KR20170076332A - 항 Ang2 항체를 포함하는 면역강화제 - Google Patents

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Abstract

항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역강화제 및 면역 질환 치료용 조성물이 제공된다.

Description

항 Ang2 항체를 포함하는 면역강화제{Immunopotentiator containing anti-Ang2 antibody}
항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역강화제 및 면역 질환 치료용 조성물이 제공된다.
노화 및 다양한 면역 관련 질병 (후천성면역결핍증, 자가면역질환 등)으로 유발되는 면역기능의 감소는 주로 흉선의 퇴화, T 세포 증식 감소, 외부 항원에 대한 T 세포 반응의 감소, 자가항원에 대한 반응 증가를 초래한다.
T 세포는 면역 세포의 증식과 분화 조절 물질인 사이토카인을 생성하여 면역반응을 조절하며, 바이러스에 감염된 세포나 이식된 세포, 종양세포를 파괴하며, 말초혈액 림프구의 60~80%를 차지하는 면역 세포의 한 종류이다. 모든 T 세포는 항원과 특이하게 결합하는 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR)와 CD2 및 CD3 분자 복합체를 발현하며, 세포막 표지분자인 CD4 또는 CD8 분자에 따라 크게 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포로 나뉜다. CD4+ T 세포는 주로 사이토카인을 생성하여 면역반응을 돕고 대식세포를 활성화시켜 지연형 과민반응을 유발한다. CD8+ T 세포는 바이러스에 감염된 세포 또는 이식된 조직과 종양세포를 파괴하는 것을 주요기능으로 가지고 있으며 세포 독성 T 세포로 알려져 있다.
최근에는 노화와 동반하여 T 세포 활성화 경로에 중요한 역할을 담당하는 c-myc, c-jun, c-fos 유전자들의 발현과 IL-2 싸이토카인의 전사조절인자인 AP-1및 NF-AT의 발현이 저하된다는 보고들이 있다. T 세포는 항원을 감지하면 T 세포의 증식이 활성화되어 면역계가 숙주 안에 들어온 세균에 맞서 싸우도록 자극하는 단백질인 IL-2 사이토카인 등의 면역 자극 물질을 분비한다. 노화가 진행되거나 HIV (Human Immunodeficiency Virus) 감염시에는 IL-2 분비량이 감소하여 T 세포를 포함한 면역계의 효과적인 대응이 저해된다. IL-2는 주로 활성화된 T 세포에서 생산되며, IL-2 수용체를 통해 자기 분비 (autocrine)와 주변 분비 (paracrine) 방식으로 기능한다. IL-2 수용체를 통한 신호전달체계는 Akt, MAP kinase, JAK-STAT 신호전달체계를 활성화 시킴으로써 세포 분화, 성장, 생존과 관련한 생물학적 기능을 조절한다.
기존의 화합물(small molecule)을 이용하는 면역력 개선 방법은　표적 이외의 비특이적 결합에 의한 부작용을 초래할 가능성이 높아 용법 및　용량에 제한이 있다. 또한, 대표적인 면역관련 질환인 AIDS의 치료를 위하여 항레트로바이러스 다제요법 (Highly Active AntiRetroviral Therapy, HAART)에 의하여 바이러스의 양의 감소시키는 방법이 사용되고 있으나 면역 강화　효과는 없다. 또한, 면역력 저하를 개선하기 위하여 글루코코르티코이드 호르몬 등과 같은 약물을 이용한 염증반응 억제 기술이 사용되고 있으나, 이들 방법은 약물의 표적분자와의 과도한 반응에 따른 심혈관질환, 암, 골다공증 등의 부작용을 초래하여 용법과 용량에 제한이 있다.
따라서 노화 및/또는 면역 관련 질병에 의한 면역 저하의 치료법의 개발이 필요하다.
본 발명은 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 면역 강화 및/또는 면역 관련 질환의 예방 및/또는 치료 용도와 관련된 것이다.
일 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역강화제를 제공한다.
다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 면역강화를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역강화 방법을 제공한다.
다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역 관련 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 면역 관련 질환의 예방 및/도는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
상기 항 Ang2 항체는 신생혈관형성 유도인자인 Ang2(Angiopoietin-2)에 특이적으로 결합하여 Ang2의 작용을 저해하고, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하여 Tie2 수용체의 활성화를 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서는 노화된 마우스에 항 Ang2 항체를 투여함으로서, 흉선 퇴화 방지, T 세포 개수 증가 및 기능 강화(회복), 및 조혈 모세포 증가 효과가 얻어짐을 확인하여, 항 Ang2 항체가 흉선 퇴화를 방지하고 기능을 개선 및/또는 회복시킴으로써, 면역강화 활성을 가지고, 면역 질환의 예방 및/또는 치료에 활용 가능함을 제안한다.
본 발명의 일 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역강화용 약학 조성물 (면역강화제)을 제공한다. 다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 면역강화를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역강화 방법을 제공한다. 상기 면역 강화 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 면역 강화를 필요로 하는 환자를 확인(진단 또는 선택)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기와 같은 항 Amg2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 면역강화 효과는, 항 Ang2 항체를 투여한 노화 마우스 (24개월령)에서의 흉선 퇴화 방지 효과 (실시예 2 및 3 참조), 흉선의 기능 개선 및 T 세포 개수 증가 효과 (실시예 4 참조), T 세포 기능 강화(회복) 효과 (실시예 5 참조), 및 조혈 모세포 증가 효과 (실시예 6 참조)에 의하여 확인된다.
따라서, 다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 흉선 퇴화 방지 및/또는 흉선 기능 개선을 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 흉선 퇴화 방지 및/또는 흉선 기능 개선을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 흉선 퇴화 방지 및/또는 기능 개선 방법을 제공한다. 상기 흉선 퇴화 방지 및/또는 기능 개선 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 흉선 퇴화 방지 및/또는 기능 개선을 필요로 하는 환자를 확인(진단 또는 선택)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 흉선 퇴화는 흉선의 크기 감소, 흉선 세포수 감소, 및/또는 T 세포 (예컨대, CD4+ T 세포 등) 생산 기능 감소 등을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 흉선 퇴화는 노화 및/또는 면역 질환에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 흉선 기능 개선은 흉선 크기 개선, 흉선 세포 개수 증가, 및/또는 흉선의 T 세포 생산 증가 등을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 T 세포 강화용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 T 세포 강화를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 T 세포 강화 방법을 제공한다. 상기 T 세포 강화 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 T 세포 강화를 필요로 하는 환자를 확인(진단 또는 선택)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 T 세포는 CD4 positive (CD+) T 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 T 세포 강화는 T 세포 개수 증가 및/또는 T 세포 기능 개선 (예컨대, IL-2 등의 사이토카인 생산 증가 등; IL-2 이외에 T 세포 기능과 관련된 사이토카인 종류가 더 있으면 알려주시기 바랍니다) 등을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, CD4+ 면역　세포의 적정수 유지는 후천선면역결핍증과 같은 면역 질환의 생존률 및 양호한 예후와 높은 상관관계를 보이므로, CD4+ T 세포 개수 증가는 면역강화 및/또는 후천성면역결핍증을 비롯한 다양한 면역 관련 질환의 치료에 유리하게 작용할 수 있다.　
다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조혈모세포 생산 증가 (자가재생능 증가)용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 조혈모세포 생산 증가(자가재생능 증가)를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 조혈모세포 생산 증가 방법을 제공한다. 상기 조혈모세포 생산 증가(자가재생능 증가) 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 조혈모세포 생산 증가를 필요로 하는 환자를 확인(진단 또는 선택)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조혈모세포는 자가증식 (self-renewal) 조혈모세포 (예컨대, long-term hematopoietic stem cells 등)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역 관련 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 면역 관련 질환의 예방 및/도는 치료를 필요로하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 면역 관련 질환의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 면역 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인 (진단 또는 선택)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역 관련 질환은 후천성면역결핍증(acquired immune deficiency syndrome; AIDS), 자가면역질환 (예컨대, 류마티즘, 전신홍반성 낭창, 자가면역성 용혈성 빈혈 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 약학 조성물 및/또는 방법에서 유효성분으로 사용되는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2 특이적으로 결합하지만 Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하지 않으며 Ang2를 통하여 Tie2 수용체와 복합체(항체/Ang2/Tie2)를 형성하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체의 이합체화(dimerization)를 유도하는 특성을 가지며, 이를 통하여 여기에 복합체화되어 있는 Tie2 수용체를 효과적으로 클러스터링(clustering)시킴으로써, Tie2 수용체 및 이의 하류 신호화 (downstream signaling)의 활성화를 유도한다. 이러한 작용 기작을 갖는 항체는 Ang2와 결합하여 세포내 이동(internalization) 및 분해를 유도함으로써 Ang2 기능을 저해하여 circulating Ang2 level을 낮추는 역할을 함과 동시에, Ang2와 함께 Tie2 수용체와 결합하여 Ang1처럼 Tie2 수용체를 활성화시켜 Tie2 downstream signaling을 유도하고 혈관내피세포의 안정화를 유도하는 이중 작용(dual function)을 갖는다.
상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2를 특이적으로 인식하고, Ang2와 결합하고, Ang2를 통하여 Tie2 수용체 결합하는 모든 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Tie2 수용체의 활성화를 유도하는 것일 수 있다. 이와 같은 Tie2 수용체의 활성화는 Tie2 수용체의 인산화 증가 및/또는 그 하부 신호 경로와 관련된 단백질, 예컨대 Akt(NM_005163), eNOS(NM_000603), 42/44(NM_002745) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 인산화에 의하여 유도될 수 있다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Tie2 수용체의 세포 내부로의 이동 (internalization)을 유도하는 것일 수 있다. 즉, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2에 특이적으로 결합하면서도, 기존의 항 Ang2 항체와 달리, Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하지 않음으로써, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하여 복합체를 형성하고, Tie2 수용체의 활성화를 유도하는 것일 수 있다.
상기 항 Ang2 항체는 인간화 및/또는 친화도 성숙 과정을 거침으로써, Ang2에 대한 결합력이 보다 증진되고, 보다 효과적으로 작용할 수 있는 것일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항체의 항원으로 작용하는 Ang2 단백질은 신생혈관 형성과 밀접한 관련이 있으며 혈액 내에 존재하는 가용성 리간드로서, 신생혈관 생성(angiogenesis), 암전이(metastasis), 암세포 침투(invasion) 에 광범위하게 작용한다. 상기 Ang2는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대 인간 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O15123 등), 원숭이 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. Q8MIK6 등), 마우스 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35608 등), 래트 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35462 등) 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
Tie2 수용체(TEK tyrosine kinase)는 안지오포이에틴-1 수용체로, 마우스(NM_013690; NP_038718), 래트, 인간(NM_000459; NP_000450) 등의 다양한 포유동물의 혈관내피세포(endothelial cell)에서 발현되며, 다양한 downstream signaling에 관여한다.
상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2 (hAng2; 서열번호 11; Accession # O15123) 의 루프 1(서열번호 11 중 417번째 아미노산부터 434번째 아미노산까지의 부위)의 전부 또는 일부(예컨대, 루프 중 외부에 노출된 아미노산 잔기 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기) 또는 서열번호 11 중에서 루프 1의 외부에 노출된 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 인접하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로서 인식하거나, 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 외부에 노출된 잔기는 생물적 매질 (biological medium) 등의 용액 (예컨대, 생체내 용액 환경; 예컨대, 생리적 pH, 온도, 등장성 등)에 노출되어 다른 단백질과의 결합에 참여 가능한 잔기를 의미하는 것이다.
Ang2(서열번호 11)
MWQIVFFTLS CDLVLAAAYN NFRKSMDSIG KKQYQVQHGS CSYTFLLPEM
DNCRSSSSPY VSNAVQRDAP LEYDDSVQRL QVLENIMENN TQWLMKLENY
IQDNMKKEMV EIQQNAVQNQ TAVMIEIGTN LLNQTAEQTR KLTDVEAQVL
NQTTRLELQL LEHSLSTNKL EKQILDQTSE INKLQDKNSF LEKKVLAMED
KHIIQLQSIK EEKDQLQVLV SKQNSIIEEL EKKIVTATVN NSVLQKQQHD
LMETVNNLLT MMSTSNSAKD PTVAKEEQIS FRDCAEVFKS GHTTNGIYTL
TFPNSTEEIK AYCDMEAGGG GWTIIQRRED GSVDFQRTWK EYKVGFGNPS
GEYWLGNEFV SQLTNQQRYV LKIHLKDWEG NEAYSLYEHF YLSSEELNYR
IHLKGLTGTA GKISSISQPG NDFSTKDGDN DKCICKCSQM LTGGWWFDAC
GPSNLNGMYY PQRQNTNKFN GIKWYYWKGS GYSLKATTMM IRPADF
예컨대, 상기 항 Ang2 항체는 서열번호 11의 루프 1에 위치하는 Q418, P419, Q418과 P419와의 조합, 또는 서열번호 11 중에서 Q418, P419, Q418과 P419와의 조합의 아미노산 잔기를 포함하는 인접하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 일 예에서 상기 항 Ang2 항체는 서열번호 11의 Q418 및 P419의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부분에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 항 Ang2 항체가 특이적으로 결합하는 부위인 Q418, P419, 또는 이를 포함하는 아미노산 부위(amino acid sequence; epitope)는 Ang2의 3차원 구조의 루프 1에 위치하는 노출된 아미노산 잔기로서, Ang2와 Tie2 수용체 간의 결합에 관여하지 않는 부위이다.
상기 항 Ang2 항체가 특이적으로 결합하는 부위인 Q418, P419, 또는 이를 포함하는 아미노산 부위에 있어서, "인접하는 아미노산"은 단백질의 1차 구조뿐 아니라 2차 또는 3차 구조상에서 서로 인접하여 위치하는 아미노산을 의미하는 것일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "인접하는 아미노산 잔기"는 단백질의 1차, 2차 또는 3차 구조 상에서 연속하는 아미노산 잔기를 의미하는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 부위를 에피토프로서 인식하거나 여기에 특이적으로 결합하는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 주형으로 인간화 및/또는 친화도 성숙된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체예에서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 중쇄(Heavy chain) 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR), 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위:
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경쇄(Light chain) 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위의 조합
을 포함하는 것일 수 있다:
보다 구체적으로, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위: 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위
를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변부위는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다:
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YINYSGNTDYNPSLKS RSSITRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR GNFEGAMDY WGQGTLVTVSS(서열번호 7)
(상기 서열번호 7에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 임)
일 구체예에 따른 항체의 경쇄는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYP GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYSSPWT FGGGTKLEIK(서열번호 9)
(상기 서열번호 9에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 임)
따라서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부위, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부위, 또는 상기 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.
상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 CDR, 예컨대, CDR-H2, CDR-L1 및 CFR-L3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열에 일부 치환에 의하여, 항체 고유의 활성은 유지하면서, Ang2에 대한 친화도가 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
일 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 치환 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:
(1) CDR-H2의 아미노산 서열(YINYSGNTDYNPSLKS; 서열번호 2) 중 1번째 아미노산 잔기 Tyr (Y)가 Lys (K)으로 치환;
(2) CDR-H2의 아미노산 서열 중 3번째 아미노산 잔기 Asn (N)이 Ser (S)으로 치환;
(3) CDR-H2의 아미노산 서열 중 5번째 아미노산 잔기 Ser (S)이 Ala (A)로 치환;
(4) CDR-H2의 아미노산 서열 중 7번째 아미노산 잔기 Asn (N)이 Lys (K)으로 치환;
(5) CDR-L1의 아미노산 서열(KASQSVSNDVA; 서열번호 4) 중 11번째 (마지막) 아미노산 잔기 Ala (A)가 His (H)로 치환;
(6) CDR-L1의 아미노산 서열(KASQSVSNDVA; 서열번호 4) 중 5번째 아미노산 잔기 Ser (S)이 Phe (F)로 치환;
(7) CDR-L1의 아미노산 서열(KASQSVSNDVA; 서열번호 4) 중 8번째 아미노산 잔기 Asn (N)이 Thr (T)로 치환;
(8) CDR-L2의 아미노산 서열(YASNRYP; 서열번호 5) 중 4번째 아미노산 잔기 Asn (N)이 Ile (I)로 치환;
(9) CDR-L2의 아미노산 서열(YASNRYP; 서열번호 5) 중 5번째 아미노산 잔기 Arg (R)이 Pro (P)로 치환;(10) CDR-L3의 아미노산 서열(QQDYSSPWT; 서열번호 6) 중 2번째 서열 Gln (Q)이 His (H)로 치환; 및
(11) CDR-L3의 아미노산 서열 중 8번째 서열 Trp (W)이 Phe (F)로 치환.
일 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은 다음의 일반식 1(서열번호 20)으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함하는 것일 수 있다:
X1-I-X2-Y-X3-G-X4-T-D-Y-N-P-S-L-K-S (일반식 1: 서열번호 20)
상기 일반식 1 중, X1는 Tyr (Y) 또는 Lys (K)이고, X2는 Asn (N) 또는 Ser (S)이며, X3는 Ser (S) 또는 Ala (A)이고, X4는 Asn (N) 또는 Lys (K)이다.
일 구체예에서, 상기 서열번호 20의 아미노산 서열은 서열번호 14 또는 서열번호 15의 아미노산 서열일 수 있다.
다른 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은 다음의 일반식 2(서열번호 21)로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1을 포함하는 것일 수 있다:
K-A-S-Q-X5-V-S-X6-D-V-X7 (일반식 2: 서열번호 21)
상기 일반식 2 중, X5는 Ser (S) 또는 Phe (F)이고, X6은 Asn (N) 또는 Thr (T)이며, X7은 Ala (A) 또는 His (H)이다.
일 구체예에서, 상기 서열번호 21의 아미노산 서열은 서열번호 16 또는 서열번호 17의 아미노산 서열일 수 있다.
다른 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은 다음의 일반식 3(서열번호 22)으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2을 포함하는 것일 수 있다:
Y-A-S-X8-X9-Y-P (일반식 3: 서열번호 22)
상기 일반식 3 중, X8은 Asn (N) 또는 Ile (I)이고, X9는 Arg (R) 또는 Pro (P)이다.
일 구체예에서, 상기 서열번호 22의 아미노산 서열은 서열번호 18의 아미노산 서열일 수 있다.
다른 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은 다음의 일반식 4(서열번호 23)으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것일 수 있다:
Q-X10-D-Y-S-S-P-X11-T (일반식 4: 서열번호 23)
상기 일반식 3 중, X10은 Gln (Q) 또는 His (H)이고, X11은 Trp (W) 또는 Phe (F)이다.
일 구체예에서, 상기 서열번호 20의 아미노산 서열은 서열번호 19의 아미노산 서열일 수 있다.
따라서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위:
서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위;
상기 중쇄 상보성 결정부위 및 상기 경쇄 상보성 결정부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위:
서열번호 4, 서열번호 16, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위;
상기 중쇄 상보성 결정부위 및 상기 경쇄 상보성 결정부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 모두 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위: 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 모두 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위
를 포함하는 것이 아닐 수 있다.
구체적으로, 상기 설명한 주형 및 친화도 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 상보성 결정 부위 및 경쇄 상보성 결정 부위를 아래의 표 1에 정리하였다.
중쇄 CDR 아미노산 서열
CDRH1-KABAT CDRH2-KABAT CDRH3-KABAT
주형 SDYAWN(서열번호1) YINYSGNTDYNPSLKS(서열번호 2) GNFEGAMDY(서열번호3)
친화도 개선 - KISYSGKTDYNPSLKS(서열번호 14) -
- KINYAGNTDYNPSLKS(서열번호 15) -
경쇄 CDR 아미노산 서열
CDRL1-KABAT CDRL2-KABAT CDRL3-KABAT
주형 KASQSVSNDVA
(서열번호4)		 YASNRYP
(서열번호 5)		 QQDYSSPWT
(서열번호 6)
친화도 개선 KASQSVSNDVH(서열번호 16) YASIPYP(서열번호 18) QHDYSSPFT(서열번호 19)
KASQFVSTDVH(서열번호 17)
일 구체예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다:
(a) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 14의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(b) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 14의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 16의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(c) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 15의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(d) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 15의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 16의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(e) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 16의 CDRL1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 19의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(f) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 14의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 17의 CDRL1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(g) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 14의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 4의 CDRL1, 서열번호 18의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(h) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 14의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 16의 CDRL1, 서열번호 18의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
(i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 14의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 17의 CDRL1, 서열번호 18의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 10nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하, 예컨대, 0.01 내지 10nM, 0.01 내지 5nM, 0.01 내지 2nM, 또는 0.01 내지 1nM의 Ang2에 대한 친화도 (KD)를 갖는 것일 수 있다. 이는 주형 항 Ang2 항체의 Ang2에 대한 친화도 (KD)가 약 8nM인 것과 비교하여 현저하게 증가된 것이라 할 수 있다.
또한, 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 상기 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변부위(서열번호 7) 중 상보성 결정부위 이외의 골격 부위의 일부 아미노산 치환에 의하여 제작될 수 있다. 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제작에 사용 가능한 중쇄 골격의 아미노산 서열을 아래의 표 2에 나타내었다:
(중쇄 인간화)
FR1 (CDR-H1의 N말단쪽 골격 부위) FR2 (CDR-H1과 CDR-H2 사이의 골격 부위) FR3 (CDR-H2와 CDR-H3 사이의 골격 부위) FR4 (CDR-H3의 C말단쪽 골격 부위)
주형(서열번호 7) DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT(서열번호 24) WIRQFPGNKLEWMG(서열번호 29) RSSITRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR(서열번호 34) WGQGTLVTVSS(서열번호 39)
인간화 (VH-hu1) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSIS(서열번호 25) WIRQPPGKGLEWIG(서열번호 30) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호 35) WGQGTLVTVSS(서열번호 40)
인간화 (VH-hu2) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSIT(서열번호 26) WIRQPPGKGLEWMG(서열번호 31) RSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호 36) WGQGTLVTVSS(서열번호 41)
인간화 (VH-hu5) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSIT(서열번호 27) WIRQPPGKGLEWIG(서열번호 32) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호 37) WGQGTLVTVSS(서열번호 42)
인간화 (VH-hu3) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSIT(서열번호 28) WVRQAPGKGLEWMG(서열번호 33) RSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호 38) WGQGTLVTVSS(서열번호 43)
또한, 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변부위(서열번호 9) 중 상보성 결정부위 이외의 골격 부위의 일부 아미노산 치환에 의하여 제작될 수 있다. 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제작에 사용 가능한 경쇄 골격의 아미노산 서열을 아래의 표 3에 나타내었다:
(경쇄 인간화)
FR1 (CDR-L1의 N말단쪽 골격 부위) FR2 (CDR-L1과 CDR-L2 사이의 골격 부위) FR3 (CDR-L2와 CDR-L3 사이의 골격 부위) FR4 (CDR-L3의 C말단쪽 골격 부위)
주형(서열번호 9) SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC(서열번호 44) WYQQKPGQSPKLLIY(서열번호 46) GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC(서열번호 48) FGGGTKLEIK(서열번호 50)
인간화 (VL-hu1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호 45) WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호 47) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호 49) FGQGTKVEIK(서열번호 51)
따라서, 일 예는 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며,
상기 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 부위는 CDR-H1의 N말단쪽 골격 부위로서 서열번호 24 내지 서열번호 28, 예컨대 서열번호 25 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, CDR-H1과 CDR-H2 사이의 골격 부위로서 서열번호 29 내지 서열번호 33, 예컨대, 서열번호 30 내지 서열번호 33으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, CDR-H2와 CDR-H3 사이의 골격 부위로서 서열번호 34 내지 서열번호 38, 예컨대, 서열번호 35 내지 서열번호 38로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 CDR-H3의 C말단쪽 골격 부위로서 서열번호 39 내지 서열번호 43, 예컨대, 서열번호 40 내지 서열번호 43으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며;
경쇄 가변 부위는 CDR-L1의 N말단쪽 골격 부위로서 서열번호 44 또는 서열번호 45, 예컨대, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, CDR-L1과 CDR-L2 사이의 골격 부위로서 서열번호 46 또는 서열번호 47, 예컨대, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, CDR-L2와 CDR-L3 사이의 골격 부위로서 서열번호 48 또는 서열번호 49, 예컨대, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 CDR-L3의 C말단쪽 골격 부위로서 서열번호 50 또는 서열번호 51, 예컨대, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
이 때, 상기 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 중쇄 가변 부위가 CDR-H1의 N말단쪽 골격 부위로서 서열번호 24의 아미노산 서열을, CDR-H1과 CDR-H2 사이의 골격 부위로서 서열번호 29의 아미노산 서열을, CDR-H2와 CDR-H3 사이의 골격 부위로서 서열번호 34의 아미노산 서열을, 및 CDR-H3의 C말단쪽 골격 부위로서 서열번호 39의 아미노산 서열을 모두 포함하는 경우; 및 경쇄 가변 부위가 CDR-L1의 N말단쪽 골격 부위로서 서열번호 44의 아미노산 서열을, CDR-L1과 CDR-L2 사이의 골격 부위로서 서열번호 46의 아미노산 서열을, CDR-L2와 CDR-L3 사이의 골격 부위로서 서열번호 48의 아미노산 서열을, 및 CDR-L3의 C말단쪽 골격 부위로서 서열번호 50의 아미노산 서열을 모두 포함하는 경우는 제외될 수 있다.
구체예에서, 상기 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 52 내지 서열번호 56으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 57 내지 서열번호 63으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.
상기 항 Ang2 항체는 수탁번호 (KCLRF-BP-00295)인 하이브리도마 세포주로부터 생산된 항 Ang2 항체 또는 이로부터 친화도 개선 및/또는 인간화된 항체일 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 한국특허공개 제2015-0136031호에 기재된 모든 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 한국특허공개 제2015-0136031호의 공개공보에 기재된 모든 내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 생체에서 분리된 것 또는 비자연적 (non-naturally occurring) 물질일 수 있으며, 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다.
항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다.　
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.
한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 발명에서 제공되는 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 단편일 수 있다.
용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 당업계에 적절한 서열이 알려져 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
항 Ang2　항체 또는 항원 결합 단편의 CDR 부위 또는 가변 부위를 제외한 부분은 인간 항체로부터 유래한 불변부위일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG 3, 또는 IgG4로부터 유래한 불변부위일 수 있다.
항 Ang2　항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항 Ang2 항체는 마우스 단클론항체를 이용하여 Schwaber 등의 논문에 기재된 방법에 의하여 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447).
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여 개별 단클론 항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 Ang2에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.
상기 방법에 있어서, 투여 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 이로부터 분리되거나 인공적으로 배양된 세포, 조직, 체액 등 일 수 있다.
상기 약학 조성물은 유효성분인 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 "약학적 유효량"은 소망하는 약리적 효과를 나타낼 수 있는 유효 성분의 함량 또는 투여량을 의미하는 것일 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 정해질 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
특히, 상기 항 Ang2 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.
본 발명은 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 흉선의 퇴화증상 방지 및 기능 개선, 면역능 향상, 및/또는 조혈모세포의 자기재생능 향상 효과를 제안함으로써, 면역강화 및/또는 면역 관련 질환의 치료에 유용한 기술을 제공한다.
도 1은 항 Ang2 항체 처리시의 흉선 크기를 대조 항체 투여시와 비교하여 보여주는 사진이다.
도 2는 항 Ang2 항체 처리시의 흉선 세포수를 대조 항체 투여시와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 3은 항 Ang2 항체 처리시의 미접촉 CD4+ T세포수를 대조 항체 투여시와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 4는 항 Ang2 항체 처리시의 IL-2를 분비하는 CD4+ T세포의 비율을 대조 항체 투여시와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 5는 항 Ang2 항체 처리시의 자가증식 조혈모세포의 비율을 대조 항체 투여시와 비교하여 보여주는 그래프이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. Ang2 에 대한 마우스 항체 10 D6 의 제조
1.1. 마우스의 면역화
　항 Ang2 항체는 5주령의 BALB/c 마우스에 인간 Ang2 단백질 (R&D systems; 623-AN-025/CF)를 adjuvant와 함께 투여하여 면역반응을 유도한 후 Schwaber 등의 논문에 기재된 공지된 방법에 의해 개별 항체를 생산하는 하이브리도마들을 제조하였다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447).
보다 구체적으로, 하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 5주령의 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)에 한 마리당 100 ug 의 인간의 Ang2 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 항원(먼저 주사한 양의 절반)을 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 Ang2을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다.
세포융합 실험 3일 전에 50 ug의 PBS에 인간 Ang2 단백질 (R&D systems) 100ug(microgram)을 혼합한 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지(DMEM, Hyclon)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1x108 개와 골수종세포(Sp2/0) 1x107 개를 혼합한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양배지(DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌 글리콜(PEG 1500) 1 ㎖을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1~2x105/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.
1.2. 단클론 항체의 생산 및 정제
상기 얻어진 항체 생산 하이브리도마들로부터 전형적인 ELISA 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여 모　하이브리도마로부터 분화시킨 하이브리도마 중 95개의 항 Ang2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1.1에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 Ang2 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 Ang2 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.
마이크로타이터 플레이트에 인간의 Ang2 단백질을 한 웰당 각각 100 ng씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 상기 실시예 1에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간의 Ang2 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 58개의 클론을 최종적으로 얻었다.
상기 얻어진 각각의 하이브리도마를 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium)에서 배양한 후 배양액을 모아 프로테인 G-친화성 크로마토그래피법으로 각각의 하이브리도마에서 생산되는 항 Ang2 단클론 항체를 정제하였다.
먼저 10% (v/v) FBS이 포함된 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖을 세포 침전물에 재현탁시킨 후 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 이후 원심분리를 통해 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여 4℃에 보관하거나 바로 모아서 50 ㎖ 내지 300 ㎖의 배양액으로부터 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 항체를 순수 정제한 후 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실험에 사용하였다.
1.3. 단클론 항체의 기능 확인 및 마우스 10 D6 항체의 선별
Ang2는 혈관내피세포에 발현된 Tie2 수용체와 결합하여 수용체의 인산화를 유도하여 활성화함으로써 혈관내피세포의 변화를 유도하는 작용을 하므로, 세포기반 분석법을 이용한 항 Ang2 항체의 Tie2 인산화에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험을 수행하였다.
이를 위하여, 100mm culture dish에서 HUVEC (ATCC) 세포(1X105개)를 EGM-2 (Lonza) 배지를 이용하여 37℃에서 배양 후, 80~90% confluency를 보이면, 무혈청 배지(Lonza)로 바꾸어 6 내지 16시간동안 37℃에서 배양하였다. PBS로 한 번 세척한 뒤, 1nM의 sodium orthovanadate 가 혼합된 무혈청 배지로 바꾸어 10분간 더 배양하였다. PBS로 한번 세척한 뒤, 상기 실시예 1.2에서 얻어진 Ang2 항체를 다양한 농도 (0.06~600nM)로 Ang2 단백질(R&D systems) 40nM과 혼합하여 20분간 둔 뒤, 상기 배양된 세포에 처리하고 10분간 더 배양하였다.
PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 뒤, lysis buffer (Roche) 400ul를 처리한 후, 세포를 tube에 모으고, 4℃에서 30분간 용해시킨 후, 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 상층액을 정량하였다. 25ug의 세포용해물에 1ug의 Tie2 항체 (R&D system)를 넣고 4℃에서 밤새도록(overnight) 반응 시킨 후, protein A bead (GE Healthcare)를 넣어 면역침강(immunoprecipitation)시켰다. 상기 얻어진 반응물을 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 펠렛을 얻은 후, lysis buffer (Roche)로 2 내지 3회 세척하고, reducing agent가 혼합된 sample buffer (Invitrogen) 를 넣고 95℃에서 5분간 끓인 뒤, NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel running하고(Invitrogen), Nitrocellulose membrane (Invitrogen)에 transfer하였다.
Tie2 수용체의 인산화 여부를 확인하기 위하여, 위의 blot을 3%(v/v) skim milk (Sigma)가 혼합된 PBST로 30분간 blocking 한 뒤, HRP-conjugated anti-phospho tyrosine 항체 (Millipore)를 이용하여 확인하였다. Tie2 확인을 위하여, blot을 stripping buffer (Thermo)에 15분간 반응시킨 뒤, 다시 blocking하여 Tie2 항체 (Santa cruz)를 이용하여 확인하였다. Ang2 단독 처리군 대비 Ang2와 함께 항체를 60nM 넣어 주었을 때 Tie2 인산화를 더 강하게 유도하는 항체를 선별하여 이를 10D6 항체로 명명하였다.
상기 10D6를 생산하는 하이브리도마는 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주은행에 2013년 5월 13일자로 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00295를 부여받았다.
1.4. 마우스 10 D6 항체의 Ang2 에 대한 친화도 시험
상기 항체의 인간 Ang2 단백질에 대한 결합 친화도를 BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한SPR 방식으로 측정하였다. SPR 방식은 센서칩에 코팅된 물질의 상태에 따라 칩을 지나는 빛의 굴절률이 변화하는 원리를 이용한 것으로, 칩에 항원 또는 항체가 코팅된 상태에서 항체 또는 항원을 흘리면 이들간 결합으로 인한 굴절률의 변화가 발생하고, 이를 측정한 수치로부터 Kd 값을 계산한다.
먼저 pH 5.0 아세테이트 용액과 아민 커플링 키트(amine coupling kit; GE Healthcare)를 이용하여 anti-His 항체를 8,000 RU 레벨까지 CM5 센서칩(GE Healthcare)에 고정화시켰다. 여기에 6 ug/ml 농도의 재조합 hAng-2 (C-His, R&D Systems) 단백질을 흘려 보내 100 ~ 200 RU 레벨로 capture시켰다. 여기에 상기 실시예 2에서 얻어진 항체를 100 nM 농도로부터 순차적으로 2배씩 희석시킨 후, 각각 흘려 보내는 방법으로 센서칩에 capture된 항원과 결합 (on), 분리 (off), 해리 (regeneration, 10 mM NaOH 용액 사용)시키며 항원-항체간 친화도를 측정하였다. hAng2에 대하여 위와 같은 방법으로 실험하였으며, 그 결과는 하기 표 4와 같다.　　　
항체 명칭 hAng2 (Kd)
SAIT-ANG2-AB-m10D6 8.0 nM
실시예 2: 마우스 10 D6 항체의 유전자 클로닝
상기 실시예 1.3에서 얻어진 항체 생산 하이브리도마(2x106 세포)로부터 RNeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 전체 RNA를 얻었다. 그런 다음, 이를 주형(template)으로 하여, OneStep RT-PCR kit (Qiagen)과 Mouse Ig-Primer Set (Novagen)과 써모사이클러(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem)를 사용하여 하기 조건으로 각 하이브리도마에서 생산되는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역(variable region) 유전자 서열만 증폭시켰다: 94℃에서 5분간; [50℃에서 30분, 95℃에서 15분], [94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분]x 35 사이클; 72℃에서 6분간; 4℃로 냉각.
각 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 직접 DNA 염기서열분석(Sequencing)을 수행하여, 각 항체의 CDR, 중쇄 가변부 및 경쇄 가변부 및 이들을 암호화하는 염기서열을 얻었으며, 상기 얻어진 결과를 아래의 표 5 내지 8에 정리하였다:
항체 명칭 중쇄 CDR 서열
CDRH1-KABAT CDRH2-KABAT CDRH3-KABAT
SAIT-ANG2-AB-m10D6 SDYAWN
(서열번호1)		 YINYSGNTDYNPSLKS
(서열번호 2)		 GNFEGAMDY
(서열번호3)
항체 명칭 경쇄 CDR 아미노산 서열
CDRL1-KABAT CDRL2-KABAT CDRL3-KABAT
SAIT-ANG2-AB-m10D6 KASQSVSNDVA
(서열번호4)		 YASNRYP
(서열번호 5)		 QQDYSSPWT
(서열번호 6)
항체 명칭 중쇄 가변부 서열
SAIT-ANG2-AB-m10D6 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YINYSGNTDYNPSLKS RSSITRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR GNFEGAMDY WGQGTLVTVSS(서열번호 7)
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAACTACAGTGGTAACACTGACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAAGCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGGGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGAGGTAACTTCGAAGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 8)
항체 명칭 경쇄 가변부 서열
SAIT-ANG2-AB-m10D6 SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYP GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYSSPWT FGGGTKLEIK(서열번호 9)
agtattgtgatgacccagactcccaaattcctgcttgtatcagcaggagacagggttaccataacctgcaaggccagtcagagtgtgagtaatgatgtagcttggtaccaacagaagccagggcagtctcctaaactgctgatatactatgcatccaatcgctaccctggagtccctgatcgcttcactggcagtggatatgggacggatttcactttcaccatcagcactgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaggattatagctctccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa(서열번호 10)
(상기 표 7 및 8에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3 임)
상기의 얻어진 서열 정보를 기반으로 중쇄가변부위와 경쇄가변부위를 코딩하는 단일가닥 DNA를 제작하고, 상기 얻어진 단일가닥 DNA를 인간 kappa 경쇄의 불변부위 및 인간 IgG1의 CH1 부위의 코딩 유전자를 포함하는 벡터에 각각 클로닝하였다. 구체적으로, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄가변부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 8)을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄가변부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 10)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄가변부위를 포함하는 벡터 및 경쇄가변부위를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.
실시예 3: 마우스 10 D6 　항체의 scFv 의 제작
마우스 10D6　항체의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 이용하여 10D6　항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 중쇄 가변부위(아미노산 서열: 서열번호 7; 코딩 염기서열: 8) 및 경쇄 가변부위(아미노산 서열: 서열번호 9; 코딩 염기서열: 서열번호 10)을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 76)'의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 'VH-링커-VL' (10D6　항체의 scFv)의 아미노산 서열과 이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 80 및 서열번호 81에 각각 나타내었다.
실시예 4: 친화도 성숙(affinity maturation)을 위한 라이브러리 유전자의 제작
4.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작
10D6　항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)을 상기 제작된 마우스 항체 10D6으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 9와 같다.
　CDR 아미노산 서열
CDR-H1 SDYAWN(서열번호 1)
CDR-H2 YINYSGNTDYNPSLKS(서열번호 2)
CDR-H3 GNFEGAMDY(서열번호 3)
CDR-L1 KASQSVSNDVA(서열번호 4)
CDR-L2 YASNRYP(서열번호 5)
CDR-L3 QQDYSSPWT(서열번호6)
항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 10D6 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오티드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오티드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오티드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.
4.2. 10 D6 　항체의 scFv 의 라이브러리 유전자 제작
CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 4.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행되었다. 주형으로 10D6 scFv(서열번호 81)를 이용하여, 아래 그림에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 10D6　항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하였다.
Figure pat00001
이렇게 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들은 모두 107~108　개 범위 내에서 구축되었다.
각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 Ang2에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 Ang2에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.
　
실시예 5: 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별
상기 실시예 4의 각 라이브러리 중 Ang-2에 강한 결합력을 보이는 상위 1.0%를 각각 분류하였으며, 이 과정은4회 반복하였다. 각각의 개별 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 10과 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다 (중쇄 불변영역: 인간IgG1 불변영역, 경쇄불변영역: 인간 KAPPA CHAIN 의 불변영역). 하기 클론 중에서, VH-6.6, VH-6.7, VL-(6.11), VL-(6.17), 및 VL-HU1(6.22)으로부터 생산된 5종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.　
클론 이름 도출된 라이브러리 CDR 서열
VH-6.6 CDR-H2 KISYSGKTDYNPSLKS(서열번호14)
VH-6.7 CDR-H2 KINYAGNTDYNPSLKS(서열번호 15)
VL-(6.11) CDR-L1 KASQSVSNDVH(서열번호 16)
VL-(6.17) CDR-L3 QHDYSSPFT(서열번호 19)
VL-(6.22) CDR-L1+ CDR-L3 KASQSVSNDVH(서열번호 16)+ QHDYSSPFT(서열번호 19)
　　
실시예 6: 마우스 항체 10 D6 로부터 인간화 항체 10 D6 - HU1 , 10 D6 - HU2 , 10 D6 -HU3, 및 10 D6 - HU5 의 제작
6.1. 중쇄의 인간화(Heavy chain humanization)
10D6-HU1 Heavy, 10D6-HU2-heavy, 및 10D6-HU5-heavy 3종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 10D6의 VH 유전자와 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, IGHV4-b*01　(DP-67; accession number: Z12367)이 아미노산 레벨에서 72.2%의 상동성을 가짐을 확인하다. 마우스 항체 10D6의 CDR-H1(서열번호 1), CDR-H2(서열번호 2), 및 CDR-H3(서열번호 3)를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 10D6의 CDR 부분이 IGHV4-b*01의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다 (10D6-HU1로 명명; 서열번호 77; QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGNTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS). 여기서, 30번 아미노산을 원래 마우스 10D6 항체의 아미노산 서열로 back-mutation (S→T)하여, 10D6-HU5(서열번호 56)를 제작하였다. 10D6-HU5에서, 48번(I→M), 67번(V→S), 71번(V→R) 아미노산을 추가로 원래 마우스 10D6 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 함으로서 10D6-HU2(서열번호 78; QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYINYSGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS)를 구축하였다.
한편, 10D6-HU3-heavy의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 10D6 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사하고, 기존의 인간화 항체 중 약 0.1% 수준의 매우 낮은 면역원성 부작용을 보인 허셉틴의 백본(backbone)으로 선정하였다. 마찬가지로 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 10D6의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3를 허셉틴 항체의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 27번 (F→Y) 28번(N→S), 30번(K→T), 48번(V→M), 49번(A→G), 67번 (F→S), 71번(A→R), 78번(A→F),　93번(S→A)을 back-mutation 하여 10D6-HU3(서열번호 79; EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGYINYSGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS)를 구축하였다.
6.2. 경쇄의 인간화(Light chain humanization)
H1-light의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 10D6의 VL 유전자와 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, IGKV1-39*01(O12; accession number: X59315)이 아미노산 레벨에서 66%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 10D6의 CDR-L1(서열번호 4), CDR-L2(서열번호 5), 및 CDR-L3(서열번호 6)를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 10D6의 CDR부분이 IGKV1-39*01의 골격에 도입되도록 디자인하였다.
이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTMAntibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(10D6-VHHU1, 10D6-VHHU2, 10D6-VHHU3, 및 10D6-VHHU5)을 EcoRI(NEB, R0101S)과 nheI(NEB, R0131) 제한효소를 사용하여 클로닝하고 pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(10D6-VLHU1(서열번호 57) 코딩: 서열번호 69)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 상기 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터는 4:1의 비율(80 ug:20 ug)로 293T 세포(2.5 x 107)에 2M CaCl2를 360 ul 첨가하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 이후, 10% FBS가 첨가된DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 10D6-HU1, 10D6-HU2, 10D6-HU3, 및 10D6-HU5를 정제하였다.　
　
실시예 7: 선별된 CDR 의　Humanization 항체로의 이식 및 IgG 로의 변환
상기 선별된 CDR 을 인간화된 항체의 중쇄와 경쇄에 각각 이식하였다. 중쇄는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다(서열번호 64-68). 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를　바이오니아에 의뢰하여 합성하였다(서열번호 69-71). Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 64-68), pcDNATM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 69-71)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 상기 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터는 4:1의 비율(80 ug:20 ug)로 293T 세포(2.5 x 107)에 2M CaCl2를 360 ul 첨가하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 이후, 10% FBS가 첨가된DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, h10D6-Opti-1,2,3,4로 명명함)를 정제하였다.
클론 이름 항체서열 (VH) 항체서열(VL)
h10D6-OPTI-1 >HU2 -6.6
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 52)		 >HU1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 57)
(코딩 염기서열)
CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 64)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 69)
h10D6-OPTI-2 >HU2 -6.7
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKINYAGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 53)		 >HU1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 57)
(코딩 염기서열)
CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGG
ATGGGAAAGATTAACTATGCCGGTAACACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGG
GGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 65)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 69)
h10D6-OPTI-43 >HU2 -6.6
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 52)		 >HU1-6.11
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 58)
(코딩 염기서열)
CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGG
ATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGG
GGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 64)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 70)
h10D6-OPTI-55 >HU2 -6.7
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKINYAGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 53)		 HU1-6.11
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 58)
(코딩 염기서열)
CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGG
ATGGGAAAGATTAACTATGCCGGTAACACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGG
GGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 65)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 70)
h10D6-OPTI-3 >HU3-6.6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 54)　		 >HU1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 57)
(코딩 염기서열)
GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 66)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 69)
h10D6-OPTI-4 >HU3-6.7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKINYAGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 55)　		 >HU1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 57)
(코딩 염기서열)
GAGGTTCAACTGGTAGAGTCCGGGGGCGGCCTGGTCCAGCCAGGAGGAAGCCTGCGGCTCTCTTGTGCCGCCAGCGGGTATAGTATCACTTCAGATTATGCCTGGAATTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGGAAGGGCTTAGAGTGGATGGGTAAAATTAATTACGCAGGCAACACCGACTATAATCCTTCACTGAAATCTAGATCCACCATCTCTAGAGATACAAGTAAGAACACCTTTTACTTGCAGATGAATAGCCTCAGGGCTGAAGACACTGCTGTGTACTACTGCGCAAGAGGAAACTTCGAAGGAGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGTACGCTTGTGACAGTGTCCTCT(서열번호 67)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 69)
h10D6-OPTI-16 >HU3-6.6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 54)		 >HU1-6.11
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 58)
(코딩 염기서열)
GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 66)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 70)
h10D6-OPTI-17 >HU3-6.7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKINYAGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 55)		 >HU1-6.11
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 58)
(코딩 염기서열)
GAGGTTCAACTGGTAGAGTCCGGGGGCGGCCTGGTCCAGCCAGGAGGAAGCCTGCGGCTCTCTTGTGCCGCCAGCGGGTATAGTATCACTTCAGATTATGCCTGGAATTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGGAAGGGCTTAGAGTGGATGGGTAAAATTAATTACGCAGGCAACACCGACTATAATCCTTCACTGAAATCTAGATCCACCATCTCTAGAGATACAAGTAAGAACACCTTTTACTTGCAGATGAATAGCCTCAGGGCTGAAGACACTGCTGTGTACTACTGCGCAAGAGGAAACTTCGAAGGAGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGTACGCTTGTGACAGTGTCCTCT(서열번호 67)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 70)
h10D6-OPTI-42 >HU5
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGNTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 56)		 >HU1-22
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHDYSSPFTFGQGTKLEIK(서열번호 59)
(코딩 염기서열)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGTACATAAACTACAGTGGTAACACTGACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGTAACTTCGAAGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACGCTTGTGACAGTGTCCTCT(서열번호 68)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCATGATTATAGCTCTCCGTTCACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 71)
(상기 표 11에서, 굵은 글씨는 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3 임)
실시예 8: 선별된 항체의 결합 친화도 분석　
표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 방식을 이용한 항원 친화도 (KD values) 측정　Ang2 항원에 대한 정확한 친화도를 측정하기 위하여 BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한　SPR 방식으로 항원 친화도를 측정하였다.　25 ug/ml 농도의 anti-His 항체를 pH 5.0 acetate 용액과 amine coupling kit (GE Healthcare)를 이용하여 CM5 센서칩 (GE Healthcare)에 고정화 시켰다. 여기에 재조합 hAng2(R&D Systems) 항원을 6 ug/ml 농도로 capture 시킨 후,　항체를 흘려 항원과 결합 및 해리시키며 항원-항체 친화도를 측정하였다. 　 상기 얻어진 결과를 아래의 표 12에 나타내었다. 표 12에서 KD 값은 kon값과 koff 값로부터 계산하였다.
항체　　 kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)
m10D6 　2.410x104 　1.932x10-4 8
10D6-HU1 3.082x104　 0.002599 84
10D6-HU2 7.298x104 0.003464 47
10D6-HU3 4.503x104 0.001938 43
10D6-HU5 　4.856x104 　0.003115 　64
h10D6-OPTI-1 　4.737x105 　3.209x10-4 0.68
h10D6-OPTI-2 　4.237x105 　1.488x10-4 0.34
h10D6-OPTI-43 　1.531x106 　5.760x10-4 0.38
h10D6-OPTI-55 　6.210x105 　8.489x10-5 0.14
h10D6-OPTI-3 　6.239x105 　3.070x10-4 0.49
h10D6-OPTI-4 　7.357x105 　2.460x10-4 0.33
h10D6-OPTI-16 　4.794x105 　4.434x10-4 0.92
h10D6-OPTI-17 　4.600x105 　3.503x10-4 0.76
h10D6-OPTI-42 　3.358x105 　2.862x10-4 0.85
표 12에서와 같이, 마우스 항체 10D6은 Ang2 항원에 대하여 약 18　nM의 결합력을 보였으며, 친화도가 개선된 5종의 인간화 항체는 0.14　nM 내지 0.85　nM범위의 결합력을 보였다. 이는 scFv 형태에서 친화도가 개선된 항체들이 IgG 변환 후에도 최소 5배에서 최대 약 37배까지 친화도가 향상되었음을 보여준다.
실시예 9: 인간화 10 D6 　항체 ( Opti -1)의 scFv 를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드의 합성
인간화 10D6　항체(Opti-1)의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 이용하여 10D6　항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 중쇄 가변부위(아미노산 서열: Hu2 6.6(서열번호 52); 코딩 염기서열: 서열번호 64) 및 경쇄 가변부위(아미노산 서열: 서열번호 Hu1(서열번호 57); 코딩 염기서열: 서열번호 서열번호 69)을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 76)'의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 10D6 opti-1　항체의 scFv('VH-링커-VL'; 서열번호 82)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 83)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다.
　
실시예 10: 2차 친화도 성숙(affinity maturation)을 위한 라이브러리 유전자의 제작
10.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작
10D6　opti-1 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 3개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)을 상기 제작된 10D6-Opti-1 항체로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 13과 같다.
　CDR 아미노산 서열
CDR-L1 KASQSVSNDVA(서열번호 4)
CDR-L2 YASNRYP(서열번호 5)
CDR-L3 QQDYSSPWT(서열번호6)
항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 10D6 opti-1 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오티드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오티드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오티드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.
10.2. 10 D6 opti -1　항체의 scFv 의 라이브러리 유전자 제작
CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 11.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행되었다. 주형으로 10D6 opti-1 scFv(서열번호 83)를 이용하여, 아래 그림에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 10D6　항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하였다.
Figure pat00002
이렇게 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들은 모두 107~108　개 범위 내에서 구축되었다.
각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 Ang2에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 Ang2에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.
　
실시예 11: 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별
상기 실시예 10에서 얻어진 라이브러리 중에서 Ang2에 강한 결합력을 보이는 상위 1.0%를 각각 분류하였고, 이를4회 반복하였다. 각각의 개별 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 14와 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다 (중쇄불변영역: 인간IgG1 불변영역, 경쇄경쇄불변영역: 인간 KAPPA CHAIN 의 불변영역). 하기 클론 중에서, 10D6_VL-Hu1-2.1, 10D6_VL-Hu1-2.4, 10D6_VL-Hu1-2.7, 10D6_VL-Hu1-2.8 으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다
클론 이름 도출된 라이브러리 CDR 서열
10D6_VL-Hu1-2.1 CDR-L1 KASQFVSTDVH(서열번호 17)
10D6_VL-Hu1-2.4 CDR-L2 YASIPYP(서열번호 18)
10D6_VL-Hu1-2.7 CDR-L1+L2 KASQSVSNDVH(서열번호 16)+YASIPYP(서열번호 18)
10D6_VL-Hu1-2.8 CDR-L1+L2 KASQFVSTDVH(서열번호 XX)+YASIPYP(서열번호 18)
실시예 12: 선별된 CDR 의　Humanization 항체로의 이식 및 IgG 로의 변환
상기 선별된 CDR 을 인간화된 항체의 경쇄에 각각 이식하였다. 중쇄는 Hu2-6.6 이나 Hu3-6.6 서열로 클로닝된 항체를 이용하고. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를　바이오니아에 의뢰하여 합성하였다(표 15 참조). invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(표 15), pcDNATM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(표 15)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 상기 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터는 4:1의 비율(80ug:20ug)로 293T 세포(2.5x107)에 2M CaCl2를 360 ul 첨가하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 이후, 10% FBS가 첨가된DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 8종의 항체(이하, h10D6-Opti-63, 65, 67, 71, 68, 70, 72, 및 73로 명명함)를 정제하였다.
클론 이름 항체서열 (VH) 항체서열(VL)
h10D6-OPTI-63 >HU2 -6.6
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 52)		 >10D6_VL-Hu1-2.1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQFVSTDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 60)
(코딩 염기서열)
CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGG
ATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGG
GGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 64)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGTTCGTGAGTACTGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 72)
h10D6-OPTI-65 >HU2 -6.6
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 52)		 >10D6_VL-Hu1-2.4
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 61)
(코딩 염기서열)
CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGG
ATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGG
GGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 64)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 73)
h10D6-OPTI-67 >HU2 -6.6
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 52)		 >10D6_VL-Hu1-2.7
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 62)
(코딩 염기서열)
CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGG
ATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGG
GGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 64)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 74)
h10D6-OPTI-71 >HU2 -6.6
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 52)		 10D6_VL-Hu1-2.8
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQFVSTDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 63)
(코딩 염기서열)
CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGG
ATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGG
GGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 64)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGTTCGTGAGTACTGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 75)
h10D6-OPTI-68 >HU3-6.6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 54)		 >10D6_VL-Hu1-2.1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQFVSTDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 60)
(코딩 염기서열)
GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 66)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGTTCGTGAGTACTGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 72)
h10D6-OPTI-70 >HU3-6.6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 54)		 >10D6_VL-Hu1-2.4
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 61)
(코딩 염기서열)
GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 66)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 73)
h10D6-OPTI-72 >HU3-6.6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 54)		 >10D6_VL-Hu1-2.7
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 62)
(코딩 염기서열)
GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 66)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 74)
h10D6-OPTI-73 >HU3-6.6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 54)　		 10D6_VL-Hu1-2.8
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQFVSTDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 63)
(코딩 염기서열)
GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 66)		 (코딩 염기서열)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGTTCGTGAGTACTGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 75)
(상기 표 15에서, 굵은 글씨는 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3 임)
실시예 13: 선별된 항체의 결합 친화도 분석　
표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 방식을 이용한 항원 친화도 (KD values) 측정　Ang2 항원에 대한 정확한 친화도를 측정하기 위하여 BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한　SPR 방식으로 항원 친화도를 측정하였다.　25 ug/ml 농도의 anti-His 항체를 pH 5.0 acetate 용액과 amine coupling kit (GE Healthcare)를 이용하여 CM5 센서칩 (GE Healthcare)에 고정화 시켰다. 여기에 재조합 hAng2(R&D Systems) 항원을 6 ug/ml 농도로 capture 시킨 후,　항체를 흘려 항원과 결합 및 해리시키며 항원-항체 친화도를 측정하였다. 　 상기 얻어진 결과를 아래의 표 16에 나타내었다. 표 16에서 KD 값은 kon값과 koff 값로부터 계산하였다.
항체　　 kon (1/Ms) koff (1/s) KD (M)
h10D6-OPTI-63 2.676x106 7.421x10-5 2.773x10-11
h10D6-OPTI-65 4.960x165 2.250x10-5 4.536x10-12
h10D6-OPTI-67 2.080x166 2.684x10-7 1.291x10-13
h10D6-OPTI-68 5.355x105 1.696x10-4 3.168x10-10
h10D6-OPTI-70 2.650x105 1.159x10-4 4.374x10-10
표 16에서와 같이, 친화도가 개선된 8종의 인간화 항체는0.000129　nM 내지 0.43　nM범위의 결합력을 보였다.
실시예 14: 흉선 크기로 측정한 항 Ang2 항체의 흉선 퇴화 방지 효과
흉선의 퇴화는 노화 및 후천성면역결핍증 등을 포함한 면역관련 질환에서 주로 관찰되는 현상이다. 항 Ang2 항체가 흉선 퇴화에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위하여 아래와 같이 실험을 진행하였다. 상기 실시예 1-13에서 선별되고 친화도 확인된 항 Ang2 항체 중에서 예시적으로 h10D6-Opti-67 항체를 사용하여 아래 시험을 진행하였다.
복강 주사를 통해 8주간 주당 1회 4 mg/kg 의 농도의 항 Ang2 항체 (h10D6-Opti-67) 및 대조 항체 (control antibody; human IgG1)를 접종 받은 4개월령 (젊은 마우스)과 24개월령 (노화 마우스) 생쥐를 사용하였다. 대조 항체를 접종 받은 젊은 마우스, 노화 마우스는 각각 YC, OC 로 표기하고, 항 Ang2 항체를 접종 받은 노화 마우스는 OA 로 표기하였다. 항체투여 8주 후 각각의 대조군 (YC, OC) 및 실험군 (OA)에서 흉선을 분리하여 형태와 크기를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인되는 바와 같이, 대조 항체를 처리한 노화 마우스 (OC)의 흉선은 대조 항체를 처리한 젊은 마우스 (YC)의 흉선에 비해 50% 이상의 크기 감소를 보이는 반면, 항 Ang2 항체를 처리한 노화 마우스 (OA)의 흉선 크기는 젊은 마우스의 흉선과 거의 동일함이 관찰되었다. 이러한 결과는 항 Ang2 항체가 흉선 퇴화 방지에 효과가 있음을 보여주는 것이다.
실시예 15: 흉선 세포수로 측정한 항 Ang2 항체의 흉선 퇴화 방지 효과
노화 및 후천성면역결핍증을 포함한 면역관련 질환으로 유발된 흉선의 퇴화는 흉선세포 (흉선에 존재하는 조혈모전구세포)수의 감소를 초래한다. 항 Ang2 항체의 흉선세포수에 대한 영향을 확인하기 위하여 상기 실시예14와 동일 조건의 마우스 집단 (YC, OC, OA; h10D6-Opti-67 항체 또는 대조 항체를 4 mg/kg 의 농도로 주당 1회 씩 8 주일 간 복강 투여)에서 분리한 흉선에서 흉선세포를 분리하여 각 실험군에서 세포수를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다 (상기 시험을 3번 수행하여 평균값을 나타냄). 도 2에 나타난 바와 같이, 대조 항체를 처리한 젊은 마우스 (YC)에 비하여 대조 항체를 처리한 노화 마우스 (OC)의 흉선세포의 수는 현격한 감소를 보이는 반면, 항 Ang2 항체를 처리한 노화 마우스(OA)에서는 대조 항체를 처리한 노화 마우스 (OC)에 비하여 흉선세포의 수의 유의미한 증가가 관찰되었다.
실시예 16: 항 Ang2 항체의 흉선 기능 개선 효과
상기 실시예14와 동일한 조건의 마우스 집단 (YC, OC, OA; h10D6-Opti-67 항체 또는 대조 항체를 4 mg/kg 의 농도로 주당 1회 씩 8 주일 간 복강 투여)에서 비장을 분리하여 유세포 분석기 (LSRFortess flow cytometry, BD)로 CD4, CD3, CD44, CD62L 표지자 (항체; 모두 Abcam사로부터 입수)를 이용하여 흉선 기능에 중요한 역할을 하는 미접촉 CD4+ T세포(naive CD4+ T cell)의 수를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다(상기 시험을 3번 수행하여 평균값을 나타냄). 도 3에 나타난 바와 같이, 대조 항체를 처리한 젊은 마우스 (YC)에 비하여 대조 항체를 처리한 노화 마우스 (OC)의 미접촉 CD4+T세포수는 현격한 감소를 보이는 반면, 항 Ang2 항체를 처리한 노화 마우스(OA)에서는 대조 항체를 처리한 노화 마우스 (OC)에 비하여 미접촉 CD4+T세포수 증가가 관찰되었다. 이러한 결과는 항 Ang2 항체의 흉선 기능 개선 효과를 확인시켜주는 것이다.
실시예17 . 항 Ang2 항체에 의한 면역기능(말초 T세포 기능) 회복 효과
노화 및 후천성면역결핍증을 포함한 면역관련 질환에서는 CD4+ T세포의 IL-2 생산기능이 저해되는 것이 알려져있다. IL-2는 림프구의 증식을 활성화시켜 면역기능을 강화시키는 대표적인 사이토카인이다.
상기 실시예14와 동일한 조건의 마우스 집단(YC, OC, OA; h10D6-Opti-67 항체 또는 대조 항체를 4 mg/kg 의 농도로 주당 1회 씩 8 주일 간 복강 투여)에서의 CD4+ T세포 기능을 측정하기 위해, 항 IL-2 항체 (Abcam) 를 이용한 세포내 싸이토카인 면역염색을 진행하여, 유세포 분석기 (LSRFortess flow cytometry, BD)로 사이토카인 IL-2를 분비하는 CD4+ T세포 수를 측정하였다.
상기 얻어진 IL-2를 분비하는 CD4+ T세포의 비율 (%; IL-2를 분비하는 CD4+ T세포의 수/전체 CD4+ T세포 수)을 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 대조 항체를 접종 받은 젊은 마우스 (YC)에 비해 대조 항체를 접종 받은 노화 마우스 (OC)에서 감소된 CD4+T세포의 IL-2 생산기능이 항 Ang2 항체를 처리한 노화 마우스 (OA)에서 회복되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 18: 항 Ang2 항체에 의한 자가증식 조혈모세포 증가 효과
상기 실시예14와 동일한 조건의 마우스 집단 (YC, OC, OA; h10D6-Opti-67 항체 또는 대조 항체를 4 mg/kg 의 농도로 주당 1회 씩 8 주일 간 복강 투여)의 뒷다리 뼈에서 골수 세포를 분리하여, 유세포 분석기 (LSRFortess flow cytometry, BD)를 이용하여 골수 세포 내의 조혈모세포의 비율(%)을 측정하였다. 특히 T세포 분화의 주요인자인 자가증식(self-renewal) 조혈모세포 (long-term hematopoietic stem cells; LT-HSC)의 비율(%)을 lineage negative (CD3-, B220-, CD11b-, Ter119-, Gr1-), c-Kit, Flk2, CD34 표지자 (Abcam)를 이용하여 면역염색을 통해 측정하였다.
상기 측정된 자가증식 조혈모세포의 비율 (%; 자가증식 조혈모세포 개수/전체 골수세포 개수)를 도 5에나타내었다 (상기 시험을 3번 수행하여 평균값을 나타냄). 도 5에 나타난 바와 같이, 대조 항체 처리군 (YC, OC)과 비교하여, 항 Ang2 항체를 처리한 노화 마우스 (OA)에서 자가증식 조혈모세포의 비율이 증가된 것을 확인할 수 있다.
한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00295 20130423
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chain variable region(SEQ ID NO: 59) <400> 71 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccaatc gctaccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcat gattatagct ctccgttcac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 72 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 60) <400> 72 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gttcgtgagt actgatgtac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccaatc gctaccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 73 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 61) <400> 73 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccatcc cataccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 74 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 62) <400> 74 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccatcc cataccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 75 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 63) <400> 75 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gttcgtgagt actgatgtac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccatcc cataccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 76 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 77 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D6-HU1 <400> 77 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 78 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D6-HU2 <400> 78 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 79 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D6-HU3 <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 80 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-linker-VL (scFv) of 10D6 <400> 80 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu 130 135 140 Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro 180 185 190 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 195 200 205 Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp 210 215 220 Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 <210> 81 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of VH-linker-VL (scFv) of 10D6 <400> 81 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataaact acagtggtaa cactgactac 180 aacccatctc tcaaaagtcg aagctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgcagttga attctgtgac tactggggac acagccacat attactgtgc aagaggtaac 300 ttcgaaggtg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcaggcggc 360 ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagca gtattgtgat gacccagact 420 cccaaattcc tgcttgtatc agcaggagac agggttacca taacctgcaa ggccagtcag 480 agtgtgagta atgatgtagc ttggtaccaa cagaagccag ggcagtctcc taaactgctg 540 atatactatg catccaatcg ctaccctgga gtccctgatc gcttcactgg cagtggatat 600 gggacggatt tcactttcac catcagcact gtgcaggctg aagacctggc agtttatttc 660 tgtcagcagg attatagctc tccgtggacg ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 720 720 <210> 82 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-linker-VL (scFv) of10D6 opti-1 <400> 82 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Lys Ile Ser Tyr Ser Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp 210 215 220 Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 <210> 83 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of VH-linker-VL (scFv) of10D6 opti-1 <400> 83 caggtgcaac tgcaggagtc aggccccggc ctggtaaaac cttctgaaac gctctcactt 60 acctgtgccg ttagtggata ctctatcact tccgactacg cttggaattg gattcggcag 120 cctccaggca aagggctgga atggatggga aagatttcct attccggtaa gactgactac 180 aatcccagtc tgaagagcag gtcaacaatc tccagagaca ccagcaagaa tcagttttcc 240 ctgaaattgt cctcggtgac agcagcggat accgcagtgt attattgcgc ccgcggtaac 300 ttcgagggag ctatggatta ctgggggcag ggtactctcg tcactgtgag cagcggcggc 360 ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg acatccagat gacccagtct 420 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcaa ggccagtcag 480 agtgtgagta atgatgtagc ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 540 atctattatg catccaatcg ctaccctggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 600 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 660 tgtcagcagg attatagctc tccgtggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatcaaa 720 720 <210> 84 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region <400> 84 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 85 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 (N-terminal frame region of CDR-H1 of 10D6) <400> 85 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 (C-terminal frame region of CDR-H3 of 10D6) <400> 86 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 87 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 87 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Asp Tyr Ala Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 88 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence coding VL (h10D6-OPTI-64) <400> 88 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccaacc gataccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtggacag gattatgcct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 89 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Asp Tyr Ser Ala Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 90 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequecne coding VL (h10D6-OPTI-66) <400> 90 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccaacc gataccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtggacag gattattctg ccccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321

Claims (13)

  1. 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고,
    상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2에 특이적으로 결합하고, Ang2를 통하여 Tie2 수용체에 결합하는 것인,
    면역강화제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2(서열번호 11)의 Q418, P419, Q418 및 P419의 조합, 또는 서열번호 11 내의 상기 Q418, P419, 또는 Q418 및 P419의 조합을 포함하는 2개 내지 20개의 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 것인, 면역강화제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위: 및
    서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위
    를 포함하는 것인, 면역강화제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위:
    서열번호 4, 서열번호 16, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위
    를 포함하는 것인, 면역강화제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 7 및 서열번호 52 내지 서열번호 56으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 8 및 서열번호 57 내지 서열번호 63으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 것인, 면역강화제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체는 마우스 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 면역강화제.
  7. 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고,
    상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2에 특이적으로 결합하고, Ang2를 통하여 Tie2 수용체에 결합하는 것인,
    면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2(서열번호 11)의 Q418, P419, Q418 및 P419의 조합, 또는 서열번호 11 내의 상기 Q418, P419, 또는 Q418 및 P419의 조합을 포함하는 2개 내지 20개의 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 것인, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위: 및
    서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위
    를 포함하는 것인, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위:
    서열번호 4, 서열번호 16, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위
    를 포함하는 것인, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 7 및 서열번호 52 내지 서열번호 56으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 8 및 서열번호 57 내지 서열번호 63으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 것인, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체는 마우스 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역질환은 후천성면역결핍증, 또는 자가면역질환인, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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