプラズム抽出物を、リン酸化アッセイでさらにスクリーニングした。このアッセイにより、ＨＧＦ駆動性のｃ−Ｍｅｔリン酸化及び下流のシグナル伝達を阻害するナノボディを同定することが可能になる。ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を阻害することによって、又はｃ−Ｍｅｔの二量体化を阻害することによって、ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害が起こり得る。Mesoscale Discovery kit (MSD, Cat # K15126A-3, Mesoscale Discovery, Gaithersburg, MD)を使用して、リン酸化ｃ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ １３４９）を検出した。このキットにより、単一のウェルで、全ｃ−Ｍｅｔ及びＴｙｒ １３４９リン酸化ｃ−Ｍｅｔの両方を検出することが可能になる。
Ａ５４９腫瘍細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１８５）を、１ウェルあたり細胞２０．０００個の密度で播種した。２日後、細胞培養培地を無血清培地に交換し、細胞を一晩血清飢餓させた。翌日、細胞を、ペリプラズム抽出物の１／５希釈物（全容量１００μl中、２０μl）と共に３０分間インキュベーションしてから、１nMのＨＧＦ（Peprotech）を追加し、３７℃でさらに１５分間インキュベーションした。次いで、細胞を洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｘＲＩＰＡ緩衝液、Cell Signaling Technology）に溶解させた。溶解物をｃ−Ｍｅｔ ＭＳＤアッセイプレートに移した。未結合の溶解材料を洗い流した後、スルホタグ付抗体をで結合リン酸化ｃ−Ｍｅｔ及び全ｃ−Ｍｅｔを検出し、Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery)でプレートを読み取った。ポジティブコントロールとして、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体ｈ２２４Ｇ１１（Pierre-Fabre Institute）（WO 2009/007427、図６５及び図７２）のいくつかの複製物を、各アッセイプレートの無関係なペリプラズム抽出物（最終１／５希釈）にスパイクした。
次いで、以下の式：

にしたがって推奨標準化比（ＮＲ）として、試料中のリン酸化タンパク質の割合を計算した。
最大シグナル（１nMのＨＧＦ＋無関係なペリプラズム材料（１／５希釈）とした場合のいくつかの複製物の平均）及びネガティブコントロール（ＨＧＦ刺激なし＋無関係なペリプラズム材料（１／５希釈）とした場合のいくつかの複製物の平均）に関して、阻害率を以下のように計算する：
スクリーニングしたクローン１９６個のうちの８８個は、Ａ５４９細胞におけるＨＧＦ誘導性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を＞３０％阻害する能力について、少なくともｈ２２４Ｇ１１と同程度に有効であった。
１．７ 本発明のナノボディのフォーマット又は突然変異
Pichia pastorisにおける発現及び培養培地中への分泌を可能にするｉｎ−ｈｏｕｓｅ構築プラスミドに、ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）、０６Ｂ０８−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号８）、０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９）、及び０６Ｆ１０−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号１０）をクローニングした。前記ナノボディ［０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）、０６Ｂ０８−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号８）、０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９）、及び０６Ｆ１０−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号１０）］が翻訳時にそれらのＣ末端において、９ＧＳリンカー（アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ）で隔てられて抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ナノボディ（Ａｌｂ１１とも表記されるＡＬＢ１１）に融合されるように、クローニングを行った。構築物は、さらなるＣ末端３×ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６−タグ（配列番号６）を有していた。
同じ発現プラスミドに、ナノボディＡｌｂ１１−３５ＧＳ−０４Ｅ０９（配列番号１１）及びＡｌｂ１１−３５ＧＳ−０４Ｅ０９（配列番号１２）をクローニングし、同じＡＬＢ１１ナノボディに融合したが、ｃ−Ｍｅｔ結合ナノボディが翻訳時にそれらのＮ末端において、３５ＧＳリンカー（配列番号２２）又は９ＧＳリンカー（配列番号１５）で隔てられてＡＬＢ１１に融合されるようにした。上記のように、これらの構築物は、Ｃ末端３×ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６−タグ（配列番号６）を有していた。
このプラスミドに、ナノボディ０４Ｅ０９−Ｌ４９Ｓ（配列番号２３）、０４Ｅ０９−Ｃ５０Ｓ／Ｃ１００ｂＧ（配列番号２４）及び０４Ｅ０９−Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ（配列番号２５）もクローニングした。ナノボディ０４Ｅ０９のKabat位置Ｌｅｕ４９をＳｅｒに突然変異させるか（Ｌ４９Ｓ）、Kabat位置Ｃｙｓ５０をＳｅｒに及びKabat位置Ｃｙｓ１００ｂをＧｌｙに突然変異させるか（Ｃ５０Ｓ／Ｃ１００ｂＧ）、又はKabat位置Ｃｙｓ２２をＡｌａに及びKabat位置Ｃｙｓ９２をＳｅｒに突然変異させ（Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ）、そのＣ末端で３×ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６−タグ（配列番号６）に融合した。
実施例２：増殖アッセイ、ケモタキシスアッセイ、２種のＨＧＦ競合アッセイ及びフローサイトメトリーアッセイにおけるｃ−Ｍｅｔ遮断ナノボディの特性決定
２．１ ナノボディの発現及び精製
１．７に記載したようにナノボディ（配列番号７〜１０）をクローニングし、培地容量２５０mLでP. pastorisにおいて発現させた。メタノールを追加することによってナノボディの発現を誘導し、３０℃で４８時間維持した。HisTrap（商標） column (GE Healthcare)を使用する固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の出発材料として、上澄みを使用した。イミダゾールの段階的勾配２０mM〜２５０mMを使用して、カラムからナノボディを溶出させた。次の段階では、HiPrep（商標）２６／１０脱塩カラム（GE Healthcare）を使用して、ナノボディをＤ−ＰＢＳ（Invitrogen）に緩衝液交換した。
２．２ ＭＥＴ遮断ベンチマーク分子
２．２．１ 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体５Ｄ５
１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したDMEM+Glutamax-I (Gibco)で、マウスハイブリドーマ細胞株５Ｄ５．１１．６（ATCC HB-11895; lot no 3996831, LGC Standards, UK）を成長させた。抗体産生のために、６mMのＬ−グルタミン及び１×コレステロールを補充したCD Hybridoma (Lonza)に培養培地を交換した。約１週間後に馴化培地を回収し、遠心分離し、0.22μm Express PLUS membrane (Millipore)を備えるStericup systemを使用してろ過してから、HiTrap ProteinG column (GE Healthcare)にロードした。０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）でカラムを溶出し、０．２容量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で溶出物を直ぐに中和した。次いで、PD-10脱塩カラム（GE Healthcare）で、抗体溶液をＤ−ＰＢＳに緩衝液交換した。
２．２．２．ｍＡｂ由来の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体フラグメント５Ｄ５ Ｆａｂ
Pierce Mouse IgG1 Fab and F(ab´)2 Micro Preparation Kit (Cat # 44980, Thermo Scientific)を使用して、マウスＩｇＧをフィシン消化することによって、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体５Ｄ５のＦａｂフラグメントを調製した。簡潔に言えば、２５mMのシステインを補充した消化緩衝液中で、ＩｇＧを、アガロース固定化フィシンと共に３７℃で４時間インキュベーションした。抗マウスＦｃアガロース（Europa Bioproducts; Cat # EU-AMIgGFc-AGA-1）と共に１時間インキュベーションすることによって、未消化ＩｇＧ及びＦｃフラグメントを除去した。ビーズを含まない上清を膜ろ過濃縮装置（20,000 MWCO, CAT # 87750, Pierce - Thermo Scientific）で容量１mL未満に濃縮した。調製物をサイズ分離し、Superdex 75 10/300GL column (GE Healthcare)でゲルろ過することによって、緩衝液交換した。溶出画分を同じ膜ろ過濃縮装置で再度濃縮した。
２．２．３ ５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２の作製
５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２の配列は、Dennis et al.（米国特許出願公開第2007/0092520号）で公開された。５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２は、ヒト化及び親和性成熟されている点で、親マウスハイブリドーマモノクローナル抗体５Ｄ５と異なっていた。可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメイン（合成で作製したもの、Geneart）の配列を、それぞれヒトＩｇＧ１ ＣＨ１（血球凝集素タグ及びヘキサヒスチジンタグでタグ付けしたもの）、及びヒトκＣＬヒトに遺伝子融合した。ｉｎ−ｈｏｕｓｅ作製E. coli発現プラスミドからこの構築物を発現させた。２Ｌ発酵槽中、０．５％グルコース及びカナマイシンを補充したＬＢ培地でE. coli TG1細胞を成長させ、１mMのＩＰＴＧで発現を誘導した。遠心分離（３６００×ｇ、２０分間）によって細胞を回収し、ペリプラズム抽出物を生産した。Ni-NTA column (HisTrap, GE Healthcare)で５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２を捕捉し、２５０mMのイミダゾールで溶出させた。抗ヒトκアフィニティーカラム（KappaSelect, GE Healthcare）で、溶出物をさらに精製した：１００mMのグリシン（ｐＨ２．５）で５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２を溶出させ、０．２容量の１ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）を追加することによって直ぐに中和した。
２．３ ナノボディは、アルファスクリーンアッセイ及びフローサイトメトリーアッセイで、ｃ−ＭｅｔリガンドＨＧＦの結合を遮断する
２．３．１ナノボディは、アルファスクリーンアッセイで、ｃ−ＭｅｔリガンドＨＧＦの結合を遮断する
遮断効力及び有効性を評価し、これを５Ｄ５ Ｆａｂと比較するために、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ競合アルファスクリーンアッセイで、精製ナノボディを特性決定した。抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ及び５Ｄ５ Ｆａｂの連続希釈物（２５０nMから０．９pMまで）を１００pMのビオチン化ｈＨＧＦ（ヒトＨＧＦ）と共に室温で１５分間インキュベーションした。次に、抗ヒトＦｃコンジュゲーションアクセプタービーズ及びｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（最終濃度１００pM）を追加し、この混合物を室温でさらに２時間インキュベーションした。次いで、ストレプトアビジンドナービーズを追加し、この混合物をさらに１時間インキュベーションした。励起波長６８０nm及び発光波長５２０nmを使用してEnVision Multilabel Plate Readerでプレートを読み取ることによって、蛍光を測定した。
選択したナノボディは、ｃ−Ｍｅｔレセプターに対するＨＧＦの結合を用量依存的に有効に阻害する。計算したＩＣ５０値及び阻害率を表１に示す。阻害率は、コールド（非ビオチン化）リガンドの最大濃度と比較した特定化合物の連続希釈物の最大阻害度を反映している（基準点を１００％として設定）。例えば、ナノボディ０６Ｂ０８−９ＧＳ−Ａｌｂ１１は、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ相互作用を最大６５％遮断するのに対して、他のナノボディ及び５Ｄ５ Ｆａｂは、約１００％阻害することができた。
５μMのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下又は非存在下で、精製ナノボディを評価した。
表２は、ＨＳＡの存在下又は非存在下におけるナノボディの効力（ＩＣ５０値）を要約したものである。どのナノボディについても、効力の有意な変化は、ＨＳＡの存在下で観察されなかった。
２．３．２ナノボディは、フローサイトメトリーアッセイで、ｃ−ＭＥＴリガンドＨＧＦの結合を遮断する
遮断効力及び有効性を評価し、これ５Ｄ５ｍＡｂと比較するために、フローサイトメトリー測定ベースのＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ競合アッセイで、精製ナノボディを特性決定した。Ａ５４９細胞を洗浄し、２×１０６／mLで再懸濁した。抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ及び５Ｄ５mAｂの連続希釈物（１μMから５．６pMまで）を１nMのビオチン化ｈＨＧＦと共にプレインキュベーションした。次に、Ａ５４９細胞及びナノボディ／ＨＧＦ混合物を４℃で２時間インキュベーションした。洗浄後、ストレプトアビジン／ＰＥ（BD Bioscience）を用いて、細胞を４℃で３０分間染色した。次いで、細胞を再度洗浄し、２．５nMのTOPRO3 (Invitrogen)で染色し、FACSArray機器（BD Bioscience）で分析した。
データにより、ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）、０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９）及び０６Ｆ１０−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号１０）は、ＨＧＦとの完全な競合を示すことが示された。ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）及び０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９）は、５Ｄ５ｍＡｂのものよりも有意に低いＩＣ５０値を有していた。このアッセイでは、５Ｄ５ ＦａｂフラグメントのＩＣ５０値は１１．３nMであると決定した。
２．３．３ アルファスクリーンアッセイにおけるｃ−ＭＥＴ−リガンドＨＧＦの結合
遮断効力及び有効性を評価し、これをベンチマーク抗体フラグメント（５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２）と比較するために、ＨＧＦ／ｃ−ＭＥＴ競合アルファスクリーンアッセイで、抗ｃ−ＭＥＴ／抗血清アルブミンナノボディ構築物を特性決定した。抗ｃ−ＭＥＴナノボディ及びベンチマーク５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２の連続希釈物（２５０nMから０．９pMまで）を１００pMのビオチン化ｈＨＧＦと共に室温（ＲＴ）で１５分間プレインキュベーションした。抗ヒトＦｃコンジュゲーションアクセプタービーズ及びｃ−ＭＥＴ／Ｆｃ（最終濃度１００pM）をこの混合物に追加し、室温（ＲＴ）で２時間インキュベーションした。次に、ストレプトアビジンドナービーズを追加し、この混合物をさらに１時間インキュベーションした。励起波長６８０nm及び発光波長５２０nmを使用してEnVision Multilabel Plate Readerでプレートを読み取ることによって、蛍光を測定した。
２つの構築物は、ｃ−ＭＥＴレセプターに対するＨＧＦの結合を用量依存的に有効に阻害する。計算したＩＣ５０値及び対応する９５％信頼区間を表３Ａに示す。Ａ００７９００１７１及び２バッチのＡ００７９０１２１９は、類似のＩＣ５０値を有する；それらの９５％ＣＩはオーバーラップしており、これは、差が統計的に有意ではないことを示唆している。これらのナノボディは、ベンチマーク５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２と比較して＞５倍向上した効力を示した。
結論としては、これらのナノボディ構築物は、特定の抗血清アルブミン部分に関係なく、ベンチマークよりも優れた性能である。
２．４ ナノボディは、Ａ５４９ガン細胞株におけるＨＧＦ誘導性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を遮断する
実施例１．６に概説したように、ＨＧＦ依存性リン酸化アッセイで、精製ナノボディを特性決定した。
２．４．１ナノボディは、Ａ５４９ガン細胞株におけるＨＧＦ誘導性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を遮断する
第１の一連の実験では、フォーマットした抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ又は５Ｄ５ Ｆａｂの連続希釈物（１μMから０．２３nMまで）を、Ａ５４９細胞において１nMのＨＧＦと共に３７℃で１５分間コインキュベーションした。次いで、細胞溶解物の１／３をＭＳＤリン酸化ｃ−Ｍｅｔアッセイプレートにアプライした。測定前に、複製物試料由来の溶解物をプールした。未結合の溶解物を洗い流した後、リン酸化ｃ−Ｍｅｔ及び非リン酸化ｃ−Ｍｅｔの両方を検出するスルホタグ付抗体を追加し、Sector Imager 2400 (MSD)を使用してプレートを読み取った。
精製ナノボディは、ＨＧＦ依存性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を事実上完全に遮断することが示された。結果を表４に要約する；図１も参照のこと。
結論としては、タグ付（配列番号６）ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）は、５Ｄ５ Ｆａｂベンチマークよりも優れた性能である。ナノボディ０６Ｂ０８−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号８）及び０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９）は、（９５％信頼区間内では）同程度のＩＣ５０を有するのに対して、０６Ｆ１０−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号１０）は効力が低い。
Ａ５４９細胞におけるｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイの結果に基づいて、ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）を最も強力なナノボディとして同定した。
２．４．２ Ａｌｂ２３由来ナノボディは、Ａ５４９ガン細胞株におけるＨＧＦ誘導性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を遮断する
第２の一連の実験では、ＨＧＦ依存性リン酸化アッセイで、精製抗ｃ−ＭＥＴ／抗血清アルブミンＡｌｂ１１及びＡｌｂ２３ナノボディ構築物を特性決定した。抗ｃＭＥＴ構築物又は抗ｃＭＥＴベンチマーク５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２の連続希釈物（１μMから０．２３nMまで）を、Ａ５４９細胞において１nMのＨＧＦと共に３７℃で１５分間コインキュベーションした。次いで、溶解細胞溶液の１／３をリンｃ−ＭＥＴ ＭＳＤアッセイプレートにアプライした。細胞培養レベルの２つの複製物をＭＳＤレベルでプールした。未結合の材料を洗い流した後、スルホタグ付検出ｃ−Ｍｅｔ抗体により、リン酸化レセプター及び非リン酸化レセプターの両方を検出した。sector imager 2400を用いて、読み出しを実施した。
２つの抗ｃ−ＭＥＴ／抗血清アルブミンナノボディ構築物は、ＨＧＦ依存性のｃ−ＭＥＴレセプターリン酸化を用量依存的に有効に阻害する。計算したＩＣ５０値及び対応する９５％信頼区間を表４Ａに示す。Ａ００７９００１７１（配列番号１１３）及び２バッチのＡ００７９０１２１９（配列番号１０６）は、類似のＩＣ５０値を有する；それらの９５％ＣＩはオーバーラップしており、これは、差が統計的に有意ではないことを示唆している。これらのナノボディは、ベンチマーク５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２と比較して２倍向上した効力を示した。加えて、９５％信頼区間内では、ヒト血清アルブミンを刺激細胞に追加しても、試験したナノボディのＩＣ５０値は変化しなかった。
結論としては、これらのナノボディ構築物は、特定の抗血清アルブミン部分に関係なく、ベンチマークよりも優れた性能である。
２．５ ナノボディは、ＢｘＰＣ−３細胞のＨＧＦ誘導性増殖を遮断する
ＢｘＰＣ３細胞（膵臓ガン細胞、ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ−１６８７）のＨＧＦ誘導性増殖を遮断する能力について、ナノボディを評価した。このアッセイでは、１ウェルあたり１×１０４個の細胞をE-plates (ACEA/Roche Applied Science)に播種し、Xcelligence RTCA Analyser (Roche Applied Science)を使用して、各ウェルのインピーダンス値を測定し、計算「標準化細胞指数」（ＮＣＩ）を提供することによって、それらの動態をモニタリングする。一晩インキュベーションし、４時間血清飢餓させた後、フォーマットした抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ又は抗ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５ Ｆａｂベンチマークの連続希釈物（０．８μMから０．０５nMまで）をＢｘＰＣ３細胞に追加した。ＮＣＩ値を３日間記録した。
３日後、すべてのナノボディは、ＨＧＦ媒介性のＮＣＩ増加をほぼ完全に遮断することができたが、これは、それらが、ＨＧＦ誘導性の細胞増殖を効率的に遮断することを示している（表５）。タグ付（配列番号６）ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）は、５Ｄ５ Ｆａｂのものよりも優れた効力を有していた（図３を参照のこと）。他のナノボディは、５Ｄ５ Ｆａｂと同程度のＩＣ５０値を有していた（データは示さない）。
２．６ ナノボディは、Ａ５４９細胞のＨＧＦ依存性ケモタキシスを遮断する
抗ｃ−Ｍｅｔナノボディが、ＨＧＦ濃度勾配に対するＡ５４９細胞の遊走を遮断する能力をケモタキシスアッセイで試験した。
このアッセイは、蛍光遮断微多孔質ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）メンブレンインサート（孔径８μm）を備えるブラックマルチウェルインサートプレートをトランスペアレント９６ウェルレシーバープレートにマウントしたものからなるFluoroBlok（商標）プレート（BD Falcon（商標））に基づくものであった。サブコンフルエントなＡ５４９細胞を一晩血清飢餓させ、蛍光色素DiIC12 (BD Biosciences)で染色した。次に、１ウェルあたり細胞７５．０００個をメンブレンインサート上に播種し、抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ又は抗ｃ−Ｍｅｔマウス５Ｄ５ Ｆａｂの連続希釈物（０．４μMから０．０１nMまで）と共にインキュベーションした。同じ濃度のナノボディ／抗体も、２．５nMのＨＧＦと同様に下部区画に追加した。２４時間後、ボトムリーディング蛍光プレートリーダー（Envision, Perkin Elmer）で、ボトムプレートに遊走した細胞の量を定量した。
試験したナノボディはすべて、ケモタキシスアッセイで、５Ｄ５ Ｆａｂベンチマーク（完全に遮断）と同程度に、Ａ５４９細胞のＨＧＦ駆動性遊走を阻害することができた。ナノボディ０６Ｂ０８−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号８）は、遊走をバックグラウンドレベルよりもさらに下に減少させると思われた。このアッセイでは、ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）及び０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９）は、５Ｄ５ Ｆａｂよりも強力であった。結果を表６に要約する。図４も参照のこと。
２．７ Ａ００７９０１２２２は、ｃ−ＭＥＴに対するＨＧＦの結合を阻害する
発酵槽中、２Ｌスケール、複合培地（ｐＨ６．０）、誘導後９５時間（９５ｈａｉ）（hours after induction））及び３０℃で、抗ｃ−ＭｅｔナノボディＡ００７９０１２２２（配列番号１８８）をP. pastoris菌株Ｘ３３で生産した。最初に、高速遠心分離工程（７０００rpm、４℃、２０分間、Sigma 8K10 rotor）によって培養ブロスをクラリファイし、次いで、ＴＦＦを使用して精密ろ過することによって上清をパーティクルフリーにした。続いて、この材料をMEP HyperCel column (PALL)にロードした。酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）でナノボディを溶出させ、１／１０v/v１Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．８）で溶出物を中和した。Sephadex G25で、ナノボディをポリッシュ工程緩衝液にさらに緩衝液交換し、続いて、Poros50 HQの陰イオン交換クロマトグラフィーポリッシュ工程によって精製した。ＬＰＳ除去のためにＯＧＰ処理した後、Superdex 75で、この材料をＤ−ＰＢＳに緩衝液交換した。
３つの異なるアッセイで精製ナノボディを試験し、５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２ベンチマークと比較した：（ｉ）ＨＧＦ競合アルファスクリーンにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ効力分析、（ｉｉ）細胞ベースのｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイ、（ｉｉｉ）細胞ベースの増殖アッセイ。
ＨＧＦ競合アルファスクリーンは、実施例２（２．３．１）に記載したよう実施した。細胞ベースのｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイは、実施例１．６に概説したよう実施した。細胞ベースの増殖アッセイは、実施例２．５に概説したよう実施した。
計算したＩＣ５０値及び対応する９５％信頼区間を表７に示す。
実施例３：ｃ−Ｍｅｔ遮断ナノボディの結合特異性
３．１ ｃ−Ｍｅｔ遮断ナノボディは、細胞膜で発現しているヒト及びカニクイザルｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する
ヒト細胞膜で発現している内因性ｃ−Ｍｅｔの供給源として、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１８５、LGC Standards, UK）を使用した。膜結合全長タンパク質として、カニクイザルｃ−ＭｅｔをＢＡＦ３細胞で発現させた。発現プラスミドＤＮＡでＢＡＦ３細胞（ABL157, DMSZ, Germany）をトランスフェクションし、ＦＡＣＳソーティング（FACSAria, BD Biosciences）によって、高いｃ−Ｍｅｔ発現レベルを有する集団を単離した。細胞表面で内因的かつ異所的に発現しているヒト及びカニクイザルｃ−Ｍｅｔそれぞれに対するナノボディの結合を、下記のようにＦＡＣＳ分析によって評価した。
抗ｃ−Ｍｅｔナノボディの連続希釈物（１μMから０．５pMまで）を、１０５個のＡ５４９細胞、ＢＡＦ３細胞、又はカニクイザルｃ−ＭｅｔトランスフェクションＢＡＦ３細胞と共に４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄した後、マウス抗ＦＬＡＧ及びＰＥコンジュゲーションヤギ抗マウスＩｇＧを使用してFACS Array（商標）で、細胞表面に結合したナノボディを検出した。
すべてのナノボディは、細胞で発現しているヒトｃ−Ｍｅｔ及びカニクイザルｃ−Ｍｅｔの両方に対して同程度の用量依存的な結合を示した。ＢＡＦ３細胞に対する結合は観察されなかったが、これは、トランスフェクションＢＡＦ３細胞に対する結合が、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ｃ−Ｍｅｔトランス遺伝子に対して特異的であったことを示している。ヒトｃ−Ｍｅｔに対する結合のＥＣ５０値と、カニクイザルｃ−Ｍｅｔに対する結合のＥＣ５０値との比は、すべて２．５倍以内であった。
３．２ ｃ−Ｍｅｔ遮断ナノボディは、リコンビナントヒト及びカニクイザルｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃキメラに結合する
３．２．１ カニクイザルｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃの生産
肝臓組織由来のプリメイドｃＤＮＡ（BioChain Institute Inc., Cat # C1534149-CY及びZyagen, Cat # KD-314の両社から購入したもの）に対するＰＣＲによって、カニクイザル（M. fascicularis）ｃ−Ｍｅｔの配列を決定した。公的に利用可能なアカゲザル（M. mulatta）ｃ−Ｍｅｔの配列（ＮＣＢＩ ｒｅｆ ＮＭ＿００１１６８６２９．１）に基づいて、プライマーを設計した。配列産物をアカゲザルの配列とアライメントすることにより、アミノ酸レベルで偏差がないことが明らかになった。
ｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン及びＦｃ部分に挟まれたＸａ因子切断部位、及びＣ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号４）を含むヒトＦｃ（ＩｇＧ１サブタイプ）に、カニクイザルｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（成熟タンパク質のＥ２５からＴ９３２まで）を融合した。ｉｎ−ｈｏｕｓｅで構築したエピソーム複製哺乳動物発現ベクターに３点ライゲーションすることによって、両フラグメントをクローニングした。４mMのグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び０．２５mg/mLのジェネテシンを補充したPro293a培地（Lonza, Cat # 12-764Q）で、エプスタイン・バー核抗原（HEK293-EBNA; LGC Standards, UK）を含有するヒト胎児腎臓細胞を成長させた。製造業者の説明書にしたがってFuGene HDトランスフェクション試薬（Roche, Cat # 04 709 713 001）及びPro293a培地を使用して、カニクイザルｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃを発現するプラスミドでＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションした。加湿ＣＯ２インキュベーター（Binder, Cat # 9140-0012 CB150）中、３７℃でインキュベーションしながら、馴化培地を２〜３日毎に５回回収した。培地を遠心分離し、0.22μm Express PLUS membrane (Millipore)を備えるStericup systemでろ過し、POROS MabCaptureA matrix column (Applied Biosystems, Cat # 4374730)で上清を精製し、５０mMのクエン酸Ｎａ３（ｐＨ３．０）で溶出させ、０．２×容量の１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で直ぐに中和した。Ｄ−ＰＢＳで連続希釈することによってこのタンパク質溶液をＤ−ＰＢＳに緩衝液交換し、膜ろ過濃縮装置（Vivaspin2, 50,000 MWCO, Sartorius Stedium Cat # VS2031）を使用して濃縮した。
３．２．２ 競合ＥＬＩＳＡによる交差反応性試験
カニクイザルｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対する抗ｃ−Ｍｅｔナノボディの結合を競合ＥＬＩＳＡで試験した。
ヒトリコンビナントｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（R&D Systems）を濃度２μg/mLでMaxisorp plate上にコーティングした。一定濃度０．１７nMのナノボディ（コーティングしたヒトリコンビナントｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するＥＣ５０濃度（結合ＥＬＩＳＡで決定した場合のもの）に対応する）を、可溶性ヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃの連続希釈物（１２０倍モル過剰から開始）、カニクイザルｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃの連続希釈物（１２０倍モル過剰から開始）又はヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃ（コントロールとして）と共に室温で１時間プレインキュベーションしてから、ｃ−Ｍｅｔ／ＦｃをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートにそれらを追加した。マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich）及びＨＲＰコンジュゲーションウサギ抗マウスＩｇＧ（Dako）を使用して、固定化したヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するナノボディの結合を検出した。TMB One solution (Promega)を使用して、検出を行った。２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０nmで決定し、６２０nmで補正した。
直接コーティングしたヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するナノボディの結合はヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃによって阻害されたが、ＣＴＬＡ−４／Ｆｃによっては阻害されなかった。選択したナノボディリードすべてについて、結合は、外因的に追加したカニクイザルｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃによって同様に阻害されたが、これは、親和性がヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃと同程度であることを示している。
さらなる実験では、同じ競合ＥＬＩＳＡ設定を使用して、マウスｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（R&D Systems）及びイヌｃ−Ｍｅｔ（R&D Systems）に対する種交差反応性も試験した。先と同様に、一定濃度０．１７nMのナノボディを、連続濃度のマウスｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（１２０倍モル過剰）、又はイヌデコイｃ−Ｍｅｔ（２４０倍モル過剰）と共に室温で１時間プレインキュベーションした。ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）、０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９）及び０６Ｆ１０−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号１０）についてのみ、非常に高濃度のマウスｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃで、又は（さらにより少ない程度だが）イヌｃ−Ｍｅｔで、いくらかの阻害を観察することができた。ヒトｃ−Ｍｅｔとマウス又はイヌｃ−Ｍｅｔとの間で定量比較を行うことはできないが、マウス及びイヌｃ−Ｍｅｔとの交差反応性が非常に低いことは明らかである。
３．３ ｃ−Ｍｅｔ遮断ナノボディは、ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメインに結合する
３．３．１ リコンビナントヒトＳＥＭＡ／Ｆｃの生産
ナノボディのサブドメイン結合を決定するために、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ、並びにＳＥＭＡ及びＦｃ（配列番号１００）に挟まれたＸａ因子切断部位を含むヒトＦｃ（ＩｇＧ１サブタイプ）に、ＳＥＭＡドメイン（成熟タンパク質のＥ２５からＧ５１９まで；Ｕｎｉｐｒｏｔ ｒｅｆ Ｐ０８５８１（ＭＥＴ＿ＨＵＭＡＮ））を融合した。エクステンションＰＣＲによってこのキメラを作製し、ｉｎ−ｈｏｕｓｅで構築したエピソーム複製哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。
ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション、並びにリコンビナントタンパク質の生産及び精製は、３．２．１に記載したように行った。
３．３．２ 競合ＥＬＩＳＡによるエピトープマッピング
細胞外ＳＥＭＡサブドメインに対する抗ｃ−Ｍｅｔナノボディの結合を競合ＥＬＩＳＡで試験した。
ヒトリコンビナントｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（R&D Systems）を濃度２μg/mLでMaxisorp plate上にコーティングした。一定濃度０．１７nMのｃ−Ｍｅｔナノボディ（固定化したヒトリコンビナントｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するＥＣ５０濃度（結合ＥＬＩＳＡで決定した場合のもの）に対応する）を、一定濃度のヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（１２０倍モル過剰）、ヒトＳＥＭＡ／Ｆｃ（１８０倍モル過剰）又はヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃ（コントロールとして）と共に室温で１時間プレインキュベーションしてから、ｃ−Ｍｅｔ／ＦｃをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに追加した。マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich）及びＨＲＰコンジュゲーションウサギ抗マウスＩｇＧ（Dako）を用いて、プレートに固定化したヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するナノボディの結合を検出した。TMB One solution (Promega)を使用して、検出を行った。２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０nmで決定し、６２０nmで補正した。
直接コーティングしたヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するナノボディの結合はヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃによって阻害され、ＣＴＬＡ−４／Ｆｃによっては阻害されなかった。選択したナノボディリードについて、ｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対する結合は、外因的に追加したＳＥＭＡ／Ｆｃによって阻害されたが、これは、それらがｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメインに結合することを示している。
３．４ ｃ−Ｍｅｔ遮断ナノボディは、ｃ−ＭｅｔヒトホモログＲＯＮ又はプレキシンＤ１に結合しない
２つの近縁ｃ−Ｍｅｔホモログに対するタグ付（配列番号６）抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ（配列番号７〜１０）の交差反応性を競合ＥＬＩＳＡでで試験した。ＲＯＮ（ＭＳＰ−Ｒ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ７００４０．１）は、ｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインと２９％のアミノ酸配列同一性を共有し、プレキシンＤ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ１１６６６１．１）は、１６％の同一性を共有する。
ヒトリコンビナントｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ（R&D Systems）を濃度２μg/mLでMaxisorp plate上にコーティングした。一定濃度０．１７nMのｃ−Ｍｅｔナノボディ（コーティングしたヒトリコンビナントｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するＥＣ５０濃度（結合ＥＬＩＳＡで決定した場合のもの）に対応する）を、ヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃの連続希釈物（２３０倍モル過剰から開始）、ＲＯＮの連続希釈物（９９０倍モル過剰から開始）又はプレキシンＤ１の連続希釈物（４４０倍モル過剰から開始）と共に室温で１時間プレインキュベーションしてから、ｃ−Ｍｅｔ／ＦｃをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートにそれらを追加した。マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich）及びＨＲＰコンジュゲーションウサギ抗マウスＩｇＧ（Dako）を用いて、固定化したヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するナノボディの結合を検出した。TMB One solution (Promega)を使用して、検出を行った。２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０nmで決定し、６２０nmで補正した。
抗ｃ−Ｍｅｔナノボディでは、ＲＯＮ又はプレキシンＤ１に対する交差反応性は検出されなかった。
実施例４：ｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイにおけるｃ−Ｍｅｔ遮断ナノボディのアゴニスト活性
実施例１．６に概説したリン酸化アッセイで、２つの精製タグ付（配列番号６）ナノボディ（０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ−１１（配列番号７）及び０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９））のＨＧＦ依存性ｃ−Ｍｅｔ活性化能を特性決定した。抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ又は５Ｄ５モノクローナル抗体の連続希釈物（１μMから０．２３nMまで）をＡ５４９細胞に３７℃で３０分間アプライした。細胞溶解物の１／３をＭＳＤリン酸化ｃ−Ｍｅｔアッセイプレートにアプライした。複製物試料由来の溶解物をプールした。未結合の材料を洗い流した後、スルホタグ付ｃ−Ｍｅｔ検出抗体を追加し、Sector Imager 2400 (MSD)を使用してプレートを読み取った。
０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ−１１（配列番号７）及び０６Ｃ１２−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号９）はいずれも、濃度１μMに至るまでいかなるアゴニスト活性も示さなかったことが図２から分かる。対照的に、５Ｄ５ｍＡｂは、最大約３７nMでｃ−Ｍｅｔリン酸化を誘導した。予想どおり、ＨＧＦは、２nM〜６nMの最大効率でｃ−Ｍｅｔリン酸化を誘導した。
実施例５：表面プラズモン共鳴を使用する親和性決定
ProteOn (BioRad)で表面プラズモン共鳴を使用して、抗ｃ−Ｍｅｔナノボディ−Ａｌｂ１１融合構築物０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ−１１（配列番号７）の動態分析を実施した。この実験は、ProteOn PBS／Ｔｗｅｅｎ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、cat. 176-2720, BioRad）中、２５℃で実施した。約５３００RU及び２７００RUの密度で２つのリガンドレーンでアミンカップリングすることによって、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（GE Healthcare）をProteOn GLC Sensorchip (BioRad)上に固定化した。動態分析では、５０nMのリコンビナントヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃキメラ（R&D Systems）及び１５０nMのリコンビナントヒトＣＴＬＡ４／Ｆｃキメラ（R&D Systems）を、別々の２レーンに２５μl／分で３分間注入し、続いて、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ−１１（配列番号７）を４５μl／分で２分間注入た。１００nM、２５nM、６．２５nM、１．５６nM及び０．３９nMのナノボディ濃度を動態分析に使用した。３Ｍ塩化マグネシウム（キットBR-1008-39のコンポーネント、GE Healthcare）を２５μl／分で８０秒間注入することによって、表面の再構成を実施した。
ナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ−１１（配列番号７）は、１３．５pMのＫＤでｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに結合した。リコンビナントヒトＣＴＬＡ４／Ｆｃコントロールキメラに対する結合は観察されなかった。表８では、４Ｅ９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１の結合の速度定数を、親和性成熟された５Ｄ５ Ｆａｂ ｖ２の公開されている親和性と比較する。
実施例６：０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１と同様のエピトープに結合するナノボディの同定
０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１と同様のエピトープに結合するナノボディのレパートリを増やすために、新たな選択セットを実施した。
実施例１．３に記載したように、ラマ４５０、４５１及び４５２から得られたファージライブラリを、細胞（カニクイザルｃ−Ｍｅｔを過剰発現するＡ５４９細胞及びＢＡＦ３細胞）での２回の選択ラウンドに使用したが、結合したファージの溶出は、トリプシンに代えて１μMの０４Ｅ０９ナノボディ（配列番号２６）を用いて実施した点を改変した。０４Ｅ０９エピトープに結合するファージが、ｃ−Ｍｅｔ抗原上の他の（オーバーラップしていない）エピトープに結合するファージよりも特異的に濃縮されるように、この溶出方法を設計した。
この選択からのアウトプットをE. coli TG1細胞でレスキューした。コロニーを剥がし、９６ディープウェルプレート（容量１mL）で成長させた。ＩＰＴＧを追加することによって、ナノボディ産生を誘導した。ナノボディは、Ｃ末端にｃ−ｍｙｃ及びＨｉｓ６を含有していた。標準的な方法にしたがって、ペリプラズム抽出物（容量：約１００μl）を調製した。
これらのナノボディがｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するナノボディ０４Ｅ０９の結合を阻害するかを決定するために、ペリプラズム抽出物をアルファスクリーンアッセイでスクリーニングした。このアッセイは、基本的には実施例１．５に記載したように実施したが、ビオチン化ＨＧＦをビオチン化０４Ｅ０９ナノボディ（ｉｎ−ｈｏｕｓｅで生産、精製及びビオチン化したもの）に替えた。
ヒトｃ−Ｍｅｔに対するナノボディ０４Ｅ０９の結合を阻害する３６３個のクローンを同定した。配列決定した後、これらのクローンを２６種の異なるファミリーにクラスタ化することができたところ、これらのうちの１４種は、これまでに同定されていないものであった。したがって、トリプシン又は０４Ｅ０９のいずれかを溶出に使用して、ｃ−Ｍｅｔに結合するファミリーを合計６０種同定した。
ｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するＨＧＦの結合を阻害する能力についても、３６３個のクローンをアルファスクリーンアッセイ（実施例１．５を参照のこと）でスクリーニングした。このスクリーニングにより、ナノボディ０４Ｅ０９のものと同様のエピトープに結合するナノボディはすべて、ｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するＨＧＦの結合も阻害することができることが確認された。
０４Ｅ０９のエピトープに結合する２６種のナノボディファミリーのうち、２５種（９６％）は、ＶＨＨ１生殖系列由来であった。トリプシンによる溶出を使用して同定した３４種のファミリーであって、０４Ｅ０９とオーバーラップしているエピトープに結合すると判明しなかったファミリーのうち、ＶＨＨ１型のものはわずか３種（９％）であった。これは、ナノボディ０４Ｅ０９によって標的とされるエピトープ領域に対する結合が、ＶＨＨ１型ナノボディ又はＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインに特に適していることを示している。
実施例７：様々な０４Ｅ０９変異体の評価
Ｌｅｕ４９をあまり大きくないＳｅｒ残基で置換したナノボディ０４Ｅ０９の突然変異体を構築した（Ｌ４９Ｓ、配列番号２３）。加えて、効力に対するＶＨＨ１特異的ジスルフィド架橋（Ｃ５０Ｓ／Ｃ１００ｂＧ、配列番号２４）及び通常のジスルフィド架橋（Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ、配列番号２５）の重要性を調べるために、クローン０４Ｅ０９の変異体を２つ構築した。実施例１．７に記載したように、配列番号２３〜２５のナノボディを生産した。
７．１ 競合ＦＡＣＳ
配列番号２３〜２５のタグ付（配列番号６）抗ｃ−Ｍｅｔナノボディの連続希釈物（１μMから０．５pMまで）を０．５nMビオチン化ＨＧＦと混合し、カニクイザルｃ−Ｍｅｔで安定トランスフェクションした２×１０５個のＢＡＦ３細胞（実施例３．１を参照のこと）と共に４℃で２時間インキュベーションした。広範囲に細胞を洗浄した後、細胞表面で発現しているｃ−Ｍｅｔに結合したビオチン化ＨＧＦをストレプトアビジン−ＰＥによって検出した。先の実施例に記載したように、FACSarrayフローサイトメーターで細胞を分析した。
配列番号２３及び配列番号２５は、親ナノボディ配列番号７（＝０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１）と類似のＩＣ５０を有していた。これは、Kabat位置Ｌｅｕ４９のＳｅｒへの突然変異（Ｌ４９Ｓ、配列番号２３）又はKabat位置Ｃｙｓ２２のＡｌａへの突然変異及びKabat位置Ｃｙｓ９２のＳｅｒへの突然変異（Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ、配列番号２５）が、リガンド結合遮断効力に影響を及ぼさなかったことを示している。しかしながら、Kabat位置Ｃｙｓ５０のＳｅｒへの突然変異及びKabat位置Ｃｙｓ１００ｂのＧｌｙへの突然変異（配列番号２４）は、効力を約３５倍減少させる。
７．２ リン酸化アッセイ
実施例１．６に概説したＨＧＦ依存性リン酸化アッセイで、配列番号２３〜２５の精製タグ付（配列番号６）抗ｃ−Ｍｅｔナノボディを特性決定した。抗ｃ−Ｍｅｔナノボディの連続希釈物（１μMから０．２３nMまで）を、Ａ５４９細胞において１nMのＨＧＦと共に３７℃で１５分間コインキュベーションした。次いで、溶解細胞物の１／３をＭＳＤリン酸化ｃ−Ｍｅｔアッセイプレートにアプライした。複製物試料由来の溶解物をプールした。未結合の材料を洗い流した後、スルホタグ付ｃ−Ｍｅｔ検出抗体を追加し、Sector Imager 2400 (MSD)を使用してプレートを読み取った。
Kabat位置Ｌｅｕ４９のＳｅｒへの突然変異（Ｌ４９Ｓ、配列番号２３）又はKabat位置Ｃｙｓ２２のＡｌａへの突然変異及びKabat位置Ｃｙｓ９２のＳｅｒへの突然変異（Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ、配列番号２５）は、ナノボディ０４Ｅ０９の効力に影響を与えなかった。Kabat位置Ｃｙｓ５０のＳｅｒへの突然変異及びKabat位置Ｃｙｓ１００ｂのＧｌｙへの突然変異（配列番号２４）は効力を減少させたが、いくらかの阻害効果がわずかに残っていた（表１０）。
７．３ 表面プラズモン共鳴を使用する０４Ｅ０９突然変異体の親和性決定
ProteOn (BioRad)で表面プラズモン共鳴を使用して、０４Ｅ０９突然変異体の０４Ｅ０９（Ｃ５０Ｓ／Ｃ１００ｂＧ、配列番号２４）及び０４Ｅ０９（Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ、配列番号２５）の動態分析を実施した。この実験は、実施例５に記載したように実施した。
リコンビナントヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対するナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）及び０４Ｅ０９（Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ、配列番号２５）の親和性（ｏｎ速度及びｏｆｆ速度）は、同程度であった。０４Ｅ０９（Ｃ５０Ｓ／Ｃ１００ｂＧ、配列番号２４）は１０倍低いｏｎ速度及びｏｆｆ速度を有していたところ、これが、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１（配列番号７）又は０４Ｅ０９（Ｃ２２Ａ／Ｃ９２Ｓ、配列番号２５）よりも有意に低い、リコンビナントヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃに対する親和性をもたらす。いずれの分析でも、コントロールのリコンビナントヒトＣＴＬＡ４／Ｆｃキメラに対する結合は示されなかった（表１１を参照のこと）。
実施例８：抗ｃ−Ｍｅｔナノボディの配列最適化
一般に、Nanobody（登録商標）の配列最適化では、ヒトＶＨ３−ＪＨ生殖系列コンセンサス配列とより同一のNanobody（登録商標）の配列を得るために、親の野生型Nanobody（登録商標）の配列を突然変異させる。フレームワーク領域の特定のアミノ酸であって、Nanobody（登録商標）とヒトＶＨ３−ＪＨ生殖系列コンセンサスとの間で異なるアミノ酸を、タンパク質の構造、活性及び安定性がインタクトに維持されるような方法で、ヒトカウンターパートに変化させる。これを調査するために、３つの異なるアッセイで、すべての配列最適化変異体を親ナノボディと比較した：（ｉ）サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）における融解温度（Ｔｍ）の決定、（ｉｉ）ＨＧＦ競合アルファスクリーンにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の分析、（ｉｉｉ）ｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の分析、及び（ｉｖ）分析的サイズ排除（ＳＥＣ）分析。
ＴＳＡアッセイでは、ナノボディを濃度０．２mg/mlに希釈し、検出用のLightcycler (Roche)を使用して、Sypro Orange（これは、タンパク質がアンフォールディングされると曝露されるＴｒｐ残基に結合する色素である）の存在下で、温度を段階的に増加させることによって、融解温度（Ｔｍ）を様々なｐＨで決定した。ＨＧＦ競合アルファスクリーンは、実施例２（２．３．１）に記載したように実施した。ｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイは、実施例２（２．４）に記載したように実施した。ＳＥＣ分析では、マルチマー又は凝集体を検出することができるように、Phenomenex matrixでナノボディを分析した。
８．１ ０４Ｅ０９の配列最適化
配列最適化のために、以下の突然変異を調査した：Ｅ１Ｄ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＧ８８Ａ。再クローニングにおいて、効力又はＴｍに影響を及ぼさない１個のさらなる突然変異を導入した：Ｑ１０８Ｌ。表１２に示されているように、３個の個々の突然変異体を作製した：
すべての構築物をE. coli発現ベクターにクローニングし、培地容量０．５Ｌ〜１．５ＬのＴＢ培地で、（実施例１．７に記載したように）３×ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ６タグ付タンパク質としてE. coliで発現させた。１mMのＩＰＴＧを追加することによって発現を誘導し、３７℃及び２５０rpmで４時間維持した。細胞をプレートし、凍結解凍することによってペリプラズム抽出物を調製し、ｄＰＢＳに再懸濁した。Histrap FF crude columns (GE healthcare)を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の出発材料として、これらの抽出物を使用した。２５０mMのイミダゾールを用いてカラムからナノボディを溶出させ、続いてｄＰＢＳで脱塩した。抗Ｈｉｓ６及び抗ＶＨＨによる検出を使用して還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、ナノボディの精製及び完全性を確認した。
表１３に要約されているように、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＱ１０８Ｌ突然変異は、効力又は熱安定性に対して明らかな影響を及ぼさなかった。Ｇ８８Ａ突然変異はＴｍの約１℃の低下をもたらしたが、効力はむしろ変化しないままであった。同様に、さらなる突然変異Ｅ１Ｄは、Ｔｍにも効力にも影響を与えなかった。
さらに、Phenomenex matrixでの分析的ＳＥＣにおけるＡ００７９００６８（配列番号１１５を参照のこと）及びＡ００７９００６９（配列番号１１６を参照のこと）の挙動は、Ａ００７９００６７（配列番号１１４を参照のこと）のものに類似していた。これらのナノボディは予想分子量で溶出し、有意な凝集は観察されなかった。Ａ００７９０１０５（配列番号１０２を参照のこと）は小さなポストピークを示したが、これは、分解度が低いことを示している可能性がある。
結論としては、Nanobody（登録商標）の配列最適化は、タンパク質の構造、活性及び安定性が野生型クローンのタンパク質の構造、活性及び安定性に対して同様に維持されたナノボディをもたらした。
実施例９：Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルにおけるナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ヒトＵ８７ＭＧ（HTB-14, American Type Culture Collection）膠芽腫腫瘍を異種移植した免疫不全マウスモデルにおいて、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１ナノボディ（配列番号７）の抗腫瘍効果を評価した。Ｕ８７ＭＧは、ｃ−Ｍｅｔ及びリガンドＨＧＦを発現する（自己分泌ループ）。腫瘍成長を誘導するために、雌性スイスヌードマウスの右脇腹に１０００万（１０７）個のＵ８７ＭＧ細胞を皮下注射した。平均腫瘍容積１９５mm3に達したら、表１４に概説されているように、マウスを無作為に３つの処置群に分け、処置を開始した。マウスを合計３週間処置した後に処置を中止し、腫瘍再発についてマウスをもう５週間さらにモニタリングした。研究期間中は、体重及び腫瘍容積（mm3）（＝（長さｘ幅２）／２）をモニタリングし、１週間に２回記録した。研究終了時に、又は腫瘍容積が２０００mm3よりも大きくなった場合にはより早期に、すべてのマウスを安楽死させた。
図５に示されているように、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１ナノボディ（図では、Ａ００７９００３５と示されている）は、ＨＧＦ依存性Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルにおいて腫瘍成長阻害を示した。この腫瘍阻害には、処置群とビヒクル群との間で有意差があることが示された（縦モード解析の腫瘍容積、ＬＳは、最終処置日における差を意味する；ｐ＜０．０００１）。腫瘍成長阻害の尺度であり、処置群対ビヒクル処置群の平均腫瘍容積比と定義されるＴ（処置）／Ｃ（コントロール）％を分析した。処置終了時（１９日目）において、Ａ００７９００３５ナノボディ及び参照化合物テモゾロマイドの％Ｔ／Ｃ比は、それぞれ７．３％及び１５．２％であった。テモゾロマイドは膠芽腫治療の基準であり、前述のＵ８７ＭＧ異種移植モデルを検証するためのポジティブコントロールとして使用した。
結論としては、ナノボディは、ＨＧＦ依存性腫瘍、特に膠芽腫の阻害において、テモゾロマイドよりも有効である。
実施例１０：ＫＰ４異種移植モデルにおけるナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
第２のＨＧＦ−及びｃ−Ｍｅｔ依存性異種移植モデル（ここでは、雌性ｎｕ／ｎｕマウスに、１０００万（１０７）個のＫＰ４膵臓腫瘍細胞（RCB1005, Riken Biosource Center Cell Bank）を皮下接種した）において、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１ナノボディ（配列番号７）のｉｎ ｖｉｖｏ有効性をさらに評価した。ＫＰ４細胞もまた、ＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔの自己分泌ループを有する。平均腫瘍容積１２５mm3に達した後、表１５に概説されているように、マウスを無作為に３つの処置群に分け、全１５日間の期間で処置を開始した。研究期間中は、体重及び腫瘍容積（mm3）（＝（長さｘ幅２）／２）をモニタリングし、１週間に３回記録した。すべてのマウスが、研究終了まで生存し続けた。
図６は、この異種移植モデルにおいて、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１ナノボディ（図では、Ａ００７９００３５と示されている）が腫瘍成長を阻害し、腫瘍退縮を引き起こすことができることを実証している。最終投与の１日後、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１及びゲムシタビン処置マウスでは、それぞれ６．３％及び２３．７％のＴ／Ｃ比が達成された。ゲムシタビンは膵臓腫瘍治療の基準であり、前述のＫＰ４異種移植モデルを検証するためのポジティブコントロールとして使用した。
結論としては、ナノボディは、ＨＧＦ依存性腫瘍、特に膵臓腫瘍の阻害において、ゲムシタビンよりも有効である。また、ナノボディは、腫瘍退縮を促進する。
実施例１１：ナノボディＡ００７９０１７１のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
実施例１０で提供した結果を考慮して、Ａ００７９０１０５に基づいて、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１ナノボディ（配列番号７）の配列最適化変異体を構築した（表１２を参照のこと）。この配列最適化変異体の名称は、Ａ００７９０１７１（Ａ００７９０１０５−９ＧＳ−Ａｌｂ１１；配列番号１１３）とした。
２つの他のＨＧＦ自己分泌異種移植研究において、配列最適化変異体Ａ００７９０１７１のｉｎ ｖｉｖｏ有効性をさらに評価した。
ヒトＨＧＦトランスジェニックＣ３Ｈ−ＳＣＩＤマウスに、ヒト非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を皮下接種する。Ａ００７９０１７１ナノボディを１０mg/kgの高用量で投与する。ガンの発症後、マウスを無作為に３つの処置群に分ける：（ｉ）ビヒクル；（ｉｉ）Ａ００７９０１７１；及び（ｉｉｉ）ポジティブコントロール。全１５日間の期間で処置を開始する。研究期間中は、体重及び腫瘍進行をモニタリングし、１週間に３回記録する。すべてのマウスが、研究終了まで生存し続けている。
Ａ００７９０１７１の有効用量を決定するために、実施例１０に詳述したように、ＫＰ４膵臓異種移植モデルにおいて、ＰＫ／ＰＤ研究を実施する。０．１〜１００mg/kgの範囲の用量で実験を開始して、有効用量を決定する。
実施例１２：多発性骨髄腫細胞株におけるＨＧＦ駆動性の増殖及び遊走に対するＡ００７９０１７１のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性
ｃ−Ｍｅｔ陽性ヒト多発性骨髄腫細胞において、ＨＧＦ誘導性の増殖及び遊走に対するＡ００７９０１７１のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を評価した。ＨＧＦ自己分泌（ＡＮＢＬ−６）及び傍分泌（ＩＮＡ−６及びＯＨ−２）多発性骨髄腫細胞株を使用して、Hov et al. (Hov et al. 2004; Clin Cancer Res 10, 6686-6694; and Hov et al., 2009; Eur J Haematology 82, 277-287)にしたがって、増殖実験を実施した。簡潔に言えば、細胞を培養し（１０％ウシ胎仔血清（ＡＮＢＬ−６及びＩＮＡ−６）又は１０％ヒト血清（ＯＨ−２）、２mmol／ＬのＬ−グルタミン及び４０μg/mlのゲンタマイシン；維持因子として２ng/mlのＩＬ−６を含むＲＰＭＩ１６４０）、９６ウェル細胞培養プレートに播種した（細胞１０．０００〜３０．０００個／ウェル）。ＩＬ−６を含まない培地で細胞を洗浄した後、細胞を、一連の用量範囲又は一定濃度のＡ００７９０１７１ナノボディ又はPHA-665752（ポジティブコントロールとして）と共に３０分間インキュベーションしてから、ＨＧＦ（２００ng/ml）を追加した（ＨＧＦ傍分泌細胞の場合のみ）。PHA-665752 (Tocris Bioscience)は、ｃ−Ｍｅｔ及び他の関連ファミリーメンバーの小分子阻害剤である。４８時間後、Matrix 96 beta counter (Packard)でβ線照射を測定するために、１ウェルあたり１マイクロＣｉのメチル−［３Ｈ］チミジンで細胞をパルスし、１８時間後に回収した。図７に示されているように、Ａ００７９０１７１（図では、抗ｃ−Ｍｅｔナノボディと示されている）で処置すると完全な増殖阻害が観察され、ＩＣ５０値は約３nMのＡ００７９０１７１であり、完全阻害は約１μMのＡ００７９０１７１であった。また、ＨＧＦ傍分泌細胞株ＩＮＡ−６では、１０nMのＡ００７９０１７１で細胞を処置すると、ＨＧＦ誘導性増殖がベースラインレベルまで特異的かつ完全に阻害されることが観察された（図８）。Ａ００７９０１７１はＨＧＦ誘導性増殖に対して特異的であり、使用した最大濃度（１μM）で非特異的阻害効果を示さなかった。ＨＧＦ傍分泌ＯＨ−２細胞株における同様の実験でも、より穏やかなＨＧＦ誘導性増殖の阻害がもたらされた（データは示さない）。
ＩＮＡ−６細胞を使用して、Holt et al. (2008; Haematologica 93, 619-622)にしたがって、遊走実験を実施した。簡潔に言えば、ＩＮＡ−６細胞をポリカーボネート膜Transwell（Corning；孔径）の上部区画に播種（４ｘ１０５個の細胞）し、１μMのＡ００７９０１７１（図では、抗ｃ−Ｍｅｔナノボディと示されている）又は２００nMのPHA-665752（小分子ｃ−Ｍｅｔ阻害剤PHA-665752）と共にインキュベーションした。３０分後、１５０ng/mLのＨＧＦ又は７５ng/mLのＳＤＦ−１α（ポジティブコントロールの遊走促進性サイトカインとして）を追加した。３７℃及び５％ＣＯ２で２２〜２４時間インキュベーションした後、Coulter Counter Z1 (Beckman Coulter, Fullerton, CA)によって、膜を通って下部区画に遊走した細胞数を決定した。図９に示されているように、Ａ００７９０１７１は、ＩＮＡ−６細胞のＨＧＦ誘導性遊走を完全に遮断した。ＩＮＡ−６細胞のＳＤＦ−１α誘導性遊走は阻害されなかったことから、この効果はＨＧＦ特異的である。
結論としては、Ａ００７９０１７１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒトＨＧＦ自己分泌及び傍分泌多発性骨髄腫細胞の増殖及び遊走を遮断することができた。
実施例１３：ＰＩ３Ｋシグナル伝達に対する二重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲナノボディの有効性の分析
ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲは、細胞分裂シグナルを変換するＰＩ３Ｋ経路を介してシグナル伝達することができる。ＡＫＴによるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔレセプターリン酸化の同時ターゲティングを実証するために、ＰＩ３Ｋ経路の下流標的をモニタリングすることができる。この目的のために、基本的には実施例１．６にしたがって、非刺激細胞、ＥＧＦ若しくはＨＧＦで処置した細胞、又は両サイトカインで処置した細胞を、非特異性親コントロール又は二重特異性ナノボディと共に同時にインキュベーションする。あるいは、ＥＧＦＲを過剰発現し、及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を活性化する自己分泌ＨＧＦループを有する細胞を評価することもできる。ＡＫＴは、ＰＩ３Ｋ経路の主な下流シグナル伝達コンポーネントであり、このタンパク質のリン酸化は、この経路を介したシグナル伝達の重要な指標である。
実施例１４：ＭＡＰＫシグナル伝達に対する二重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲナノボディの有効性の分析
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔレセプターは、ＭＡＰＫ経路を介してシグナル伝達することができる。ＥＲＫ１／２によるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔレセプターリン酸化のターゲティングを実証するために、ＭＡＰＫ経路の主な下流標的をモニタリングすることができる。この目的のために、基本的には実施例１．６にしたがって、非刺激細胞、ＥＧＦ若しくはＨＧＦで処置した細胞、又は両サイトカインで処置した細胞を、非特異性、単一特異性又は二重特異性ナノボディと共に同時にインキュベーションする。あるいは、ＥＧＦＲを過剰発現し、及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を活性化する自己分泌ＨＧＦループを有する細胞を評価することもできる。
実施例１５：増殖阻害に対する二重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲナノボディの有効性の分析
他の研究で独立して確認されたように、Ａ４３１細胞は、細胞表面で高レベルのＥＧＦＲ及び細胞表面で中高発現のｃ−Ｍｅｔをディスプレイする。
二重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲナノボディによるＡ４３１増殖の阻害は、４８時間後のCellTiterGlow（商標）アッセイで、又は基本的には実施例２．６に記載したように測定することができる。
実施例１６：二重特異性ナノボディによる処置後の細胞遊走のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析。
活性ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達は、細胞の遊走及び浸潤に関与する。ＨＧＦ誘導性遊走の阻害を測定することによって、二重特異性ナノボディの有効性を決定することができる。この目的のために、基本的には実施例２．６に記載したように、二重特異性ナノボディ、ｃ−Ｍｅｔに対する単一特異性ナノボディ及びＥＧＦＲ阻害剤の存在下又は非存在下で、ＨＧＦ誘導性細胞株Ａ５４９をＨＧＦで処置する。あるいは、リードアウトとしてＣＩＭプレートを使用してAcea Real Time analyzerで、細胞が８μmの細孔を通って遊走するのを時間依存的に測定する。
実施例１７：ＫＰ４膵臓異種移植腫瘍モデルにおける二重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＶＥＧＦナノボディの有効性の分析。
ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen）、２mMのＬ−グルタミン、及び１０％ウシ胎仔血清からなる成長培地で、ＫＰ４細胞を培養する。マウス導入用の細胞を調製するために、細胞をトリプシン処理し、続いて、１０ミリリットルの滅菌ＩＸリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。トリパンブルー排除によって細胞のサブセットをカウントし、残りの細胞を１００μlの滅菌ＩＸＰＢＳに再懸濁して、１ミリリットルあたり細胞５ｘ１０７個の濃度にする。マウスの右肩甲下部に５ｘ１０６個のＫＰ４細胞を皮下接種する。腫瘍が平均容積２３０mmに達するまでそれらをモニタリングする。
マウスを無作為に５群（それぞれマウス１０匹）に分け、処置を開始する。第１群のマウスを単一特異性ｃ−Ｍｅｔナノボディで処置する。第２群のマウスを単一特異性ＶＥＧＦナノボディで処置する。第３群のマウスを二重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＶＥＧＦナノボディで処置する。第４群のマウスを単一特異性ＶＥＧＦナノボディ及び単一特異性ｃ−Ｍｅｔナノボディで処置する。第５群のマウスをネガティブコントロール（無関係なナノボディ）で処置する。腫瘍容積を１週間に２回測定し、動物を２５日間モニタリングする。
実施例１８：ＮＳＣＬＣ異種移植腫瘍モデルにおける二重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＶＥＧＦナノボディの有効性の分析。
ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen）、２mMのＬ−グルタミン、及び１０％ウシ胎仔血清からなる成長培地で、ヒトＮＳＣＬＣ細胞（A549, DSMZ, Braunschweig, Germany）培養する。マウス導入用の細胞を調製するために、細胞をトリプシン処理し、続いて、１０ミリリットルの滅菌ＩＸリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。トリパンブルー排除によって細胞のサブセットをカウントし、残りの細胞を１００μlの滅菌ＩＸＰＢＳに再懸濁して、１ミリリットルあたり細胞５ｘ１０７個の濃度にする。マウスの右肩甲下部に５ｘ１０６個のヒトＡ５４９細胞を皮下接種する。腫瘍が平均容積２００mmに達するまでそれらをモニタリングする。
マウスを無作為に５群（それぞれマウス１０匹）に分け、処置を開始する。第１群のマウスを単一特異性ｃ−Ｍｅｔナノボディで処置する。第２群のマウスを単一特異性ＶＥＧＦナノボディで処置する。第３群のマウスを二重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＶＥＧＦナノボディで処置する。第４群のマウスを単一特異性ＶＥＧＦナノボディ及び単一特異性ｃ−Ｍｅｔナノボディで処置する。第５群のマウスをネガティブコントロール（無関係なナノボディ）で処置する。腫瘍容積を１週間に２回測定し、動物を２５日間モニタリングする。
実施例１９：ＮＳＣＬＣ異種移植腫瘍モデルにおける三重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＶＥＧＦ／ＥＧＦＲナノボディの有効性の分析。
ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen）、２mMのＬ−グルタミン、及び１０％ウシ胎仔血清からなる成長培地で、ヒトＮＳＣＬＣ細胞（A549, DSMZ, Braunschweig, Germany）培養する。マウス導入用の細胞を調製するために、細胞をトリプシン処理し、続いて、１０ミリリットルの滅菌ＩＸリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。トリパンブルー排除によって細胞のサブセットをカウントし、残りの細胞を１００μlの滅菌ＩＸＰＢＳに再懸濁して、１ミリリットルあたり細胞５ｘ１０７個の濃度にする。マウスの右肩甲下部に５ｘ１０６個のヒトＡ５４９細胞を皮下接種する。腫瘍が平均容積２００mmに達するまでそれらをモニタリングする。
マウスを無作為に６群（それぞれマウス１０匹）に分け、処置を開始する。第１群のマウスを単一特異性ｃ−Ｍｅｔナノボディで処置する。第２群のマウスを単一特異性ＶＥＧＦナノボディで処置する。第３群のマウスを単一特異性ＥＧＦＲナノボディで処置する。第４群のマウスを単一特異性ＶＥＧＦナノボディ、単一特異性ＥＧＦＲナノボディ及び単一特異性ｃ−Ｍｅｔナノボディで処置する。第５群のマウスを三重特異性ｃ−Ｍｅｔ／ＶＥＧＦ／ＥＧＦＲナノボディで処置する。第６群のマウスをネガティブコントロール（無関係なナノボディ）で処置する。腫瘍容積を１週間に２回測定し、動物を２５日間モニタリングする。
実施例２０：選択したＶＨＨの親和性成熟
２０．１ ３３Ｈ１０を２サイクルの親和性成熟に供する。
１回目のサイクルでは、エラープローンＰＣＲ法を使用して、フレームワーク（ＦＷ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）の両方に、アミノ酸置換を無作為に導入した。１ngの３３Ｈ１０ ｃＤＮＡ鋳型を使用する２ラウンドＰＣＲベースアプローチ（Stratagene, La Jolla, CA, USAから入手したGenemorph II Random Mutagenesis kit）、続いて、ラウンド１の産物０．１ngを使用する２回目のエラープローンＰＣＲで、突然変異誘発を実施した。ポリッシュ工程の後、ＶＨＨライブラリのファージディスプレイを容易にするように設計されたベクターに、固有の制限部位を介してＰＣＲ産物を挿入した。漸減濃度のビオチン化リコンビナントカニクイザルｃＭｅｔ（ｂｉｏｔ−ｒｃｙｃＭｅｔ）及びトリプシンによる溶出を使用して、連続ラウンドのｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ選択を実施した。３回目及び４回目のラウンドでは、コールドカニクイザルｃＭｅｔ（ｒｃｙｃＭｅｔ）（ビオチン化ｃＭｅｔ（ｂｉｏｔ−ｒｃｙｃＭｅｔ）よりも少なくとも１００倍過剰）を使用して、親和性駆動型の選択も実施した。ＬａｃＺプロモーター、アンピシリン耐性遺伝子、マルチクローニング部位及びｏｍｐＡリーダー配列を含有するｐＵＣ１９由来の発現ベクター（ｐＡＸ５０）を使用して、個々の突然変異体をリコンビナントタンパク質として生産した。発現ベクターライブラリでE. coli TG1細胞をトランスフォーメーションし、寒天プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ＋２％グルコース）上にプレートした。寒天プレートから単一コロニーを剥がし、１mL ９６ディープウェルプレートで成長させた。ＩＰＴＧ（１mM）を追加することによって、ＶＨＨ発現を誘導した。標準的な方法にしたがってペリプラズム抽出物（容量約８０μL）を調製し、ナノボディ競合アルファスクリーンアッセイ（２．３．１で概説した）及びProteOn (BioRad, Hercules, CA, USA)ｏｆｆ速度アッセイで、リコンビナントヒトｃＭｅｔ／Ｆｃに対する結合についてスクリーニングした。簡潔に言えば、一方の「リガンドチャネル」上では、リコンビナントヒトｃＭｅｔ／ＦｃでGLC ProteOnセンサーチップをコーティングした（別の「リガンドチャネル」を参照チャネルとする）。親和性成熟クローンのペリプラズム抽出物を１／１０希釈し、「分析物チャネル」Ａ１−Ａ６に注入した。プレートに存在する親クローンの平均ｏｆｆ速度を計算し、ｏｆｆ速度の改善を計算するために参照として用いた。
２回目のサイクルでは、１回目のサイクルで同定した感受性位置を同時に無作為化することによって、コンビナトリアルライブラリを作った。このために、無作為化位置で変性したオリゴヌクレオチド（ＮＮＳ）を使用してオーバーラップＰＣＲによって、完全長の３３Ｈ１０ ｃＤＮＡを合成し、レスキューＰＣＲを実施した。上記特異的制限部位を使用して、無作為化ＶＨＨ遺伝子をファージディスプレイベクター（ｐＡＸ２１２）に挿入した。個々のＶＨＨクローンのペリプラズム抽出物の調製は、前記のように実施した。
ＴＳＡアッセイでは、ナノボディを濃度０．２mg/mlに希釈し、検出用のLightcycler (Roche)を使用して、Sypro Orange（これは、タンパク質がアンフォールディングされると曝露されるＴｒｐ残基に結合する色素である）の存在下で、温度を段階的に増加させることによって、融解温度（Ｔｍ）を様々なｐＨで決定した。ＨＧＦ競合アルファスクリーンは、実施例２（２．３．１）に記載したように実施した。ＳＥＣ分析では、マルチマー又は凝集体を検出することができるように、Phenomenex matrixでナノボディを分析した。
実施例２１：３３Ｈ１０の配列最適化
配列最適化のために、以下の突然変異を調査した：Ｅ１Ｄ、Ａ１４Ｐ、Ｅ４３Ｋ、Ｓ７１Ｒ、Ｓ７２Ｄ、Ａ７４Ｓ、Ｎ８２ｂＳ、及びＱ１０８Ｌ。表１６に記載されているように、１６個の個々の突然変異体を作製した（配列番号１１７〜１３２）。
すべての構築物をE. coli発現ベクターにクローニングし、培地容量０．５Ｌ〜１．５ＬのＴＢ培地で、３×ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ６タグ付タンパク質としてE. coliで発現させた。１mMのＩＰＴＧを追加することによって発現を誘導し、３７℃及び２５０rpmで４時間維持した。細胞をプレートし、凍結解凍することによってペリプラズム抽出物を調製し、ｄＰＢＳに再懸濁した。Histrap FF crude columns (GE healthcare)を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の出発材料として、これらの抽出物を使用した。２５０mMのイミダゾールを用いてカラムからナノボディを溶出させ、続いてＤ−ＰＢＳで脱塩した。抗Ｈｉｓ６及び抗ＶＨＨによる検出を使用して還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、ナノボディの精製及び完全性を確認した。
３つの異なるアッセイで、精製ナノボディを試験した：（ｉ）サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）における融解温度（Ｔｍ）の決定、（ｉｉ）ＨＧＦ競合アルファスクリーンにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の分析、及び（ｉｉｉ）分析的サイズ排除（ＳＥＣ）分析。
ＴＳＡアッセイでは、ナノボディを濃度０．２mg/mlに希釈し、検出用のLightcycler (Roche)を使用して、Sypro Orange（これは、タンパク質がアンフォールディングされると曝露されるＴｒｐ残基に結合する色素である）の存在下で、温度を段階的に増加させることによって、融解温度（Ｔｍ）を様々なｐＨで決定した。ＨＧＦ競合アルファスクリーンは、実施例２（２．３．１）に記載したように実施した。ＳＥＣ分析では、マルチマー又は凝集体を検出することができるように、Phenomenex matrixでナノボディを分析した。
表１７に要約されているように、Ｓ７１Ｒ突然変異は効力に対して悪影響を及ぼしたので、最終的な配列最適化クローンから排除する；Ｔｍは、わずかに約０．５℃増加した。Ｅ４３Ｋ突然変異は、効力に対してわずかに悪影響を及ぼした；Ｔｍは、３〜４℃増加したが、これは、クローンの安定性の増加を示している；この突然変異は、親和性成熟突然変異と組み合わせて再試験する。すべての他の突然変異は効力に影響を与えなかったので、配列最適化に含める。
さらに、Phenomenex matrixでの分析的ＳＥＣにおけるクローンＡ００７９００７３８〜Ａ００７９００７５３の移動度は、親クローンＡ００７９００１８４のものと同様であった。これらのナノボディは予想分子量で溶出し、有意な凝集は観察されなかった。
結論としては、Nanobody（登録商標）の配列最適化は、タンパク質の構造、活性及び安定性が野生型クローンのタンパク質の構造、活性及び安定性に対して同様に維持されたナノボディをもたらした。
実施例２２：配列最適化及び親和性成熟突然変異の組み合わせ
表１８に要約されているように、実施例２０及び２１で同定した突然変異を、９個の個々のクローンのセットで組み合わせた。
構築物Ａ００７９０１２４５〜Ａ００７９０１２５３（配列番号１３３〜１４１）をE. coli発現ベクターにクローニングし、培地容量０．５Ｌ〜１．５ＬのＴＢ培地で、３×ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ６タグ付タンパク質としてE. coliで発現させた。１mMのＩＰＴＧを追加することによって発現を誘導し、３７℃及び２５０rpmで４時間維持した。細胞をプレートし、凍結解凍することによってペリプラズム抽出物を調製し、ｄＰＢＳに再懸濁した。Histrap FF crude columns (GE healthcare)を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の出発材料として、これらの抽出物を使用した。２５０mMのイミダゾールを用いてカラムからナノボディを溶出させ、続いてＤ−ＰＢＳで脱塩した。抗Ｈｉｓ６及び抗ＶＨＨによる検出を使用して還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、ナノボディの精製及び完全性を確認した。
３つの異なるアッセイで、精製ナノボディを試験した：（ｉ）サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）における融解温度（Ｔｍ）の決定、（ｉｉ）ＨＧＦ競合アルファスクリーンにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の分析、（ｉｉｉ）細胞ベースのｃＭｅｔリン酸化アッセイ、（ｉｖ）細胞ベースの増殖アッセイ、及び（ｖ）分析的サイズ排除（ＳＥＣ）分析。
ＴＳＡアッセイは、上に概説したように実施した。ＨＧＦ競合アルファスクリーンは、実施例２（２．３．１）に記載したように実施した。細胞ベースのｃＭｅｔリン酸化アッセイは、実施例１．６に概説したように実施した。細胞ベースの増殖アッセイは、実施例２．５に概説したように実施した。ＳＥＣ分析では、マルチマー又は凝集体を検出することができるように、Phenomenex matrixでナノボディを分析した。
サブ選択のナノボディをそれらのＣ末端において、９ＧＳリンカーで隔てて抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ナノボディ（ＡＬＢ１１）に融合した。構築物は、さらなるＣ末端アラニン残基を有していた。
ナノボディを培地容量５mLでP. pastorisにおいて発現させた。メタノールを追加することによってナノボディの発現を誘導し、３０℃で４８時間維持した。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（MabCap A POROS, Applied Biosystems）による精製の出発材料として、上澄みを使用した。
サーマルシフトアッセイ、分析的サイズ及びＨＧＦ競合アルファスクリーンで、ナノボディを試験した；ビオチン化ＨＧＦの濃度を０．１nMから０．４nMに増加させ、ｃＭｅｔ／Ｆｃの濃度を０．１nMから０．０１６nMに減少させることによって、後者を（最初に記載した設定と比較して）より高感度に改変した（表２０を参照のこと）。
Phenomenex matrixでの分析的ＳＥＣにおけるクローンＡ００７９０１２５５〜Ａ００７９０１２６０の移動度は同様であった：これらのナノボディは予想分子量で溶出し、有意な凝集は観察されなかった。
実施例２３：ＫＰ４異種移植モデルにおけるナノボディ０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１に対する可溶性ｃ−Ｍｅｔの反応
ＨＧＦ−及びｃ−Ｍｅｔ依存性異種移植モデル（ここでは、雌性ｎｕ／ｎｕマウスに、１０００万（１０７）個のＫＰ４膵臓腫瘍細胞（RCB1005, Riken Biosource Center Cell Bank）を皮下接種した）において、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１ナノボディ（クローンＡ００７９００３５、配列番号７）による処置に対する可溶性ｃ−Ｍｅｔの反応をさらに評価した。ＫＰ４細胞もまた、ＨＧＦ及びｃ−Ｍｅｔの自己分泌ループを有する。平均腫瘍容積１２５mm3に達した後、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１ナノボディ（１０mg/kg、腹腔内（ｉ．ｐ．）、１日２回を３日間（Ｑ２Ｄｘ３））又はビヒクル（ＰＢＳ、１０ml/kg、腹腔内（ｉ．ｐ．））でマウスを無作為に処置した。マウスを１５日間処置した。最終投与の２４時間後（すなわち、腫瘍移植後２２日目）に、血液採取のために、Ａ００７９００３５又はビヒクルで処置したマウスすべてを、二酸化炭素への過剰曝露により安楽死させた。末端心穿刺によって、全血を採取した。血液及びＥＤＴＡを完全に混合するために、EDTA Microtainer（登録商標）チューブを数回反転させた。次いで、試料を４℃で５分間遠心分離（９３００rcf)して血漿を作った。血漿を取り出し、ラベルした微小遠心管に入れた。すべての血漿試料を凍結し、分析まで−８０℃で保存した。目的に合った市販のＥＬＩＳＡキット（R&D systems）を使用して、可溶性ｃ−Ｍｅｔレベルについて、試料を分析した。各動物の可溶性ｃ−Ｍｅｔレベル、及び両処置群についての平均±平均の標準誤差を示す。
図１０に示されているように、０４Ｅ０９−９ＧＳ−Ａｌｂ１１ナノボディで処置したマウス（０．５０７ng/ml）では、平均可溶性ｃ−Ｍｅｔレベルは、ビヒクルで処置したマウス（５．３４８ng/ml）と比較して大きく減少していた。
要約すると、ナノボディは、平均可溶性ｃ−Ｍｅｔレベルを減少させるのに有効である。さらに、試料中に存在する可溶性ｃ−Ｍｅｔの量は、全体的な腫瘍量の明確な指標を提供するものであり、疾患状態をモニタリングするためにこのバイオマーカーを使用すること、及び投与療法の有効性を強調していると結論付けることができる。
実施例２４：Ａ００７９０１７１は、ＩＮＡ−６多発性骨髄腫細胞株において、ＨＧＦ媒介性のｃ−Ｍｅｔリン酸化並びにＭＡＰＫ及びＡｋｔの下流シグナルを遮断する
ＨＧＦがそのレセプターｃ−Ｍｅｔを介して媒介するシグナル伝達を抗ｃ−ＭｅｔナノボディＡ００７９０１７１が阻害する能力を研究するために、ＨＧＦ誘導性ＩＮＡ−６多発性骨髄腫細胞株において、ｃ−Ｍｅｔ上のｃ−ＭｅｔチロシンエピトープＴｙｒ１２３４／１２３５、Ｔｙｒ１３４６及びＴｙｒ１００３のリン酸化レベルを調査した。また、下流タンパク質ｐ４４／４２ＭＡＲＫ及びＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化を評価した。平行して、全ｃ−ＭＥＴ、全Ａｋｔ及びＧＡＤＰＨのレベルを決定した。ｃ−Ｍｅｔチロシンキナーゼ阻害剤PHA-665752（２００nM）をポジティブコントロールとして使用した（Hov et al. .2004; Clin Cancer Res 10, 6686-6694）。簡潔に言えば、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）で４回洗浄することによって、ヒト血清及びＩＬ−６についてＩＮＡ−６細胞を枯渇させ、続いて無血清環境で３時間飢餓させ、２４ウェルプレートに播種した（０，１％ＢＳＡを含む１０００μLのＲＰＭＩに１，０ｘ１０６個の細胞）。細胞をＡ００７９０１７１（ｃ−Ｍｅｔ Ｔｙｒリン酸化実験では０．１、０．２５、０．５、１及び１．５及び５０nM；ＭＡＲＫ及びＡｋｔリン酸化実験では０．５、１及び１nM）又はPHA-665752（２００nM）と共にプレインキュベーションし、続いて、１５０〜２００ng/mLのＨＧＦで又はこれを加えずに５〜７分間処置した。回収してペレット化した後、細胞を溶解緩衝液（１％ＮＰ４０、１５０mmol／ＬのＮａＣｌ、５０mmol／ＬのＴｒｉｓＨＣｌ ７，５、１０％グリセロール、１mmol／ＬのＮａＦ、２mmol／ＬのＮａ３ＶＯ４及びプロテアーゼ−ホスファターゼ阻害剤の混合物（Complete mini tablets, Roche, Basel, Switzerland））に再懸濁した。氷上で３０分後、１２，０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、核をペレット化した。１０mmol／Ｌのジチオトレイトールを含むドデシル硫酸リチウム試料緩衝液（Invitrogen, Carslbad, CA）と試料を混合し、９８℃で２分間加熱し、４〜１２％又は１０％Ｂｉｓ−ｔｒｉｓゲル（Invitrogen）上で分離した。次いで、タンパク質をiBlot（登録商標）dry blotting system (Invitrogen)のニトロセルロース膜に転写した。０，０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む５％ＢＳＡ又は５％スキムミルクのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で膜をブロッキングし、リン酸化タンパク質に対する抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲーション抗体（DAKO Cytomation, Copenhagen, Denmark）及びSupersignal（登録商標）West Femto Maxiumum Sensitivity Substrate (Thermo scientific, Rockford, IL, USA)を用いて、検出を実施した。６２，５mmol／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．６）、２％ＳＤＳ、及び１０mmol／Ｌの２−メルカプトエタノールを含有するストリップ緩衝液中で穏やかに回転させながら、膜を６０℃で３０分間ストリップし、次いで、０，０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で洗浄し、０，０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む５％スキムミルク又はＢＳＡのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水でブロッキングし、非リン酸化エピトープに対する抗体でプローブした。リン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰＫ、全ｐ４４／４２、リン酸化Ａｋｔ、全Ａｋｔ、リン酸化ｃ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）、リン酸化ｃ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１３４９）及び全ｃ−Ｍｅｔに対する抗体は、Cell Signaling Technology (Beverly, MA)製であった。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１００３）を認識する抗体は、Invitrogen (Camarillo, CA)製であった。ＧＡＰＤＨに対する抗体は、Abeam (Cambridge, United Kingdom)製であった。
図１１に見られるように、Ａ００７９０１７１を追加することにより、ＩＮＡ−６細胞のＨＧＦ刺激（２００ng/ml）後に、Ｔｙｒ １３４９（Ａ）、Ｔｙｒ１２３４／１２３５（Ｂ）及びＴｙｒ１００３（Ｃ）におけるｃ−Ｍｅｔのリン酸化が用量依存的（０．１〜１nM）に減少した。ナノボディ濃度を１nMよりも高くすると、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化が完全に遮断された。ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合は、ｐ４４／４２ＭＡＰＫ及びＡｋｔのリン酸化を媒介することが公知である。図１２に示されているように、Ａ００７９０１７１は、ＨＧＦ（１５０ng/ml）媒介性のｐ４４／４２ＭＡＰＫ（図１２Ａ）及びＡｋｔ（図１２Ｂ）リン酸化を遮断することができた。結論としては、Ａ００７９０１７１は、ｃ−Ｍｅｔのチロシン残基Ｔｙｒ１３４９、Ｔｙｒ１２３４／１２３５及びＴｙｒ１００３のリン酸化、並びに下流タンパク質ｐ４４／４２ＭＡＰＫ及びＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化を遮断する。
実施例２５：抗ｃ−ＭｅｔナノボディＡ００７９０１７１は、フィブロネクチンに対するヒト骨髄腫細胞株ＩＮＡ−６のＨＧＦ媒介性接着を遮断する
骨髄における多発性骨髄腫細胞の接着は、骨髄腫細胞の成長及び生存に重要である。骨髄マトリックスタンパク質に対する骨髄腫細胞の接着は、薬物耐性を促進することが示されている（Daiton WS, Cancer Treat Rev 2003; 29 Suppl 1:11-9.）。ＨＧＦは、フィブロネクチンに対する骨髄腫細胞の接着を刺激することが過去に示された（Holt RU et al., 2005, Haematologica, 90(4):479-88）。本目的は、フィブロネクチンに対するＩＮＡ−６細胞のＨＧＦ媒介性接着に対するＡ００７９０１７１の効果が何であるかを調査することであった。簡潔に言えば、ヒト血漿フィブロネクチン（２０μg/mLのＰＢＳ溶液、８０μL／ウェル）を用いて、９６ウェル丸底マイクロプレート（Sarstedt, Newston, NC）を４℃で一晩コーティングし、ＢＳＡ（１mg/mL、１００μL／ウェル）を用いて室温で１時間ブロッキングし、最後にＨＢＳＳで３回洗浄した。ＩＮＡ−６細胞をＨＢＳＳで３回洗浄し、０，１％ＢＳＡを含む５mLのＲＰＭＩに再懸濁し、時々撹拌しながら１μg/mLのアセトキシメチルエステル−２’，７ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（及び６）−カルボキシフルオセイン（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）（蛍光色素）と共に３７℃で１時間インキュベーションした。ＨＢＳＳで３回洗浄した後、３〜５ｘ１０４個の細胞（細胞アベイラビリティに応じて）を１ウェルあたり総容量１００μLで播種し、５％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベーションした。細胞をＢＳＡ（コントロールとして）又はＨＧＦ（１５０ng/ml）若しくはＳＤＦ−１α（７５ng/ml）（ポジティブコントロールの遊走促進性サイトカインとして）のいずれかと共にインキュベーションした。ｃ−Ｍｅｔチロシンキナーゼ阻害剤PHA-665752をポジティブコントロールとして使用した。続いて、プレートをＨＢＳＳで十分に４回洗浄して、非接着細胞を除去した。残った細胞を５０μL／ウェルの１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で可溶化した。VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA)蛍光リーダーを用いて、５３８nmの蛍光レベルを決定した。ＩＮＡ−６細胞を１００nMのＡ００７９０１７１と共にプレインキュベーションすると、フィブロネクチンに対するＨＧＦ（１５０ng/ml）誘導性接着は無効化された（図１３）。フィブロネクチンに対するＳＤＦ−１α誘導性接着は、このナノボディによって有意な影響を受けないが、これは、このナノボディの効果がｃ−Ｍｅｔ特異的であることを示唆している。結論としては、Ａ００７９０１７１は、フィブロネクチンに対するＩＮＡ−６細胞のＨＧＦ誘導性接着を遮断する。
実施例２６：Ａ００７９０１７１は、ＨＧＦの骨芽細胞形成阻害を無効化する
骨芽細胞及び破骨細胞は、骨の形成及び再吸収に関わる特別な細胞である。骨髄腫骨疾患では、骨恒常性の異常調節、破骨細胞形成の誘導、及び骨形成の阻害がある。骨特異的アルカリホスファターゼ（ｂＡＬＰ）は、骨芽細胞によって産生される。ｂＡＬＰの産生は骨形成中に多いことから、ｂＡＬＰは、全体的な骨形成活性の良い指標である（van Straalen JP et al., 1991 Clin Chim Acta; 201(1-2):27-33）。組織形態学的研究により、ｂＡＬＰと骨形成の動的パラメータとの間の有意な相関関係が示されている（Abildgaard et al,, 2000, Eur J Haematol 2000;64(2):121-9）。ＨＧＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨芽細胞形成に対する阻害効果を有することが公知である。早期の骨芽細胞分化のマーカーとして使用されることが多いｂＡＬＰ活性は、ＨＧＦの追加によって阻害される（Standal et al., 2007 Blood ;109(7):3024-30）。また、ＨＧＦは、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ石灰化に対する阻害効果を有することが公知である。ｈＭＳＣの石灰化は、Alizarin Red-S (ARS)染色によって定量及び可視化することができる。この実験では、Standal et al., 2007 (Blood ;109(7):3024-30)に記載されている手順にしたがって、ｂＡＬＰ活性及びｈＭＳＣの石灰化に対するＡ００７９０１７１の効果を評価した。
抗ｃ−ＭｅｔナノボディＡ００７９０１７１は、ＢＭＰ＿２誘導性ｂＡＬＰ活性に対するＨＧＦ（１００ng/ml）の阻害効果を用量依存的に無効化し、２０nM以上の濃度では、ｂＡＬＰ活性に対するＨＧＦの阻害効果は、完全に無効化された（図１４Ａ）。処置の２１日後に定量又は可視化したところ、Ａ００７９０１７１（５nM）は、ｈＭＳＣの石灰化に対するＨＧＦ（１００ng/ml）の阻害効果を完全に低減した（図１４Ｂ〜Ｃ）。これは、過去の知見を裏付けている。結論としては、Ａ００７９０１７１は、ＨＧＦの骨芽細胞形成阻害を無効化する。

Claims (14)

  1. アルファスクリーンアッセイにより決定される１００pM未満のＩＣ５０と、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ競合アルファスクリーンアッセイにより決定される６０％〜８０％又はそれ以上の最大ＨＧＦ置換レベルとで、ヒトｃ−Ｍｅｔ（配列番号１）からＨＧＦを置換することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、
    該免疫グロブリン単一可変ドメインが、
    式１
    ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ （１）；
    （式中、ＦＲ１〜ＦＲ４は、フレームワーク領域１〜４を指し、そして免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；そして
    ここで、
    ａ）ＣＤＲ１は配列番号５１からなり、
    ｂ）ＣＤＲ２は配列番号６７からなり、かつ
    ｃ）ＣＤＲ３は配列番号８３からなる、
    又はここで、
    ｄ）ＣＤＲ１は配列番号１６０からなり
    ｅ）ＣＤＲ２は配列番号１７０からなり、かつ
    ｆ）ＣＤＲ３は配列番号１８０からなる、
    アミノ酸配列を含む、
    免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  2. フレームワーク領域（ＦＲ）が、配列番号１０２のＦＲと９０％超の配列同一性を有する、請求項１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  3. 請求項１又は２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、
    配列番号１０２又は１８８のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、ポリペプチド。
  4. 請求項１又は２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、ヒト血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含み、該ヒト血清アルブミンと結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ａｌｂ１１（配列番号５）である、ポリペプチド。
  5. 配列番号１１３又は１４２〜１４９と９０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項４に記載のポリペプチド。
  6. ｉ）請求項１又は２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又はｉｉ）請求項３〜５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、核酸。
  7. ｉ）請求項１又は２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又はｉｉ）請求項３〜５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
  8. 薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. ガンにおける使用のための、請求項１又は２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又はｉｉ）請求項３〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
  10. 請求項１又は２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又はｉｉ）請求項３〜５のいずれかに記載のポリペプチドを生産するための方法であって、該方法が、
    適切な宿主細胞若しくは宿主生物又は別の適切な発現系で、請求項６に記載の核酸を発現させる工程を少なくとも含む、方法。
  11. 前記免疫グロブリン単一可変ドメイン又は前記ポリペプチドを単離及び／又は精製する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 請求項７又は８に記載の医薬組成物であって、該医薬組成物を必要とする被験体に投与することにより、少なくとも１つのｃ−Ｍｅｔに関連する疾患又は障害を処置するための医薬組成物。
  13. ｃ−Ｍｅｔに関連する疾患又は障害に罹患している患者の治療に対する反応性を評価するためのキットであって、ｉ）請求項１又は２のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン；ｉｉ）請求項３〜５のいずれかに記載のポリペプチド；又はｉｉｉ）請求項７〜９に記載の医薬組成物を含む、キット。
  14. 患者の反応性が、
    ａ）治療前に前記患者から第１の試料を提供し、前記第１の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程、
    ｂ）治療開始後に前記患者から第２の試料を提供し、前記第２の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を測定する工程、及び
    ｃ）第１の試料中に存在する可溶性ｃ−Ｍｅｔの量を、第２の試料中に見られる可溶性ｃ−Ｍｅｔの量と比較する工程
    の工程によって評価され；ここで
    第２の試料中に見られる可溶性ｃ−Ｍｅｔの量が第１の試料中の可溶性ｃ−Ｍｅｔの量と比較して減少していることが、患者が前記治療に対して反応性であることを示す、請求項１３に記載のキット。
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