CN110964107B

CN110964107B - Met结合分子、其组合和用途

Info

Publication number: CN110964107B
Application number: CN201910929834.3A
Authority: CN
Inventors: 徐霆; 汪皛皛; 金宇灏; 王玲
Original assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd
Current assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2019-09-29
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2039-09-29
Also published as: CN110964107A

Abstract

本发明涉及医药生物领域，公开了MET结合分子、其组合和用途。本发明公开了特异性结合MET的重链单域抗体及其组合在治疗和/或预防异常MET表达相关疾病例如癌症中的用途。

Description

MET结合分子、其组合和用途

技术领域

发明背景

受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)经常以异常方式表达并在许多类型的人类癌症中组成型激活，这使得它们在过去几十年中成为癌症治疗的最重要靶标。已经开发许多针对RTK的激酶中心或配体介导的激活的药物，包含单克隆抗体和化学抑制剂。然而，结果并不十分乐观。越来越多的证据显示RTK对肿瘤发生和扩散具有不依赖激酶的致癌作用，这表明当前基于激酶抑制的策略效力低。因此，理想的RTK-靶向癌症治疗应该能够消耗RTK靶标，而不是仅仅阻断它。

MET，也称为肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor，HGFR)，是RTK家族的代表性成员。HGF-MET信号传导通路在生长因子刺激的增殖、上皮至间叶细胞转换(M-E-T)-控制的转移和AKT-调节的存活中起关键作用。不幸的是，关于HGF/MET-靶向的候选药物的临床试验直到目前都没有成功。例如，已经发现靶向MET的小分子抑制剂(例如Tivantinib(ArQule))在癌症患者中不那么特异，并且对MET的基底表达水平没有影响。此外，据报道，靶向MET的传统单克隆抗体通过模拟HGF介导的二聚化促进MET活化，即使它对诱导内吞-溶酶体相关降解具有潜在作用。至于靶向MET的单价抗体，例如Onartuzumab(Genentech)确实避免二聚化引起的激活，但它也降低促进降解的能力。

5D5是一种人源化单臂(one armed)mAb，旨在破坏MET磷酸化，同时避免诱导MET二聚体形成和激活。与其小鼠来源亲本不同，5D5真正抑制而不是激活MET，并且在胶质母细胞瘤、胃癌和胰腺癌中显示出强烈的抗肿瘤活性。然而，5D5未显示出良好的临床试验的数据，这可能是由于其对MET内化和降解的影响可以忽略不计。

VHH是骆驼科动物重链抗体的抗原特异性单一结构域可变区，亦即单一可变结构域，其最初由Hamers Casterman等人在1993年鉴定，最近已成为癌症诊断和治疗的有吸引力的候选药物和分子成像工具。与常规单克隆抗体药物相比，VHH具有天然优势，例如最小的可用的完整抗原结合单位(～15kDa，4nm长和2.5nm宽)、对不可接近表位的亚纳摩尔级的亲和力、可忽略不计的免疫原性、低成本的高产率、以及在水溶液中的高溶解性、稳定性、耐热性和耐化学性。然而，如何利用VHH获得最大治疗效率鲜为人知。已经报道靶向MET或HGF的VHH，但它仍然集中于抑制激酶活性和MET的活化，或仅仅作为药物递送的转运载体。

本领域仍然需要能有效用于癌症预防和/或治疗的靶向MET的抗体或抗体组合物。

附图简述

图1.抗MET VHH文库的构建。(A)抗MET骆驼血清的滴度评估。免疫后，从外周血分离骆驼血清，然后通过针对MET的直接ELISA确定免疫应答和功效。免疫前血清用作阴性对照。(B)VHH文库的容量估计。用重组噬菌粒转化后，回收TG1细胞并以10倍梯度连续稀释，随后接种在含有适当抗生素的LB固体培养基上。通过计算最高稀释度的菌落数来估计容量。单位：cfu/mL。(C)重组体的正确插入率评估。分别随机选择32个不同的转化体，然后通过PCR检测插入片段的大小。正确的插入大小约为600bp，32个菌落中只有一个(No.24)插入不正确。

图2.抗MET VHH池的产生。(A)富集MET特异性VHH。进行三轮生物淘选，计算阳性/阴性(抗原包被的孔/对照孔的菌落数)和输入/洗脱(加入到抗原包被的孔的噬菌体/从同一孔洗脱的噬菌体)以量化MET特异性VHH的富集参数。(B)MET特异性VHH的筛选和鉴定。从富集的菌落中随机选择282个菌落。分别提取每个菌落的周质中的粗产物，随后通过ELISA与载体对照(空白)相比测试对MET蛋白的特异性。高于5的比率被认为是阳性。(C)选择的抗MET VHH池候选物的纯化。在测序和功能分析后，选择、纯化所有有希望的候选物(N45、N56、N114、N133、N146、N175、N200、N238、N263、N278)，并然后进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色。(D)选择的抗MET VHH池候选物的确认。通过ELISA测试纯化候选物的特异性和亲和力。BSA被定为阴性对照。(E)抗MET VHH池内单个VHH的结合动力学测定。通过生物层干涉测定法(Bio-Layer Interferometry，BLI)分析单个VHH与MET结合动力学，在200nM浓度下。显示抗MET VHH池中每个VHH的抗原-抗体结合动力学曲线和相关拟合曲线。(F)详细显示VHH结合动力学测定中的参数。(G)抗METVHH池内成对VHH的表位竞争测定(epitope binningassay)。每两个VHH之间的竞争可能性表示为百分比。比率越小，对表位的竞争可能性越大，理论阈值约为50％。

图3.体外抗MET VHH池对癌细胞的抑制作用。(A)在HGF刺激下抗MET VHH池对癌细胞的抑制作用。将HepG2细胞饥饿过夜，然后用HGF和抗MET VHH池(TOP10MIX)或所指示的细分组处理，或不处理，并随后进行细胞活力分析。抗MET单克隆抗体(5D5)用作阳性对照。(B-E)抗MET VHH池对生理条件下的癌细胞增殖的抑制作用。用50μg/ml 2G1(N45+N238)、50μg/ml TOP10MIX或等体积载体对照(PBS)分别处理HepG2、HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827细胞，随后进行癌细胞增殖分析。每天更换生长培养基，计算指定时间点的细胞数用于分析。与TOP10MIX相比，2G1 VHH用作参照对照。(F-I)生理条件下抗MET VHH池对癌细胞活力的抑制作用。将HepG2、HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827细胞分别用50μg/ml 2G1、TOP10MIX或等体积PBS处理36小时，然后进行癌细胞活力分析。(J-M)生理条件下抗MET VHH池对癌细胞集落形成的抑制作用。将HepG2、HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827细胞分别用50μg/ml 2G1、TOP10MIX或PBS处理2周，随后进行癌细胞的集落形成能力分析。每2天更换生长培养基，并显示菌落数的定量。数据表示为来自至少3次独立实验的平均值±SD。双尾学生t检验的统计学显著差异标记为*(p＜0.05)或**(p＜0.01)。

图4.抗METVHH池对METKO癌细胞没有影响。(A)抗METVHH池对METKO癌细胞增殖的影响。MET KO HepG2细胞分别用50μg/ml 2G1(N45+N238)、50μg/ml TOP10MIX或等体积PBS处理，随后进行癌细胞的增殖分析。每天更换生长培养基，计算指定时间点的细胞数用于分析。与TOP10MIX相比，2G1 VHH用作参照对照。(B)抗MET VHH池对MET KO癌细胞活力的影响。将MET KO HepG2细胞分别用或不用50μg/ml 2G1、TOP10MIX或等体积PBS处理36小时，然后进行癌细胞的活力分析。(C)抗MET VHH池对MET KO癌细胞集落形成的影响。用或不用50μg/ml 2G1、TOP10MIX或PBS处理MET KO HepG2细胞2周，然后进行癌细胞的集落形成能力分析。每2天更换生长培养基，并显示菌落数的定量。

图5.在小鼠模型中抗MET METH池的抗肿瘤作用。(A)抗MET VHH池的保护功能评价策略。(B)评价抗MET VHH池针对肿瘤发生的保护功能。用抗MET单克隆抗体5D5(mAb，50μg/ml)、抗MET VHH池(TOP10MIX，50μg/ml)或载体对照(PBS，等效体积)分别预处理HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827细胞过夜，随后皮下(s.c.)接种到无胸腺nu/nu小鼠的侧部。据报道，根据Kaplan-Meier方法，从第3天起报告每组n＝10只动物的小鼠肿瘤发生率。当团块达到至少2mm²的大小时，动物被认为是肿瘤阳性。(C)抗MET VHH池的治疗作用评估策略。(D)评价抗MET VHH池在肿瘤进展中的治疗作用。分别s.c.接种HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827细胞至无胸腺nu/nu小鼠的侧部。一旦肿瘤表面达到35-45mm²，肿瘤分别每3天用10mg/kg抗MET mAb、10mg/kg TOP10MIX或PBS处理。在治疗期间每3天记录肿瘤生长，并报告为每组n＝10只动物的平均肿瘤表面大小±s.e.m.。箭头表示治疗的开始。(E)显示在处死每只小鼠后检测的荷瘤重量(第30天)。

图6.抗METVHH池对小鼠肿瘤生长的阻断作用。(A)抗METVHH池或mAb处理下的个体肿瘤生长曲线。如前所述单独处理HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827的移植肿瘤，并且在治疗期间定期记录每只小鼠中每个肿瘤的生长曲线。(B)抗MET VHH池或mAb处理的个体肿瘤体积。在第30天处死后分别检测每只小鼠中每个移植肿瘤的体积。(C)显示每只小鼠模型的荷瘤的代表性图像。

图7.抗MET VHH池在小鼠长期治疗中的治疗作用。(A)评价抗MET VHH池在长期治疗中的肿瘤抑制作用。将HGF和TPRMET驱动的NIH3T3细胞单独s.c.接种进无胸腺nu/nu小鼠的侧部。一旦肿瘤表面达到35-45mm²，肿瘤分别每3天用10mg/kg抗MET mAb、10mg/kgTOP10MIX或等体积PBS处理。(B)在较大肿瘤的长期治疗中评价抗MET VHH池的肿瘤抑制作用。如上所述接种HGF和TPRMET驱动的NIH3T3细胞。一旦肿瘤表面达到80-90mm²，肿瘤分别用抗MET mAb、TOP10MIX或PBS处理。在治疗期间每3天记录肿瘤生长，并报告为每组n＝10只动物的平均肿瘤表面大小±s.e.m.，箭头表示治疗的开始。

图8.抗MET VHH池介导的MET的内吞-溶酶体降解。(A)抗MET VHH池和单个VHH之间的靶向MET功能的比较。HepG2细胞分别用50μg/ml抗MET的单个VHH(N45、N56、N114、N133、N146、N175、N200、N238、N263、N278)、50μg/ml抗MET VHH池(TOP10MIX)或等体积的载体对照(PBS)处理。用所示抗体通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。(B)抗MET VHH池对多种癌细胞系中MET的影响。用50μg/ml TOP10MIX或等体积PBS分别处理HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827细胞。通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。(C)抗MET VHH池对小鼠MET的影响。在接受10mg/kg抗MET mAb、10mg/kg TOP10MIX或等体积PBS的治疗后，分离HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827异种移植的肿瘤组织，随后进行如上所述的蛋白质印迹分析。(D)内吞-溶酶体途径在抗METVHH池介导的MET降解中的功能。分别用50μg/mlTOP10MIX或等体积PBS处理HepG2细胞，含有或不含所示的内吞-溶酶体途径抑制剂，包括Pitstop2、Dynasore、巴弗洛霉素A1、E64D和Pepstatin A。处理后，细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。(E)抗MET VHH池和网格蛋白之间以MET依赖性方式的相互作用。将WT和MET KOHepG2细胞裂解物分别与TOP10MIX-缀合的Ni-树脂一起孵育，随后进行免疫沉淀和蛋白质印迹分析。(F)内吞作用调节剂网格蛋白在抗MET VHH池介导的MET降解中的作用。分别用50μg/ml TOP10MIX或等体积PBS处理HepG2细胞，敲低或不敲低网格蛋白。用指定的抗体通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。

图9.抗MET VHH池对细胞表面MET水平的降低功能。(A)抗MET VHH池对膜定位MET的影响。将HepG2细胞分别用50μg/ml TOP10MIX或等体积PBS处理72小时，然后分离或不分离细胞膜。通过蛋白质印迹用所示抗体分析总细胞裂解物(TCL)和膜级分(MF)。ATP1A1用作膜蛋白的阳性对照，GAPDH用作胞质蛋白的参照对照。(B)显示细胞膜上MET的相对定量。数据表示为来自至少3次独立实验的平均值±SD。双尾学生t检验的统计学显著差异标记为*(p＜0.05)或**(p＜0.01)。

图10.抗MET VHH池诱导的MET降解的统计分析。(A-E)使用Image J进行对应于图8的统计学分析。MET或p-MET(1234/1235)和上样对照(ACTIN)之间的比率分别通过相对条带强度计算。数据表示为来自至少3次独立实验的平均值±SD。双尾学生t检验的统计学显著差异标记为*(p＜0.05)或**(p＜0.01)。

图11.抗MET VHH池的工作模型。通过靶向细胞外区域的多个点，抗MET VHH池抑制HGF结合诱导的MET激酶活化，同时通过网格蛋白介导的内吞作用和溶酶体降解途径促进MET降解。这些特性使得抗MET VHH池能够克服HGF-MET信号传导介导的(激酶活性依赖性)，甚至只有MET本身驱动的(激酶活性非依赖性)治疗抗性，如下游PI3K-AKT、IKK-NFκB或MEK-ERK途径引起的残存。因此，抗MET VHH池大大改善靶向MET的癌症治疗功效。

图12.抗MET VHH的序列。其中加粗序列为根据Chothia定义的CDR序列，下划线序列为根据KABAT定义的CDR序列。

发明详述

定义

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin，“Genes IV”，Oxford University Press，New York，(1990)；及Roitt等人，“Immunology”(第2版)，Gower Medical Publishing，London，New York，(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。

如本文所用，术语“MET结合分子”意指任何能够特异性结合肝细胞生长因子受体MET(例如所述MET可以包含SEQ ID NO：71或75所示序列)的分子。MET结合分子可以是特异性结合MET的抗体，例如是特异性结合MET的重链单域抗体。

除非另有说明，否则可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“抗体序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。

如本文所用，术语(多肽或蛋白的)“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。

如本文所用的术语“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。“免疫球蛋白可变结构域”可以是所谓的“免疫球蛋白单一可变结构域”，即能够在不与其他免疫球蛋白可变结构域配对的情况下特异性结合抗原表位的免疫球蛋白可变结构域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变结构域的一个实例为“结构域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变结构域VH及VL(VH结构域及VL结构域)。免疫球蛋白单一可变结构域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。

在本发明的上下文中，术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”以及“VHH抗体”可互换使用，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的负责抗原结合的免疫球蛋白可变结构域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，MuyldermansS，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.：“Naturally occurringantibodies devoid of light chains”；Nature 363，446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(其在本文中称为“VH结构域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(其在本文中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规4链抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。

对于骆驼科的VHH结构域所应用的氨基酸残基，可以根据Kabat等人给出的VH结构域的一般编号法来编号(“Sequence ofproteins of immunological interest”，USPublic Health Services，NIH Bethesda，MD，公开案第91号)。根据该编号法，FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，FR2包含在位置36-49处的氨基酸，CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。然而应注意，如本领域中对于VH结构域及VHH结构域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。

本领域中也已知对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，所述替代方法还可以类似地应用于VHH结构域。所述替代方法例如是Chothia编号。重链单域抗体的Chothia编号同样适用于本发明。

VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。

获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于以下文献中：R.van derLinden et a1.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，JBiol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal ofBiotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。

源自骆驼科的VHH结构域可通过以人常规4链抗体VH结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而经“人源化”。人源化VHH结构域可含有一个或多个完全人框架区序列。

此外，本领域技术人员还将了解，有可能将VHH的一个或多个CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。通过此类移植产生的抗原结合蛋白/多肽，也涵盖在本发明的MET结合分子的范畴内。

如本文所用，术语“表位”或可互换使用的术语“抗原决定簇”指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性”表位或“构象”表位。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。

可使用本领域中熟知的许多表位定位技术鉴别给定抗原的表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。举例而言，线性表位可通过例如以下方法来确定：在固体支持物上同时合成大量肽，其中这些肽对应于蛋白质分子的各部分，且使这些肽在仍然与支持物连接的情况下与抗体反应。这些技术在本领域中为已知的且描述于例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23：709-715中。类似地，构象表位可通过诸如通过例如x射线结晶学及2维核磁共振确定氨基酸的空间构形加以鉴别。参见例如Epitope Mapping Protocols(同上)。

可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的抗体分子竞争结合MET上的相同表位的抗体及其抗原结合片段。

一般而言，术语“特异性”是指特定抗体(例如本发明的MET结合分子)可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗体(例如本发明的MET结合分子)的亲和力和/或亲合力确定其特异性。由抗原与抗体的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗体上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗体(例如本发明的MET结合分子)之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为缔合常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解，取决于具体感兴趣的抗原，可以以已知方式测定亲和力。亲合力为抗体(例如MET结合分子)与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与以下两者有关：与抗体(例如本发明的MET结合分子)上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗体(例如本发明的MET结合分子)上的相关结合位点的数目。

一般而言，术语“竞争性”“竞争可能性”指不同抗体结合同一抗原所存在的竞争，其可通过本领域常规实验测得。根据非限制性理论，两个存在较高竞争可能性的抗体结合抗原相同或相关的(例如结构类似或空间接近)的表位。

通常，本发明的MET结合分子将以如于生物层干涉测定法(Bio-LayerInterferometry，BLI)、Biacore或KinExA测定中测量的优选10^-8至10^-12摩尔/升(M)、更优选10^-9至10^-12摩尔/升、甚至更优选10^-10至10^-12、甚至更优选10^-11至10^-12或更低的解离常数(KD)，和/或以至少10⁸M-1、优选至少10⁹M^-1、更优选至少10¹⁰M^-1，更优选至少10¹¹M^-1、例如至少10¹²M^-1的缔合常数(KA)结合所要结合的抗原(例如MET)。任何大于10^-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。抗体(例如本发明的MET结合分子)对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如表面等离子体共振术(SPR)测定、Scatchard测定和/或竞争性结合测定(例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)及夹心式竞争性测定)。

氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸编码加以表示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与另一序列相比，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。

两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，NewYork，1991。

相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，当其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中通常与之相关的其他组分(例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离时，多肽或核酸分子视为“基本上分离的”。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上分离的”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“基本上分离的”多肽或核酸分子优选基本上为均质的。

“亲和力成熟”的抗MET抗体，特别是VHH，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对MET的亲和力相比于其各自的亲本抗MET抗体有所增加。亲和力成熟的抗MET抗体(例如VHH)可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson及RE Hawkins，“Affinity maturation ofantibodies usingphage display”，Oxford University Press 1996。

如本文所用的术语“对象”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。

本发明的MET结合分子

在第一方面，本发明提供了一种分离的肝细胞生长因子受体(MET)结合分子，其包含至少一个免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域包含SEQ ID NO：61-70任一中的CDR1、CDR2和CDR3。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域包含选自以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3，且特异性结合MET：

(1)SEQ ID NO：1所示的CDR1，SEQ ID NO：2所示的CDR2，SEQ ID NO：3所示的CDR3(对应于抗体株N45的CDR)；

(2)SEQ ID NO：4所示的CDR1，SEQ ID NO：5所示的CDR2，SEQ ID NO：6所示的CDR3(对应于抗体株N56的CDR)；

(3)SEQ ID NO：7所示的CDR1，SEQ ID NO：8所示的CDR2，SEQ ID NO：9所示的CDR3(对应于抗体株N114的CDR)；

(4)SEQ ID NO：10所示的CDR1，SEQ ID NO：11所示的CDR2，SEQ ID NO：12所示的CDR3(对应于抗体株N133的CDR)；

(5)SEQ ID NO：13所示的CDR1，SEQ ID NO：14所示的CDR2，SEQ ID NO：15所示的CDR3(对应于抗体株N146的CDR)；

(6)SEQ ID NO：16所示的CDR1，SEQ ID NO：17所示的CDR2，SEQ ID NO：18所示的CDR3(对应于抗体株N175的CDR)；

(7)SEQ ID NO：19所示的CDR1，SEQ ID NO：20所示的CDR2，SEQ ID NO：21所示的CDR3(对应于抗体株N200的CDR)；

(8)SEQ ID NO：22所示的CDR1，SEQ ID NO：23所示的CDR2，SEQ ID NO：24所示的CDR3(对应于抗体株N238的CDR)；

(9)SEQ ID NO：25所示的CDR1，SEQ ID NO：26所示的CDR2，SEQ ID NO：27所示的CDR3(对应于抗体株N263的CDR)；和

(10)SEQ ID NO：28所示的CDR1，SEQ ID NO：29所示的CDR2，SEQ ID NO：30所示的CDR3(对应于抗体株N278的CDR)。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域包含选自以下的根据Chothia定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(1)SEQ ID NO：31所示的CDR1，SEQ ID NO：32所示的CDR2，SEQ ID NO：33所示的CDR3(对应于抗体株N45的CDR)；

(2)SEQ ID NO：34所示的CDR1，SEQ ID NO：35所示的CDR2，SEQ ID NO：36所示的CDR3(对应于抗体株N56的CDR)；

(3)SEQ ID NO：37所示的CDR1，SEQ ID NO：38所示的CDR2，SEQ ID NO：39所示的CDR3(对应于抗体株N114的CDR)；

(4)SEQ ID NO：40所示的CDR1，SEQ ID NO：41所示的CDR2，SEQ ID NO：42所示的CDR3(对应于抗体株N133的CDR)；

(5)SEQ D NO：43所示的CDR1，SEQ ID NO：44所示的CDR2，SEQ ID NO：45所示的CDR3(对应于抗体株N146的CDR)；

(6)SEQ ID NO：46所示的CDR1，SEQ ID NO：47所示的CDR2，SEQ ID NO：48所示的CDR3(对应于抗体株N175的CDR)；

(7)SEQ ID NO：49所示的CDR1，SEQ ID NO：50所示的CDR2，SEQ ID NO：51所示的CDR3(对应于抗体株N200的CDR)；

(8)SEQ ID NO：52所示的CDR1，SEQ ID NO：53所示的CDR2，SEQ ID NO：54所示的CDR3(对应于抗体株N238的CDR)；

(9)SEQ ID NO：55所示的CDR1，SEQ ID NO：56所示的CDR2，SEQ ID NO：57所示的CDR3(对应于抗体株N263的CDR)；和

(10)SEQ D NO：58所示的CDR1，SEQ ID NO：59所示的CDR2，SEQ ID NO：60所示的CDR3(对应于抗体株N278的CDR)。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域包含与SEQ ID NO：61-70中任一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列与SEQ IDNO：61-70中任一相比包含一或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域包含SEQ ID NO：61-70中任一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域是VHH。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域是人源化的。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域是人源化的VHH。

在一些实施方案中，本发明的MET结合分子是经过亲和力成熟获得的。经亲和力成熟的MET结合分子可以在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对MET的亲和力相比于亲本MET结合分子有所增加。

在一些实施方案中，本发明的MET结合分子还可以包含延长体内半衰期的部分。所述延长体内半衰期的部分包括但不限于血清白蛋白、结合血清白蛋白的VHH或免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，所述延长体内半衰期的部分是免疫球蛋白Fc区。例如，可用于本发明的Fc区可以来自不同亚型的免疫球蛋白，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM。然而，优选地，所述Fc区被突变使得其不能形成二聚体。

在一些实施方案中，本发明的MET结合分子还可以包含适于多肽表达、检测、分离和/或纯化的标签。例如，所述标签包括但不限于His标签、HA标签、GST标签等。

在另一方面，本发明的MET结合分子还涵盖能够与由SEQ ID NO：61-70中任一的氨基酸序列组成的VHH结合MET上的相同表位的MET结合分子例如VHH。

本发明的所述MET结合分子结合MET的KD值可以小于1×10^-8M、优选小于1×10^-9M、更优选小于1×10^-10M、更优选小于1×10^-11M、尤其更优选小于1×10^-12M。

本发明的MET结合分子的组合

本发明人令人惊奇地发现，当使用多种不同抗MET VHH(特别是针对不同表位的VHH)同时靶向MET时，在阻断其配体结合的同时，能够通过内吞-溶酶体途径介导MET蛋白的显著降解，从而真正抑制MET的功能，例如实现MET阳性肿瘤的显著抑制。

因此在第二方面，本发明提供了一种组合，包含两种或更多种，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种MET结合分子。优选地，本发明的MET结合分子的组合包含至少10种MET结合分子。不受任何理论限制，预期同时结合的结合分子如抗体越多，MET由内吞-溶酶体途径介导的降解越强。

在一些实施方案中，所述两种或更多种MET结合分子特异性结合MET上的不同表位。在一些实施方案中，所述两种或更多种MET结合分子特异性结合MET的胞外部分上的不同表位。特异性结合MET上的不同表位意指所述MET结合分子结合的表位不完全重合，尽管可能存在部分重叠。在一些实施方案中，所述两种或更多种MET结合分子是两种或更多种抗体，例如两种或更多种单克隆抗体。在一些实施方案中，所述两种或更多种MET结合分子是两种或更多种VHH。在一些实施方案中，所述两种或更多种MET结合分子选自本发明的MET结合分子。然而，本发明的组合也设想其他的MET特异性抗体，例如现有技术已有的MET抗体。

在一些实施方案中，本发明的组合包含两种或更多种，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种分离的MET结合分子，所述MET结合分子各自包含至少一个免疫球蛋白可变结构域且特异性结合MET，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含SEQ IDNO：61-70任一中的CDR1、CDR2和CDR3，

例如所述免疫球蛋白可变结构域各自包含选自以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(10)SEQ D NO：28所示的CDR1，SEQ ID NO：29所示的CDR2，SEQ ID NO：30所示的CDR3(对应于抗体株N278的CDR)；

或者，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含选自以下的根据Chothia定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(5)SEQ ID NO：43所示的CDR1，SEQ ID NO：44所示的CDR2，SEQ ID NO：45所示的CDR3(对应于抗体株N146的CDR)；

在一些实施方案中，本发明的组合包含至少2种不同的MET结合分子，所述MET结合分子各自包含至少一个免疫球蛋白可变结构域且特异性结合MET，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含选自以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(1)SEQ ID NO：1所示的CDR1，SEQ INO：2所示的CDR2，SEQ ID NO：3所示的CDR3(对应于抗体株N45的CDR)；和

(2)SEQ ID NO：22所示的CDR1，SEQ ID NO：23所示的CDR2，SEQ ID NO：24所示的CDR3(对应于抗体株N238的CDR)；

或者，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含以下的根据Chothia定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(1)SEQ ID NO：31所示的CDR1，SEQ ID NO：32所示的CDR2，SEQ ID NO：33所示的CDR3(对应于抗体株N45的CDR)；和

(2)SEQ ID NO：52所示的CDR1，SEQ ID NO：53所示的CDR2，SEQ ID NO：54所示的CDR3(对应于抗体株N238的CDR)。

在一些实施方案中，本发明的组合包含至少4种不同的MET结合分子，所述MET结合分子各自包含至少一个免疫球蛋白可变结构域且特异性结合MET，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含选自以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(2)SEQ ID NO：7所示的CDR1，SEQ ID NO：8所示的CDR2，SEQ ID NO：9所示的CDR3(对应于抗体株114的CDR)；

(3)SEQ ID NO：16所示的CDR1，SEQ ID NO：17所示的CDR2，SEQ ID NO：18所示的CDR3(对应于抗体株N175的CDR)；和

(4)SEQ ID NO：22所示的CDR1，SEQ ID NO：23所示的CDR2，SEQ ID NO：24所示的CDR3(对应于抗体株N238的CDR)；

(2)SEQ ID NO：37所示的CDR1，SEQ ID NO：38所示的CDR2，SEQ ID NO：39所示的CDR3(对应于抗体株N114的CDR)；

(3)SEQ ID NO：46所示的CDR1，SEQ ID NO：47所示的CDR2，SEQ ID NO：48所示的CDR3(对应于抗体株N175的CDR)和

(4)SEQ ID NO：52所示的CDR1，SEQ ID NO：53所示的CDR2，SEQ ID NO：54所示的CDR3(对应于抗体株N238的CDR)。

在一些实施方案中，本发明的组合包含至少5种MET结合分子，所述MET结合分子各自包含至少一个免疫球蛋白可变结构域且特异性结合MET，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含选自以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(2)SEQ ID NO：7所示的CDR1，SEQ ID NO：8所示的CDR2，SEQ ID NO：9所示的CDR3(对应于抗体株N114的CDR)；

(3)SEQ ID NO：10所示的CDR1，SEQ ID NO：11所示的CDR2，SEQ ID NO：12所示的CDR3(对应于抗体株N133的CDR)；

(4)SEQ ID NO：16所示的CDR1，SEQ ID NO：17所示的CDR2，SEQ ID NO：18所示的CDR3(对应于抗体株N175的CDR)；和

(5)SEQ ID NO：22所示的CDR1，SEQ ID NO：23所示的CDR2，SEQ ID NO：24所示的CDR3(对应于抗体株N238的CDR)；

(3)SEQ ID NO：40所示的CDR1，SEQ ID NO：41所示的CDR2，SEQ ID NO：42所示的CDR3(对应于抗体株N133的CDR)；

(4)SEQ ID NO：46所示的CDR1，SEQ ID NO：47所示的CDR2，SEQ ID NO：48所示的CDR3(对应于抗体株N175的CDR)和

(5)SEQ ID NO：52所示的CDR1，SEQ ID NO：53所示的CDR2，SEQ ID NO：54所示的CDR3(对应于抗体株N238的CDR)。

在一些优选实施方案中，本发明的组合包含至少10种不同的MET结合分子，所述MET结合分子各自包含至少一个免疫球蛋白可变结构域且特异性结合MET，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含选自以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(10)SEQ ID NO：28所示的CDR1，SEQ ID NO：29所示的CDR2，SEQ ID NO：30所示的CDR3(对应于抗体株N278的CDR)；

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含与SEQ ID NO：61-70中任一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域各自的氨基酸序列与SEQ ID NO：61-70中任一相比包含一或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含SEQ ID NO：61-70中任一的氨基酸序列。其中SEQ ID NO：61-70分别对应于抗体株N45、N56、N114、N133、N146、N175、N200、N263、N278的氨基酸序列。

在一些具体实施方案中，本发明的组合包含两种或更多种，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种分离的MET结合分子，所述MET结合分子各自包含SEQ ID NO：61-70中任一的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，本发明的组合包含至少2种不同的分离的MET结合分子，所述至少2种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：68所示氨基酸序列。在一些具体实施方案中，本发明的组合包含至少4种不同的分离的MET结合分子，所述至少4种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO：61、63、66和68所示氨基酸序列。在一些具体实施方案中，本发明的组合包含至少5种不同的分离的MET结合分子，所述至少5种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO：61、63、64、66和68所示氨基酸序列。在一些具体实施方案中，本发明的组合包含至少10种不同的分离的MET结合分子，所述10种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO：61-70所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述MET结合分子是经过亲和力成熟获得的。经亲和力成熟的MET结合分子可以在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对MET的亲和力相比于亲本MET结合分子有所增加。

在一些实施方案中，所述MET结合分子还可以与延长体内半衰期的部分融合。所述延长体内半衰期的部分包括但不限于血清白蛋白、结合血清白蛋白的VHH或免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，所述延长体内半衰期的部分是免疫球蛋白Fc区。例如，可用于本发明的Fc区可以来自不同亚型的免疫球蛋白，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM。然而，优选地，所述Fc区被突变使得其不能形成二聚体。

在一些实施方案中，所述MET结合分子还可以包含适于多肽表达、检测、分离和/或纯化的标签。例如，所述标签包括但不限于His标签、HA标签、GST标签等。

在一些实施方案中，所述MET结合分子结合MET的KD值小于1×10^-8M、优选小于1×10^-9M、更优选小于1×10^-10M、更优选小于1×10^-11M、尤其更优选小于1×10^-12M。

在一些实施方案中，本发明的组合包含相等量的各MET结合分子。

核酸、载体、宿主细胞

在另一方面中，本发明涉及编码本发明的MET结合分子的核酸分子。本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的核酸。

本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可尤其为表达载体，即可提供MET结合分子体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。针对在特定宿主中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。对本发明的MET结合分子的表达有用或必需的调控元件及其他元件的具体实例，例如启动子、增强子、终止子、整合因子、选择标记物、前导序列、报告基因。

本发明的核酸可基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息通过已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。

在另一方面中，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的MET结合分子和/或含有本发明的核酸或载体的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。

适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。

适合的真菌细胞包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。

适合的哺乳动物细胞包括例如HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞等。

然而，本发明也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。

本发明还提供产生本发明的MET结合分子的方法，所述方法通常包含以下步骤：

-在允许表达本发明的MET结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞；及

-从培养物回收由所述宿主细胞表达的MET结合分子；及

-任选进一步纯化和/或修饰本发明的MET结合分子。

在一个优选的实施方案中，本发明的MET结合分子使用大肠杆菌细胞产生。本发明的MET结合分子可以在大肠杆菌细胞中获得高表达。

在一个优选的实施方案中，本发明的MET结合分子使用哺乳动物细胞产生。本发明的MET结合分子可以在哺乳动物细胞中获得高表达。

本发明的MET结合分子可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞质中、在周质中或在包涵体中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。

用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的MET结合分子的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。

然而，本发明的MET结合分子也可以通过本领域已知的其它产生蛋白质的方法获得，例如化学合成，包括固相或液相合成。

治疗性缀合物

另一方面，本发明涉及与诸如细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质等治疗性部分缀合的本发明的MET结合分子。

细胞毒素包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。

可用于缀合的治疗剂还包括，例如：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

能与本发明的MET结合分子缀合的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀、和它们的衍生物。

可以利用本领域使用的接头技术将细胞毒素与本发明的MET结合分子缀合。已经用于将细胞毒素与MET结合分子缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接头，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。

关于细胞毒素的类型、用于缀合治疗剂与抗体的接头和方法的进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53：247-264。

本发明的MET结合分子也可以与放射性同位素缀合，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性免疫缀合物。能够与诊断或治疗性使用的抗体缀合的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性免疫缀合物的方法在本领域中已经建立。放射性免疫缀合物的例子可以作为商品获得，包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能够利用类似的方法使用本发明的MET结合分子制备放射性免疫缀合物。

本发明的MET结合分子也可以与具有需要的生物活性的蛋白质缀合，可用于修饰特定的生物学反应。这样的生物活性蛋白质包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-Y；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-10(“IL-10”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他免疫因子如IFN等。

将这种治疗性部分与抗体分子缀合的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，Controlled DrugDelivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In CancerTherapy：AReview”，MonoclonalAntibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。

药物组合物

另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的本发明的MET结合分子或本发明的治疗性缀合物或本发明的前述的组合。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子(如VHH)包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

通过将活性化合物即抗体分子(如VHH)以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物即抗体分子(如VHH)掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分即抗体分子(如VHH)的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。

可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。

对于抗体分子的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。对于包含多种抗体分子(如VHH)的情况，所述剂量是指总剂量，即抗体分子各自施用剂量的总和。在一些实施方案中，本发明的药物组合物中包含相等剂量的各抗体分子(如VHH)。

示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。

或者，抗体分子也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本发明的MET结合分子或缀合物或组合的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于MET相关肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“治疗有效量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的治疗性化合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明的药物组合物的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

或者，本发明的药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。

活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利引入本文作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物可配制为确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个靶向部分，从而增强靶向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。靶向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

疾病预防和治疗

在另一方面，本发明提供了本发明的MET结合分子、治疗性缀合物、组合或药物组合物在预防和/或治疗与MET相关的疾病，尤其是MET异常表达相关疾病中用途和方法。本发明的MET结合分子、治疗性缀合物、组合或药物组合物可以在体内、体外显著抑制癌细胞的增殖。

因此，在一方面，本发明提供一种预防和/或治疗癌症的方法，包括给该对象施用治疗有效量的本发明的MET结合分子、治疗性缀合物、组合或药物组合物。

在另一方面，本发明提供本发明的MET结合分子、治疗性缀合物、组合或药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途。

可以通过本发明的方法或药物治疗的癌症包括但不限于脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、阴道癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、头颈癌或黑色素瘤。

本发明的MET结合分子、治疗性缀合物、组合或药物组合物也可以与标准癌症治疗组合，例如标准化疗和/或放疗。

本发明的的MET结合分子、治疗性缀合物、组合或药物组合物还可以与靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体联合使用。所述靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体包括但不限于，抗EGFR抗体、抗EGFR变体的抗体、抗VEGFa抗体、抗HER2抗体。优选所述抗体是单克隆抗体。

在另一方面，本发明提供了降低/减小细胞的MET蛋白水平和/或MET活性的方法，包括使所述细胞与本发明的MET结合分子、治疗性缀合物、组合或药物组合物接触。

所述MET活性包括但不限于受体磷酸化、受体二聚化、配体结合、下游信号传导(例如，MAPK级联、PI3K-Akt轴、STAT途径和NF-κB途径)等。用于测量这些活性的方法在本领域中是已知的。在具体的实施方式中，本发明的MET结合分子、治疗性缀合物、组合或药物组合物将一种或多种这些MET活性抑制(例如，部分抑制)至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、97％、98％、99％或100％。

诊断检测

在另一方面本发明还提供检测生物学样品中MET的存在或MET的表达水平的方法，包括在本发明的MET结合分子与MET之间能够形成复合物的条件下，使所述生物学样品和对照样品接触本发明的MET结合分子。然后检测复合物的形成，其中所述生物学样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中MET的存在或MET的表达水平。

在某些实施方式中，本文提供了诊断MET相关疾病，尤其是MET异常表达相关疾病例如癌症的方法，其包括：(a)使用本发明的MET结合分子测定受试者样品中MET的表达；和(b)将MET表达水平与对照水平，例如，正常组织样品(例如，来自不具有MET相关疾病的患者或者来自MET相关疾病发生前的相同患者)中的水平相比较，其中与MET的对照表达水平相比，MET的测定表达水平的升高或降低指示了所述MET相关疾病。

在一些实施方案中，本发明的MET结合分子还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。

试剂盒

本发明的范围内还包括试剂盒，该试剂盒包括本发明的MET结合分子、治疗性缀合物、组合或药物组合物，以及使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一种另外的试剂。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。

实施例

为了便于理解本发明，下面将参照相关具体实施例及附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

材料与方法

抗体、抑制剂和其他试剂：

抗体从所指示来源获得：抗MET(700261，Thermo Fisher，用于WB；单臂5D5(其HC、LC、Fc的序列分别如SEQ ID NO：72-74所示)，ALPHAMAB，用于治疗)，抗p-MET Y1234/1235(#3077，Cell Signaling)，抗网格蛋白(#4796，Cell Signaling)，抗βACTIN(HRP-60008，Proteintech)，抗兔IgG(HRP)(GTX221666-01，GeneTex)，抗小鼠IgG(HRP)(GTX221667-01，GeneTex)。内吞-溶酶体途径抑制剂来自指定供应商：Pitstop2(SML1169，Sigma)，Dynasore(D7693，Sigma)，巴弗洛霉素A1(1334，Tocris/R&D)，E64D(E8640，Sigma)和Pepstatin A(77170，Sigma公司)。其他试剂购自指定公司：完全弗氏佐剂(F5881，Sigma)，不完全弗氏佐剂(F5506，Sigma)，胰蛋白酶(T1426，Sigma)，ABESF(2931.3，Carl Roth)，HGF(100-39-2，PeproTech)，嘌呤霉素(ant-pr-1，InvivoGen)和网格蛋白靶向siRNA(SR300867，OriGene)。

抗MET VHH的产生

为了产生抗MET VHH，双峰驼用MET的重组Sema结构域免疫(由ALPHAMAB提供)，以一周间隔进行五次皮下注射。分离血清，评估第4次和第5次注射间隔的免疫反应。最后一次免疫之后三天，收集100mL外周血，构建VHH文库。从分离的外周血淋巴细胞PBL)中用Ficoll-Paque PLUS(17-1440-03，GE)提取总RNA，并通过SuperScript III逆转录酶(18080093，Life Tech)逆转录成cDNA。该合成的cDNA用作两轮PCR中的模板以根据E.Pardon的标准程序扩增VHH编码序列。将VHH库连接到pMECS噬菌粒(Biovector501740，BioVector NTCC Inc.)，然后将重组体电转化到大肠杆菌TG1细胞中，然后在含氨苄青霉素和葡萄糖的固体LB培养基上培养。通过连续稀释和单菌落测序分析文库的容量和多样性。对于初始选择，将在100μL包被缓冲液中的100ng MET蛋白(100mM NaHCO₃，pH8.4)在4℃下在Maxisorp 96-well Immunoplate(439454，Nunc)上包被过夜，并用包被缓冲液设置对照孔。用含0.05％吐温-20的无菌PBS(PBST)洗涤多余的抗原三次，并且用PBS中2％脱脂乳在室温(RT)下保持2小时封闭非特异性结合位点。随后，从VHH文库中拯救的重组噬菌体与抗体包被的孔(和对照)在RT孵育1小时。用PBST洗涤过量的噬菌体，并通过100μL的250μg/mL胰蛋白酶/PBS洗脱结合的噬菌体。立即将5μL的4mg/mL ABESF/PBS加入洗脱液中以保护蛋白质免于降解。为了计算富集参数，将洗脱的噬菌体连续稀释然后用于感染TG1细胞。1小时后，将感染的TG1细胞铺板在含葡萄糖和氨苄青霉素的LB琼脂平板上。对于周质提取物ELISA，随机选择282个单个菌落。在此之后，培养菌落并且由异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导产生VHH。通过ELISA分别测试提取的VHH与抗原的结合，并且对阳性菌落进行测序。最终，将选择的克隆重新克隆到pET28a载体并大规模转化入BL-21(DE3)大肠杆菌细胞表达。基于融合的His标签，根据说明书通过固定化金属亲和层析(IMAC)纯化VHH。以上都是完全通过内部设施(VHH平台)实现。

抗MET VHH的结合和表位竞争测定

使用Octet K2系统(FortéBio)确定纯化的VHH对MET的结合动力学和表位竞争 (epitope binning)竞争测试。简而言之，所有实验均在30℃下进行，试剂在0.1％BSA、0.02％Tween20 PBS、pH7.4缓冲液中制备。将hMET-ECD蛋白固定在抗人Fc捕获(Anti-HumanFc Capture，AHC)生物传感器上，随后用于以时间窗口分别为150s和300s进行VHH的结合和解离测量。对于表位竞争测定，具有抗原和第一VHH(Ab1)的传感器用于在相同时间窗口用第二VHH(Ab2)进行结合和解离测量。收集具有和不具有Ab1下的Ab2的结合反应。然后，使用含Ab1的Ab2/不含Ab1的Ab2的公式计算Ab1和Ab2对相同的表位的竞争可能性。从理论上讲，当该公式的结果不低于50％时，测量的两种抗体对同一表位没有明显的竞争。使用该仪器随附的软件进行数据分析。

抗MET VHH池(pool)的缩小分析

将HepG2细胞用PBS洗涤两次，重悬于无血清培养基中，然后在48孔板中接种每孔6,000个细胞。12小时后，用终浓度为100ng/mL的人HGF单独处理细胞(Z03229，GenScript)，分别有或没有50μg/mL5D5 mAb、抗MET VHH池TOP10MIX、以及重新组合的亚组5G1-5G12(其次是4G1-4G5，3G1-3G4和2G1-2G3)。处理后36小时，用100μL无血清培养基中的10μLCCK-8溶液(C0038，Beyotime)更换培养基，将板在37℃下再孵育1小时。随后，测量450nm处的吸光度以进行细胞活力分析，计算与HGF相比降低的百分比作为VHH对HGF刺激的抑制作用。

细胞系和细胞培养

HepG2、SK-HEP-1、HCC827和NIH3T3细胞系获自中国科学院细胞库(www.cellbank.org.cn)，其中为了确保质量和身份而进行支原体污染检测和短串联重复序列(STR)分析。如之前文献报道产生HGF和TPR MET驱动的NIH3T3细胞系。所有细胞系和衍生细胞在供应商规定的标准条件下维持，而全部细胞在实验期间都是在Dulbecco’smodified Eagle’s medium(DMEM)(高葡萄糖加2mML-谷氨酰胺、1％NEAA、100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素和10％FBS)中在37℃培养箱中用5％CO₂进行培养以进行平行比较。根据国际细胞系认证委员会(International Cell Line Authentication Committee，ICLAC)的数据库，本发明中使用的细胞系没有错误鉴定的细胞系。所有细胞系都是从购买的种子细胞中新鲜解冻，培养不超过2个月，并根据其形态特征定期检查以避免交叉污染或误用。

细胞增殖、活力和集落形成能力测定

对于细胞增殖测定，在第0天将细胞一式三份接种于6孔细胞培养板，每孔密度为在3ml正常生长培养基中10,000个细胞，然后按照描述进行处理。培养基每天更换。胰蛋白酶消化后用血细胞计数器在指定时间计数细胞，并记录用于分析。对于细胞活力测定，在第0天细胞在96孔微孔板中一式三份接种，每孔密度为100μl正常生长培养基中2,500个细胞，随后如所述进行处理。36小时后，将细胞与0.25mg/ml WST-8溶液在37℃下进一步孵育2小时，然后加入10μl 3％SDS以终止反应。测量450nm处的吸光度，并计算活细胞的百分比并取平均。对于克隆形成测定，需要以一定密度接种相同量的细胞以保持对照(未处理)细胞在整个实验处于指数生长期。在对HepG2细胞系进行预测试后，第0天在6孔板中一式三份每孔在3ml补充20％FBS的常规生长培养基中接种500个细胞。然后培养细胞并如所示在37℃，5％CO₂处理2周。含有或不含有HGF或药物的生长培养基每2天更换一次。剩余的细胞用4％冷的PFA固定(多聚甲醛)45分钟，然后用溶于10％甲醇中的0.1％(w/v)结晶紫(SSI1047-1，SunShineBio)在室温下染色2小时。用蒸馏水彻底清洗直到背景变得清晰后，使用数码相机拍摄每个重复的图片，并且在显微镜下量化集落数。

动物护理和使用

从扬州大学比较医学中心(扬州，中国)获得无胸腺nu/nu小鼠(雄性，4-6周龄)。在东南大学(Southeast University，SEU)医学院的动物设施中在无特定病原体的条件下维持小鼠，恒温恒湿，12小时光暗周期，随意获得食物和水。本发明所有动物研究都由SEU的生命科学研究所(Institute of Life Sciences，ILS)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准和监督。

肿瘤异种移植模型和分析

为了评估抗METVHH针对肿瘤发生的保护功能，HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1或HCC-827细胞用抗MET单克隆抗体5D5(mAb，50μg/ml)、抗MET VHH(TOP10MIX，50μg/ml)或载体对照(PBS，等效体积)单独预处理过夜，然后皮下(s.c.)接种到6周龄雄性无胸腺nu/nu老鼠的右侧背侧。每只小鼠分别注射在100μl PBS中的5×10⁶个预处理的HGF和TPRMET驱动的NIH3T3细胞、1×10⁶个预处理的SK-HEP-1细胞或1×10⁶个预处理的HCC-827细胞。根据Kaplan-Meier方法定期报告每组n＝10只动物的小鼠的肿瘤发病率，从第3天直至第30天。当卡尺测量在侧部检测到的团块通过公式(大小＝最长尺寸x垂直尺寸)计算达到至少2mm²的大小，动物视为肿瘤阳性。为了评估抗MET VHH在已建立的肿瘤移植模型中的治疗作用，用5×10⁶个未处理的HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、1×10⁶个未处理的SK-HEP-1或1×10⁶个未处理的HCC-827细胞分别皮下接种于无胸腺nu/nu小鼠的右侧背侧。接种后，每天监测小鼠，并且每周称重两次。当肿瘤变得可见时，如上所述通过卡尺测量每三天例行监测肿瘤生长(表示为肿瘤表面大小)。一旦肿瘤表面达到35-45mm²，就通过在卡尺测量后每三天分别用抗MET单克隆抗体5D5(mAb，10mg/kg，在100μl PBS中)、10mg/kg抗MET VHH(TOP10MIX，10mg/kg，在100μl PBS中)或载体对照(PBS，等效体积)在肿瘤邻近皮下多点注射处理小鼠。在第30天处死所有小鼠，然后对肿瘤解剖、称重、测量、拍照和加工用于进一步分析。根据公式计算肿瘤体积(体积＝最长尺寸x垂直尺寸x垂直尺寸/2)。为了评估抗METVHH对小鼠中MET和自噬的影响，选择每组的三个肿瘤组织样品并均质化以提取蛋白质用于用指定抗体进行蛋白质印迹分析，然后进行鉴定。所有实验每组包含5只小鼠并且至少运行两次。相同处理下的总共10只小鼠的每一个产生相似的结果，并一起进行分析。为了伦理考虑，对携带超过其体重的20％或最长轴超过20mm的肿瘤病变的动物进行安乐死。

免疫共沉淀和蛋白质印迹

用冰冷的PBS漂洗四次后，细胞重悬于裂解缓冲液(25mM HEPES pH 7.5、150mMNaCl、0.25％Triton X-100、0.25％NP-40、0.5％CHAPS、0.05％SDS、10％甘油、磷酸酶抑制剂混合物(B15001，Bimake)和蛋白酶抑制剂混合物(B14001，Bimake))，在冰上2.5小时，然后以14,000g离心20分钟。上清液随后与2.5μg的TOP10MIX-conjucted Ni-resin一起在4℃孵育下过夜。用裂解缓冲液洗涤三次后，免疫沉淀物在1×上样缓冲液中煮沸用于免疫印迹分析。通过SDS-PAGE用4-20％15孔ExpressPlus^TM PAGE凝胶(M42015C，GenScript)进一步分离蛋白质样品，然后转移到硝酸纤维素膜(66485，PALL)。用在TBST中的7.5％脱脂牛奶封闭膜2小时，然后根据制造商的建议与指定的一抗孵育。用TBST洗三次后将膜与适当的HRP标记的二抗孵育。使用SuperSignal^TMWest Femto Maximum Sensitivity Substrate(34095，Thermo Fisher)显影免疫标记。使用摄影胶片获得可视化图像。应用相似的曝光时间、亮度、对比度和扫描条件设置以捕获平行数字图像。

统计分析

使用Excel 2015(Microsoft Corporation)和GraphPad Prism 5(GraphPadSoftware，Inc.)软件进行统计分析来评估实验组之间的差异。结果显示为平均值±SD，其中从至少重复三次的技术或生物学重复计算。通过学生t检验分析统计显著性并表示为p值。所有p值均通过双尾学生t检验获得。与对照相比，*p值＜0.05，**p值＜0.01。p值＜0.05被认为是统计学上显著的。

实施例1、抗-METVHH池的构建

由于传统的药物和策略在靶向MET治疗方面没有那么成功，开发一种新的治疗工具-抗MET VHH池。为了获得MET特异性VHH文库，用MET细胞外结构域的重组蛋白免疫双峰驼。从外周血分离血清以确定针对MET的特异性(图1A)。与同一骆驼的免疫前血清相比，免疫血清的滴度不低于5×10⁴。随后，从淋巴细胞中提取总RNA以构建VHH cDNA噬菌体文库。通过连续稀释和单菌落PCR分别估计文库的容量和VHH片段的插入率，结果显示文库容量约为2×10⁸以及插入率约为95％(图1B和1C)。然后，通过用MET的胞外域进行三轮生物淘选富集MET特异性VHH文库(图2A)。对于每轮，将从原始文库或富集的子文库中拯救的2×10¹¹个噬菌体颗粒加入到抗原包被的孔和相应的对照孔中。洗涤后，洗脱结合的噬菌体并计算富集参数。然后，挑选282个单独的菌落用于通过周质提取物ELISA进一步筛选MET特异性VHH，并随后对阳性菌落进行测序并且放弃重复的菌落(图2B)。

此外，所有MET特异性VHH在大肠杆菌中表达，通过固相金属亲和层析(IMAC)纯化，并进行抗原结合分析和细胞活力抑制测定(表1)。在进行大规模有效表达并通过考马斯亮蓝染色(图2C)和特异性分析(图2D)单独验证后，最终选择具有最佳表现的VHH(N45、N56、N114、N133、N146、N175、N200、N238、N263、N278)构建抗METVHH池(TOP10MIX)。进一步进行亲和力和表位竞争测定以揭示抗MET VHH池中的多重性。图2E显示单独VHH的抗原-抗体结合动力学曲线和相关拟合曲线。所含VHH的亲和力均达到纳摩尔水平，尤其是N45，其KD小于1×10^-12(图2F)。此外，在表位竞争测定中，计算后VHH之间的竞争可能性差异很大(图2G)。总体来讲，生成对细胞外MET具有高亲和力和多重靶向的抗METVHH池。

表1、筛选抗-MET VHH池的候选物。序列独特的VHH(初始筛选中282个阳性菌落中的38个)分别通过结合测定和功能分析进一步评价。在结合测定中，将100μL PBS中的500ng抗原包被于平底板孔中，并在ELISA后显示终点OD405值。在功能分析中，候选物对HepG2细胞活力的影响用WST-8方法监测，并示出归一化的VHH的抑制率。使用5D5-mAb作为阳性对照。

实施例2、抗MET VHH池在体外抑制癌细胞增殖、存活能力和集落形成

基于靶向的抗原位点和VHH本身之间的差异，尝试将抗MET VHH池最小化用于功能分析。将抗METVHH池中的单个组分分成5个簇(N45；N114；N133；N146、N175、N263；N56、N200、N238、N278)，并然后组合成12个组，即5G1-5G12(表2)。比较抗MET VHH池和所指示的亚组对HGF刺激的癌细胞活力的抑制作用，发现5G7(N45、N114、N133、N175、N238)是12组VHH中最有效的组合。随后，通过随机去掉一种组分将5G7进一步分成五组，平行地称为4G1-4G5，并且4G3(N45、N114、N175、N238)比较突出。同样地，剩下的组合再次被逐渐缩小，并且最终证明2G1(N45、N238)具有与阻断HGF刺激的整个抗MET VHH池相似的作用。这暗示N45和N238是抗METVHH池中的核心元件。将所有组合和相关结果整合在一起，并如图所示(图3A)。

表2、抗-MET VHH池的亚组。根据它们与抗原的差异和竞争性，将抗MET VHH池分至5个簇中。随机选择来自每个簇的单个VHH与其他组合，并且将12种不同组合命名为5G1-5G12。5G7在功能分析中表现突出，然后依次缩小至4G1-4G5、3G1-3G4和2G1-2G3。

组	组分(VHH#)
		5G1	N45、N114、N133、N146、N56
5G2	N45、N114、N133、N146、N200
		5G3	N45、N114、N133、N146、N238
5G4	N45、N114、N133、N146、N278
		5G5	N45、N114、N133、N175、N56
5G6	N45、N114、N133、N175、N200
		5G7	N45、N114、N133、N175、N238
5G8	N45、N114、N133、N175、N278
		5G9	N45、N114、N133、N263、N56
5G10	N45、N114、N133、N263、N200
		5G11	N45、N114、N133、N263、N238
5G12	N45、N114、N133、N263、N278
		4G1	N45、N114、N133、N175
4G2	N45、N114、N133、N238
		4G3	N45、N114、N175、N238
4G4	N45、N133、N175、N238
		4G5	N114、N133、N175、N238
3G1	N45、N114、N175
		3G2	N45、N114、N238
3G3	N114、N175、N238
		3G4	N45、N175、N238
2G1	N45、N238
		2G2	N45、N175
2G3	N175、N238

鉴于MET在维持癌细胞增殖、活力和集落形成能力方面起着至关重要的作用，随后研究体外抗MET VHH池的抗肿瘤作用。用整个抗MET VHH池、仅2G1或载体对照分别处理多种癌细胞系，包括肝细胞癌HepG2、人HGF和TPRMET(MET受体的组成型活性形式)-转化的成纤维细胞癌HGF和TPRMET-NIH3T3、肝腺癌SK-HEP-1和非小细胞肺癌HCC827，并然后分别进行细胞增殖、活力和集落形成的分析。出乎意料的是，发现与2G1和未处理的对照相比，只有整个抗MET VHH池显著限制癌细胞增殖(图3B-3E)。此外，接下来的实验结果表明，与2G1相比，整个抗MET VHH池也强烈降低癌细胞活力(图3F-3I)。从菌落形成能力的测定也观察到类似的结果(图3J-3M)。这表明整个抗MET VHH池而不是2G1具有实际治疗效果，甚至令人惊讶地有效，这也暗示多重组合引起的功效不仅仅依赖于破坏HGF诱导的MET活化。此外，为了排除人为影响的可能性，还使用MET KO HepG2细胞作为参考对照。结果显示，抗MET VHH池确实对MET缺陷型癌细胞的增殖、存活能力和集落形成没有显著影响，这表明其功能的高度特异性(图4A-4C)。总之，发现抗MET VHH池在体外特异性地、有力地并普遍地抑制癌细胞。

实施例3、抗METVHH池抑制小鼠模型中的肿瘤发生和肿瘤生长

为了进一步评估抗MET VHH池的体内抗肿瘤作用，选择两种不同的策略和三种异种移植肿瘤模型。首先，为了评估抗MET VHH组合物在肿瘤发生和肿瘤生长中的保护功能和治疗作用，HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827分别用抗MET VHH池(TOP10MIX)、抗MET单克隆抗体5D5(mAb)或载体对照(PBS)预处理或在建立后处理(图5A)。实际上，与抗MET单克隆抗体5D5(mAb)和载体对照(PBS)相比，用抗METVHH池(TOP10MIX)预处理显著抑制无胸腺nu/nu小鼠的所有三个模型中的肿瘤发生(表示为在每个时间点每组中无肿瘤小鼠的百分比)(图5B)。

为了评估抗MET VHH池在已建立的肿瘤中的治疗作用，用抗MET VHH池(TOP10MIX)、抗MET单克隆抗体5D5(mAb)或载体对照(PBS)分别处理携带异种移植肿瘤的小鼠，并随后监测(表示为在每个时间点每组中的肿瘤大小)(图5C)。皮下注射后30天对所有小鼠实施安乐死，然后切除肿瘤，拍照并测量(表示为终点时各组的肿瘤重量和体积)。结果显示，抗MET VHH池明显破坏肿瘤生长(图5D和6A)、减少肿瘤重量(图5E)和限制肿瘤体积(图6B)。图6C示出解剖肿瘤的代表性图像。为了进一步探索抗MET VHH池的治疗潜力，将治疗时间延长至45天，并将HGF和TPRMET驱动的NIH3T3肿瘤模型中的治疗肿瘤大小增加至80-90mm²，发现抗MET VHH池在长期治疗(图7A)和针对更大的肿瘤中具有相当稳定的功效(图7B)。总之，抗METVHH池有力地阻断体内的肿瘤发生和生长。

实施例4、抗MET VHH池通过内吞-溶酶体途径促进MET降解

使用生化方法探讨抗MET VHH池在癌症治疗中的作用机制。分别用载体对照(PBS)、抗METVHH池(TOP10MIX)或池中的单个VHH(包括N45、N56、N114、N133、N146、N175、N200、N238、N263和N278)处理HepG2细胞，随后用指定的抗体进行蛋白质印迹分析。与单个VHH完全不同，抗METVHH池不仅彻底阻断MET的磷酸化，而且还强烈促进其降解(图8A)。此外，这是在许多其他癌细胞系中一致的表型(图8B)。为了进一步检查抗MET VHH池是否促进体内MET降解，通过蛋白质印迹分析切除肿瘤(随机选自HGF和TPRMET驱动的NIH3T3、SK-HEP-1和HCC-827异种移植样品)中的MET的基础和磷酸化含量。令人高兴的是，与抗MET单克隆抗体5D5或PBS对照相比，除了极大地阻断肿瘤组织中MET的磷酸化状态之外，抗MET VHH池同时显著降低MET的蛋白质水平(图8C)。

此外，发现了在抗MET VHH池处理后MET下调位置和方式。由于MET是一种受体且抗MET VHH池靶向细胞外暴露的MET，首先研究细胞表面上的情况，发现当用MET VHH组合物处理时，与MET总水平的降低相比，细胞膜定位的MET几乎完全消失(图9A和9B)。考虑到内吞作用介导的溶酶体降解是膜受体再循环和降解的主要途径，随后使用多种抑制剂包括Pitstop2、Dynasore、巴弗洛霉素A1、E64D和Pepstatin A，分别阻断内吞溶酶体途径中的不同步骤。结果显示MET的降低水平大部分(如果不是完全)恢复，这表明抗MET VHH池确实通过内吞作用和溶酶体途径促进MET降解(图8D)。鉴于网格蛋白是内吞作用的最初和最重要的调节因子，接下来应用抗METVHH池进行免疫沉淀测定，发现抗MET VHH池拉下MET，而MET与网格蛋白强烈相互作用，抗MET VHH池也以MET依赖性方式免疫沉淀网格蛋白(图8E)。这表明网格蛋白在抗MET VHH池诱导的MET内吞溶酶体降解中起关键作用。因此，进一步使用网格蛋白特异性siRNA来敲低网格蛋白，并最终证实网格蛋白缺失确实阻断抗MET VHH池介导的MET降解(图8F)。图10A-10E相应地呈现所有统计量化。

综上，本发明提供了针对MET的整个外部结构域的抗MET VHH池，其中的抗MET VHH靶向MET多靶点。所述组合克服传统药物的缺点(例如，避免单克隆抗体引起的受体二聚化和活化)，并且其他优点非常明显(如增加药物-靶复合物的总分子量使内吞作用更轻松)。在体外和体内验证发现与靶向MET单克隆抗体或单个VHH相比，抗MET VHH池通过内吞-溶酶体途径强烈促进MET降解。抗MET VHH池不仅彻底阻断MET的磷酸化，而且还显著降低MET水平，这有助于抑制许多癌细胞系的增殖、生存能力和集落形成。此外，它在许多异种移植的小鼠模型中预防肿瘤发生和阻断肿瘤进展。

另一方面，本发明所提供的抗MET VHH池包含10种相同浓度的单独的VHH，混合物比(GxS)y接头连接的多特异性或多价抗体更容易制备。此外，多种VHH的混合物比(GxS)y接头连接的多个VHH的融合物更加稳定(数据未显示)。与多靶向常规抗体相比，VHH池更容易大规模产生。

此外，许多证据表明单个分子中的不同结构域(或残基)发挥各种不同的功能来促进癌症的形成。内吞作用过程中，暴露于内体的外部的部分在进入溶酶体进行降解之前仍然可能发挥一些原始作用，例如EGFR。从这个角度来看，与常规抗体相比，VHH池具有潜在的能力，同时靶向单个分子中更难以接近的关键点。

另外，本发明发现抗MET VHH池介导的MET内吞作用实际上部分依赖于网格蛋白。这是首次揭示网格蛋白在多靶向VHH联合治疗中的关键作用。尽管许多基于网格蛋白的抑制剂已经成功开发，但靶向网格蛋白的激动剂仍处于空白状态。与抗MET VHH组合物或常规的MET靶向治疗性抗体组合从而激活网格蛋白可能是更好的选择。

本发明建立一个优化的抗MET VHH池，它通过内吞-溶酶体途径诱导MET降解来克服治疗抗性(图11)。该策略不仅提高癌症治疗功效，而且避免复杂工程生物材料(例如基因工程抗体)的产生和生产的限制。抗MET VHH池是MET靶向癌症治疗的有吸引力的候选者。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表：

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序列表

<110> 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司

<120> MET结合分子、其组合和用途

<130> I2019TC3486CB

<150> 201811165140.9

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<220>

<223> N263-CDR2 KABAT

<400> 26

Ala Ile Tyr Lys Gly Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N263-CDR3 KABAT

<400> 27

Asp Tyr Arg Cys Gly Gly Ser Trp Trp Thr Arg Ala Ala Asp Phe Ala

1 5 10 15

Tyr

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N278-CDR1 KABAT

<400> 28

Ser Tyr Cys Leu Ala

1 5

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N278-CDR2 KABAT

<400> 29

Asp Ile Asp Ala Val Gly Lys Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Met Gly

1 5 10 15

<210> 30

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N278-CDR3 KABAT

<400> 30

Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45-CDR1 Chothia

<400> 31

Gly Tyr Thr Tyr Thr Ser Asn

1 5

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45-CDR2 Chothia

<400> 32

Tyr Thr Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45-CDR3 Chothia

<400> 33

Gly Gly Gln Thr Ser Gly Ala Tyr Thr Pro Cys Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56-CDR1 Chothia

<400> 34

Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56-CDR2 Chothia

<400> 35

Asp Ser Val Gly Arg

1 5

<210> 36

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56-CDR3 Chothia

<400> 36

Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Lys Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N114-CDR1 Chothia

<400> 37

Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly Ala

1 5

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N114-CDR2 Chothia

<400> 38

Ala Ile Asp Gly Thr

1 5

<210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N114-CDR3 Chothia

<400> 39

Gly Ala Asp Gly Gly Ser Arg Tyr Ala Pro Cys Ala Tyr Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N133-CDR1 Chothia

<400> 40

Ser Gly Tyr Thr Asp Ser Ala Tyr

1 5

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N133-CDR2 Chothia

<400> 41

Asp Ala Val Gly Arg

1 5

<210> 42

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N133-CDR3 Chothia

<400> 42

Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Lys Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N146-CDR1 Chothia

<400> 43

Ser Ala Asp Thr Tyr Ser Thr Tyr

1 5

<210> 44

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N146-CDR2 Chothia

<400> 44

Tyr Lys Gly Gly Ala Ser

1 5

<210> 45

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N146-CDR3 Chothia

<400> 45

Asp Tyr Arg Cys Gly Ser Ser Trp Trp Thr Arg Thr Ala Asp Phe Pro

1 5 10 15

Tyr

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N175-CDR1 Chothia

<400> 46

Ser Ala Asp Thr Tyr Ser Thr Tyr

1 5

<210> 47

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N175-CDR2 Chothia

<400> 47

Tyr Lys Gly Gly Ala Ser

1 5

<210> 48

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N175-CDR3 Chothia

<400> 48

Asp Tyr Arg Cys Gly Ser Ser Trp Trp Thr Arg Thr Ala Asp Phe Pro

1 5 10 15

Tyr

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N200-CDR1 Chothia

<400> 49

Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr Tyr

1 5

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N200-CDR2 Chothia

<400> 50

Asp Ala Val Gly Arg

1 5

<210> 51

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N200-CDR3 Chothia

<400> 51

Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Lys Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N238-CDR1 Chothia

<400> 52

Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Ser Tyr

1 5

<210> 53

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N238-CDR2 Chothia

<400> 53

Asp Ala Val Gly Lys

1 5

<210> 54

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N238-CDR3 Chothia

<400> 54

Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N263-CDR1 Chothia

<400> 55

Ser Lys Tyr Thr Ala Ser Thr Tyr

1 5

<210> 56

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N263-CDR2 Chothia

<400> 56

Tyr Lys Gly Gly Thr Ser

1 5

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N263-CDR3 Chothia

<400> 57

Asp Tyr Arg Cys Gly Gly Ser Trp Trp Thr Arg Ala Ala Asp Phe Ala

1 5 10 15

Tyr

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N278-CDR1 Chothia

<400> 58

Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Ser

1 5

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N278-CDR2 Chothia

<400> 59

Asp Ala Val Gly Lys

1 5

<210> 60

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N278-CDR3 Chothia

<400> 60

Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 61

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N45

<400> 61

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ser Asn

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Val Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Gly Gln Thr Ser Gly Ala Tyr Thr Pro Cys Gly Tyr Asn

100 105 110

Tyr Tyr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 62

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N56

<400> 62

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

20 25 30

Cys Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Ile

35 40 45

Val Asp Ile Asp Ser Val Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Lys Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 63

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N114

<400> 63

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly Ala

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Val Ile Ala Ile Asp Gly Thr Ile Ser Tyr Arg Glu Tyr Leu Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ala Ser Lys Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Gly Ala Asp Gly Gly Ser Arg Tyr Ala Pro Cys Ala Tyr Ala Tyr

100 105 110

Tyr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 64

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N133

<400> 64

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Ser Ala Tyr

20 25 30

Cys Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Ile

35 40 45

Val Asp Ile Asp Ala Val Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Lys Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 65

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N146

<400> 65

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ala Asp Thr Tyr Ser Thr Tyr

20 25 30

Cys Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Tyr Lys Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp His Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Tyr Arg Cys Gly Ser Ser Trp Trp Thr Arg Thr Ala Asp

100 105 110

Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 66

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N175

<400> 66

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ala Asp Thr Tyr Ser Thr Tyr

20 25 30

Cys Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Tyr Lys Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp His Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Tyr Arg Cys Gly Ser Ser Trp Trp Thr Arg Thr Ala Asp

100 105 110

Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 67

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N200

<400> 67

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Pro Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr Tyr

20 25 30

Cys Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Val Asp Ile Asp Ala Val Gly Arg Ala Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Lys Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N238

<400> 68

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Ser Tyr

20 25 30

Cys Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Ile

35 40 45

Val Asp Ile Asp Ala Val Gly Lys Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Met

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 69

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N263

<400> 69

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Lys Tyr Thr Ala Ser Thr Tyr

20 25 30

Cys Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Tyr Lys Gly Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Tyr Arg Cys Gly Gly Ser Trp Trp Thr Arg Ala Ala Asp

100 105 110

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 70

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N278

<400> 70

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Asn Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Ser Tyr

20 25 30

Cys Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Ile

35 40 45

Val Asp Ile Asp Ala Val Gly Lys Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Met

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Asn Leu Ser Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Gly Gly Tyr Cys Arg Arg Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 71

<211> 908

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MET

<400> 71

Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys

1 5 10 15

Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile

20 25 30

Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val

35 40 45

Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro

50 55 60

Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys

65 70 75 80

Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu

85 90 95

Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val

100 105 110

Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala

115 120 125

Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu

130 135 140

Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val

145 150 155 160

Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr

165 170 175

Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val

180 185 190

Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln

195 200 205

Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys

210 215 220

Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val

225 230 235 240

Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg

245 250 255

Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu

260 265 270

Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu

275 280 285

Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln

290 295 300

Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly

305 310 315 320

Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser

325 330 335

Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys

340 345 350

Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro

355 360 365

Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly

370 375 380

Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu

385 390 395 400

Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr

405 410 415

Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly

420 425 430

Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro

435 440 445

Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro

450 455 460

Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val

465 470 475 480

Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys

485 490 495

Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val

500 505 510

Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu

515 520 525

Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val

530 535 540

Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys

545 550 555 560

Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys

565 570 575

Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu

580 585 590

Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys

595 600 605

His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln

610 615 620

Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro

625 630 635 640

Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn

645 650 655

Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr

660 665 670

Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro

675 680 685

Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu

690 695 700

Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val

705 710 715 720

Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile

725 730 735

Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val

740 745 750

Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His

755 760 765

Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln

770 775 780

Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp

785 790 795 800

Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val

805 810 815

Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn

820 825 830

Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly

835 840 845

Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His

850 855 860

Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn

865 870 875 880

Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu

885 890 895

Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe Thr

900 905

<210> 72

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5D5-HC

<400> 72

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 73

<211> 220

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5D5-LC

<400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr

20 25 30

Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 74

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgG1-FC

<400> 74

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 75

<211> 559

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sema-His

<400> 75

Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys

1 5 10 15

Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile

20 25 30

Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val

35 40 45

Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro

50 55 60

Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys

65 70 75 80

Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu

85 90 95

Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val

100 105 110

Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala

115 120 125

Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu

130 135 140

Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val

145 150 155 160

Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr

165 170 175

Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val

180 185 190

Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln

195 200 205

Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys

210 215 220

Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val

225 230 235 240

Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg

245 250 255

Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu

260 265 270

Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu

275 280 285

Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln

290 295 300

Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly

305 310 315 320

Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser

325 330 335

Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys

340 345 350

Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro

355 360 365

Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly

370 375 380

Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu

385 390 395 400

Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr

405 410 415

Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly

420 425 430

Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro

435 440 445

Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro

450 455 460

Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val

465 470 475 480

Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys

485 490 495

Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val

500 505 510

Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu

515 520 525

Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Gly

530 535 540

Ser Met Asp Pro Gly Gly Ser His His His His His His His His

545 550 555

Claims

1.分离的肝细胞生长因子受体(MET)结合分子，其包含免疫球蛋白可变结构域且特异性结合MET，

其中所述免疫球蛋白可变结构域包含选自以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(1) SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2，SEQ ID NO:3所示的CDR3；

(2) SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2，SEQ ID NO:6所示的CDR3；

(3) SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2，SEQ ID NO:9所示的CDR3；

(4) SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2，SEQ ID NO:12所示的CDR3；

(5) SEQ ID NO:13所示的CDR1，SEQ ID NO:14所示的CDR2，SEQ ID NO:15所示的CDR3；

(6) SEQ ID NO:16所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:18所示的CDR3；

(7) SEQ ID NO:19所示的CDR1，SEQ ID NO:20所示的CDR2，SEQ ID NO:21所示的CDR3；

(8) SEQ ID NO:22所示的CDR1，SEQ ID NO:23所示的CDR2，SEQ ID NO:24所示的CDR3；

(9) SEQ ID NO:25所示的CDR1，SEQ ID NO:26所示的CDR2，SEQ ID NO:27所示的CDR3；和

(10) SEQ ID NO:28所示的CDR1，SEQ ID NO:29所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3，

或者，所述免疫球蛋白可变结构域包含选自以下的根据Chothia定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(1) SEQ ID NO:31所示的CDR1，SEQ ID NO:32所示的CDR2，SEQ ID NO:33所示的CDR3；

(2) SEQ ID NO:34所示的CDR1，SEQ ID NO:35所示的CDR2，SEQ ID NO:36所示的CDR3；

(3) SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:38所示的CDR2，SEQ ID NO:39所示的CDR3；

(4) SEQ ID NO:40所示的CDR1，SEQ ID NO:41所示的CDR2，SEQ ID NO:42所示的CDR3；

(5) SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:44所示的CDR2，SEQ ID NO:45所示的CDR3；

(6) SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:47所示的CDR2，SEQ ID NO:48所示的CDR3；

(7) SEQ ID NO:49所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:51所示的CDR3；

(8) SEQ ID NO:52所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:54所示的CDR3；

(9) SEQ ID NO:55所示的CDR1，SEQ ID NO:56所示的CDR2，SEQ ID NO:57所示的CDR3；和

(10) SEQ ID NO:58所示的CDR1，SEQ ID NO:59所示的CDR2，SEQ ID NO:60所示的CDR3。

2.权利要求1的MET结合分子，其中所述免疫球蛋白可变结构域包含SEQ ID NO:61-70中任一的氨基酸序列。

3.权利要求1的MET结合分子，其中所述免疫球蛋白可变结构域是(1)人源化的免疫球蛋白可变结构域；或(2)VHH；或(3)人源化的VHH。

4.权利要求1-3中任一项的MET结合分子，其中所述MET结合分子进一步包含延长体内半衰期的部分和/或所述MET结合分子进一步包含适于多肽表达、检测、分离和/或纯化的标签。

5.一种组合物，其包含选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子中的两种或更多种MET结合分子，所述两种或更多种MET结合分子特异性结合MET上的不同表位。

6.权利要求5的组合物，其中所述两种或更多种MET结合分子特异性结合MET的胞外部分上的不同表位。

7.权利要求5的组合物，其包含选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子中的至少2种不同的MET结合分子，所述至少2种不同的MET结合分子各自包含免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(1) SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2，SEQ ID NO:3所示的CDR3；和

(2) SEQ ID NO:22所示的CDR1，SEQ ID NO:23所示的CDR2，SEQ ID NO:24所示的CDR3；

(1) SEQ ID NO:31所示的CDR1，SEQ ID NO:32所示的CDR2，SEQ ID NO:33所示的CDR3；和

(2) SEQ ID NO:52所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:54所示的CDR3。

8.权利要求7的组合物，其中所述至少2种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO:61和68所示氨基酸序列。

9.权利要求5的组合物，其包含选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子中的至少4种不同的MET结合分子，所述至少4种不同的MET结合分子各自包含免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(2) SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2，SEQ ID NO:9所示的CDR3；

(3) SEQ ID NO:16所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:18所示的CDR3；和

(4) SEQ ID NO:22所示的CDR1，SEQ ID NO:23所示的CDR2，SEQ ID NO:24所示的CDR3；

(2) SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:38所示的CDR2，SEQ ID NO:39所示的CDR3；

(3) SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:47所示的CDR2，SEQ ID NO:48所示的CDR3；和

(4) SEQ ID NO:52所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:54所示的CDR3。

10.权利要求9的组合物，其中所述至少4种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO:61、63、66和68所示氨基酸序列。

11.权利要求5的组合物，其包含选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子中的至少5种不同的MET结合分子，所述至少5种不同的MET结合分子各自包含免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(3) SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2，SEQ ID NO:12所示的CDR3；

(4) SEQ ID NO:16所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:18所示的CDR3；和

(5) SEQ ID NO:22所示的CDR1，SEQ ID NO:23所示的CDR2，SEQ ID NO:24所示的CDR3；

(3) SEQ ID NO:40所示的CDR1，SEQ ID NO:41所示的CDR2，SEQ ID NO:42所示的CDR3；

(4) SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:47所示的CDR2，SEQ ID NO:48所示的CDR3；和

(5) SEQ ID NO:52所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:54所示的CDR3。

12.权利要求11的组合物，其中所述至少5种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO:61、63、64、66和68所示氨基酸序列。

13.权利要求5的组合物，其包含选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子中的至少10种不同的MET结合分子，所述至少10种不同的MET结合分子各自包含免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

(10) SEQ ID NO:28所示的CDR1，SEQ ID NO:29所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3；

14.权利要求13的组合物，其中所述至少10种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO:61-70所示氨基酸序列。

15.核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项的MET结合分子。

16.表达载体，其包含与表达调控元件可操作地连接的权利要求15的核酸分子。

17.宿主细胞，其包含权利要求15的核酸分子或以权利要求16的表达载体转化，并能够表达所述MET结合分子。

18.产生权利要求1-4中任一项的MET结合分子的方法，包括：

a) 在允许所述MET结合分子表达的条件下培养权利要求17的宿主细胞；

b) 从得自步骤a)的培养物回收由所述宿主细胞表达的MET结合分子；及

c) 任选进一步纯化和/或修饰得自步骤b)的MET结合分子。

19.治疗性缀合物，其包含与治疗性部分缀合的权利要求1-4任一项的MET结合分子。

20.权利要求19的治疗性缀合物，其中所述治疗性部分包括细胞毒素、生物活性蛋白质或放射性同位素。

21.药物组合物，其包含权利要求1-4任一项的MET结合分子或权利要求5-14任一项的组合物或权利要求19或20的治疗性缀合物，以及药学上可接受的载体。

22.权利要求1-4任一项的MET结合分子或权利要求5-14任一项的组合物或权利要求19或20的治疗性缀合物或权利要求21的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中预防和/或治疗癌症、降低MET磷酸化水平、降低MET水平或促进MET降解。

23.权利要求22的用途，所述预防和/或治疗癌症还包括给所述对象施用标准化疗、标准放疗或靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体。

24.权利要求23的用途，其中所述靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体包括抗EGFR抗体、抗EGFR变体的抗体、抗VEGFa抗体、抗HER2抗体。

25.权利要求22的用途，其中所述癌症选自脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、阴道癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、头颈癌或黑色素瘤。

26.选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子中的两种或更多种MET结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中预防和/或治疗癌症、降低MET磷酸化水平、降低MET水平或促进MET降解，所述两种或更多种MET结合分子特异性结合MET上的不同表位。

27.权利要求26的用途，其中所述两种或更多种MET结合分子特异性结合MET的胞外部分上的不同表位。

28.选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子中的至少2种不同的MET结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中预防和/或治疗癌症、降低MET磷酸化水平、降低MET水平或促进MET降解，所述至少2种不同的MET结合分子各自包含免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

29.权利要求28的用途，其中所述至少2种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO:61和68所示氨基酸序列。

30.选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子中的至少4种不同的MET结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中预防和/或治疗癌症、降低MET磷酸化水平、降低MET水平或促进MET降解，所述至少4种不同的MET结合分子各自包含免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

31.权利要求30的用途，其中所述至少4种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO:61、63、66和68所示氨基酸序列。

32.选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子中的至少5种不同的MET结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中预防和/或治疗癌症、降低MET磷酸化水平、降低MET水平或促进MET降解，所述至少5种不同的MET结合分子各自包含免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

33.权利要求32的用途，其中所述至少5种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO:61、63、64、66和68所示氨基酸序列。

34.选自权利要求1-4中任一项的MET结合分子的至少10种不同的MET结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于在对象中预防和/或治疗癌症、降低MET磷酸化水平、降低MET水平或促进MET降解，所述至少10种不同的MET结合分子各自包含免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域各自包含以下的根据KABAT定义的CDR1、CDR2和CDR3：

35.权利要求34的用途，其中所述至少10种不同的MET结合分子分别包含SEQ ID NO:61-70所示氨基酸序列。

36.权利要求26-35任一项的用途，所述预防和/或治疗癌症还包括给所述对象施用标准化疗、标准放疗或靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体。

37.权利要求36的用途，其中所述靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体包括抗EGFR抗体、抗EGFR变体的抗体、抗VEGFa抗体、抗HER2抗体。

38.权利要求26-35任一项的用途，其中所述癌症选自脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、阴道癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、头颈癌或黑色素瘤。

39.权利要求1-4任一项的MET结合分子在制备用于检测生物学样品中MET的存在和/或MET的表达水平的的试剂盒中的用途，包括：

a) 在权利要求1-4任一项的MET结合分子与MET之间能够形成复合物的条件下，使所述生物学样品和对照样品接触权利要求1-4任一项的MET结合分子；

b) 检测复合物的形成，

其中所述生物学样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中MET的存在和/或MET的表达水平。

40.权利要求1-4任一项的MET结合分子在制备用于诊断MET相关疾病的试剂盒中的用途。

41.权利要求40的用途，其中所述MET相关疾病为癌症。

42.一种用于诊断MET相关疾病的试剂盒，其包含权利要求1-4任一项的MET结合分子。

43.权利要求42的试剂盒，其中所述MET相关疾病为癌症。