CN116648461A - 新型抗-lag3抗体及其制备和使用方法 - Google Patents

新型抗-lag3抗体及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

公开了与人LAG3或其片段或功能域特异性结合的单域抗体，和含有该单域抗体的组合物。还公开了制备该抗体的方法和该抗体用于治疗和/或预防一种或多种疾病的用途，如淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，或胶质母细胞瘤。

Description

新型抗-LAG3抗体及其制备和使用方法
优先权声明
本申请对国际专利申请案(申请号：PCT/CN2020/132111；提交日期：2020年11月27日)的权益提出主张，要求以引用的方式(包括其说明书附图)纳入本申请。
技术领域
本发明的公开涉及新型抗-LAG3抗体(尤其是新型单域抗体)及其治疗用途。
背景技术
淋巴细胞活化基因3(LAG3)也叫CD223，是一种在活化的T细胞，NK细胞，B细胞，和浆细胞样树突细胞表面表达的分子，其对T细胞功能[1，2]有多种多样的生物学作用。LAG3还是一种免疫检查点受体，因此是各种癌症和自身免疫性疾病的发病靶点之一[3]。目前有若干种抗-LAG3抗体正在开展临床试验，用于治疗各疾病，例如，淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，胶质母细胞瘤等。但目前尚未有任何抗-LAG3抗体药物面市。市场对有效的抗-LAG3疗法有需求。本发明的公开满足该领域的需求。
概述
本申请在某些实施例中提供了可特异性地与LAG3或其片段结合的抗体(尤其是单域抗体(sdAb))。还公开了sdAb的抗体互补决定区(CDR)。在一些实施例中，抗体为人源化抗体。在一些实施例中，抗体为重组抗体。在一些实施例中，单域抗体为VHH抗体。
在此提供了一种药物组合物，用于治疗和/或预防多种疾病，例如，淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，和胶质母细胞瘤。在此公开的药物组合物包括一种或多种单域抗体。在一些实施例中，该药物组合物包括两种或多种在此公开的单域抗体，以产生协同作用。例如，该两种或多种单域抗体可与LAG3蛋白质不同位置或区域的表位结合。在一些实施例中，该药物组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的佐剂，载体，辅料，防腐剂，或其组合。
在此提供了一种试剂盒，其包括在此公开的一种或多种单域抗体，用于治疗和/或预防多种疾病，例如，淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，和胶质母细胞瘤。替代地，该试剂盒包括一种药物组合物，其包括在此公开的一种或多种单域抗体，用于治疗和/或预防多种疾病，例如，淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，和胶质母细胞瘤。在某些实施例中，该试剂盒进一步包括使用说明。
在此提供了一种方法，用于治疗和/或预防多种疾病，例如，淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，和胶质母细胞瘤。该方法包括向有需要的受试者给予有效治疗量的在此公开的一种或多种单域抗体。替代地，该方法包括向有需要的受试者给予有效治疗量的一种药物组合物，其包括在此公开的一种或多种单域抗体。在某些实施例中，向该受试者同时或依次给予两种或多种单域抗体。在某些实施例中，该药物组合物包括两种或多种单域抗体。
在此提供了所公开的一种或多种单域抗体在配制用于治疗和/或预防多种疾病的药剂中的用途，例如，淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，和胶质母细胞瘤。
附图说明
图1示出了多种单域抗体(如sdAb Nos.1，17，18，20，21，24，25，27，和73)与对照BMS抗体的效果对比。
图2示出了多种单域抗体(如sdAb Nos.2015，2018，2093，18，25，和27)与多种sdAb的组合(如25和2015的组合，25和18的组合，以及25和27的组合)的效果对比。
图3示出了具有不同数量连接子的多种sdAb融合物(如25-27-2，25-27-3，25-Fc-27，25-17-1，25-17-2，25-17-3，25-2015-1，25-2015-2，和25-2015-3)与对照GS2-2和BMS抗体的效果对比。
图4示出了多种经改良的sdAb No.17的实施例(17以空心三角形表示)与hLAG3-His蛋白的结合情况：sdAb No.17-H1(实心正方形)，sdAb No.17-H2(实心三角形)，sdAbNo.17-H3(实心倒三角形)，和sdAb No.17-H4(实心菱形)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)。
图5示出了另一种经改良的sdAb No.17的实施例(17以空心三角形表示)与hLAG3-His蛋白的结合情况：sdAb No.17-H5(实心三角形)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)。
图6示出了另一种经改良的sdAb No.27的实施例(27以空心三角形表示)与hLAG3-His蛋白的结合情况：sdAb No.27-H1(实心菱形)和sdAb No.27-H2(星号)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)。
图7示出了多种经改良的sdAb No.17的实施例(17以空心三角形表示)与293T-hLAG3细胞的结合情况：sdAb No.17-H1(实心倒三角形)，sdAb No.17-H2(实心菱形)，sdAbNo.17-H3(实心圆)，和sdAb No.17-H4(实心正方形)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)。
图8示出了多种经改良的sdAb No.27的实施例(27以空心三角形表示)与293T-hLAG3细胞的结合情况：sdAb No.27-H1(实心倒三角形)和sdAb No.27-H2(实心菱形)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)，BMS作为阳性对照(BMS，星号)。
图9示出了多种经改良的sdAb No.17的实施例(17以空心三角形表示)与hLAG3-His蛋白的结合情况：sdAb No.17-H5B1(实心倒三角形)，sdAb No.17-H5B2(实心六边形)，sdAb No.17-H5B3(星号)，和sdAb No.17-H5(实心圆)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)。
图10示出了多种经改良的sdAb No.25的实施例(25以空心三角形表示)与hLAG3-His蛋白的结合情况：sdAb No.25-B5(实心三角形)，sdAb No.25-B6(实心倒三角形)，和sdAb No.25-B7(实心菱形)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)。
图11示出了多种经改良的sdAb No.27的实施例(27以空心三角形表示)与hLAG3-His蛋白的结合情况：sdAb No.27-H1B1(实心三角形)，sdAb No.27-H1B2(实心倒三角形)，和sdAb No.27-H1B3(实心菱形)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)。
图12示出了多种经改良的sdAb No.25的实施例与293T-LAG3细胞的结合情况(ELISA)：sdAb No.25-B5(实心正方形)，sdAb No.25-B6(实心三角形)，和sdAb No.25-B7(实心倒三角形)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)。
图13示出了多种经改良的sdAb No.25的实施例(25，实心正方形)：sdAb No.25-B7(实心菱形)，和经人源化改良的sdAb No.27的实施例(27，实心三角形)：sdAb No.27-H1B3(星号)与293T-LAG3细胞的结合情况(FACS)。使用抗-PD-L1抗体KN035作为阴性对照(NC，十字)，BMS作为阳性对照(BMS，星号)。
具体实施方式
本发明的以下说明仅意图为描述本发明的多种实施例。故此，本发明的保护范围并不仅限于所讨论的具体改良。任何熟悉本技术领域的技术人员应了解在不脱离本发明的范围的情况下可以进行多种等价形式，改动，和改良，且这些实施例均应包括在保护范围之内。
在此提供了可特异性地与LAG3(如人LAG3)结合的抗体，尤其是单域抗体。在此所用的术语“抗体”指的是一种免疫球蛋白分子或其免疫学活性部分，可特异性地与某种抗原(例如，LAG3或其功能域或片段)结合或发生免疫反应。术语“抗体”除包括天然抗体外，还包括经基因工程或其他方式改良的免疫球蛋白，如合成抗体，全人抗体，人源化抗体。在此公开的抗体，包括免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，保留与特定抗原例如，LAG3结合，或与LAG3的特定片段或结构域结合的能力。术语“单域抗体”(sdAb)与“纳米抗体”可互换使用，其缺乏轻链但仅含传统抗体的VHH。VHH是传统抗体重链的抗原结合片段。与传统抗体不同，不含Fc的sdAb要小得多，约为15kDa，约为100个到150个氨基酸的长度。例如，sdAb可以为约100个氨基酸，约110个氨基酸，约120个氨基酸，约130个氨基酸，约140个氨基酸，或约150个氨基酸。由于其尺寸较小，sdAb稳定性要好得多，且能识别并特异性地结合传统抗体无法接近(accessible)的表位。
在此公开的单域(VHH)抗体的一些示例的氨基酸序列及CDR如下表1所列。
注：CDR区域是通过IMGT编号法计算出的。
在一些实施例中，所公开的sdAb融合物是通过将两个sdAb与一个或多个G4S(GGGGS)(SEQ ID NO：57)连接子连接获得的。例如，可以用一个，二个，三个，四个，五个，或六个G4S连接子来将两个sdAb连接起来，从而获得sdAb融合物。下表2列出的是在此公开的一些sdAb融合物的示例的氨基酸序列。一个或多个G4S连接子(SEQ ID NO：57)以及N-端的信号肽和C-端的部分Fc序列以加亮显示。
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在此提供的抗体包含所公开的序列的多种变体，其氨基酸序列含有一种或多种突变但仍保留了与LAG3和/或其片段或功能域的结合亲和力。在一些实施例中，所公开的sdAb包含与选自SEQ ID NOs：1-19，80-86，和89-97的序列至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列，或上述氨基酸序列中保留与LAG3和/或其片段或功能域的结合亲和力的片段，或大体上由其组成，或由其组成。在一些实施例中，在此公开的sdAb包括CDR1，其具有选自SEQ ID NOs：20-31，98-101，和110的氨基酸序列，包括CDR2，其具有选自SEQ ID NOs：32-41，102-107，和111的氨基酸序列，或包括CDR3，其具有选自SEQID NOs：42-56，108，109，和112的氨基酸序列。在一些实施例中，在此公开的sdAb包括CDR1，其具有选自SEQ ID NOs：20-31，98-101，和110的氨基酸序列，包括CDR2，其具有选自SEQ IDNOs：32-41，102-107，和111的氨基酸序列，或包括CDR3，其具有选自SEQ ID NOs：42-56，108，109，和112的氨基酸序列。在某些实施例中，在此公开的序列的变体含有一种或多种突变，使得一个或多个CDR的一个或多个DG突变为DA和/或EG；和/或含有一种或多种突变，使得一个或多个CDR的一个或多个NG突变为NA和/或QG，其中D为天冬氨酸，G为甘氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，N为天冬酰胺，Q为谷氨酰胺。
还公开了一种sdAb融合物，其包括两种或多种sdAb，每种sdAb包括选自SEQ IDNOs：1-19，80-86，和89-97的氨基酸序列，或大体上由其组成，或由其组成，每种sdAb包括CDR1，其具有选自SEQ ID NOs：20-31，98-101，和110的氨基酸序列，包括CDR2，其具有选自SEQ ID NOs：32-41，102-107，和111的氨基酸序列，或包括CDR3，其具有选自SEQ ID NOs：42-56，108，109，和112的氨基酸序列；或每种sdAb包括CDR1，其具有选自SEQ ID NOs：20-31，98-101，和110的氨基酸序列，还包括CDR2，其具有选自SEQ ID NOs：32-41，102-107，和111的氨基酸序列，和包括CDR3，其具有选自SEQ ID NOs：42-56，108，109，和112的氨基酸序列。任何熟悉本技术领域的技术人员均应了解在此公开的任何两种或更多种sdAb可以组合或融合形成sdAb融合物。
在一些实施例中，通过一个或多个G4S连接子将两个或更多个sdAb融合起来。在一些实施例中，sdAb融合物进一步包括Fc域或其片段。在一些实施例中，在此公开的sdAb融合物包括选自SEQ ID NOs：58-76的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NOs：58-76的序列至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列，或大体上由其组成，或由其组成。
药物组合物
在此公开的一种或多种抗-LAG3抗体或融合物可配制成药物组合物。该药物组合物可进一步包括一种或多种药学上可接受的载体，辅料，防腐剂，或其组合。该药物组合物可有多种剂型，例如，注射剂，冻干剂，液体制剂等。视剂型和给药途径而定，本领域技术人员可以选用合适的添加剂，如佐剂，载体，辅料，防腐剂。例如，Wang等人发表于J.Pharm.Sciences 96(1)：1-26(2007)的文章内容通过引用纳入本申请。
在某些实施例中，该药物组合物可进一步包括一种或多种额外的抗体，如抗-PD-1抗体，抗-PD-L1抗体，CTLA-4抗体，或其组合。该一种或多种额外的抗体可配制到包括在此公开的抗-LAG3抗体的同一药物组合物中，或配制成单独的药物组合物用于联合治疗。
该药物组合物可被包括在具有使用该组合物的说明的试剂盒中。
治疗方法
在此提供了一种治疗和/或预防患有癌症或自身免疫性疾病和/或处于发生癌症或自身免疫性疾病的高风险的受试者的癌症或自身免疫性疾病的方法。这些疾病包括，例如，淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤和，和胶质母细胞瘤。该方法需要向受试者给予有效治疗量的在此公开的抗-LAG3抗体。在一些实施例中，该方法包括向受试者给予包括在此公开的抗-LAG3抗体的药物组合物。在此公开的抗-LAG3抗体可与一种或多种额外的抗体(如抗-PD-1抗体和/或抗-PD-L1抗体)联用。
在此使用的术语“受试者”指的是哺乳动物受试者，最好为人类受试者。“有需要受试者”指的是确诊有癌症或自身免疫性疾病，或处于发生癌症或自身免疫性疾病的高风险的受试者。短语“受试者”和“患者”在此可互换使用。
在此使用的术语“治疗(treat)”，“治疗(treating)”，和“治疗(treat)”在用于“疾病”一词前时指的是部分或完全减轻疾病，预防疾病，降低疾病发生或复发的可能性，减慢疾病的进展或发展，或消除，降低，或减慢与疾病有关联的一种或多种症状。当事关癌症或自身免疫性疾病时，“治疗”可指防止或减慢现有肿瘤的长大，防止或减慢癌症形成或转移，和/或减慢癌症或自身免疫性疾病的某些症状的发展。在一些实施例中，术语“治疗”，“治疗”，或“治疗”意指受试者的肿瘤数量和大小与未接受抗体给药者相比有所减小。在一些实施例中，术语“治疗”，“治疗”，或“治疗”意指在接受在此公开的抗体或药物组合物给药后，受试者的癌症或自身免疫性疾病的一种或多种症状与未接受此治疗的受试者相比有所减轻。
在此使用的抗体或药物组合物的“有效治疗量”指的是能在受试者中产生有利治疗作用(如治疗和/或预防癌症或自身免疫性疾病)的抗体或药物组合物用药量。在某些实施例中，有效治疗量指的是产生最大治疗效果的抗体或药物组合物用药量。在一些实施例中，有效治疗量产生的治疗效果低于最大治疗效果。例如，有效治疗量可以是某个用药量，在该用药量下治疗可产生治疗效果同时避免产生最大治疗效果用药量可能会引起的一种或多种副作用。特定组合物的有效治疗量视多种因素的差异而有所不同，包括但不限于治疗成分(如活性，药代动力学，药效动力学，和生物利用度)，受试者生理状况(如年龄，体重，性别，疾病类型和阶段，病史，一般身体状况，对所给药物剂量的响应，及其他现有用药)，组合物中任何药学上可接受的载体，辅料，和防腐剂的性质，以及给药途径。临床和药理专业人员可通过常规实验，即通过监测受试者对抗体或药物组合物的反应来调整剂量。如需了解更多的相关指南，可参阅Remington的The Science and Practice of Pharmacy，22ndEdition，Pharmaceutical Press，London，2012和Goodman&Gilman的The PharmacologicalBasis of Therapeutics，12th Edition，McGraw-Hill，New York，NY，2011等书籍。书中的相关内容通过引用纳入本申请。
在一些实施例中，在此公开的抗体的有效治疗量范围介于约0.01mg/kg至约30mg/kg，约0.1mg/kg至约10mg/kg，约1mg/kg至约5mg/kg。
选择合适的给药途径属于本领域技术人员的能力范围，如皮下给药，静脉给药，肌肉给药，皮内给药，鞘内给药，或腹膜内给药。在治疗有需要的受试者时，该抗体或药物组合物可采用速释，控释，或缓释方式连续或间歇给药。另外地，该抗体或药物组合物可采取每天三次，每天两次，或每天一次进行为期3天，5天，7天，10天，2周，3周，或4周的给药。该抗体或药物组合物可在预先确定的时间段内给药。替代地，该抗体或药物组合物可给药直到达到特定的疗效标准。在某些实施例中，在此提供的方法包括评估一个或多个疗效标准的步骤以确定该抗体或药物组合物是否需要继续给药。
下面给出的示例用于更好地说明实施例而不应被解读为对任何要求保护的实施例的范围的限制。就所提及的特定材料而言，其仅供用于说明而非意图限制本发明。本领域技术人员可以在不发挥创造性能力且不脱离本发明范围的情况下开发等效方法或反应物。应当理解，在此描述的过程可有多种变动而仍在本发明的界限之内。发明者的意图是将这些变动包括在本发明的范围之内。
示例
示例1：抗-LAG3单域抗体的产生
以下抗原购自北京义翘神州科技有限公司：人重组生物素化LAG3蛋白质(商品目录号：16498-HNAH-B)，人重组(Fc标签)LAG3蛋白质(商品目录号：16498-H02H)，和人重组(His标签)LAG3蛋白质(商品目录号：16498-H08H)。
澳大利亚羊驼，一到两岁龄，按以下时间表进行免疫：
用PBS将重组LAG3融合蛋白质柿释至2μg/mL，包被微孔板，100μL/孔，于4℃培养过夜，然后用300μL/孔的3％脱脂牛奶封闭，于37℃培养1小时。用含吐温20 的磷酸盐缓冲液(PBST)洗板三次。向每孔加入100μL稀释的LAG3-免疫羊驼血浆，于37℃孵育45分钟。用PBST洗板五次，然后加入辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗羊驼抗体(用PBS以1∶1稀释)，100μL/孔，室温孵育1小时。用PBST洗板五次后，用100μL/孔的四甲基联苯胺(TMB)底物对板进行显色，于37℃孵育5分钟，然后加入50μL/孔的终止液，在分光光度计上测定OD 450nm。
示例2：纳米抗体免疫库的构建
从50mL外周血分离PBMC。根据制造商说明书使用TRIzol(Invitrogen)将总RNA从PBMC中提取出来。通过PCR将来自该cDNA的单域抗体编码开放阅读框进行扩增，并克隆到适宜的噬菌体展示载体上。将VHH片段克隆到含有6xHis标签的M13噬菌粒载体中。所得的噬菌体库容为5.2×108cfu/mL(52*100*105)。
示例3：噬菌体展示筛选
亲和力生物淘选：用碳酸盐缓冲液将LAG-3蛋白质稀释至5μg/mL，以100μL/孔的量对96-孔板进行包被，并于4℃孵育过夜。弃去包被缓冲液，用PBS洗板三次。加入300μL/孔的3％BSA-PBS封闭缓冲液并在37℃孵育一小时。用PBS洗板三次，加入100μL/孔的噬菌体库，并在37℃培养一小时。将未结合的噬菌体吸出，用PBST洗板六次，PBS洗板两次。向每孔加入100μL的洗脱缓冲液(Gly-HCl)，并在37℃孵育8分钟。将含有特异性结合噬菌体的洗脱物转移到一支干净的1.5mL微量离心管中，并立即用15μL Tris-HCl缓冲液中和pH。取出10μL的溶液，进行10倍连续稀释。通过最高稀释度的菌落计数估算噬菌体滴度。下表5详述了每一轮的生物淘选条件。
从免疫库复苏和扩增噬菌体：将噬菌体库洗脱液与20mL对数生长期的TG1大肠杆菌细胞混合，于37℃不振荡培养30分钟。将1mL的20％葡萄糖和4μL的氨苄西林加入到离心管中，于37℃180rpm旋转培养30分钟。以细胞∶噬菌体＝1∶20的比例加入M13K07辅助噬菌体，于37℃不振摇培养30分钟。然后加入20mL 2xYT，于37℃180rpm旋转培养30分钟。将上清液转移到一支新的微量离心管中，5000rpm离心10分钟。将沉淀的噬菌体重悬于含氨苄西林和卡那霉素的50mL2*YT中，于30℃230rpm旋转培养过夜。将过夜培养物以10000rpm室温离心20分钟。将上清液转移到一支新的微量离心管中，加入PEG/NaCl溶液(1∶5 v/v)，轻轻混合并于4℃静置1小时。将溶液于10000rpm 4℃离心20分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1mLPBS中，向上清液加入PEG/NaCl溶液(1∶5 v/v)，在4℃静置1小时。将溶液于12000rpm4℃离心2分钟。将沉淀重悬于200μL PBS中，通过菌落计数估算噬菌体滴度。
抗原结合物的筛选：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将LAG-3蛋白质稀释至2μg/mL，以100μL的该稀释液包被96-孔板，于4℃孵育过夜。用PBST洗板三次，每孔加入200μL脱脂牛奶，于37℃孵育1小时。然后用PBST洗板三次，每孔加入50μL噬菌体上清液和50μL 5％脱脂牛奶，于37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，每孔加入100μL结合有HRP的抗-M13抗体(1∶5000稀释于PBS)，于37℃孵育1小时。用PBST洗板6次，每孔加入100μL TMB，于37℃孵育7分钟。然后向每孔加入50μL终止液，在酶标仪上测定450nm处的吸光度。
示例4：单域抗体的表达与纯化
在测定了阳性克隆的序列后，通过PCR技术将VHH序列克隆到pTT5载体上。通过ExpiCHO转染系统表达重组单域抗体。将细胞在振荡式培养箱中于37℃培养12天。收获细胞培养上清液并通过2000rpm离心澄清10分钟，然后将其滤过0.22μm过滤器。使用AKTA和MabselectSure(1mL)柱纯化澄清的上清液，并用0.2MTris-Glycine(pH 3.4)缓冲液洗脱。浓缩后，将洗脱出的抗体通过Superdex 200(GE)色谱法进一步纯化。
示例5：抗-LAG3单域抗体和人LAG3蛋白的结合测定
通过BiacoreTM测定法检测单域抗体与重组人LAG3蛋白质(rhLAG3)的结合情况。使用包被抗人Fc的CM5芯片(商品目录号：BR-1005-30，GE)捕获单域抗体。按照试剂盒(商品目录号：BR-1008-39，GE)附带的制造商说明进行包被。然后将LAG3-His抗原(商品目录号：16498-H08H，北京义翘神州科技有限公司)通过CM5芯片的表面。用Biacore仪器检测实时信号，以获得结合与解离曲线，通过下表6所示的曲线拟合得到单域抗体与rhLAG3的结合动力学。每个循环完成后用25mMNaOH再生，随后用试剂盒中提供的HBS-EP清洗芯片表面。
在结合测定中，采用百时美施贵宝(BMS)生产的抗-LAG3抗体作为阳性对照，VH和VL序列如下所示。该BMS抗体的序列已经公布于申请号为201I/0150892的美国专利中。只有25F7的VH和VL被克隆到pTT5载体上。另一个阳性对照为GS2-2抗体(W3396-R2-2，在中国专利CN 110305215A中公开)。结果显示，在此公开的单域抗体对LAG3蛋白具有强大的结合活性和亲和力。
BMS抗体的VH氨基酸序列(SEQ ID NO：77)：
BMS抗体的VL氨基酸序列(SEQ ID NO：78)：
GS2-2抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO：79)：
示例6：抗-LAG3 sdAb的表位测定
按试剂盒(商品目录号：BR-1008-39，GE)提供的制造商说明通过包被于CM5芯片上的抗-Fc捕获单域抗体，从而捕获了抗-LAG3抗体(BMS，sdAb 1，17，18，20，21，24，25，27，37，和73)。然后将LAG3-His抗原(商品目录号：16498-H08H，北京义翘神州科技有限公司)以25ug/mL的流速通过CM5芯片的表面，然后再将封闭抗体(人lgG1 Fc，自制)通过芯片表面占据剩余的未结合部位。最后，将抗-LAG3 sdAb(sdAb 1，17，18，20，21，24，25，27，37，和73)以及BMS对照通过芯片表面。Biacore仪器检测到了实时信号，获取了下表7所示的单域抗体的结合动力学。每个循环后用25mM NaOH再生芯片，随后用试剂盒中提供的HBS-EP清洗芯片表面。
表7.单域抗体的表征
在此获得的sdAb的结合表位位置与对照BMS抗体结合的表位位置不同。此外，sdAb#25能结合到一个表位，其位置与其余的sdAb结合到的表位位置均不相同。
示例7：单域抗体对表达人LAG-3的Jurkat T细胞的效果
抗-LAG3单域抗体的功效是通过Jurkat T细胞所产生的IL-2的水平来判定。一个稳定表达人LAG3的Jurkat T细胞系是通过慢病毒转导构建产生。流式细胞术测定结果显示，RajiB细胞上的MHCII能与人LAG3结合，导致当JurkatT细胞被激活时，IL-2的产量显著下降。
为了评估抗-LAG3单域抗体的效果，将RajiB细胞(25000/孔)与过表达人LAG3(100000/孔)的Jurkat T细胞混合，并加入SEE(50pg/孔)(商品目录号：ET404，ToxinTechnology)。向微孔板加入不同的抗-LAG3抗体(100μg/mL，3x连续稀释)。在37℃，5％CO2条件下刺激24小时后，通过ELISA测定培养物上清液中的IL-2分泌量。一种拮抗抗体能恢复被细胞膜中过表达的LAG3抑制的T细胞功能。单域抗体恢复IL-2的EC50值由hLAG3 JurkatT系统测定获得，结果如图1，表8，和表9所示。BMS抗体的功效设为100％作为对照。
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示例8：抗-LAG-3单域抗体体外功效的优化
根据表位竞争测定结果，将两种结合到两个不同表位的单域抗体组合，以改善体外功效。对该过程的描述见示例7。如图2和表10所示，结合到不同表位的两个单域抗体的组合表现出了IL-2产量升高作用，导致抗-LAG3体外细胞水平的功效增强。
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图3，表11，和表12表明，单域抗体以及sdAb融合物均刺激hLAG3 Jurkat T系统中IL-2的产生。结果显示，sdAb融合物25-27-2，25-17-1，25-17-2，25-17-3，25-2015-1，25-2015-2，和25-2015-3在LAG3 T细胞/APC生物测定中能刺激IL-2的产生，其EC50与阳性对照抗体BMS和GS2-2(中国专利CN 110305215A公开的W3396-R2-2)的相当。
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示例9：改良的sdAb Nos.17和27
改良的sdAb Nos.17和27通过突变其CDR区中的一个或多个氨基酸进行制备，这些位点在人源化步骤前出现翻译后修饰的可能性更高。改良后的序列如表13所示，CDR区以下划线粗体表示；突变区以方框标出；CDR区是通过Kabat编号法计算获得。
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示例10：改良的sdAb Nos.17和27的实施例与hLAG3-His蛋白质的结合情况分析(ELISA)
改良的sdAb Nos.17和27与hLAG3-His蛋白的结合情况分析是按在此描述的ELISA法进行的。所有改良后的17sdAb均能特异性地与hLAG3-His蛋白结合。SdAb No.17-H5与hLAG3-His蛋白质的结合亲和力最高，其次为sdAb 17-H3。所有改良后的27sdAb均可特异性地与hLAG3-His蛋白结合。sdAb Nos.27-H2的亲和力较sdAb Nos.27-H1和sdAb No.27稍高一些。见表14-16和图4-6。
用100μL/孔的包被液对板进行包被，然后封板，于2-8℃培养过夜(12-18小时)。用＞200μL/孔的清洗缓冲液抽吸并清洗1次，将板倒置于吸上纸上轻敲以去除过量液体。用200μL/孔的封闭缓冲液(1xPBS+4％牛奶)室温封闭1小时，吸出液体，将板倒置于吸水纸上，轻敲去除过量液体。用封闭缓冲液配制标准品和样品稀释液。将100μL的标准品(一式两份)和样品移到指定的孔中。在室温轻柔连续振摇(～500rpm)孵育1小时后，吸出孔内液体，并用＞200μL/孔的清洗缓冲液清洗3次，将板倒置于吸水纸上，轻敲以去除过量液体。
用封闭缓冲液稀释一抗溶液。推荐的一抗稀释度见表14。每孔加入100μL的一抗稀释液，室温下轻柔连续振摇(～500rpm)孵育2小时。将孔中的液体吸出，并用＞200μL/孔的清洗缓冲液清洗3次，将板倒置于吸水纸上，轻敲以去除过量液体。用封闭缓冲液将二抗稀释2500倍后获得二抗工作溶液。向每孔加入100μL的二抗工作溶液，室温孵育30分钟。将孔中的液体吸出，并用＞200μL/孔的清洗缓冲液清洗5次，将板倒置于吸水纸上，轻敲以去除过量液体。向每孔加入100μL的TMB底物溶液(Biopanda，TMB-S-004)，室温培养30分钟。向每孔加入100μL的终止液(Solarbio，C1058)。在加入终止液后30分钟内测量450nm处的吸光度。用对数-对数或4-参数曲线拟合法计算结果。
所用的材料如下所列：
1)包被液：含LAG3-His的1 x PBS(北京义翘神州科技有限公司，16498-H08H，2ug/mL，100uL/孔)；
2)封闭缓冲液：1x PBS+4％牛奶(BD，23200)；
3)一抗：sdAb Nos.17，27，17-H1，17-H2，17-H3，17-H4，27-H1，27-H2；
4)二抗：鼠抗人1gG1 Fc抗体HRP(1：2500，Invitrogen，MH1715)：
5)NC，阴性对照：抗-PD-L1抗体KN035，由上海仁会用如下所列的序列制备：
KN035 HC(SEQ ID NO：87)：
KN035 LC(SEQ ID NO：88)：
表14.改良的sdAb No.17实施例与hLAG3-His蛋白的结合分析(见图4)
注：符号“～”表示约等于。
表15.改良的sdAb No.17实施例与hLAG3-His蛋白的结合分析(见图5)
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注：符号“～”表示约等于。
表16.改良的sdAb No.27的实施例与hLAG3-His蛋白的结合分析(见图6)
Conc.μg/mL sdAb No.27 sdAb No.27-H1 sdAb No.27-H2 NC
10 2.15 1.947 2.269 0.04
3.333333 1.77 2.003 2.076 0.036
1.111111 1.844 1.8 1.955 0.04
0.37037 1.501 1.417 1.425 0.036
0.123457 0.331 0.36 0.334 0.041
0.041152 0.063 0.063 0.063 0.037
0.013717 0.042 0.043 0.043 0.04
0.004572 0.039 0.04 0.038 0.043
EC50(nM) 3.136 3.283 3.725 N/A
示例11：改良的sdAb Nos.17和27的实施例与293T-hLAG3细胞的结合分析
改良的sdAb Nos.17和27与293T-hLAG3细胞的结合情况分析按在此描述的方法进行。所有改良的sdAb 17均特异性地与293T-hLAG3细胞结合。改良的sdAb No.17-H1和17-H2与293T-hLAG3细胞的亲和力与sdAb No.17的相似。所有改良的sdAb 27均特异性地与293T-hLAG3细胞结合。改良的sdAb Nos.27-H1和27-H2与293T-hLAG3细胞的亲和力与sdAb No.27的相似。见表17-18和图7-8。
在96-孔微量板中培养293T-hLAG3单层细胞。每个孔均以刺激成分进行处理。然后将细胞进行固定，并用封闭缓冲液封闭。加入一抗。对板孔进行清洗，加入HRP-结合二抗。用1x PBS清洗板孔，加入含TMB(Biopanda，TMB-S-004)的溶液。TMB与HRP反应，溶液颜色由无色变为蓝色。然后加入一种酸性终止液(Solarbio，C1058)以停止反应。颜色由蓝色变为黄色。
材料包括如下所列：
1)细胞：293T-LAG3(5*105个细胞/孔)；
2)封闭缓冲液：1xPBS+3％BSA(Sigma，B2064)；
3)一抗：sdAb Nos.17，27，17-H1，17-H2，17-H3，17-H4，27-H1，27-H2；
4)二抗：山羊抗人1gG1 Fc抗体，HRP(1：2500，invitrogen，A18817)。
5)BMS，阳性对照：抗-LAG3抗体Relatimab，由上海仁会自制
6)NC，阴性对照：抗-PD-L1抗体KN035，由上海仁会自制。
表17.改良的sdAb No.17的实施例与293T-hLAG3细胞的结合分析(见图7)
表18.改良的sdAb No.27的实施例与293T-hLAG3细胞的结合分析(见图8)
Conc.μg/mL BMS sdAb No.27 sdAb No.27-H1 sdAb No.27-H2 NC
10 1.13 1.264 1.33 1.198 0.039
3.333333 1.024 1.21 1.235 1.14 0.039
1.111111 1.004 1.277 1.169 1.161 0.038
0.3703704 0.858 1.131 1.08 1.067 0.038
0.1234568 0.675 0.79 0.719 0.626 0.037
0.0411523 0.357 0.408 0.359 0.314 0.036
0.0137174 0.176 0.198 0.171 0.152 0.037
0.0045725 0.081 0.097 0.076 0.075 0.043
EC50(nM) 0.5667 1.18 1.396 1.55 N/A
示例12：sdAb Nos.17，25，27，和改良的sdAb Nos.17和27的人源化
抗体人源化通过用人抗体骨架取代非人抗体骨架来降低单克隆抗体的免疫原性并改善抗体对人类免疫系统的激活作用。在治疗性抗体的发现过程中，它是非常重要的一个步骤。
人源化的进行过程如下：1).热点分析与去除；2).根据Kabat编号法确定亲代VH/VL的典型结构；3).根据同源性选择最佳的种系框架；4).根据同源性选择J区域；5).鉴别回环构象与界面中的关键残基；6).建模鉴别CDR结合区的5A内的残基；7).构建具备不同回复突变的多种人源化Ab的载体；8).人源化sdAb的表达与纯化；9).通过SEC，SDS-PAGE等方式对人源化Ab的进行表征；和10).通过ELISA进行初步筛选。CDR区是通过Kabat编号法计算获得。
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注：CDR区通过Kabat编号法计算获得并以黑体下划线标出。突变的热点氨基酸(AAs)以方框标示。
示例13：人源化sdAb Nos.17-H5，25，和27-H1的实施例与hLAG3-His蛋白的结合分析(ELISA法)
人源化sdAb Nos.17-H5，25，和27-H1的实施例与hLAG3-His蛋白质的结合分析是通过ELISA进行的，具体方法见示例10。所有的人源化sdAb Nos.17-H5均特异性地与hLAG3-His蛋白结合，其表现出的与hLAG3-his蛋白的亲和力与SdAb No.17的相似。所有的人源化sdAb No.17-H5与hLAG3-his蛋白的亲和力均稍低于SdAb No.17-H5。在若干个人源化sdAbNo.25的示例中，sdAb No.25-B7特异性地与hLAG3-His蛋白结合并且其与hLAG3-his蛋白的亲和力高于sdAb No.25；而sdAb Nos.25-B5和25-B6与hLAG3-His蛋白的亲和力则较低。在若干个人源化sdAb No.27-H1的示例中，sdAb No.27-H1B3特异性地与hLAG3-His蛋白结合并且其与hLAG3-His蛋白的亲和力高于sdAb No.27；而sdAb Nos.27-H1B1和27-H1B2与hLAG3-his蛋白的亲和力则较低。见表20-21和图9-11。
本示例中开展的ELISA分析与示例10中的ELISA分析方法相似，不同之处在于所检测的一抗为sdAb Nos.17，17-H5，17-H5B1，17-H5B2，17-H5B3，25，25-B5，25-B6，25-B7，27，27-H1B1，27-H1B2，和27-H1B3；使用的阴性对照(NC)为抗-PD-L1抗体KN035。
表20.人源化sdAb No.17-H5的实施例与hLAG3-His蛋白质的结合分析(见图9)
注：符号‘～’表示约等于。
表21.人源化sdAb No.25和人源化sdAb No.27-H1的实施例与hLAG3-His蛋白的结合分析(见图10-11)
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注：符号‘～’表示约等于。
示例14：人源化sdAb No.25的实施例与293T-LAG3细胞的结合分析
人源化sdAb No.25实施例与293T-hLAG3细胞的结合分析方式如示例11所述。SdAbNo.25-B7与293T-LAG3细胞的亲和力比sdAb No.25-B6和25-B5高。见表22和图12。
表22.人源化sdAbs No.25的实施例与293T-LAG3细胞的结合分析(见图12)
示例15：人源化sdAb Nos.25-B7和27-H1B3与293T-LAG3细胞的结合分析(FACS法)
按在此描述进行了人源化sdAb Nos.25-B7和27-H1B3与293T-hLAG3细胞的结合分析；所有检测的sdAb均特异性地与293T-hLAG3细胞结合。人源化sdAb No.25-B7与293T-hLAG3细胞的亲和力比sdAb No.25高；而人源化sdAb No.27-H1B3与293T-hLAG3的亲和力则比sdAb No.27的稍高，见表23和图13。
FACS执行步骤规定如下：
1)将293T-hLAG3细胞消化，在Counter Star中用台盼蓝染色法计数；活细胞密度为4.16×106个细胞/mL，体积为15mL，细胞活率为93.03％.
2)将293T-LAG3细胞用PBS清洗三次，并用含3％BSA的1xPBS将其重悬为5×106个细胞/mL的混悬液。
3)根据检测板图，向96-孔板的每个孔加入100μL细胞悬液。
4)用3％BSA/1xPBS配制理想抗体浓度的抗体样品。
5)按检测板图将配制的抗体样品加入到96-孔板中，重悬细胞并在4℃孵育1小时。
6)细胞于400g离心5分钟，并清洗4次。
7)用3％BSA/1xPBS将山羊抗人IgG-Fc多克隆二抗(650)稀释到理想的浓度(1：200)，采用此溶液重悬细胞并在4℃孵育1小时。
8)将细胞于400g离心5分钟，并清洗3次。
9)将细胞重悬于200μL的3％BSA/1xPBS中，由Shsti Biotech Inc进行流式细胞术检验。
FACS分析的执行条件：
1)细胞：293T-LAG3(5×105/孔)；
2)封闭缓冲液：1*PBS+3％BSA；
3)一抗：sdAb Nos.25，25-B7，27，和27-H1B3；
4)在此描述的BMS抗体作为阳性对照；
5)二抗：山羊抗人IgG-Fc多克隆二抗(650)(1∶200)。
表23.sdAb Nos.25-B7和27-H1B3的实施例与293T-LAG3细胞的结合分析(FACS法)(见图13)
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Claims (15)

1.一种特异性地结合到人LAG3上的单域抗-LAG3抗体，其中，该单域抗体包括选自SEQID NOs：1-19，80-86，和89-97的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NOs：1-19，80-86，和89-97的序列至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列。
2.一种特异性地结合到人LAG3上的单域抗-LAG3抗体，其中，该单域抗体包括CDR1，其具有选自SEQ ID NOs：20-31，98-101，和110的氨基酸序列，包括CDR2，其具有选自SEQ IDNOs：32-41，102-107，和111的氨基酸序列，和/或包括CDR3，其具有选自SEQ ID NOs：42-56，108，109，和112的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的单域抗-LAG3抗体，其中，
所述的单域抗体包括CDR1，其具有选自SEQ ID NOs：20-31，98-101，和110的氨基酸序列，包括CDR2，其具有选自SEQ ID NOs：32-41，102-107，和111的氨基酸序列，和/或包括CDR3，其具有选自SEQ ID NOs：42-56，108，109，和112的氨基酸序列；且
CDR1，CDR2，或CDR3中的一个或多个CDR的一处或多处DG被突变为DA和/或EG，和/或CDR1，CDR2，或CDR3中的一个或多个CDR的一处或多处NG被突变成NA和/或QG，其中D为天冬氨酸，G为甘氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，N为天冬酰胺，Q为谷氨酰胺。
4.一种单域抗体融合蛋白，其包括如权利要求1-3中任一项所述的两种或多种单域抗-LAG3抗体。
5.如权利要求4所述的单域抗体融合蛋白，其进一步包含一个或多个G4S连接子。
6.如权利要求4或5所述的单域抗体融合蛋白，其进一步包括Fc区域或片段。
7.如权利要求4-6中任一项所述的单域抗体融合蛋白，其中，两种或多种单域抗体所结合的表位位于LAG3抗原的不同位置或不同功能域处。
8.一种单域抗体融合蛋白，其包含选自SEQ ID NOs：58-76的氨基酸序列，或选自与SEQID NOs：58-76的序列至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列。
9.一种药物组合物，其包括有效治疗量的如权利要求1-3中任一项所述的一种或多种单域抗-LAG3抗体，或如权利要求4-8中任一项所述的一种或多种单域抗体融合蛋白。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述两个或多个单域抗-LAG3抗体与位于LAG3抗原的不同位置或功能域处的表位结合。
11.如权利要求1-3中任一项所述的单域抗体或如权利要求4-8中任一项所述的单域抗体融合蛋白在制造用于治疗或预防受试者的淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，或胶质母细胞瘤的药剂中的用途。
12.一种治疗或预防受试者的一种或多种疾病的方法，其包含向所述受试者给予有效治疗量的如权利要求1-3中任一项所述的一种或多种单域抗体，或如权利要求4-8中任一项所述的一种或多种单域抗体融合蛋白，其中所述一种或多种疾病为淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，和胶质母细胞瘤。
13.如权利要求12所述的方法，其包括向所述受试者给予如权利要求1-3中任一项所述的两种或多种单域抗体。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述两种或多种单域抗体的给药同时或依次进行。
15.一种治疗或预防受试者的一种或多种疾病的方法，其包含向所述受试者给予有效治疗量的如权利要求9或权利要求10所述的药物组合物，其中所述一种或多种疾病为淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，胃癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，黑素瘤，和胶质母细胞瘤。
CN202180081655.4A 2020-11-27 2021-11-29 新型抗-lag3抗体及其制备和使用方法 Pending CN116648461A (zh)

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