KR20150032075A

KR20150032075A - Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체를 포함하는 항암제

Info

Publication number: KR20150032075A
Application number: KR1020130112089A
Authority: KR
Inventors: 김경은; 한상열; 고규영; 이효선; 김찬
Original assignee: 삼성전자주식회사; 한국과학기술원
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2015-03-25
Also published as: US20150079112A1; EP3272772B1; US9505841B2; KR102196450B1; EP2848631B1; EP3272772A1; EP2848631A1

Abstract

신생혈관형성 유도인자인 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2; Ang2)에 특이적으로 결합하고, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하는, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 항암 보조제 및 병용 투여용 약학 조성물이 제공된다.

Description

Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체를 포함하는 항암제{Anticancer composition containing an anti-Ang2 antibody inducing binding to Tie2 receptor}

앤지오포이에틴-1(Angiopoietin-1; Ang1)과 앤지오포이에틴-2(Angiopoietin-2; Ang2)는 혈관 내피세포 특이적으로 발현된 Tie2 수용체에 결합하여 혈관 신생 (angiogenesis) 및 혈관 리모델링 (vascular remodeling)에 있어서 복잡한 역할을 수행한다.

Ang1은 Tie2 수용체를 활성화 시키는 리간드로서, 혈관의 형성과 성숙 (maturation)에 관여하며, 혈관 내피세포와 주변세포(pericyte)와의 상호작용을 증가시킴으로써 혈관의 안정화(stabilization)에 기여하는 것으로 알려져 있다. 또한, Ang1은 혈관내피세포의 barrier function을 유지시킴으로써 혈관의 안정화를 유지하는 주요 조절제(key regulator)로서 작용한다. VEGF의 과발현 또는 염증 상태에서는 혈관내피세포가 활성화되며, 혈관 투과도(vascular permeability)가 증가된다. 이때, Ang1은 혈관내피세포의 junctional integrity를 촉진함으로써 혈관내피세포의 안정화를 유도하고 혈관 투과도를 감소시키는 역할을 한다.

Ang2 의 경우에 다양한 고형암 및 혈액암에서 과발현이 보고되어 있으며, 혈청내의 Ang2 발현 정도가 항암 치료의 나쁜 예후(poor prognosis)의 바이오마커 가 되기도 한다. 암뿐 아니라 패혈증, 박테리아 감염, 폐 또는 신장 손상 등의 다양한 질병에서 Ang2의 과발현이 보고되고 있다. 이와 같이 과발현된 Ang2는 Ang1과 경쟁함으로써 Ang1에 의한 혈관내피세포 안정화를 억제하는 역할을 한다. 이와 같은 병리적 상태와의 연관성으로 인하여, Ang2는 therapeutic intervention에 있어서의 표적으로 고려되어 왔다. 현재 이를 표적으로 하는 다수의 약물이 임상 또는 전임상 단계에서 개발 중이며, 그 형태도 펩티바디(peptibody), 이중특이항체(bispecific antibody), 단클론항체 등 다양하다.

그러나 이들 대부분의 Ang2 표적 약물은 Ang2가 Tie2 수용체에 결합하는 것을 저해한다.

본 발명의 일 예는 신생혈관형성 유도인자인 Ang2(Angiopoietin-2)에 특이적으로 결합하고, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하여 Tie2 수용체의 활성화를 유도하는, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체의 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 Ang2가 결합된 항 Ang2 항체-Ang2 복합체를 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체-Ang2 복합체를 유효성분으로 포함하는 Tie2 수용체 활성화용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성 저해를 위한 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관 투과성 감소를 위한 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 정상 혈관 생성 유도를 위한 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성, 혈관 투과성 증가, 및/또는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항암제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체 활성화를 위한 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 Ang2 과발현과 관련된 질병의 진단용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, Ang2, 및 Tie2 수용체가 결합된 복합체를 제공한다.

본 발명자들은 Ang2 특이적으로 결합하지만 Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하지 않으며 Ang2와 Tie2 수용체와 함께 복합체(항체/Ang2/Tie2)를 이루는 항체가, 항체의 이합체화(dimerization)를 유도하는 특성을 가지며, 이를 통하여 여기에 복합체화되어 있는 Tie2 수용체를 효과적으로 클러스터링(clustering)시킴으로써, Tie2 수용체 및 이의 하류 신호화 (downstream signaling)의 활성화를 유도할 수 있게 된다는 것을 확인하였다. 이러한 작용 기작을 갖는 항체는 Ang2와 결합하여 세포내 이동(internalization) 및 분해를 유도함으로써 Ang2 기능을 저해하여 circulating Ang2 level을 낮추는 역할을 함과 동시에, Ang2와 함께 Tie2 수용체와 결합하여 Ang1처럼 Tie2 수용체를 활성화시켜 Tie2 downstream signaling을 유도하고 혈관의 정상화 (normalization)를 유도하는, Ang2 중화(neutralization; 신생혈관 억제) 및 혈관 정상화의 이중 작용(dual function)을 갖는다. 혈관 정상화는 비정상적으로 형성된 암 혈관이 구조 및 기능적으로 정상적인 상태로 바뀌는 것을 의미하는 것으로, 암 혈관이 정상적인 구조를 가지고 혈관 투과성이 감소되며 정상적 기능 수행 능력이 회복된 것을 의미한다.

본 발명은 신생혈관형성 유도인자인 Ang2를 표적으로 하는 치료용 항체에 관한 것으로, Ang2에 특이적으로 결합함으로써 Ang2의 기능을 저해하여 신생혈관 형성을 억제하고 암 조직 내 혈관 밀도를 감소시킬 뿐 아니라, Ang2와 함께 Tie2에 결합하여 Tie2의 활성화를 유도하여 혈관을 구조적 및/또는 기능적으로 정상화시키는 항 Ang2 항체에 관한 것이다. 상기 항 Ang2 항체는 암, 패혈증, 안구질환 등 혈관의 비정상적 활성화 및 기능이상(dysfunction)과 관련된 질병에서 Ang2의 하향조절(downregulation)과 함께, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하여 Tie2 수용체를 활성화 시킴으로써 혈관의 구조적/기능적 정상화(normalization)를 유도함으로써 질병을 치료하는 효과를 갖는다.

또한, 본 발명에서 제공되는 Ang2 항체는, 앞서 설명한 바와 같이, Ang2 중화에 따른 신생혈관 저해 및 혈관 정상화의 기능을 모두 가짐으로써, 다양한 종류의 항암제와의 병용 투여시 함께 투여되는 항암제의 암세포 또는 암조직으로의 전달 효율을 증가시킴으로써 항암효능을 향상시키는 보조제 (효능 증강제) 또는 감작제 (sensitizer)로서도 유용하다.

구체적으로, 본 발명의 일 예는 신생혈관형성 유도인자인 Ang2(Angiopoietin-2)에 특이적으로 결합(인식)하고, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하는, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 즉, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2를 특이적으로 인식하고, Ang2와 Tie2 수용체 모두에 결합하는 것일 수 있다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Tie2 수용체의 활성화를 유도하는 것일 수 있다. 이와 같은 Tie2 수용체의 활성화는 Tie2 수용체의 인산화 증가 및/또는 그 하부 신호 경로와 관련된 단백질, 예컨대 Akt(NM_005163), eNOS(NM_000603), 42/44(NM_002745) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 인산화에 의하여 유도될 수 있다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Tie2 수용체의 세포 내부로의 이동 (internalization)을 유도하는 것일 수 있다. 즉, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2에 특이적으로 결합하면서도, 기존의 항 Ang2 항체와 달리, Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하지 않음으로써, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하여 복합체를 형성하고, Tie2 수용체의 활성화를 유도하는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 항체의 항원으로 작용하는 Ang2 단백질은 신생혈관 형성과 밀접한 관련이 있으며 혈액 내에 존재하는 가용성 리간드로서, 신생혈관 생성(angiogenesis), 암전이(metastasis), 암세포 침투(invasion) 에 광범위하게 작용한다. 상기 Ang2는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대 인간 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O15123 등), 원숭이 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. Q8MIK6 등), 마우스 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35608 등), 래트 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35462 등) 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

Tie2 수용체(TEK tyrosine kinase)는 안지오포이에틴-1 수용체로, 마우스(NM_013690; NP_038718), 래트, 인간(NM_000459; NP_000450) 등의 다양한 포유동물의 혈관내피세포(endothelial cell)에서 발현되며, 다양한 downstream signaling에 관여한다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2 특이적으로 결합하지만 Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하지 않으며 Ang2와 Tie2 수용체와 함께 복합체(항체/Ang2/Tie2)를 이루는 항체로서, 항체의 이합체화(dimerization)를 유도하는 특성을 가지며, 이를 통하여 여기에 복합체화되어 있는 Tie2 수용체를 효과적으로 클러스터링(clustering)시킴으로써, Tie2 수용체 및 이의 하류 신호화 (downstream signaling)의 활성화를 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이러한 작용 기작으로 인하여, 본 발명의 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와 결합하여 세포내 이동(internalization) 및 분해를 유도함으로써 Ang2 기능을 저해하여 circulating Ang2 level을 낮추는 역할을 함과 동시에, Ang2와 함께 Tie2 수용체와 결합하여 Ang1처럼 Tie2 수용체를 활성화시켜 혈관내피세포의 안정화를 유도하는 이중 작용(dual function)을 가짐으로써, Ang2 과발현에 의한 증상(질환)뿐 아니라 혈관내피세포의 안정화 저하, 즉 혈관 침투성 증가로 인한 증상(질환)의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 혈관을 정상화시킴으로써 치료 약물의 병변 조직(예컨대 Ang2 발현 암조직)으로의 전달을 용이하게 하고 약물에 대한 민감성(sensitiveness)를 증가시켜, 약물의 치료 효능을 증대시키고, 적은 용량의 약물로도 소망하는 효과를 달성할 수 있도록 할 수 있다. 따라서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 기존의 치료 약물, 예컨대 항암제와 병용투여하여 상기 항암제의 효능을 증대시키기 위한 보조제로 사용될 수 있다.

상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2 (hAng2; 서열번호 11; Accession # O15123) 의 루프 1 (서열번호 11 중 417번째 아미노산부터 434번째 아미노산까지의 부위)의 전부 또는 일부(예컨대, 루프 중 외부에 노출된 아미노산 잔기 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기) 또는 서열번호 11 중에서 루프 1의 외부에 노출된 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 연속하거나 연속하지 않는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로서 인식하거나, 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

Ang2 (서열번호 11)

MWQIVFFTLS CDLVLAAAYN NFRKSMDSIG KKQYQVQHGS CSYTFLLPEM DNCRSSSSPY

VSNAVQRDAP LEYDDSVQRL QVLENIMENN TQWLMKLENY IQDNMKKEMV EIQQNAVQNQ

TAVMIEIGTN LLNQTAEQTR KLTDVEAQVL NQTTRLELQL LEHSLSTNKL EKQILDQTSE

INKLQDKNSF LEKKVLAMED KHIIQLQSIK EEKDQLQVLV SKQNSIIEEL EKKIVTATVN

NSVLQKQQHD LMETVNNLLT MMSTSNSAKD PTVAKEEQIS FRDCAEVFKS GHTTNGIYTL

TFPNSTEEIK AYCDMEAGGG GWTIIQRRED GSVDFQRTWK EYKVGFGNPS GEYWLGNEFV

SQLTNQQRYV LKIHLKDWEG NEAYSLYEHF YLSSEELNYR IHLKGLTGTA GKISSISQPG

NDFSTKDGDN DKCICKCSQM LTGGWWFDAC GPSNLNGMYY PQRQNTNKFN GIKWYYWKGS

GYSLKATTMM IRPADF

예컨대, 상기 항 Ang2 항체는 서열번호 11의 루프 1에 위치하는 Q418, P419, Q418과 P419와의 조합, 또는 서열번호 11 중에서 Q418, P419, Q418과 P419와의 조합의 아미노산 잔기를 포함하는 연속하거나 연속하지 않는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 일 예에서 상기 항 Ang2 항체는 서열번호 11의 Q418 및 P419의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부분에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

상기 항 Ang2 항체가 특이적으로 결합하는 부위인 Q418, P419, 또는 이를 포함하는 아미노산 부위는 Ang2의 3차원 구조의 루프 1에 위치하는 노출된 아미노산 잔기로서, Ang2와 Tie2 수용체 간의 결합에 직접 관여하거나, 이를 조절하는 부위인 것으로 여겨진다.

상기 항 Ang2 항체가 특이적으로 결합하는 부위인 Q418, P419, 또는 이를 포함하는 아미노산 부위에 있어서, "연속하지 않는 아미노산"은 단백질의 2차 또는 3차 구조상에서는 서로 인접하지만, 아미노산 서열 상에서는 연속하지 않는 아미노산을 의미하는 것일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "연속하거나 연속하지 않는 아미노산 잔기"는 단백질의 1차, 2차 또는 3차 구조 상에서 연속하는 아미노산 잔기를 의미하는 것일 수 있다.

또한, 상기 부위를 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 항 Ang2 항체뿐 아니라, 상기 항 Ang2 항체와 경쟁적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 역시 Ang2를 저해하면서 동시에 Ang2와 Tie2 수용체와 복합체를 형성하여(즉, 항체-Ang2가 Tie2 수용체에 결합하여), Tie2를 활성화시킬 수 있다. 이와 같이 경쟁적으로 결합하는 항체는 앞서 기술한 부위와 3차원 구조상의 인접한 부위를 에피토프 및/또는 특이적 결합 부위로 인식하는 항체일 수 있다. 상기 경쟁적으로 결합하는 항체는 Ang2와의 결합 친화도가 0.1pM 내지 50nM, 구체적으로 1pM 내지 30nM, 2pM 내지 20nM 또는 1nM 내지 10nM인 것일 수 있다.

따라서, 본 발명의 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 부위를 에피토프로서 인식하거나 여기에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

구체예에서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 중쇄(Heavy chain) 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR), 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변 영역:

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경쇄(Light chain) 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정부위의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다:

보다 구체적으로, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위: 및

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위

를 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 상보성 결정 부위는 예컨대 다음의 표 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

중쇄 CDR 아미노산 서열
CDRH1-KABAT	CDRH2-KABAT	CDRH3-KABAT
SDYAWN (서열번호1)	YINYSGNTDYNPSLKS (서열번호 2)	GNFEGAMDY (서열번호3)

또한 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 상보성 결정 부위는 예컨대 다음의 표 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

경쇄 CDR 아미노산 서열
CDRL1-KABAT	CDRL2-KABAT	CDRL3-KABAT
KASQSVSNDVA (서열번호4)	YASNRYP (서열번호 5)	QQDYSSPWT (서열번호 6)

일 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다:

VQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YINYSGNTDYNPSLKS RSSITRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR GNFEGAMDY WG (서열번호 7)

(상기 서열번호 7에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDRH1, CDRH2, CDRH3 임)

일 구체예에 따른 항체의 경쇄는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYP GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYSSPWT FGGGTKLEIK (서열번호 9)

(상기 서열번호 9에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDRL1, CDRL2, CDRL3 임)

따라서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로만 이루어진 것이 아닐 수 있다.

또 다른 예에서, 상기한 에피토프를 이용하여 Ang2 과발현, 신생혈관 형성, 혈관 투과성 증진, 및/또는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 진단, 예방 및/또는 치료를 위한 후보 물질, 예컨대 항 Ang2 항체를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 상기 스크리닝 방법은,

(a) 상술한 앤지오포이에틴-2의 3차 구조의 에피토프에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 에피토프와 후보 화합물과의 결합력을 측정하는 단계

를 포함할 수 있다.

상기 스크리닝 방법은 (c) Ang2와 Tie2 수용체 간의 결합을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계는 상기 후보 화합물이 Ang2와 Tie2 수용체 간 결합을 저해하는지 여부를 확인하기 위한 것으로, 상기 (b) 단계 전, 후 또는 이와 동시에 수행할 수 있다. 상기 단계 c)를 통하여 Ang2에 결합하면서 Ang2와 Tie2 수용체 간의 결합을 저해하지 않는, 즉 Ang2와 Tie2 수용체 간의 결합을 유도하는 특성을 갖는 항 Ang2 항체를 스크리닝할 수 있다.

또한 상기 스크리닝 방법은 (d) Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체의 활성화를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 그 포함되는 순서는 제한이 없다. 상기 단계 d)를 통하여, Ang2에 결합하여 그 활성을 저해하지만, Ang2와 결합하여 Ang2와 Tie2 수용체 간의 결합을 유도하고, Ang1과 같은 Tie2 수용체 활성화 효과를 나타내는, 항 Ang2 항체를 스크리닝할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 있어서. 상기 에피토프와 후보 화합물이 10nM 이하, 예컨대, 0.1 pM 내지 10 nM 범위, 또는 10 pM 내지 10 nM, 또는 100 pM 내지 10 nM 범위의 결합력(kd)을 보이는 경우, 또는 상기 에피토프와 후보 화합물이 상기와 같은 결합력을 보이면서 Ang2와 Tie2 수용체 간 결합이 확인되는 경우 (즉, 상기 후보 화합물이 Ang2와 Tie2 수용체 간 결합을 저해하지 않는 경우), 상기 후보 화합물을 Ang2 과발현, 신생혈관 형성, 혈관 투과성 증진, 및/또는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 진단, 예방, 및/또는 치료를 위한 후보 물질, 예컨대 항 Ang2 항체 후보 물질로 판단할 수 있다.

상기 에피토프는 인간 Ang-2 (hAng-2; 서열번호 11; Accession # O15123) 의 루프 1 (서열번호 11 중 417번째 아미노산부터 434번째 아미노산까지의 부위)의 전부, 일부(예컨대, 루프 1 중 외부에 노출된 아미노산 잔기 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상), 또는 서열번호 11 중에서 루프 1의 외부에 노출된 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 연속하거나 연속하지 않는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 또는 2개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위 일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 11의 루프 1에 위치하는 Q418, P419, Q418과 P419와의 조합, 또는 이들을 포함하는 연속하거나 연속하지 않는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 후보 화합물은 인공적으로 합성되거나 천연의 각종 화합물, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 펩타이드 또는 단백질 구조체 (예컨대, 항체, 펩티바디, 나노바디, 등), 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, shRNA(short hairpin RNA), siRNA(small interference RNA), 압타머, 천연물 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 에피토프와 후보 화합물과의 결합력을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 결합력은 Biacore 장치를 사용하여 측정할 수 있다. 일반적으로, 치료용 약품으로서 상기 결합력이 인정되는 범위는 결합 상수인 KD값이 10 nM 이하로 정의될 수 있다. 즉, 예를 들어, 상술한 앤지오포이에틴-2의 에피토프와 분석하고자 하는 시료(예를 들어, 항체)의 결합력은 Biacore 장치와 같은 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 방법으로 측정하였을 때, 0.1pM 내지 50nM, 구체적으로 0.5pM 내지 35nM, 보다 구체적으로 1pM 내지 10nM인 경우, 상기 시료(예를 들어, 항체)를 Ang2 과발현, 신생혈관 형성, 혈관 투과성 증진, 및/또는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 진단, 예방 및/또는 치료용 후보 물질로 판단할 수 있다.

상기 Ang2와 Tie2 간 결합 여부의 확인 및 Ang2 저해 및 Tie2 수용체의 활성화의 확인 방법은 후술되는 바와 같다.

다른 예에서, 앞서 설명한 항 Ang2 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제작뿐 아니라 Ang2에 대한 길항제의 전구체 또는 구성 성분으로서 기능을 할 수 있다. 예컨대, 상기 폴리펩타이드 분자는 Ang2 항원 결합 부위 역할을 하는 것일 수 있으며, 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaffold; 예컨대 펩티바디, 나노바디 등), 이중 특이 항체, 다중 특이 항체 등의 구성 성분으로 포함될 수 있다.

용어 "길항제(antagonist)"는 표적물 (예를 들어, Ang2)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다.

용어 "펩티바디(peptide + antibody)"는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 상기 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및/또는 경쇄 CDR 또는 가변 영역)로서 작용하여, 항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 단백질을 의미한다.

용어 "나노바디"는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하며, 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체(두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며, 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.

용어 "이중 특이 항체" 또는 "다중 특이 항체"는 2개(이중 특이 항체) 또는 그 이상(다중 특이 항체)의 상이한 항원을 인식 및/또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및/또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로, 상기 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 상기 폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 폴리펩타이드 분자는

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상;

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는

이들의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 폴리펩타이드 분자는 서열번호 8의 아미노산 서열, 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 폴리펩타이드 분자는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로만 이루어진 것이 아닐 수 있다.

상기한 바와 같이, 상기 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체는, 서로 다른 2종 또는 그 이상의 항원에 대한 각각의 항원 결합 부위를 포함하여, 2종 이상 또는 그 이상의 항원을 동시에 인식 및/또는 결합하는 항체로서, 상기 항원 결합 부위 중 하나는 앞서 설명한 폴리펩타이드 분자를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 Ang2 항원 결합 부위 역할을 하는 상기 폴리펩타이드 분자는 다른 항원에 대한 항원 결합 부위와 이합체 또는 다합체를 형성하여 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체를 구성할 수 있다. 따라서, 일 구체에서, Ang2 항원 결합 부위로서 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체가 제공된다.

또 다른 예에서, 앞서 설명한 폴리펩타이드 분자 하나 이상 또는 상기 폴리펩타이드 분자가 링커에 의하여 반복하여 연결된 반복체 (이하, '제1 펩타이드')와 구조적 기능을 하는 폴리펩타이드 (이하, '제2 펩타이드'; 예컨대, 항체(IgG, IgA, IgE, IgD, IgM 등)의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위, 또는 항체의 Fc 단편)를 포함하는 펩타이드 복합체를 하나 이상 (예컨대 1 내지 5개, 또는 2 내지 4개) 포함하고, 상기 하나 이상의 펩타이드 복합체가 제2 펩타이드 (예컨대 Fc 단편)에서 결합되어 다합체 구조를 갖는 단백질 골격체가 제공된다.

본 발명에서 항체는 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함한다. 원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다.

본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 항체는 최근에 질병 치료제의 용도로 많이 사용되고 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다.　

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

본 발명에서 제공되는 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 단편일 수 있다.

용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 당업계에 적절한 서열이 알려져 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다. 예컨대, 상기 힌지는 인간 항체로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG 3, 또는 IgG4로부터 유래한 것일 수 있다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

항 Ang2　항체의 가변 부위를 제외한 부분은 인간 항체로부터 유래한 불변부위일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG 3, 또는 IgG4로부터 유래한 불변부위일 수 있다.

항 Ang2　항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항 Ang2 항체는 마우스 단클론항체를 이용하여 Schwaber 등의 논문에 기재된 방법에 의하여 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447).

한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 Ang2에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.

최종 선택된 항체들은 항원결합부를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다 (Almagro, J. C. and Fransson, J., "Humanization of antibodies," Frontiers in Bioscience, 13(2008), 1619-1633).

다른 예는 상기 항 Ang2 항체의 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 상기 하이브리도마 세포주는 수탁번호 (KCLRF-BP-00295)인 세포주일 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 제안되는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와 결합하면서도 Ang2가 Tie2 수용체와 결합하는 것을 저해하지 않고, Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 유도하는 것을 특징으로 한다. 또한, 이와 같이 결합된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 Ang2의 복합체(conjugate)는, Ang1과 같이 작용하여, Tie2 수용체에 결합하고(상기 복합체 중 Ang2 부분이 결합함), Tie2 수용체를 활성화시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 한다.

따라서, 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 Ang2이 결합된 항 Ang2 항체-Ang2 복합체를 제공한다. 또 다른 예는 상기 항 Ang2 항체-Ang2 복합체를 유효성분으로 포함하는 Tie2 수용체 활성화용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 상기 항 Ang2 항체-Ang2 복합체를 Tie2 수용체의 활성화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, Tie2 수용체 활성화 방법을 제공한다. 상기 Tie2 수용체 활성화 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 Tie2 수용체의 활성화를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 환자는 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 이로부터 분리되거나 인공적으로 배양된 세포, 조직, 체액 등 일 수 있다. 또 다른 예는 상기 항 Ang2 항체-Ang2 복합체의 Tie2 수용체 활성화를 위한 용도가 제공된다.

상기한 바와 같이, 본 발명에서 제안되는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2의 기능을 저해함으로써 비정상적 혈관신생을 저해하는 기능을 가지므로, 비정상적 혈관신생과 관련된 다양한 질병(예컨대, 암)의 예방, 경감, 개선 및/또는 치료에 사용 가능하다 (실시예 13 및 14 참조). 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와 Tie2 간의 결합은 저해하지 않음으로써(실시예 3 및 도 1 참조), Tie2를 활성화시켜(실시예 5 및 도 2 참조), Tie2 신호전달을 활성화시키고(실시예 6 및 도 3 참조), 혈관 내피 또는 림프관 내피의 생성을 촉진하고 이동성을 증가시켜 (실시예 10 참조), 혈관 투과성 증가를 억제함으로써(실시예 11 참조), 혈관 투과성과 관련된 다양한 질병(예컨대, 패혈증, 안구질환, 등)의 예방, 경감, 개선 및/또는 치료에 또한 적용 가능하다. 또한, 상기한 바와 같이, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 혈관 내피 또는 림프관 내피의 생성을 촉진하여 건강한 혈관의 형성을 증가 및 혈관을 정상화시키므로, 상처 치유 또는 허혈성 질환 등과 같이 건강한 혈관의 형성을 필요로 하는 다양한 질병 또는 증상의 예방, 경감, 개선 및/또는 치료에도 적용 가능하고, 비정상적으로 형성된 암 혈관을 구조 및 기능적으로 정상적인 상태로 변화시켜 암의 성장 및 전이 가능성을 감소시킨다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 염증 반응을 억제하는 효과를 가짐으로써 (실시예 12 참조), 다양한 염증 질환의 예방, 경감, 개선 및/또는 치료에도 적용 가능하다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암혈관을 정상화(normalization)시키는 효과를 가짐으로써 (실시예 15 참조), 상기 정상화된 혈관을 통한 항암제의 Ang2 발현 세포로의 전달 효능을 증진시켜, 항암 치료에 있어서, 항암제와 병용 투여되어 항암제에 대한 민감성 (sensitiveness)을 증진시키고 항암제의 효능 증진(실시예 18 참조)시키기 위한 항암 보조제로서도 적용 가능하다.

이에, 본 발명의 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성 저해를 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 신생혈관 형성 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 신생혈관 형성 저해 방법을 제공한다. 상기 신생혈관 형성 저해 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 신생혈관 형성 저해를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관 투과성 감소를 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 혈관 투과성 감소를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관 투과성 감소 방법을 제공한다. 상기 혈관 투과성 감소 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 혈관 투과성 감소를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 Ang2 과발현, 신생혈관 형성, 및/또는 혈관 투과성 증가와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 Ang2 과발현, 신생혈관 형성 및/또는 혈관 투과성 증가와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ang2 과발현, 신생혈관 형성 및/또는 혈관 투과성 증가와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 Ang2 과발현, 신생혈관 형성 및/또는 혈관 투과성 증가와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 정상 혈관 생성 유도를 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 정상 혈관 생성 유도를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 정상 혈관 생성 증가 방법을 제공한다. 상기 혈관 투과성 감소 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 정상 혈관 생성 유도를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조직 재생 및/또는 상처 치유(wound healing)용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 조직 재생 및/또는 상처 치유를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 조직 재생 및/또는 상처 치유 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 조직 재생 및/또는 상처 치유를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 유효성분의 투여 대상 환자는 예컨대 피부 조직 또는 장기 조직의 손상이 있거나, 피부 이식을 받은 환자일 수 있다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체 활성화를 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체 활성화를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체 활성화 방법을 제공한다. 상기 Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체 활성화 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체 활성화를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원인 Ang2와 결합된 상태일 수 있다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암제 효능 증진을 위한 약학 조성물 (항암 보조제)를 제공한다. 다른 예는 항암제 및 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 상기 항암제의 투여를 필요로 하는 환자에게 병용 투여하는 단계를 포함하는, 항암제의 효능 증진 방법을 제공한다. 상기 항암제 효능 증진은 혈관 정상화에 의하여 항암제의 암조직 내부로 전달 효율을 높이고 항암제에 대한 감수성을 높여서, 투여 용량 대비 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 상기 항암 보조제는 항암제의 효능 증진을 위하여 보충적으로 사용되는 약학 조성물을 의미한다.

또 다른 예는 항암제 및 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 항암제의 약학적 유효량 및 상기 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량이 혼합된 혼합제를 포함하는 두 약물의 동시 투여를 위한 형태일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 항암제의 약학적 유효량 및 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량이 각각 제제화되어 동시적 또는 순차적으로 투여되기 위한 형태일 수 있다. 이 경우, 상기 병용 투여용 약학 조성물은 유효 성분으로 항암제의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학 조성물 및 유효성분으로 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는 동시적 또는 순차적 투여를 위한 병용 투여용 약학 조성물일 수 있다. 순차적 투여의 경우 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다. 또 다른 예는 항암제 및 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 병용 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 항암제의 효능 증진 방법 또는 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 항암제의 투여를 필요로 하는 환자 또는 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원인 Ang2와 결합된 상태일 수 있다. 상기 병용 투여하는 단계는 항암제와 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함께 투여하거나 순서와 무관하게 순차적으로 투여하여 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 병용 투여는 항암제의 약학적 유효량과 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 혼합한 혼합제를 투여함으로써 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 병용 투여는 항암제의 약학적 유효량을 투여하는 제1 단계 및 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 투여하는 제2 단계를 동시에 또는 순차적으로 수행하는 것일 수 있다. 순차적으로 투여하는 경우 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.

상기 항암제는 암세포 또는 암조직의 성장 저해, 사멸, 전이 억제 등의 효과를 얻기 위하여 사용되는 모든 화학 약물, 항체, 유전자 (예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, microRNA, 등), 앱타머, 세포치료제, 방사선 치료제 등일 수 있으며, 예컨대, 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin), 옥살리플라틴(Oxalliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Doxetaxel), 빈크리스틴(Vincristine), 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 블레오마이신(Bleomycin), 프레드니손(Prednisone), 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실(5-FU), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 6-티오구아닌(6-TG) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것 은 아니다. 또한 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 약학 조성물의 유효성분인 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와의 결합에 의하여 기능이 활성화되므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 기능을 보다 증진시키기 위하여, 상기 약학 조성물은 Ang2을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 방법은 Ang2의 약학적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 신생혈관 형성 및/또는 혈관 투과성 증가 및/또는 정상 혈관 형성 감소와 관련된 질병의 진단용 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물 내의 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기 "약학적 유효량"은 소망하는 약리적 효과를 나타낼 수 있는 유효 성분의 함량 또는 투여량을 의미하는 것일 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 정해질 수 있다.

상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

특히, 상기 항 Ang2 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.

한편, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 Ang2를 검출할 수 있으며, 이를 통하여 Ang2의 과발현 여부를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 Ang2 검출용 조성물 및 Ang2 과발현과 관련된 질병의 진단용 조성물을 제공한다.

또 다른 예에서, 환자로부터 얻어진(또는 분리된) 생물 시료에 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는 Ang2 검출 방법이 제공된다. 또한, 환자로부터 얻어진 생물 시료에 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는 Ang2 과발현과 관련된 질병의 진단에 정보를 제공하는 방법이 제공된다. 상기 진단에 정보를 제공하는 방법은 상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계에서 항원-항체 반응이 탐지되는 경우 상기 환자를 Ang2 과발현 증상이 존재하거나, Ang2 과발현 관련 질병을 갖는 것으로 판단하는 것일 수 있다. 상기 생물 시료는 환자로부터 얻어진 (또는 분리된) 세포, 조직, 체액 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물 또는 항체 또는 항원결합단편의 투여 또는 진단 대상 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 이로부터 분리되거나 인공적으로 배양된 세포, 조직, 체액 등 일 수 있다.

상기 신생혈관 형성 및/또는 혈관 투과성 증가 및/또는 Ang2 과발현과 관련된 질병은 암; 암전이; 미숙아 망막병증, 황반변성 (예컨대, 연령 관련 황반변성), 당뇨병성 망막병증, 혈관신생성 녹내장 등의 안구혈관질환; 건선, 천식, 류마티스성 관절염, 폐렴, 만성 염증 등의 염증 질환; 감염성질환(감염); 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관질환; 신장질환; 패혈증; 천식; 부종; 유전성 출혈성 모세혈관 확장증 (Hereditary hemorrhagic telangiectasia; HHT) 등일 수 있다. 상기 암은 Ang2를 과발현하는 것으로, 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병은 정상 혈관 생성의 유도를 필요로 하는 질병으로서, 심근경색, 협심증, 뇌경색, 뇌졸중(뇌허혈) 등의 허혈성 질환, 버거씨병(폐색성 혈전 혈관염), 무혈관 괴사 (avascular necrosis), 족부궤양 (예컨대, 당뇨병성 족부궤양 등), 발기부전 (erectile dysfunction), 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

다른 예는 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, Ang2, 및 Tie2 수용체가 결합된 복합체를 제공한다. 상기 복합체는 생체 내에 존재하거나, 생체로부터 분리된 세포에 존재하는 것일 수 있다. 또한 상기 복합체 내의 항체는 인접하는 복합체 내의 항체와 이합체를 형성하여, 두 개 또는 그 이상의 복합체를 클러스터링시켜, 두 개 또는 그 이상의 복합체를 포함하는 클러스터를 형성할 수 있다 (실시예 8 참조). 이와 같은 작용은 상기 항 Ang2 항체의 Tie2 수용체 활성화 기능과 관련 있다. 상기 복합체는 상기 항 Ang2 항체의 작용, 즉, Ang2의 저해 및/또는 Tie2 수용체의 활성화 여부를 모니터링 하거나, 그 자체로 Ang2의 저해 및/또는 Tie2 수용체의 활성화 용도로 사용될 수 있다.

다른 예는 상기 복합체 형성, 및/또는 Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체의 활성화 여부를 확인하여 신생혈관 형성 및/또는 혈관 투과성 증진과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 상기 스크리닝 방법은,

Ang2 및 Tie2 수용체를 포함하는 시료에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및

후보 화합물, Ang2, 및 Tie2 수용체가 결합된 복합체의 형성을 확인하는 단계

를 포함할 수 있다.

상기 후보 화합물, Ang2, 및 Tie2 수용체가 결합된 복합체의 형성을 확인하는 단계는, 후보 화합물, Ang2, 및 Tie2 수용체가 결합된 복합체의 존재 여부를 확인하거나, 또는 후보 화합물과 Ang2 간 결합 여부 및 Ang2와 Tie2 수용체 간 결합 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 상기 스크리닝 방법은 상기 후보 화합물, Ang2, 및 Tie2 수용체가 결합된 복합체의 형성을 확인하는 단계 전, 후, 또는 이와 동시에, Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체의 활성화를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 후보 화합물, Ang2, 및 Tie2 수용체가 결합된 복합체의 형성이 확인되는 경우, 즉 후보 화합물, Ang2, 및 Tie2 수용체가 결합된 복합체의 존재가 확인되는 경우 또는 후보 화합물과 Ang2 간 결합 및 Ang2와 Tie2 수용체 간 결합이 확인되는 경우, 상기 후보 화합물을 Ang2 과발현, 신생혈관 형성, 혈관 투과성 증진, 및/또는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 후보 물질로 판단할 수 있다.

다른 예에서, 상기 스크리닝 방법은,

Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체의 활성화를 확인하는 단계

를 포함할 수 있다. 상기 스크리닝 방법에 있어서, Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체의 활성화가 확인되는 경우, 상기 후보 화합물을 Ang2 과발현, 신생혈관 형성, 혈관 투과성 증진, 및/또는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 후보 물질로 판단할 수 있다. 상기 Ang2의 저해(분해)는 동일한 시료에 대하여 상기 후보 화합물의 처리 전 후의 Ang2의 수준을 측정하거나, 동일한 시료를 상기 후보 화합물의 처리군과 미처리군으로 나누어 Ang2의 수준을 측정하여, 상기 후보 화합물 처리 전과 후 또는 처리군과 미처리군의 Ang2의 수준과 비교하여 확인할 수 있다. 또는 이 때, 상기 후보 화합물 처리 후 또는 처리군의 Ang2 수준이 상기 후보 화합물의 처리 전 또는 미처리군과 비교하여 감소한 경우, Ang2이 저해되었다고 판단할 수 있다. 또한, 상기 Tie2 수용체의 활성화는 Tie2 수용체의 인산화 정도 및/또는 Tie2 수용체의 downstream signaling에 관여하는 단백질 (예컨대, Akt, eNOS, 42/44, 등) 중 하나 이상의 인산화 정도를 동일한 시료에 대하여 상기 후보 화합물의 처리 전과 후에 측정하거나, 동일한 시료를 상기 후보 화합물의 처리군과 미처리군으로 나누어 측정하여, 상기 후보 화합물 처리 전과 후 또는 처리군과 미처리군의 상기 단백질의 인산화 정도를 비교하여 확인할 수 있다. 이 때, 상기 후보 화합물 처리 후 또는 처리군의 인산화 정도가 상기 후보 화합물의 처리 전 또는 무처리군과 비교하여 증가한 경우, Tie2 수용체가 활성화되었다고 판단할 수 있다. 또는, 상기 Tie2 수용체의 활성화는 Tie2 수용체의 세포내 이동(internalization) 여부를 확인함으로써 판단할 수 있다.

다른 예에서, 상기 스크리닝 방법은,

후보 화합물, Ang2, 및 Tie2 수용체가 결합된 복합체의 형성, 및 Ang2 저해 및/또는 Tie2 수용체의 활성화를 확인하는 단계

를 포함할 수 있다. 상기 복합체의 형성, Ang2 저해, 및 Tie2 수용체의 활성화의 구체적 내용은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 복합체 형성의 확인, Ang2 수준의 측정, Tie2의 인산화 정도의 측정, downstream signaling에 관여하는 단백질의 인산화 정도의 측정, 및/또는 Tie2 수용체의 세포내 이동(internalization)의 확인은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있으며, 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 후보 화합물은 인공적으로 합성되거나 천연의 각종 화합물, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 펩타이드 구조체 또는 단백질 구조체 (예컨대, 항체, 펩티바디, 나노바디, 등), 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, shRNA(short hairpin RNA), siRNA(small interference RNA), 압타머, 천연물 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 Ang2 및 Tie2 수용체를 포함하는 시료는 생체에서 분리되거나 인공적으로 배양된 세포 또는 조직으로서, 본래적으로 Ang2 및 Tie2 수용체를 포함(발현)하거나, Ang2 및/또는 Tie2 수용체가 처리되거나 Ang2 및/또는 Tie2 수용체를 발현하도록 조작된 것일 수 있다.

기존에는 Ang2와 그 수용체인 Tie2와의 결합을 저해함으로써 Ang2에 의한 신생혈관형성을 저해하려는 시도가 있어왔으나, Ang2에 특이적으로 결합하여 Ang2의 세포내 이동 및 분해를 유도하면서 Ang2와 Tie2 수용체와의 결합능은 유지시켜 항체-Ang2-Tie2 수용체 복합체를 형성하면서 Tie2 수용체를 활성화시키는 작용을 하는 항체는 현재까지 알려져 있지 않다. 이러한 상황에서, 본 발명은 Ang2를 저해하면서 동시에 Tie2 수용체를 활성화시켜 하류 신호 전달을 촉진하는 항체를 제안함으로써, Ang2에 의한 신생혈관형성을 저해하고 혈관 투과성을 감소시킬 수 있는 새로운 방법을 제시한다. 또한 본 발명에서 제안되는 항체는 암 이외의 비정상적 혈관 형성관련 질환 및/또는 혈관 투과성이 증가되어 유발되는 질환의 진단 및 치료에의 응용 가능성이 기대된다. 상기 항체는 화학 의약품 및 기타 다른 항암 치료제와 병용 치료 요법 등에 활용 가능하며, Ang2 특이적인 인지작용을 이용하여 antibody fragment, bi- 또는 multi-specific antibody, protein scaffold 등에 사용 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리 농도에 따른 Tie2 수용체와 Ang2간의 결합을 억제하는 정도를 보여주는 Ang2-Tie2 competition ELISA 결과이다.
도 2a은 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체가 처리 농도에 따른 Tie2 수용체와 인산화된 Tie2 수용체의 수준 변화를 보여주는 면역 블라팅 결과이다.
도 2b은 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체에 의한 Tie2 수용체와 인산화된 Tie2 수용체의 수준 변화를 대조항체 (RG)와 비교하여 보여주는 면역 블라팅 결과이며, 도 2c는 Tie2 내의 인산화된 Tyr 비율을 보여주는 그래프이다.
도 3a는 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리시의 Tie2 수용체의 Downstream signaling에 관여하는 단백질의 인산화 정도를 보여주는 면역 블라팅 결과이다.
도 3b는 동물모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리시의 Tie2 수용체 인산화 및 이의 Downstream signaling에 관여하는 단백질(Akt)의 인산화 정도를 보여주는 면역 블라팅 결과이고, 도 3c는 도 3b의 결과를 수치화하여 보여주는 그래프이다.
도 4는 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체가 Ang2, 및 Tie2와 결합하여 Complex를 형성하는 정도를 보여주는 ELISA 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 monomeric 항 Ang2 항체의 Tie2 수용체 및 Tie2 수용체의 Downstream signaling에 관여하는 단백질의 인산화 정도를 보여주는 면역 블라팅 결과이다.
도 6는 일 실시예에 따른 Ang1 과 항 Ang2 항체가 유사한 Tie2 수용체의 세포 내 internalization을 보여주는 면역세포염색 결과이다.
도 7는 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체가 혈관 및 림프관 내피세포의 증식에 미치는 영향을 나타내는 결과이다.
도 8는 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체가 림프관 내피세포의 이동에 치는 영향을 나타내는 결과이다.
도 9 일 실시예에 따른 Ang1 또는 Ang2 항체 처리시 TNF 또는 LPS에 의해 유도되는 세포 투과성 저해 정도를 나타낸 결과이다.
도 10 일 실시예에 따른 Ang1 또는 Ang2 항체 처리시 LPS 자극에 의해 유도되는 염증관련 세포부착물질 (ICAM-1, E-selectin)의 mRNA 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리시 염증 세포로부터 얻어진 형광의 세기를 상대적인 fold로 나타낸 그래프로, 혈관 내피 세포에 부착된 염증 세포의 수를 나타낸다.
도 12은 Colo205 종양 모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리에 따른 종양 크기 변화를 보여주는 그래프이다.
도 13은 LLC 종양 모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리에 따른 종양 크기 변화를 보여주는 그래프이다.
도 14는 LLC 종양 모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리시의 혈관과 주변세포의 변화를 면역염색으로 확인한 결과를 보여주는 형광이미지로, 상기 항 Ang2 항체 처리에 따른 혈관의 구조적 정상화를 보여준다.
도 15a는 LLC 종양 모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리시의 혈관과 주변세포의 변화를 Lectin perfusion을 통하여 확인한 결과를 보여주는 형광 이미지로서, 상기 항 Ang2 항체 처리에 따른 혈관의 기능적 정상화를 보여준다
도 15b는 LLC 종양 모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리에 따른 Lectin perfusion 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 16는 LLC 종양 모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리에 따른 종양 세포 내 괴사 부위 변화를 보여주는 사진이다.
도 17은 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리에 따른 림프절 모습을 보여주는 형광 이미지이다.
도 18a은 폐암 동물 모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체와 시스플라틴과의 병용 투여시의 종양 크기 변화를 보여주는 그래프이다.
도 18b은 폐암 동물 모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체와 시스플라틴과의 병용 투여시의 종양 내부로 시스플라틴 전달의 변화를 보여주는 형광 이미지이다
도 18c는 폐암 동물 모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체와 시스플라틴과의 병용 투여시의 종양 세포 내 괴사 부위 변화를 보여주는 사진(위쪽) 및 이를 정량화하여 보여주는 그래프(이래쪽)이다.
도 19a는 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체를 정상 생쥐에 처리시의 생쥐의 무게 변화를 보여주는 그래프이다.
도 19b는 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체를 정상 생쥐에 처리시의 혈관 형태를 보여주는 형광 이미지이다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1. 항 Ang2 항체의 제조

　항 Ang2 항체는 5주령의 BALB/c 마우스에 인간 Ang2 단백질 (R&D systems; 623-AN-025/CF)를 adjuvant와 함께 투여하여 면역반응을 유도한 후 Schwaber 등의 논문에 기재된 공지된 방법에 의해 개별 항체를 생산하는 하이브리도마들을 제조하였다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447).

보다 구체적으로, 하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 5주령의 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)에 한 마리당 100 ug 의 인간의 Ang2 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 항원(먼저 주사한 양의 절반)을 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 Ang2을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다.

세포융합 실험 3일 전에 50 ug의 PBS에 인간 Ang2 단백질 (R&D systems) 100 ug을 혼합한 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지(DMEM, Hyclon)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1x10⁸ 개와 골수종세포(Sp2/0) 1x10⁷ 개를 혼합한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양배지(DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌 글리콜(PEG 1500) 1 ㎖을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

실시예 2. 항- Ang2 항체의 제작

2.1. 항- Ang2 항체의 생산 클론　선별 및 항체 정제

상기 얻어진 항체 생산 하이브리도마들로부터 전형적인 ELISA 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여 모　하이브리도마로부터 분화시킨 하이브리도마 중 95개의 항 Ang2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 Ang2 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 Ang2 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 Ang2 단백질을 한 웰당 각각 100 ng씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 상기 실시예 1에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간의 Ang2 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 58개의 클론을 최종적으로 얻었다. 상기 제작된 하이브리도마는 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주은행에 2013년 4월 23일자로 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00295를 부여받았다.

상기 얻어진 각각의 하이브리도마를 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium)에서 배양한 후 배양액을 모아 프로테인 G-친화성 크로마토그래피법으로 각각의 하이브리도마에서 생산되는 항 Ang2 단클론 항체를 정제하였다.

먼저 10% (v/v) FBS이 포함된 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖을 세포 침전물에 재현탁시킨 후 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 이후 원심분리를 통해 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여 4℃에 보관하거나 바로 모아서 50 ㎖ 내지 300 ㎖의 배양액으로부터 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 항체를 순수 정제한 후 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실험에 사용하였다. 상기 각각의 하이브리도마로부터 얻어진 항체 중 하나를 10D6으로 명명하였다.

상기 항체의 인간 Ang-2 단백질에 대한 결합 친화도를BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한SPR 방식으로 측정하였다. SPR 방식은 센서칩에 코팅된 물질의 상태에 따라 칩을 지나는 빛의 굴절률이 변화하는 원리를 이용한 것으로, 칩에 항원 또는 항체가 코팅된 상태에서 항체 또는 항원을 흘리면 이들간 결합으로 인한 굴절률의 변화가 발생하고, 이를 측정한 수치로부터 Kd 값을 계산한다.

먼저 pH 5.0 아세테이트 용액과 아민 커플링 키트(amine coupling kit; GE Healthcare)를 이용하여 anti-His 항체를 8,000 RU 레벨까지 CM5 센서칩(GE Healthcare)에 고정화시켰다. 여기에 6 ug/ml 농도의 재조합 hAng-2 (C-His, R&D Systems) 단백질을 흘려 보내 100 ~ 200 RU 레벨로 capture시켰다. 여기에 상기 실시예 2에서 얻어진 항체를 100 nM 농도로부터 순차적으로 2배씩 희석시킨 후, 각각 흘려 보내는 방법으로 센서칩에 capture된 항원과 결합 (on), 분리 (off), 해리 (regeneration, 10 mM NaOH 용액 사용)시키며 항원-항체간 친화도를 측정하였다. hAng1에 대하여 위와 같은 방법으로 실험하였으며, 그 결과는 하기 표 3와 같다.　　　

항체 명칭	hAng2 (Kd)
SAIT-ANG2-AB-m10D6	8.0 nM

2.2. 항 Ang2 항체의 유전자 클로닝

상기 실시예 2.1에서 얻어진 항체생산 하이브리도마(2x10⁶ 세포)로부터 RNeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 전체 RNA를 얻었다. 그런 다음, 이를 주형(template)으로 하여, OneStep RT-PCR kit (Qiagen)과 Mouse Ig-Primer Set (Novagen)과 써모사이클러(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem)를 사용하여 하기 조건으로 각 하이브리도마에서 생산되는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역(variable region) 유전자 서열만 증폭시켰다: 94℃에서 5분간; [50℃에서 30분, 95℃에서 15분], [94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분]x 35 사이클; 72℃에서 6분간; 4℃로 냉각.

각 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 직접 DNA 염기서열분석(Sequencing)을 수행하여, 각 항체의 CDR, 중쇄 가변부 및 경쇄 가변부 및 이들을 암호화하는 염기서열을 얻었으며, 상기 얻어진 결과를 아래의 표 4 내지 7에 정리하였다:

항체 명칭	중쇄 CDR 서열
항체 명칭	CDRH1-KABAT	CDRH2-KABAT	CDRH3-KABAT
SAIT-ANG2-AB-m10D6	SDYAWN (서열번호1)	YINYSGNTDYNPSLKS (서열번호 2)	GNFEGAMDY (서열번호3)

항체 명칭	경쇄 CDR 아미노산 서열
항체 명칭	CDRL1-KABAT	CDRL2-KABAT	CDRL3-KABAT
SAIT-ANG2-AB-m10D6	KASQSVSNDVA (서열번호4)	YASNRYP (서열번호 5)	QQDYSSPWT (서열번호 6)

항체 명칭	중쇄 가변부 서열
SAIT-ANG2-AB-m10D6	VQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YINYSGNTDYNPSLKS RSSITRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR GNFEGAMDY WG (서열번호 7)
SAIT-ANG2-AB-m10D6	GATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAACTACAGTGGTAACACTGACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAAGCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGGGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGAGGTAACTTCGAAGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 8)

항체 명칭	경쇄 가변부 서열
SAIT-ANG2-AB-m10D6	SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYP GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYSSPWT FGGGTKLEIK (서열번호 9)
SAIT-ANG2-AB-m10D6	agtattgtgatgacccagactcccaaattcctgcttgtatcagcaggagacagggttaccataacctgcaaggccagtcagagtgtgagtaatgatgtagcttggtaccaacagaagccagggcagtctcctaaactgctgatatactatgcatccaatcgctaccctggagtccctgatcgcttcactggcagtggatatgggacggatttcactttcaccatcagcactgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaggattatagctctccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa (서열번호 10)

(상기 표 6 및 7에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3 임)

실시예 3. Ang2 - Tie2 결합에 대한 10 D6 항체의 competition ELISA assay

상기 실시예 2-1에서 제작된 Ang-2에 결합하는 항체를 이용하여 Ang2-Tie2 binding competition ELISA를 수행하였다.

보다 구체적으로, 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 4 ug(microgram)/ml의 인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hTie2-Fc(R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.

Ang2-Tie2 competition ELISA를 위해, 상기 실시예 2에서 제작된 각각의 항 Ang2 항체를 400nM ~ 0.001nM의 다양한 농도로 1% (v/v)의 BSA와 400 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 hAng-2과 함께　상기 hTie-2/Fc 융합 단백질이 코팅된 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시킨 후,　상기 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG 항체 (Sigma)를 1% (v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 (v/v) 비율로 희석하여 100 ul 의 양으로 각각의 웰에 넣어주고 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul(microliter)의 TMB 기질 (Cell Signaling)을 첨가하여 3분간 발색반응을 유도시켰으며, 이후, Stop 용액 (Cell Signaling) 100 ul를 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 plate 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다.

비교를 위하여 Ang2-Tie2 결합을 저해하는 anti-Ang2항체인 4H10를 사용하여 상기와 동일한 시험을 수행하였다. 상기 4H10은 다음과 같은 중쇄가변영역과 경쇄가변영역을 갖는 항체이다:

중쇄가변영역 (서열번호 12):

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSLISPDSSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLISFWRGGFDYWGQGTLVTVSS

경쇄가변영역 (서열번호 13)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG

Ang-Tie2결합을 저해하는 정도(%)를 도1에 나타내었다. 도 1에서 보여지는 바와 같이, Ang2-Tie2 결합을 저해하는 anti-Ang2항체인 4H10과는 달리 10D6항체의 경우에는 Ang2-Tie2 수용체간 결합을 저해하지 않는 것이 확인되었다.

실시예 4. Ang2 항체의 항원인지부위 ( epitope ) 확인

상기 실시예 2에서 제작된 항 Ang2 항체의 에피토프(또는 특이적 결합 부위)를 확인하기 위하여 Flag이 tagging된 형태의 Ang2 단백질의 수용체 결합 부위(receptor binding domain, RBD)를 인위적으로 돌연변이를 일으킨 재조합 단백질을 이용하여 ELISA를 수행하였다.

96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)의 각 웰을 1000nM의 항체 50 ul(microliter)로 코팅하였다.　그 후, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS (PBST)로 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.　 FLAG 서열 (DYKDDDDK, Sigma)이 N-terminal에 태깅되어 있는 Ang2 단백질의 S417, Q418, P419, N421, I434, D448, A449, P452, Y460, N467, K468, 또는 F469 잔기를 알라닌으로 치환(mutation)시켜 얻어진 각각의 변이단백질(Mutant Ang2)을 상기 플레이트의 각각의 웰에 각각 250ng씩 넣어준 후, 상기 플레이트를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다.

0.05%(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG　항체 (SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 (v/v) 비율로 희석하여 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다.

마지막으로, 상기 플레이트의 각 웰에 50 ul의 TMB 기질 (Cell signaling)을 첨가하여 상온에서 3분동안 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 50 ul의 Stop 용액 (Cell signaling) 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. Mutation 을 시킨 Ang2와의 결합력을 mutation 을 시키지 않은 Ang2와 비교함으로 Ang2 항체들에 대한　각각의 에피토프를 확인하였다. 상기 얻어진 native Ang2와의 결합력에 대한 Mutant Ang2 와의 결합력(%) 측정 결과를 하기 표 8에 나타내었다:　

	Loop 1					Loop 2			Loop 3			Loop4
	417	418	419	421	434	448	449	452	460	467	468	469
10D6	101.17	38.94	41.08	109.09	109.49	104.55	97.86	102.15	103.15	106.84	110.27	108.79

실시예 5. 10 D6 항체에 의한 Tie2 수용체의 인산화 유도 시험

Ang2는 혈관내피세포에 발현된 Tie2 수용체와 결합하여 수용체의 인산화를 유도하여 활성화함으로써 혈관내피세포의 변화를 유도하는 작용을 하므로, 세포기반 분석법을 이용하여 항 Ang2 항체의 Tie2 인산화에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험을 수행하였다.

이를 위하여, 100mm culture dish에서 HUVEC (ATCC) 세포 (1X10⁶개)를 EGM-2 (Lonza) 배지를 이용하여 37℃에서 배양 후, 80~90% confluency를 보이면, 무혈청 배지 (Lonza)로 바꾸어 6 내지 16시간 동안 37℃에서 배양하였다. PBS로 한 번 세척한 뒤, 1nM의 sodium orthovanadate (Sigma) 가 혼합된 무혈청 배지(Lonza)로 바꾸어 10분간 더 배양하였다. 　PBS로 한 번 세척한 뒤, 다양한 농도(600~0.06 nM)의 Ang2 항체(10D6)를 Ang2 단백질(R&D systems) 40nM과 혼합하여 20분간 둔 뒤, 상기 배양된 세포에 처리하고 10분간 더 배양하였다. PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 뒤, 400ul의 lysis buffer (Roche) 를 처리한 후, 세포를 tube에 모으고, 4℃에서 30분간 용해시킨 후, 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 상층액을 Nanodrop을 이용하여 정량하였다.

0.8 mg 세포용해물에 1ug의 Tie2 항체 (R&D system)를 넣고 4℃에서 밤새도록(overnight) 반응 시킨 후, protein A bead (GE Healthcare)를 넣어 면역침강(immunoprecipitation)시켰다. 상기 얻어진 반응물을 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 펠렛을 얻은 후, lysis buffer (Roche)로 2 내지 3회 세척하고, reducing agent가 혼합된 sample buffer (Invitrogen) 를 넣고 95℃에서 5분간 끓인 뒤, NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel(Invitrogen) running하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Invitrogen)에 이동시켰다.

Tie2 인산화 여부의 확인을 위하여, 위의 멤브레인을 3%(v/v) skim milk (Sigma)가 혼합된 PBST로 30분간 blocking 한 뒤, HRP-conjugated anti-phospho tyrosine 항체 (Millipore)를 이용하여 확인하였다. Tie2 확인을 위하여, blot을 stripping buffer (Thermo)에 15분간 반응시킨 뒤, 다시 blocking하여 Tie2 항체 (Santa Cruz)를 이용하여 확인하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에서 보여지는 바와 같이, Ang2 단독 처리군 대비 Ang2와 함께 10D6 항체를 넣어준 경우에 시험된 모든 항체 농도 범위에서 Tie2의 인산화가 보다 강하게 유도됨 확인하였다.

또한, 상기한 방법을 참조하여, 10D6 항체 60 nM과 Ang2 처리시의 Tie2의 인산화 정도를 대조항체 (Regeneron 사의 항 Ang2 항체; Ang2-Tie2 결합을 저해하는 MOA를 갖는 control 항체; RG항체로 표시)와 비교한 면역 블라팅 결과를 도 2b에 나타내었다. 항체 처리 후, pTyr과Tie2의 blot의 band density를 ImageJ software를 이용하여 측정하고, pTyr/Tie2 비율을 계산하여 그 결과를 도 2c에 나타내었다.

도 2b 및 2c에서 NC로 표시된 부분은 항체와 Ang2를 처리하지 않은 군에서의 Tie2 인산과 결과이다. 도 도 2b 및 2c에서 확인되는 바와 같이, 10D6 항체 처리시 Tie2 수용체의 인산화 정도가 항체 처리 없이 Ang2만 처리한 경우와 비교하여 약 180% 증가하는 반면, 대조항체인 RG 항체 처리시에는 항체 처리 없이 Ang2만 처리한 경우와 비교하여 약 67% 감소하여, 10D6 항체의 Tie2 인산화 효과가 대조항체 대비 약 8.6배 높은 것으로 나타났다.

실시예 6: 10 D6 항체에 의한 Tie2 signaling 의 활성화 유도 시험

10D6항체가 Tie2뿐만 아니라 Tie2 수용체의 downstream signaling의 활성화를 유도하는지 확인하기 위하여, HUVEC (ATCC) 세포에 Ang2 단독 또는 Ang2와 10D6 항체를 처리시의 downstream signaling에 참여하는 단백질의 인산화 정도를 면역 블라팅으로 시험하였다. downstream signaling 활성화 정도를 비교하기 위하여, Ang1 (R&D systems), 및 Ang2(R&D systems)와 Regeneron 사의 항 Ang2 항체(RG항체; Ang2-Tie2 결합을 저해하는 MOA를 갖는 control 항체)를 함께 처리한 그룹에 대하여도 동일한 시험을 수행하였다.

구체적으로, 6 well culture dish에서 HUVEC (ATCC) 세포(1X105개)를 EGM-2 (Lonza) 배지를 이용하여 37℃에서 배양 후, 80~90% confluency를 보이면, 무혈청 배지(Lonza)로 바꾸어 6 내지 16시간동안 37℃에서 배양하였다. PBS로 한 번 세척한 뒤, Ang2 항체(10D6) 60nM을 Ang2 단백질(R&D systems) 40nM과 혼합하여 20분간 둔 뒤, 상기 배양된 세포에 처리하고 30분간 더 배양하였다. 비교를 위하여, Ang1(R&D systems) 4nM, Ang2 (R&D systems) 40nM, 및Ang2 (R&D systems) 40nM +항 Ang2 항체(Regeneron) 60nM을 각각 처리한 그룹을 준비하였다.

PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 뒤, lysis buffer (Roche) 를 처리한 후, 세포를 tube에 모으고, 4℃에서 30분간 용해시킨 후, 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 상층액을 정량하였다. 25ug의 세포용해물에 reducing agent가 혼합된 sample buffer (Invitrogen)를 넣고 95℃에서 5분간 끓인 뒤, NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) running하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Invitrogen)에 이동시켰다.

Tie2 수용체의 downstream signaling에 관여하는 Akt, eNOS, 42/44의 인산화 여부를 확인하기 위하여, 위의 blot을 3%(v/v) skim milk (Sigma)가 혼합된 PBST로 30분간 blocking 한 뒤, 항 pAkt 항체, 항 p-eNOS 항체, 항 p-42/44 항체 (이상 Cell signaling)를 처리하였다. Blot을 stripping buffer (Thermo)에 15분간 반응시킨 뒤, 다시 blocking하여 항 Akt 항체, 항 eNOS 항체, 42/44 항체를 (이상 cell signaling) 이용하여 Akt, eNOS, 및 42/44를 확인하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3a에 나타내었다. 도 3에서 보여지는 바와 같이, Ang2 단독 처리군 및 Ang2와 RG항체를 함께 처리한 군 대비, Ang1 단독 처리군 및 Ang2와 10D6 항체를 함께 처리한 군에서 downstream signaling이 강하게 유도되며, Ang2와 10D6 항체를 함께 처리한 군에서의 효과가 Ang1 단독 처리군의 동등 이상임을 확인할 수 있다.

또한, 항 Ang2 항체 처리시의 Tie2 수용체 인산화 및 이의 Downstream signaling에 관여하는 단백질(Akt)의 인산화 정도를 동물모델(in vivo)에서 확인하였다. 구체적으로, 7-8주령의 C57BL6 생쥐에 항체 5 mg/kg를 단독 또는 20 ug의 Ang2와 함께 꼬리 정맥을 통해 주입한 뒤, 1시간 후에 생쥐로부터 폐조직을 얻었다. lysis buffer (Roche)와 FastPrep kit (MP biomedicals)를 이용하여 상기 준비된 폐조직을 homogenization lysis하여 얻어진 조직 용해물(tissue lysate)에서의 Tie2및 Akt의 활성 정도를 상기한 방법으로 확인하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3b 및 3c에 나타내었다. 도 3b 및 3c에서 REGN 또는 RG로 표시된 것은 대조항체 ((Regeneron 사의 항 Ang2 항체)의 결과이다. 도 3b 및 3c에서 확인되는 바와 같이, 10D6 항체는 in vivo 시험에서도 대조항체와 비교하여 현저한 Tie2 및 이의 Downstream signaling에 관여하는 단백질(Akt)의 인산화 효과를 나타내었다.

실시예7 . 10 D6 - Ang2 - Tie2 complex 형성 확인을 위한 ELISA assay

10D6 anti-Ang2 항체가 Ang2-Tie2 결합을 저해하지 않고, Tie2 signaling을 활성화 시키는 것을 확인하였기 때문에, 항체와 Ang2 Tie2수용체 간의 complex가 형성되는지 여부를 확인하기 위하여 ELISA 를 수행하였다.

96-well MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)에 4ug/ml의 Tie2-Fc (R&D systems) 또는 BSA (Sigma)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 0.25 ug/ml의 Ang2와 2 ug/ml의 10D6 항체를 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시킨 후,　상기 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. HRP 가 Conjugation 된 항-마우스 IgG 항체 (Sigma)를 1% (v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 (v/v) 비율로 희석하여 100 ul 의 양으로 각각의 웰에 넣어주고 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul(microliter)의 TMB 기질 (Cell Signaling)을 첨가하여 3분간 발색반응을 유도시켰으며, 이후, Stop 용액 (Cell Signaling) 100 ul를 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 plate 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 것과 같이 10D6 항체가 Tie2에 결합된 Ang2에 결합하여 complex를 이루는 것을 확인 할 수 있었다.

실시예8 . 10 D6 항체의 dimerization 에 의한 Tie2 수용체 clustering 을 통한 활성화 유도

Tie2 수용체가 활성화되는 것이 10D6 항체의 dimerization에 의한 효과인지를 확인하기 위하여 10D6 항체의 Fab fragment를 정제하여 실험에 이용하였다. Fab fragment는 10D6 항체로부터 Fab Preparation Kit (Pierce)을 이용하여 얻었다. Digestion buffer로 20 mM EDTA, 20 mM L-Cysteine을 포함하는 PBS을 사용하였으며, 상온에서 2시간 동안 immobilized papain을 처리하면 Fab과 Fc로 분리된다. MabSelectSuRe column (GE Healthcare)을 이용하여 이 반응 용액으로부터 Fc fragment를 제거하고 순수한 Fab fragment만을 분리, 정제하였다.

100mm culture dish에서 HUVEC (ATCC) 세포 (1X10⁶개)를 EGM-2 (Lonza) 배지를 이용하여 37℃에서 배양 후, 80~90% confluency를 보이면, 무혈청 배지 (Lonza)로 바꾸어 6 내지 16시간 동안 37℃에서 배양하였다. PBS로 한 번 세척한 뒤, 1nM의 sodium orthovanadate (Sigma) 가 혼합된 무혈청 배지(Lonza)로 바꾸어 10분간 더 배양하였다. 　PBS로 한 번 세척한 뒤, 60nM의 10D6 Ang2 항체 또는 10D6 Fab을 40nM Ang2 단백질(R&D systems)과 혼합하여 20분간 둔 뒤, 상기 배양된 세포에 처리하고 10분간 더 배양하였다. PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 뒤, 400ul의 lysis buffer (Roche) 를 처리한 후, 세포를 tube에 모으고, 4℃에서 30분간 용해시킨 후, 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 상층액을 Nanodrop을 이용하여 정량하였다.

Tie2 수용체의 downstream signaling에 관여하는 Akt, eNOS, 42/44의 인산화 여부를 확인하기 위하여, 위의 blot을 3%(v/v) skim milk (Sigma)가 혼합된 PBST로 30분간 blocking 한 뒤, 항 pAkt 항체, 항 p-eNOS 항체, 항 p-42/44 항체 (이상 Cell signaling)를 처리하였다. Blot을 stripping buffer (Thermo)에 15분간 반응시킨 뒤, 다시 blocking하여 항 Akt 항체, 항 42/44 항체를 (이상 cell signaling) 이용하여 Akt, 및 42/44를 확인하였다.

상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보여지는 바와 같이, Ang2와 함께 10D6 항체를 넣어 주었을 때는 Tie2 및 Akt, 42/44 의 활성화가 일어나는 반면, 10D6 Fab을 처리하였을 때는 활성화가 관찰 되지 않는 것으로 보아 10D6 항체의 dimerization 에 의하여 Tie2 수용체가 clustering 되어 인산화가 강하게 일어남을 확인하였다.

실시예9 .10 D6 항체에 의한 Tie2 수용체의 internalization 확인

HUVEC (ATCC) 세포(1X10⁶개)를 24시간 동안 m-slide 8 well (#80826, ibidi) 에서 키운 뒤 serum 없는 EBM-2 media (Lonza) 에서 3시간 serum starvation 시켰다. Ang1 (R&D systems) 200ng/ml 혹은 Ang2 (R&D systems) 2ug/ml과 10D6 항체 10ug/ml 를 serum 없는 EBM-2 media 에 각각 희석시킨 뒤 세포에 처리하여 그림에 명시된 시간별로 세포를 incubation하였다. 4% formaldehyde (Sigma) 로 고정시킨 세포를 anti-Tie2 항체 (R&D systems) 로 1차 염색시킨 뒤, anti-goat Alexa 555 항체 (red, Life technology)와 anti-mouse Alexa 488 항체 (green, Life technology)로 2차 염색시켰다. 염색된 세포에 Vectashield mounting medium with DAPI (Vector labs) 를 처리한 뒤 confocal laser scanning microscopy (Carl Zeiss) 로 관찰하였다.

그 결과를 도 6a 및 6b에 나타내었다. 도 6a 에서 보는 것과 같이, Ang1 처리시 Tie2 endocytosis 되는 것과 마찬가지로 Ang2와 10D6 항체를 처리하면 Tie2 수용체의 internalization이 30분부터 시작됨을 알 수 있었다 (확대 그림의 dot들). 그리고 internalized 된 Tie2 와 10D6 항체가 세포 내 organelle 인 early endosome 에 위치함을 도 6b의 anti-EEA1 항체 (Cell Signaling) 염색으로 확인할 수 있었다.

실시예10 . 10 D6 항체에 의한 세포 성장 및 이동성 증가 효과 확인

혈관 및 림프관 내피세포의 증식의 측정은 BrdU assay kit (Roche) Cell 를 이용하여 분석을 수행하였다. P3~P8의 혈관 내피 세포 (HUVEC, ATCC) 또는 림프관 내피세포(Lonza)를 Collagen coated 96 well plate (BD Bioscience)에 3000~5000 cells /well로 넣은 뒤 EGM-2 배지 (Lonza)로 16~24시간 배양하였다. 2%EBM 배지에 2ug/ml Ang2 (R&D systems)와 10ug/ml 10D6 항체를 혼합하여 준비한 뒤, PBS로 washing한 96-well plate에 넣어준 뒤 3일간 배양하였다.

효능 비교를 위하여 MedImmune 사의 anti-Ang2 항체(MEDI)를 사용하였다. BrdU assay 분석을 위하여, 1;1,000 으로 희석된 BrdU solution을 10ul씩 각 well에 넣어서 세포에 labeling 되도록 하였다. 1시간 동안 배양한 뒤, 배양액 제거 후, Fixation/Denaturation solution(Roche)을 100ul 씩 각 웰에 넣고 30분간 기다린 뒤 제거하였다. Peroxidase가 conjugation 되어있는 Anti-BrdU 항체(Roche)를 dilution buffer(Roche)를 이용하여 1;100 으로 희석한 뒤, 각 웰에 넣고 1시간 반응시킨 후 washing buffer(Roche)를 이용하여 4회 washing하였다. 여기에 100ul의 TMB substrate를 넣고 반응시킨 후, Microplate reader (Perkin Elmer)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보여지는 바와 같이, 혈관 내피세포 및 림프관 내피세포 모두에서 Ang2에 10D6 항체를 함께 넣은 군에서 세포의 성장이 증가됨을 확인하였고, MEDI 항체의 경우에는 Ang2에 의한 세포의 성장을 감소시킴을 확인하였다.

또한, 림프관 내피세포의 이동성의 측정은 GE Healthcare의 xCelligence RTCA (Realtime cell analyzer)를 이용하여 측정하였다. RTCA는 realtime으로 impedance를 측정함으로써 세포의 변화를 확인할 수 있는 non-invasive한 cell monitoring system이다. Cell migration assay 수행을 위해 lower chamber와 upper chamber로 구성된 CIM-plate16 (GE Healthcare)을 사용하는데, upper chamber에 impedance를 측정하는 미세전극이 배열되어 있어 chamber에 seeding된 세포가 미세구멍을 통해 이동하면 미세 전극에 부착되어 세포의 이동 정도를 확인할 수 있고, 이를 migration index로 나타내었다. EGM-2 배지 (Lonza)에서 자란 림프관 내피세포(P5-7; Lonza)를 1% FBS가 첨가된 EBM 배지에서 6시간 동안 배양하였다. CIM-plate16의 lower chamber 각 well에 2% FBS가 첨가된 EBM 배지에 2 ug/ml Ang2와 10D6 항체를 넣은 뒤 fibronectin (Sigma) coating된 upper chamber와 assembly 하였다. 효능 비교를 위하여 MedImmune 사의 anti-Ang2 항체를 사용하였다. Upper chamber에 serum free EBM 배지를 30 ul 씩 넣어준 뒤, plate와 배지간의 equilibration을 위해 1시간 동안 incubator에 두고 CIM-plate를 incubator내의 device station에 장착한 후 background value 측정하였다. Serum-free media로 resuspension된 림프관 내피세포를 60,000 cells/well의 양으로 seeding하고, 15분간 settle down하도록 방치한 뒤, device에 장착하여 세포 이동을 실시간으로 측정하였다. 세포 이동 정도는 Slope (1/hr) 로 나타내었다.

상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보는 것과 같이 Ang2와 함께 10D6 항체를 넣은 림프관 내피세포의 이동이 증가되나, MEDI 항체의 경우에는 Ang2에 의한 세포의 이동이 저해 됨을 확인하였다.

실시예11 . 10 D6 항체에 의한 세포 투과성 억제 효과 확인

10D6 항체의 세포 투과성 억제 효과를 확인하기 위해 In vitro vascular permeability assay kit (Millipore)를 이용하였다. collagen coating 된 transwell에 HUVEC (ATCC) 세포를 5x10⁴ 개 넣고 2일간 배양하여 confluent monolayer를 만들었다. Ang2 200 ng/ml 혹은 Ang1 (R&D systems) 200 ng/ml 단독, 또는 Ang2 200 ng/ml와 10D6 항체 1ug/ml를 처리하고 30분간 pre-incubation 후에, HUVEC monolayer의 permeability를 유도하기 위해 LPS (Lipopolysaccharide; Sigma) 100 ng/ml 혹은 TNF-a(R&D systems) 100 ng/ml를 처리하였다. LPS나 TNF-a는 HUVEC 세포 간의 결합을 약화시켜 gap을 형성하게 하여, HUVEC monolayer 간의 물질의 이동을 증가시킨다. LPS 처리 그룹은 6시간 incuabtion, TNF-a 처리 그룹은 22시간 incubation 후에 FITC-dextran (Millipore)를 upper chamber에 처리하고, 18분 동안 incubation하였다. lower chamber로 이동한 FITC-Dextran의 형광을 Envision 2104 multilabel Reader (Perkinelmer) 를 이용 485 / 535 nm (Ex /Em) setting 에서 측정하였다다.

상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 도9는 상기 측정한 형광의 세기를 상대적인 fold로 나타낸 그래프로, LPS 혹은 TNF-a에 의해 유도된 vascular permeability를 의미한다. 상기 결과를 통해 LPS 혹은 TNF-a에 의해 증가한 vascular permeability가 Ang1 단독 처리군 및 Ang2와 10D6 항체를 함께 처리한 군에서 control level 로 감소함을 확인할 수 있다.

실시예12 . 10 D6 항체에 의한 항 염증 효과 확인

10D6 항체에 의한 항 염증 효과를 확인하기 위해, HUVEC (ATCC) 세포 4X10⁵에 Ang2 단독 또는 Ang2와 10D6 항체를 함께 처리하였으며, 대조군으로 Ang1 및 Ang2 (R&D systems) 와 Regeneron 사 항체(RG 항체)를 함께 처리한 그룹을 포함하였다. Ang1 0.2ug/ml, Ang2 0.1ug/ml, 또는 Ang2 0.1ug/ml와 항체 0.5ug/ml를 HUVEC 세포에 각각 처리하고, 30분 pre-incubation 후에, 염증반응을 유도하기 위해 LPS (Sigma) 100 ng/ml를 처리하고, 5시간 동안 incubation 하였다.

염증반응의 정도는 염증부착물질 (ICAM-1, E-selectin)의 mRNA 발현 정도를 측정해 확인하였다. PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 후, RNeasy Mini kit (Qiagen)을 사용하여 RNA를 추출하여, 이 중 2ug RNA를 Transcriptor First Strand cDNA synthesis kit (Roche)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. pPCR reaction은 RT2 SYBR^TM Green Mastermix (Qiagen)와 LightCycler^TM 480 Real-Time PCR System (Roche)을 사용하여 수행하였다. 샘플의 RNA 양을 보정하기 위한 internal control로는 HPRT1를 사용하며, qPCR은 모든 primer에 대해 다음 과정을 따른다. Step1: 95℃, 10 min; Step2 (45 cycles): Step 2-1: 95℃, 15 sec; Step 2-2: 60℃, 1 min; Step3: 65℃, 15 sec; Step4: 95℃, continuous (every 20℃); Step6: 40℃, 10 sec.　

qPCR에 사용된 primer sequence를 아래의 표 9에 정리하였다:

상기 측정된 ICAM-1과 E-selectin의 상대적인 발현양을 도 10에 나타내었다. 도 10에서 보여지는 바와 같이, LPS에 의해 유도된 ICAM-1, E-selectin의 발현이 Ang1 단독 처리군 및 Ang2와 10D6 항체를 함께 처리한 군에서 현저히 억제됨을 확인할 수 있다.

한편, 혈관내피세포의 염증부착물질(ICAM-1, E-selectin 등)의 발현이 증가하면, 염증세포와 혈관내피세포 간의 결합이 촉진되어 염증반응이 유도된다. 이를 확인하기 위해 염증세포인 HL-60 (ATCC) 세포와 HUVEC의 간의 결합을 측정하는 실험을 진행하였다.

24-multiwell plate에 HUVEC 세포(4X10⁵)를 배양하여 Ang2 0.1 ug/ml 단독 또는 Ang2 0.1 ug/ml와 10D6 항체 0.5 ug/ml를 함께 처리하였으며, 대조군으로 Ang1 0.2 ug/ml, 및 Ang2 0.1 ug/ml와 Regeneron 사 항체(RG항체) 0.5 ug/ml를 함께 처리한 그룹을 포함하였다. 상기한 바와 같이 Angiopoietin 및 항체를 HUVEC 세포에 처리하고 30분 pre-incubation 후에, 염증반응을 유도하기 위해 TNF-a (eBioscience) 1 ng/ml를 처리하고 2시간 30분 동안 incubation 하였다.

HUVEC 세포를 complete media (Lonza)로 washing 한 후에, Calcein-AM (BD bioscience) 용액으로 염색한 HL-60 세포를 각 well 당 2.5x10⁵ 개씩 넣고, 1시간 동안 incubation 하였다. HUVEC 세포에 결합하지 않은 HL-60 세포를 제거하기 위해 PBS를 이용해 세 번 세척한 뒤, lysis buffer(0.1% SDS, 50mM Tris.HCl, pH8.0)를 처리하였다. 얻어진 lysate를 96 well plate로 옮겨 HL-60 세포에서 유래된 형광의 세기를 Envision 2104 multilabel Reader (Perkin Elmer) 를 이용하여 485 / 535 nm (Ex /Em) setting 에서 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도11에 나타내었다. 도 11의 그래프는 상기 측정된 형광의 세기를 상대적인 fold로 나타낸 것으로, HUVEC 세포에 부착된 HL-60 세포의 개수에 비례한다. 상기 결과를 통해 TNF-a에 의해 유도된 HUVEC 세포와 HL-60세포의 결합이 Ang1 단독 처리군 및 Ang2와 10D6 항체를 함께 처리한 군에서 현저히 억제됨을 확인할 수 있다.　

실시예 13. 항 Ang -2 항체의 Colo205 종양 성장 저해 효과

Ang-2항체의 종양 성장 억제 효과를 확인하기 위하여 인간 대장암 세포주인 Colo205 (ATCC)를 이용한 대장암 Xenograft model이 이용되었다.

Colo205 세포주는 10% FBS(Gibco)가 첨가된 RPMI-1640 (Gibco) 배지를 이용하여 배양하였다. 100 ul의 serum-free 배지에 5X10⁵개의 Colo205 세포주를 resuspension한 뒤, 1~2% isoflurane을 이용하여 마취된 4~5 주령의 BALB/c nude 생쥐 (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.)에 피하주사 하였다. 종양의 크기가 100~200mm³에 이르면, 항 Ang-2 항체(10D6)을 10 mg/kg의 농도로 일주일에 2번씩 복강내 주사한 후, 종양의 크기를 측정하였다.

종양의 크기 (V)는 다음과 같은 식을 이용하여 계산하였다:

V=(length x width²)/2

상기 얻어진 결과를 도 12 에 나타내었다. 도 12의 x축은 Days after grouping으로 항체 처리가 이루어진 날을 의미한다. 도 12에서와 같이 10D6 항체가 대장암의 성장을 저해 하는 것을 확인하였다.

실시예 14. 항 Ang -2 항체의 LLC 종양 성장 저해 효과

Ang-2항체의 종양 성장 억제 효과를 확인하기 위하여 암 세포주인 LLC (Lewis Lung Carcinoma) 암세포를 이용한 Xenograft model이 이용되었다.

구체적으로, LLC 세포주(ATCC)를 10% FBS(Gibco)가 첨가된 DMEM (Gibco) 배지를 이용하여 배양하였다. 100 ul의 PBS (Gibco) 에 1X10⁶개의 LLC 세포주를 resuspension한 뒤, 1~2% isoflurane을 이용하여 마취된 6-8 주령의 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory)에 피하 주사하였다..

종양의 크기가 50~100mm³에 이르면, 10D6 항체를 10 mg/kg의 양으로 3일마다 복강 내 투여하며 종양 크기를 측정하였다. 종양의 크기 (V)는 다음과 같은 식을 이용하여 계산하였다.

Volume (V) = (width)2 x length/2

비교를 위하여 IgG1의 Fc (대조군), 또는 4H10 항체 (실시예 3 참조; 비교군)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서와 같이, 본 발명에서 제안되는 Ang2와 Tie2와의 결합을 유도하는 10D6 항체는 종양 성장을 대조군 대비 약 40% 억제하는 것을 확인할 수 있다. Ang2와 Tie2의 결합을 억제하는 항체인 4H10 항체가 종양 성장을 약 27% 억제하는 것과 비교하면, 10D6 항체의 종양 성장 억제 효과는 매우 현저한 것이라고 할 수 있다.

실시예 15. 항 Ang -2 항체의 혈관 정상화 효과

한편, 항체 처리 후 종양 내 혈관의 변화를 관찰하기 위하여, 종양의 동결절편을 얻어 혈관 특이 마커인 CD31 과 pericyte의 마커인 PDGFR-β를 이용하여 형광면역염색을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 14로부터 얻어진 종양을 OCT compound (Sakura Finetek)를 이용해 동결시킨 뒤, cryostat (Leica)를 이용하여 절편을 얻었다. 상기 얻어진 종양의 동결 절편을 5% goat serum (Jackson Immunoresearch)이 포함된 0.3% TBST (0.3% Triton X-100이 섞여있는 TBS) buffer를 이용하여 1시간 동안 블로킹하였다. Blocking buffer 에 hamster anti-CD31 antibody (1:200, Millipore) 와 rat anti-PDGF receptor beta antibody (1:200, eBioscience)를 넣은 뒤 동결 절편에 첨가하여 3 시간 동안 반응시켰다. TBS로 3회 washing 후에 blocking buffer에 cy3-conjugated anti-hamster IgG antibody와 FITC-conjugated anti-rat IgG antibody (1:1,000, Jackson Immunoresearch)를 섞어서 동결 절편에 첨가하여 2 시간 동안 반응시켰다. TBS를 이용하여 3회 washing후, Fluorescence mounting medium (DAKO)이용하여 coverslip (Marenfield)을 덮어주었다. 염색된 종양의 동결절편은 LSM5 (Zeiss) confocal microscope를 이용하여 관찰하였다. 비교를 위하여 IgG1의 Fc, 또는 4H10 항체 (실시예 3 참조)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 붉은색은 CD31+ area, 녹색은 PDGFR-베타+ area를 나타낸다. 도 14에 나타난 바와 같이, Fc 처리된 종양이나 4H10 항체가 처리된 종양과 비교하여, 10D6 항체가 처리된 종양에서 대부분의 암 혈관이 감소되어 있으며, 정상화(normalization)되어 있는 것을 관찰 할 수 있다. 예를 들면, 다른 비교군들과 비교하여, 10D6 항체 처리군에서 관찰되는 혈관의 형태가 훨씬 규칙적이고, 혈관 직경이 일정하며, sprouting이 적게 관찰되고, 또한 PDGFR-베타 양성 주변세포가 혈관주변에 밀접하게 associated되어 있는 등, 암혈관의 normalization 특징이 보다 현저하게 관찰됨을 확인 할 수 있다. 이러한 결과는 10D6 항체가 암조직 내부의 혈관 밀도를 감소시키고 정상화를 유도함을 보여준다.

실시예 16. 항 Ang -2 항체의 종양 혈관 기능 향상 효과

10D6항체가 처리된 종양 혈관의 기능을 확인하기 위하여 Lectin perfusion assay를 이용하여 혈관의 perfusion 정도를 확인하였다. 상기 실시예 14의 방법을 참조하여, 마우스에 LLC tumor cell line 을 피하주사 하고 종양의 크기가 50~100mm³에 이르면, 10D6 항체를 10 mg/kg의 양으로 3일마다 복강 내 투여하며 종양 크기를 측정하였다. 비교를 위하여 IgG1의 Fc (대조군), 또는 4H10 항체 (실시예 3 참조; 비교군)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다. 5번의 항체 투여 후, FITC-Lectin (Vector laboratory)을 꼬리 정맥 주사 후 20 분 뒤, 생쥐를 perfusion fixation 하였다. 종양의 동결 절편을 얻어 hamster anti-CD31 antibody (1:200, Millipore) 항체로 면역 염색 하고 LSM5 confocal microscope (Zeiss)로 이미지를 얻은 뒤, ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij) 를 이용하여 Lectin+ area/CD31+ area를 정량화 하였다.

상기 얻어진 결과를 도 15a와 15b에 나타내었다. 도 15a 및 15b에 나타낸 바와 같이, Fc 또는 4H10 항체 처리군과 비교하여, 10D6 항체 처리에 의하여 정상화된 종양 혈관의 perfusion 기능이 증가되며, CD31+ area (붉은색) 중에 Lectin+ area(녹색)의 %가 증가됨을 확인할 수 있다.

실시예 17. 항 Ang -2 항체의 종양 내부 괴사 감소 효과

10D6 항체 처리 후 구조적 및 기능적으로 정상화된 종양 혈관이 암 조직에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 14의 방법을 참조하여, 마우스에 LLC tumor cell line 을 피하주사 하고 종양의 크기가 50~100mm³에 이르면, 10D6 항체를 10 mg/kg의 양으로 3일마다 복강 내 투여하며 종양 크기를 측정하였다. 5번의 항체 투여 후, 종양 절편을 standard protocol에 따라 H&E 염색한 뒤, 종양 내 Eosin+ 세포 괴사 부위를 확인하였다. 비교를 위하여 IgG1의 Fc (대조군), 또는 4H10 항체 (실시예 3 참조; 비교군)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 보여지는 바와 같이, Fc 또는 4H10 항체 처리군과 비교하여, 10D6 항체 처리군의 종양에서는 세포의 괴사가 일어난 부분이 훨씬 적게 관찰되었다. 이는　10D6 항체 처리 후 정상화된 종양 내의 혈관이 정상화되어 정상적인 기능을 수행하여 종양 내부 조직의 괴사를 감소시킴을 보여주는 결과이다.

실시예 18. 항 Ang -2 항체의 암 전이 저해 효과

10D6 항체 처리시의 주변 림프절로의 암전이 정도를 확인하기 위하여, 상기 실시예 14의 방법을 참조하여, 마우스에 LLC tumor cell line 을 피하주사 하고 종양의 크기가 50~100mm³에 이르면, 10D6 항체를 10 mg/kg의 양으로 3일마다 복강 내 투여하며 종양 크기를 측정하였다. 5번의 항체 투여 후, inguinal 림프절을 분리 한 후, 조직 절편을 rabbit anti-LYVE-1 antibody (1:200, Millipore) 와 mouse pan-Cytokeratin antibody (1;200, Abcam) 를 이용하여 면역염색하였다.

비교를 위하여 IgG1의 Fc (대조군) 또는 4H10 항체 (실시예 3 참조; 비교군)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 붉은색은 폐암 세포를 나타낸다. 도 17에 나타난 바와 같이, Fc 또는 4H10 항체 처리군과 비교하여, 10D6 항체 처리에 의하여 림프절 크기가 감소(녹색 참조)되고 림프절로 전이된 폐암 세포 수가 감소(붉은색 참조)되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 10D6 항체 처리에 의하여 폐암 세포의 주변 림프절로의 전이가 억제됨을 보여주는 것이다.

실시예 19. 폐암 동물 모델에서의 항 Ang -2 항체와 항암제와의 병용 투여 효과

10D6 항체를 시스플라틴과 병용 처리시 상승된 효과를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 14의 방법을 참조하여, 마우스에 LLC tumor cell line 을 피하주사 하고 종양의 크기가 50~100mm³에 이르면, 10D6 항체를 10 mg/kg의 양으로 3일마다 총 5회 복강 내 투여하였다. 10D6 항체를 두 번 투여 후, 3 mg/kg 의Cisplatin (Sigma-Aldrich)을 1회 복강 내 투여하였다. 종양의 크기 (V)는 다음과 같은 식을 이용하여 계산하였다.

Volume (V) = (width)2 x length/2

비교를 위하여 4H10 항체를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다. 상기 얻어진 결과를 도 18a에 나타내었다.

도 18a에서 확인되는 바와 같이, 4H10 항체, 10D6 항체 또는 시스플라틴 단독 사용시에는 종양 크기가 대조군 대비 각각 29.2 %, 38.5 % 또는 17.6 % 감소한 반면, 4H10 항체와 시스플라틴 또는 10D6 항체와 시스플라틴을 병용 투여시 종양 크기가 대조군 대비 42.3 % 또는 66.9 % 감소하였다 (상기 수치는 대조군 대비 종양 부피 감소폭을 의미한다). 이는 10D6 항체와 항암제와의 병용 투여에 의하여 현저한 상승 효과를 얻을 수 있음을 보여준다.

또한, 위와 같이 보여지는 10D6 항체와 시스플라틴의 병용 투여에 의해 관찰되는 상승 효과가 실제로 10D6 항체의 처리에 의해 유도된 혈관의 정상화 효과에 의하여 마우스에 투입된 시스플라틴의 전달 효율이 높아짐으로써 나타나는 결과인지를 확인하는 실험을 진행하였다. 시스플라틴은 생체내에서 DNA에 결합하고 crosslinking을 유도함으로써 cell death를 유도하는 특징을 갖고 있다. 종양의 동결 절편에서 시스플라틴에 의해 변화된 DNA에 결합할 수 있는 rat monoclonal anti-Cisplatin modified DNA (CP9/19) antibody (1:200, Abcam)와 hamster anti-CD31 antibody (1:200, Millipore) 를 이용하여 형광 면역 염색하고, LSM5 confocal microscope (Zeiss)로 관찰하여 형광 이미지를 얻었다. 상기 얻어진 형광 이미지를 도 18b에 나타내었다. 또한, necrotic region을 확인하기 위하여, 종양 절편을 standard protocol에 따라 H&E 염색한 뒤, 종양 내 Eosin+ 세포 부위를 확인하였으며, 그 결과를 도 18c 에 나타내었다.

도 18b 에서 확인되는 바와 같이, Fc와 시스플라틴 병용 투여 또는 4H10 항체와 시스플라틴 병용 투여군 대비, 10D6 항체와 시스플라틴 병용 투여군에서 Cisplatin modified DNA (CP9/19) 항체에 positive한 area가 훨씬 많이 관찰 된 것을 확인하였다. 또한, 도 18c 에서 확인되는 바와 같이, Fc와 시스플라틴 병용 투여 또는 4H10 항체와 시스플라틴 병용 투여군 대비, 10D6 항체와 시스플라틴 병용 투여군에서 전체 종양 area 에 대한 Eosin에 positive 한 area에 대한 비율이 훨씬 증가한 것을 확인하였다. 이는 10D6 항체와 시스플라틴과의 병용 투여에서 확인된 상승효과가 실제로 10D6 항체에 의하여 유도된 혈관의 정상화 효과에 의해 암조직 내부로의 항암제 전달을 증가시켰으며, 이에 의하여 항암제의 효과를 증가시켰음을 보여준다.

실시예 20. 항 Ang -2 항체의 혈관 독성 시험

10D6 항체의 혈관 독성을 시험하였다.

구체적으로 정상6주령의 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratory)에 5 mg/kg 의 10D6 항체를 단독 및 20 ug의 Ang2와 함께 3일에 한번씩 6번 복강 주사하며, 마우스의 무게를 측정하였다. 20일 후, 갑상선, 부갑상선 및 부신을 포함한 다양한 조직을 얻고, 조직의 동결절편에서 hamster anti-CD31 antibody (1:200, Millipore)를 이용하여 형광 면역 염색 하여 변화를 관찰 하였다. 비교를 위하여 20 ug 의 Ang2를 단독으로 투여한 군을 사용하였다.

상기 결과를 도 19a 및 도 19b에 나타내었다. 19a 및 도 19b에서 확인되는 바와 같이, 정상 생쥐에 10D6 항체 처리시 체중 변화 및 혈관의 형태적 이상이 관찰되지 않았으며, 이는 10D6 항체가 혈관 독성이 없음을 보여준다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00295

20130423

<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Anticancer composition containing an anti-Ang2 antibody inducing binding to Tie2 receptor <130> DPP20133907KR <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 1 Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of anti-Ang2 antibody <400> 2 Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of anti-Ang2 antibody <400> 3 Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of anti-Ang2 antibody <400> 4 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of anti-Ang2 antibody <400> 5 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of anti-Ang2 antibody <400> 6 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of an anti-Ang2 antibody <400> 7 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ser Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 <210> 8 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding DNA of heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody <400> 8 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataaact acagtggtaa cactgactac 180 aacccatctc tcaaaagtcg aagctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgcagttga attctgtgac tactggggac acagccacat attactgtgc aagaggtaac 300 ttcgaaggtg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of anti-Ang2 antibody <400> 9 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding DNA of light chain variable region of anti-Ang2 antibody <400> 10 agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60 ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120 gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctaccctgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 11 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Ang2 <400> 11 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 145 150 155 160 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 165 170 175 Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser 195 200 205 Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn 210 215 220 Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255 Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270 Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 275 280 285 Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300 Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320 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Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Leu Ile Ser Phe Trp Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of 4H10 <400> 13 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110

Claims

앤지오포이에틴-2(Ang2)에 특이적으로 결합하고, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하는, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Tie2 수용체의 인산화를 증가시킴으로써 활성을 증가시키는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Akt, eNOS, 및 42/44로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 인산화를 증가시키는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2(서열번호 11)의 Q418, P419, Q418과 P419의 조합, 또는 서열번호 11 내의 상기 Q418, P419, 또는 Q418과 P419의 조합을 포함하는 2개 내지 20개의 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 중쇄(Heavy chain) 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경쇄(Light chain) 상보성 결정부위, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정부위 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변 영역: 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 수탁번호 KCLRF-BP-00295의 하이브리도마로부터 얻어진 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Ang2를 추가로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
앤지오포이에틴-2(Ang2)에 특이적으로 결합하고, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하는, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 항암 보조제.
제12항에 있어서,
상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Tie2 수용체의 인산화를 증가시킴으로써 활성을 증가시키는 것인, 항암 보조제.
제12항에 있어서,
상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Akt, eNOS, 및 42/44로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 인산화를 증가시키는 것인, 항암 보조제.
제12항에 있어서,
상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2(서열번호 11)의 Q418, P419, Q418과 P419의 조합, 또는 서열번호 11 내의 상기 Q418, P419, 또는 Q418과 P419의 조합을 포함하는 2개 내지 20개의 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 것인, 항암 보조제.
제15항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 중쇄(Heavy chain) 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경쇄(Light chain) 상보성 결정부위, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정부위 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것인, 항암 보조제.
제16항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변 영역: 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 것인, 항암 보조제.
제17항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 항암 보조제.
제12항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 수탁번호 KCLRF-BP-00295의 하이브리도마로부터 얻어진 것인, 항암 보조제.
제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 항암 보조제.
제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 항암 보조제.
제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Ang2를 추가로 포함하는, 항암 보조제.
항암제; 및
제12항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항암 보조제
를 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제23항에 있어서, 상기 항암제는 화학 약물, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, microRNA, 앱타머, 세포치료제, 및 방사선 치료제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제23항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴, 카보플라틴(Carboplatin), 옥살리플라틴(Oxalliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Doxetaxel), 빈크리스틴(Vincristine), 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 블레오마이신(Bleomycin), 프레드니손(Prednisone), 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실(5-FU), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 및 6-티오구아닌(6-TG)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.
제23항에 있어서, Ang2를 추가로 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물.